Xây dựng mô hình máy tính mô phỏng mạng lưới trao đổi chất sinh tổng hợp vitamin B12 của vi khuẩn Pseudomonas denitrificans

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong điều kiện phát triển của công nghệ thông tin hiện nay, mô hình mô phỏng đang trở thành một công cụ hiệu quả để nghiên cứu hệ thống sinh học của các quá trình trao đổi c

KHUẨN PSEUDOMONAS DENITRIFICANS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

KHUẨN PSEUDOMONAS DENITRIFICANS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân

thành và sâu sắc tới TS Đỗ Ngọc Quang là người thầy đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và

tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này Sự đam mê, nhiệt huyết và lòng yêu nghề của thầy đã truyền động lực để em phấn đấu và cống hiến hết mình

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô ở bộ môn Vi sinh và Sinh học - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô cùng cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, quan tâm em trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè những người đã luôn bên cạnh, động viên em cố gắng để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Do trình độ còn hạn chế nên bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp của em không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy, cô để em có thể hoàn thành tốt hơn bài báo cáo tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019 Sinh viên

Nguyễn Thị Ly

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm sinh học và quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas denitrificans 2

1.1.1 Đặc điểm sinh học của Pseudomonas denitrificans 2

1.1.2 Quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas denitrificans 2

1.1.2.1 Giới thiệu về vitamin B12 2

1.1.2.2 Con đường sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas denitrificans 3

1.2 Mô hình hóa quá trình trao đổi chất 6

1.2.1 Nguyên lý quá trình trao đổi chất 6

1.2.1.1 Quá trình trao đổi chất 6

1.2.1.2 Con đường trao đổi chất 6

1.2.1.3 Năng lượng cần thiết cho các con đường trao đổi chất hoạt động 6

1.2.2 Biểu diễn quá trình trao đổi chất dưới dạng mô hình toán học 7

1.2.3 Sử dụng COBRA để xây dựng mô hình trao đổi chất 9

1.2.3.1 Constraint-based modeling (CMB) 9

1.2.3.2 COBRA 9

1.2.4 Phân tích cân bằng thông lượng của mô hình trao đổi chất 11

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.2.1 Xây dựng mô hình 13

2.2.2 Đánh giá độ tin cậy của mô hình 134

2.3 Phương pháp nghiên cứu……….14

2.3.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu……… 14

2.3.1.1 Cơ sở dữ liệu KEGG_PD 14

2.3.1.2 Cơ sở dữ liệu KEGG_RXN và KEGG_MET 15

2.3.2 Xây dựng mô hình 15

2.3.2.1 Tạo chất trao đổi 16

2.3.2.2 Tạo phản ứng 17

2.3.2.3 Tạo mô hình 18

2.3.3 Phân tích thông lượng của mô hình 19

2.3.4 Mô phỏng hoạt động của mô hình trong các điều kiện môi trường khác

nhau 20

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Xây dựng mô hình 22

3.1.1 Thu thập dữ liệu từ KEGG 22

3.1.2 Xây dựng mô hình trao đổi chất sơ bộ của Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 23

3.1.3 Hoàn thiện mô hình 24

3.1.3.1 Bổ sung các phản ứng thiếu 24

3.1.3.2 Tạo phản ứng nối các chất chuyển hóa 26

3.1.3.3 Điều chỉnh chiều phản ứng 27

3.1.3.4 Tạo phản ứng trao đổi với môi trường 29

3.1.3.5 Tạo chuỗi phản ứng hô hấp sinh ATP 30

3.1.3.6 Tạo phản ứng sinh khối 31

3.2 Đánh giá độ tin cậy của mô hình 32

3.2.1 Khả năng tạo sinh khối trong điều kiện có và không có oxy 32

3.2.2 Khả năng tạo sinh khối từ các nguồn carbon khác nhau 35

3.2.3 Khả năng sinh tổng hợp vitamin B12 từ các nguồn carbon khác nhau 36

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của glutamat và cobinamid đến sự sinh tổng hợp vitamin B12 37

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39

4.1 Kết luận 39

4.2 Đề xuất 39

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AdoCbl Adenosylcobalamin Adenosylcobalamin

ADN Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic ADP Adenosin diphosphate Adenosin diphosphat

ALA δ-aminolevulinic acid Acid δ-aminolevulinic

ATCC American Type Culture

Collection

Tập hợp các chủng vi sinh vật Mỹ

ATP Adenosin triphosphate Adenosin triphosphat

CBM constraint-based model Mô hình dựa trên giới hạn

lượng KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes

and Genomes

Bách khoa toàn thư Kyoto

về gen và bộ gen NADH Nicotinamide adenine

dinucleotide

Nicotinamid adenin dinucleotid

NCBI National Center for

Biotechnology Information

Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Các tham số của phản ứng chuyển hóa N-acetyl-L-glutamat-5-semialdehyd

thành N-acetylornithin (R002283) 26

Bảng 3.2: Tham số giới hạn của một số phản ứng trong các con đường trao đổi chất

của P denitrificans ATCC 13867 29

Bảng 3.3: Tham số của một số phản ứng trao đổi với môi trường của P denitrificans

ATCC 13867 29

Bảng 3.4: Tỷ lệ các thành phần trong sinh khối của P putida KT2440 31

Bảng 3.5: Thành phần môi trường của mô hình PD13867 32 Bảng 3.6: So sánh thông lượng tạo sinh khối (mmol/gDW/h) của 3 mô hình: PD13867

(P denitrificans ATCC 13867), iJN746 (P puttida KT2440) và iECW_1372 (E coli

W) trong điều kiện môi trường nuôi cấy tương tự nhau 34

Bảng 3.7: Kết quả sinh khối tạo ra của mô hình từ 3 nguồn carbon (glucose, sucrose

và maltose) trong điều kiện có oxy 36

Bảng 3.8: So sánh thông lượng sinh tổng hợp vitamin B12 từ các nguồn carbon và so

với hiệu suất thực nghiệm 37

Bảng 3.9: Thông lượng tạo sinh khối của môi trường ban đầu và môi trường bổ sung

L-glutamat và cobinamid 38

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Các con đường sinh tổng hợp Adenosylcobalamin của Pseudomonas

denitrificans 5

Hình 1.2: Ma trận cân bằng hóa học 8 Hình 1.3: Các giai đoạn chính của quá trình xây dựng mô hình trao đổi chất bằng

phương pháp Constraint-based modeling 11

Hình 1.4: Quá trình phân tích cân bằng thông lượng 12 Hình 3.1: Dữ liệu thông tin về con đường trao đổi chất Glycolysis (pdr00010) nằm trong

cơ sở dữ liệu KEGG_PD của Pseudomonas denitrificans ATCC 13867……… 23

Hình 3.2: Ma trận của hai phản ứng trao đổi chất được lấy ra từ chu trình citrat

(pdr00020) của P denitrificans ATCC 13867 244

Hình 3.3: Phản ứng thiếu trong con đường sinh tổng hợp arginin của P denitrificans

ATCC 13867 …5

Hình 3.4: (A) Phản ứng thiếu trong con đường sinh tổng hợp leucin (pdr00290) của P

denitrificans ATCC 13867 277

Hình 3.5: Đổi chiều phản ứng tạo pyruvat từ phosphoenol-pyruvat (R00200) của con

đường đường phân……… 28

Hình 3.6: Con đường phosphoryl oxy hóa (pdr00190) của Pseudomonas denitrificans

ATCC 13867 31

Hình 3.7: Thông lượng tối ưu của phản ứng bio1 trong điều kiện có và không có oxy

của mô hình PD13867 33

Hình 3.8: Thông lượng các phản ứng kết thúc chuỗi phosphoryl oxy hóa trong điều kiện

có oxy của mô hình PD13867 34

Hình 3.9: Thông lượng các phản ứng kết thúc chuỗi phosphoryl oxy hóa trong điều kiện

không có oxy của mô hình PD13867 35

Hình 3.10: Thông lượng sinh khối tạo ra trong điều kiện không có oxy và không có hô

hấp khử nitrat của mô hình PD13867 35

Hình 3.11: Quá trình chuyển hóa tạo vitamin B12 từ ba nguồn carbon: glucose, sucrose,

maltose của P denitrificans ATCC 13867 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong điều kiện phát triển của công nghệ thông tin hiện nay, mô hình mô phỏng đang trở thành một công cụ hiệu quả để nghiên cứu hệ thống sinh học của các quá trình trao đổi chất Mô hình mô phỏng cung cấp một nền tảng để trực quan hóa và phân tích dữ liệu gen và chức năng gen, protein và chức năng protein và dữ liệu chuyển hóa Từ đó,

nó cho phép nghiên cứu về mối tương quan giữa các phản ứng trong một mạng lưới trao đổi chất cũng như ảnh hưởng của các yếu tố như dinh dưỡng, độc tố, di truyền, … lên từng phản ứng trao đổi chất của sinh vật [7]

Vitamin B12 là một vitamin thiết yếu và được sử dụng rộng khắp trong y khoa và trong công nghiệp thực phẩm [5] Do cấu trúc phức tạp, vitamin B12 hiện nay chủ yếu

được sản xuất bằng vi sinh vật Pseudomonas denitrificans là một trong những vi sinh

vật đang được sử dụng rộng rãi để sản xuất vitamin B12 trên quy mô công nghiệp [28]

Quá trình trao đổi chất của P denitrificans đã và đang được cải biến theo nhiều hướng

khác nhau nhằm gia tăng hiệu suất sinh tổng hợp vitamin B12 [5] Việc sử dụng mô hình trao đổi chất mô phỏng có thể giúp thu ngắn quá trình sàng lọc đối tượng cho các nghiên cứu thực nghiệm Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có một mô hình trao đổi chất nào

của P denitrificans được công bố

Để góp phần tạo thêm một công cụ cho nghiên cứu trao đổi chất của P denitrificans chúng tôi quyết định thực hiện đề tài nghiên cứu: “Xây dựng mô hình máy tính mô phỏng

mạng lưới trao đổi chất sinh tổng hợp vitamin B12 của vi khuẩn Pseudomonas denitrificans” Mục tiêu của đề tài là bước đầu xây dựng được mô hình trao đổi chất mô

phỏng của P denitrificans đạt được độ tin cậy để phục vụ cho nghiên cứu.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm sinh học và quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas

denitrificans

1.1.1 Đặc điểm sinh học của Pseudomonas denitrificans

Pseudomonas denitrificans, một loại vi khuẩn kị khí tùy tiện gram âm, có khả năng

thực hiện hô hấp khử nitrat và có khả năng sinh tổng hợp vitamin B12 trong điều kiện hiếu khí [1],[5]

Pseudomonas denitrificans ATCC 13967 là chủng hay được sử dụng trong nghiên

cứu và trong công nghiệp sinh tổng hợp vitamin B12 Kích thước bộ gen của

Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 là 5696307 bp với 65,2% hàm lượng G+C Bộ

gen của P.denitrificans ATCC 13867 có 2567 operon và 5059 gen mã hóa protein Trong

số 5059 protein, 3013 protein (chiếm 59,56%) được dự kiến nằm trong tế bào chất, 982 protein (19,4%) nằm trên màng Vị trí còn lại 1045 protein (21,02%) chưa được xác

định Bộ gen của P denitrificans ATCC 13867 chứa đầy đủ các gen mã hóa cho 26

enzym cần thiết để tổng hợp coenzym B12 khi có oxy Các gen được phân bố ở hai nhóm khác nhau trên nhiễm sắc thể [1]

1.1.2 Quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas denitrificans

1.1.2.1 Giới thiệu về vitamin B12

Vitamin B12 hay còn gọi là cyanocobalamin là một trong những phân tử sinh học phức tạp Các dạng sinh học của vitamin B12 bao gồm adenosylcobalamin,

hydroxocobalamin và methylcobalamin Vitamin B12 là một yếu tố tăng trưởng quan trọng đối với vi sinh vật và động vật Vitamin B12 được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1926 và khi đó được gọi là “yếu tố chống lại thiếu máu nguy hiểm” [15],[19] Phân tử vitamin B12 gồm ba phần: một vòng Corrin trung tâm chứa bốn phối tử với ion coban ở trung tâm, một phối tử (alpha) thấp hơn được cho bởi DMBI (5,6-

dimethylbenzimidazol) và phối tử trên (beta) được tạo từ một nhóm adenosyl hoặc một nhóm methyl Các sản phẩm cuối cùng tạo ra trong tự nhiên từ sinh tổng hợp vitamin B12 là 5′-deoxyadenosylcobalamin (coenzym B12), methylcobalamin và

hydroxocobalamin Dạng vitamin B12 chủ yếu được sản xuất trong công nghiệp là

cyanocobalamin (CNCbl), một cobalamin ổn định, nhóm adenosyl hoặc methyl được thay thế bằng nhóm cyano là kết quả của quá trình chiết xuất [15]

Hiện nay, vitamin B12 được sử dụng rộng rãi trong điều trị thiếu máu ác tính, viêm dây thần kinh ngoại biên [22] và là cofactor cần thiết cho enzym methionine synthase

và (R)-methylmalonyl-CoA mutase ở động vật và người [23]

1.1.2.2 Con đường sinh tổng hợp vitamin B12 của Pseudomonas denitrificans

Do quá trình tổng hợp vitamin B12 hóa học rất phức tạp và tốn kém, vitamin B12 thương mại chỉ được sản xuất thông qua quá trình lên men sinh tổng hợp từ vi sinh vật Trong tự nhiên có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp vitamin B12 như

Pseudomonas denitrificans, Salmonella typhimurium, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium shermanii, Bacillus megaterium, Rhodopseudomonas protamicus, Rhizobium cobalaminogenum, và Streptomyces olivaceus Hầu hết các vi sinh vật sản xuất vitamin B12 trong điều kiện kỵ khí, trong khi

P denitrificans tạo ra vitamin B12 trong điều kiện hiếu khí Năng suất lên men sản xuất

vitamin B12 của P.denitrificans cao hơn so với các vi sinh vật lên men kỵ khí, có thể

đạt tới 300 mg/l [28]

Pseudomonas denitrificans sinh tổng hợp adenosylcobalamin theo cả hai con đường

tổng hợp mới (de novo) và tổng hợp nối tiếp (salvage) Tổng hợp nối tiếp cần cung cấp

cobinamid từ bên ngoài thông qua các hệ thống vận chuyển liên kết ATP (ABC), bao gồm BtuC, BtuD và BtuF [5]

Pseudomonas denitrificans chủ yếu tổng hợp vitamin B12 hiếu khí qua con đường

tổng hợp mới (hình 1.1) Tiền chất để sinh tổng hợp vitamin B12 là δ-aminolevulinic acid (ALA) ALA được tổng hợp bởi con đường C4 hoặc C5 Hai phân tử ALA được ngưng tụ để tạo monopyrrol porphobilinogen và bốn phân tử này sau đó được trùng hợp

và đóng vòng để tạo uroporphyrinogen III Tiếp đó, Uroporphyrinogen III được methyl hóa ở vị trí C-2 và C-7 bởi enzym CobA để tạo ra precorrin-2 (là một tiền chất chính của cobalamin) Tám phản ứng methyl hóa tiếp theo tạo ra Adenosyl cobyrinic acid a, c-diamide Chất này nhờ bốn phản ứng amid hóa các nhóm carboxyl ở các vị trí b, d, e

và g để tạo ra acid adenosylcobyric Sau đó, (R)-1-amino-2-propanol được gắn trực tiếp vào vòng corrinoid của acid adenosylcobyric thông qua protein α và được phosphoryl

hóa bởi CobP Hai phản ứng tiếp theo chuyển các phối tử trục dưới vào AdoCbi-GDP

và tạo ra adenosylcobalamin (AdoCbl) [5]

Pseudomonas Denitrificans có ba hợp chất bao gồm cobalamin, heme và

bacteriochlorophyll đều có chung con đường sinh tổng hợp từ ALA đến Uroporphyrinogen III Ba hợp chất này có mối quan hệ cạnh tranh, tương tác và phụ thuộc lẫn nhau Mối quan hệ phức tạp giữa các hợp chất này là kết quả của quá trình tiến hóa tự nhiên và có ảnh hưởng quan trọng đến sự sinh tổng hợp vitamin B12 của vi sinh vật [5]

Hình 1.1: Các con đường sinh tổng hợp Adenosylcobalamin của Pseudomonas

denitrificans [5]

1.2 Mô hình hóa quá trình trao đổi chất

1.2.1 Nguyên lý quá trình trao đổi chất

1.2.1.1 Quá trình trao đổi chất

Trao đổi chất là tập hợp tất cả các phản ứng enzym cần cho sự tăng trưởng, phát triển

và phân chia tế bào Các phản ứng hóa học của sự trao đổi chất được biểu diễn thành các con đường trao đổi chất, trong đó một chất được biến đổi thông qua hàng loạt các bước thành các chất khác, bởi một chuỗi các enzym Enzym hoạt động như là chất xúc tác cho phép các phản ứng tiến hành nhanh hơn Enzym cũng cho phép điều chỉnh các con đường trao đổi chất để đáp ứng với những thay đổi trong môi trường của tế bào hoặc tín hiệu từ các tế bào khác [11] Trong cơ sở dữ liệu như BRENDA [21], METACYC [3] hoặc KEGG [9], các enzym được xác định bởi mã EC, một mã cụ thể đề cập đến một loại enzyme hoặc một nhóm enzym có chức năng cụ thể

1.2.1.2 Con đường trao đổi chất

Mỗi con đường trao đổi chất là một mạng lưới của toàn bộ quá trình trao đổi chất, kết nối một nhóm các chất chuyển hóa với các chất chuyển hóa khác thông qua các phản ứng Trong một con đường trao đổi chất, sản phẩm của một phản ứng trở thành chất tham gia phản ứng cho phản ứng tiếp theo Hướng của các con đường trao đổi chất

thường được coi là một chiều [11]

Các con đường trao đổi chất trung tâm là những con đường liên quan đến các chất dinh dưỡng quan trọng cốt lõi như carbohydrat, acid béo và acid amin Một số con đường trung tâm như là: đường phân, chu trình citrat, con đường pentose phosphat và chu trình Calvin Các con đường trao đổi chất trung tâm thường được chấp nhận là gần như giống nhau trong tất cả các sinh vật [11]

1.2.1.3 Năng lượng cần thiết cho các con đường trao đổi chất hoạt động

Quá trình trao đổi chất và các phản ứng vận chuyển yêu cầu năng lượng Năng lượng này được tạo ra thông qua quá trình dị hóa, khi các chất dinh dưỡng bị phá vỡ tạo ra NADH và ATP [11]

NADH là chất mang điện tử Các electron năng lượng cao từ NADH được truyền dọc theo chuỗi vận chuyển điện tử trong màng trong của ty thể, khi đó năng lượng được giải

phóng và được sử dụng để phosphoryl oxy hóa ADP thành ATP, điều khiển quá trình tạo ATP và tiêu thụ oxy phân tử (O2) Phần lớn năng lượng được giải phóng bởi quá trình phosphoryl oxy hóa được sử dụng để tạo ra hầu hết ATP của tế bào [2]

ATP là một phân tử mang năng lượng được hình thành theo từng bước, có thể được tạo ra bởi quá trình quang hợp, sự phosphoryl oxy hóa được thực hiện bởi ty thể, hoặc bởi sự phosphoryl hóa các chất môi trường ATP có thể cung cấp năng lượng cho các quá trình tế bào bằng cách chuyển một nhóm phosphat sang một phân tử khác (quá trình này gọi là phosphoryl hóa) Sự chuyển đổi này được thực hiện bởi các enzym đặc biệt, kết hợp lấy năng lượng giải phóng từ ATP cho các hoạt động của tế bào cần năng lượng [11]

Các tế bào liên tục phá vỡ ATP để lấy năng lượng, ATP cũng liên tục được tổng hợp

từ ADP và phosphat thông qua các quá trình hô hấp tế bào Hầu hết ATP trong các tế bào được sản xuất bởi ATP synthase, giúp chuyển đổi ADP và phosphat thành ATP Các vi sinh vật thu năng lượng thông qua quá trình lên men sẽ có mức năng lượng thấp hơn so với các sinh vật thực hiện hô hấp hoặc quang hợp, vì ATP chỉ có thể được tạo ra thông qua quá trình phosphoryl hóa ở mức cơ chất [11]

1.2.2 Biểu diễn quá trình trao đổi chất dưới dạng mô hình toán học

Mô hình trao đổi chất có thể chuyển thành một mô hình toán học mà thành phần chính

là ma trận cân bằng hóa học (ma trận S) (Hình 1.2) [20]

Trong ma trận cân bằng hóa học, mỗi hàng tương ứng với một chất chuyển hóa duy nhất, mỗi cột tương ứng với một phản ứng cụ thể diễn ra trong hệ thống Ở trạng thái ổn định,

tỉ lệ thay đổi nồng độ chất chuyển hóa là bằng 0 trong tất cả các phản ứng, có nghĩa là, tất cả các chất chuyển hóa được tiêu thụ với cùng tốc độ mà chúng được tạo ra Do đó,

ma trận cân bằng hóa học trình bày một hệ phương trình tuyến tính, mô tả mọi thông lượng phản ứng của hệ thống Nồng độ của mỗi chất chuyển hóa sau đó sẽ ở trạng thái

ổn định được mô tả bởi một phương trình tuyến tính, thay cho phương trình vi phân trước khi đạt được trạng thái ổn định Ví dụ, đối với chất chuyển hóa B ở hàng thứ tư

trong hình 2, phương trình tuyến tính mô tả nồng độ chất chuyển hóa ở trạng thái ổn

định sẽ là:

𝑣𝑅3 + 𝑣𝑅5 – 𝑣𝑅6 – 𝑣𝑅7 = 0

Hình 1.2:Ma trận cân bằng hóa học

Ma trận trên bao gồm 14 chất chuyển hóa, 13 phản ứng nội bào, 7 phản ứng trao đổi, 1 phản ứng tạo biomass Các số 0, 1, -1,… là hệ số cân bằng hóa học của các chất chuyển hóa, dấu (-) thể hiện là các chất tham gia phản ứng, dấu (+) thể hiện là các chất tạo thành sau phản ứng [20]

Hệ phương trình tuyến tính của hệ thống trong hình 1.2 sẽ là [20]:

1.2.3 Sử dụng COBRA để xây dựng mô hình trao đổi chất

1.2.3.1 Constraint-based modeling (CBM)

Constraint-based modeling (tạm dịch là “Mô hình hóa dựa vào các giới hạn”) là

phương pháp mô hình hóa các hệ thống nói chung đã và đang được sử dụng trong hơn

30 năm Đặc điểm chính của Constraint-based modeling là các đối tượng trong hệ thống

không có một giá trị duy nhất mà nằm trong khoảng giá trị đã được xác định trước gọi

là các giới hạn Constraint-based modeling được sử dụng rộng rãi trong mô phỏng các

hệ thống sinh học

Nghiên cứu của Fell, D.A and Small J.R là một trong số những công bố đầu tiên sử dung CMB để tổng hợp acid béo từ glucose vào năm 1986 [6] Vào năm 1989, R.A Majewski and M.M.Domach là các nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu sản xuất acetat ở E.coli bằng CBMs [14] Năm 2009, một mô hình trao đổi chất quy mô hệ gen mới của

Bacillus subtilis được giới thiệu Mô hình này dựa trên chú thích bộ gen B.subtilis 168

được tạo ra bởi SEED, một trong số những chú thích gen chính xác và cập nhật nhất của

B.subtilis 168 sẵn có với 1103 gen và 1437 phản ứng [8] Năm 2014, Elena Vinay-Lara

và các đồng nghiệp đã xây dựng lại mô hình trao đổi chất quy mô hệ gen để so sánh sự

khác biệt về trao đổi chất giữa hai chủng Lactobacillus casei (ATCC 334 và 12A) [27]

Trong đầu năm 2016, Levering, J và cộng sự [12] đã xây dựng một mô hình mới cho

Streptococcus pyogenes M49 với 480 gen liên quan đến 576 phản ứng và 558 chất

chuyển hóa

1.2.3.2 COBRA

COBRA (Constraint-based reconstruction and analysis) là công cụ tin học do Thiele

và cộng sự phát triển, dùng để xây dựng và phân tích mô hình trao đổi chất của sinh vật

theo phương pháp Constraint-based modeling [24].

Quá trình xây dựng mô hình và phân tích mô hình trao đổi chất được tiến hành theo các giai đoạn chính như sau (hình 1.3):

- Dự đoán các sản phẩm được mã hóa (protein, ARN) trên trình tự bộ gen của sinh vật

- Từ các sản phẩm dự kiến, kết hợp với các cơ sở dữ liệu thực nghiệm để xác định các phản ứng trao đổi chất có ở sinh vật

- Các phản ứng được tập hợp lại thành mạng lưới trao đổi chất, được biểu thị dưới dạng

ma trận toán học

- Thiết lập các giới hạn về không gian hoạt động và giá trị của ma trận trao đổi chất

- Phân tích các trạng thái hoạt động của mô hình, điều chỉnh các sai sót nếu có

- Sử dụng mô hình hoàn thiện để phân tích các hoạt động trao đổi chất của sinh vật Với các công cụ tin học sẵn có, việc xây dựng mô hình trao đổi chất bắt nguồn từ genom của sinh vật có thể được thực hiện một cách tự động Tuy nhiên mô hình ban đầu thường chưa có đủ độ tin cậy do gặp phải một số khó khăn nhất định Các khó khăn chính bao gồm: xác định sai sản phẩm mã hóa của gen dẫn đến các phản ứng không tồn tại ở sinh vật, không xác định được các sản phẩm mã hóa của gen dẫn đến thiếu các phản ứng trao đổi chất, cơ sở dữ liệu tham khảo không chính xác dẫn đến sai thông tin phản ứng Các khó khăn trên dẫn đến việc chỉnh sửa mô hình đòi hỏi rất nhiều thời gian và công sức Để xây dựng được một mô hình hoàn chỉnh có thể mất từ nhiều tháng đến nhiều năm tùy vào số lượng phản ứng [24]

Hình 1.3:Các giai đoạn chính của quá trình xây dựng mô hình trao đổi chất bằng phương

pháp Constraint-based modeling [17]

1.2.4 Phân tích cân bằng thông lượng của mô hình trao đổi chất

Thông lượng trao đổi chất (gọi tắt là thông lượng) là tốc độ chuyển hóa các chất trong phản ứng Phân tích cân bằng thông lượng (FBA-Flux Balance Analysis) là phương pháp được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu mô hình trao đổi chất sinh vật FBA tính toán thông lượng chuyển hóa các chất trong toàn bộ mạng lưới trao đổi chất, từ đó xác định được trạng thái cân bằng của mô hình trong điều kiện cho trước như tạo sinh khối, sinh tổng hợp một sản phẩm trao đổi chất, hoạt động trong sự có mặt của một số hợp chất, v.v… (hình 1.4) [16]

Hình 1.4:Quá trình phân tích cân bằng thông lượng

Mô hình trao đổi chất (a) được biểu diễn dưới dạng ma trận S (b) Các phản ứng trong

mô hình có sự ràng buộc lẫn nhau và có giới hạn thông lượng riêng Các ràng buộc và giới hạn này sẽ tính được giá trị cân bằng tối ưu của mô hình với điều kiện cho trước (c)

Phân tích cân bằng thông lượng tồn tại một số hạn chế như: không có tham số động học (nồng độ enzym, …), chỉ áp dụng với giả thiết hệ thống ở trạng thái cân bằng, v.v [20] Mặc dù còn một số hạn chế nhưng phân tích cân bằng vẫn được áp dụng rộng rãi

và đã được kiểm chứng trong thực nghiệm về giá trị dự đoán [4]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

Dữ liệu sử dụng để xây dựng mô hình Pseudomonas defnitrificans được lấy từ cơ sở

dữ liệu Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) tại địa chỉ:

và chất trao đổi

- KEGG_RXN: chứa thông tin chi tiết của tất

cả các phản ứng có trong KEGG_PD

- KEGG_MET: chứa thông tin chi tiết của tất

Mô hình cuối

2.2.2 Đánh giá độ tin cậy của mô hình

Thứ nhất là khả năng tạo sinh khối trong điều kiện có và không có oxy Chúng tôi

tiến hành cung cấp cho mô hình một số thành phần môi trường tương tự thực nghiệm, sau đó so sánh thông lượng tạo sinh khối trong điều kiện có và không có oxy của mô hình, rồi so sánh thông lượng này với kết quả của hai mô hình đã được công bố là

Pseudomonas puttida KT2440 (iJN746) và E coli W (iECW_1372) Tiếp đó, chúng tôi

khảo sát thông lượng các phản ứng kết thúc chuỗi phosphoryl oxy hóa trong điều kiện

có và không có oxy, so sánh với thực nghiệm Từ đó khảo sát thông lượng tạo sinh khối trong điều kiện không có oxy và hô hấp nitrat của mô hình

Thứ hai là khả năng tạo sinh khối từ các nguồn carbon khác nhau Chúng tôi tiến hành khảo sát và so sánh với thực nghiệm khả năng tạo sinh khối của mô hình từ 3 nguồn carbon: sucrose, maltose, glucose

Thứ ba là khả năng sinh tổng hợp vitamin B12 từ các nguồn carbon khác nhau Tương

tự trên, chúng tôi tiến hành khảo sát và so sánh với thực nghiệm khả năng sinh tổng hợp vitamin B12 của mô hình từ 3 nguồn carbon: sucrose, maltose, glucose

Cuối cùng, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của glutamat và cobinamid đến thông lượng tạo sinh khối và vitamin B12 của mô hình

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu

2.3.1.1 Cơ sở dữ liệu KEGG_PD

Các dữ liệu trao đổi chất của Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 trong KEGG

được tổ chức dưới dạng các tệp tin ở định dạng xml Mỗi tệp tin chứa thông tin của một

con đường trao đổi chất Dữ liệu trong các tệp tin KEGG được chiết xuất và chuyển

sang định dạng dictionary với tên gọi KEGG_PD bằng ngôn ngữ lập trình Python 3.6 Cấu trúc của dictionary như sau:

KEGG_PD[‘Con đường trao đổi chất 1’] = {‘Phản ứng 1’:{‘Chất tham gia’: [],

‘Chất tạo thành’: [],

‘Gen’: [],

‘Loại phản ứng’: ‘ ’,}

‘Phản ứng 2’: {…},

…,}

KEGG_PD[‘Con đường trao đổi chất 2’] = { }

2.3.1.2 Cơ sở dữ liệu KEGG_RXN và KEGG_MET

Sau khi xây dựng KEGG_PD, toàn bộ tên của các phản ứng và chất trao đổi có trong KEGG_PD được tập hợp vào danh sách tương ứng gọi là RXN và MET Thông tin của từng phản ứng và chất trao đổi trong hai danh sách RXN và MET sẽ được lấy từ cơ sở

dữ liệu KEGG và lưu vào hai dictionary với tên gọi là KEGG_RXN và KEGG_MET Cấu trúc của hai dictionary như sau:

Mô hình trao đổi chất của Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 được xây dựng

bằng công cụ COBRApy của Python (https://opencobra.github.io/cobrapy/) COBRApy

là công cụ xây dựng mô hình theo phương pháp do Thiele và cộng sự đề xuất [24] Các

thông số về chất và phản ứng để xây dựng mô hình được lấy từ các cơ sở dữ liệu KEGG_PD, KEGG_RXN, KEGG_MET Mô hình trao đổi chất được xây dựng qua ba

bước: tạo chất trao đổi, tạo phản ứng, tạo mô hình

2.3.2.1 Tạo chất trao đổi

Các chất trao đổi được định nghĩa bằng câu lệnh:

3-oxotetradecanoyl-acyl-# Khởi động công cụ COBRA

from cobra import Model, Reaction, Metabolite

# Tạo định nghĩa cho acyl-carrier-protein

reaction.lower_bound = 0 # Giới hạn thông lượng dưới (mặc định)

reaction.upper_bound = 1000 # Giới hạn thông lượng trên (mặc định)

reaction.gene_reaction_rule = 'Các gen tham gia'

reaction1.name = '3 oxoacyl acyl carrier protein synthase n C140 '

reaction1.subsystem = 'Cell Envelope Biosynthesis'

Ví dụ, để tạo mô hình chứa các chất và phản ứng đã tạo ở trên, các câu lệnh được viết như sau:

Model = Model(‘Test’)

model.add_reactions([reaction1])

2.3.3 Phân tích thông lượng của mô hình

Để phân tích thông lượng của mô hình, các bước được thực hiện như sau:

# Xác định phản ứng (ví dụ, tên là ‘reaction1’) để thực hiện tối ưu thông lượng

# Kết quả: “In fluxes”, các chất vào; “Out fluxes”, các chất ra; “Objectives”, phản ứng tối ưu

IN FLUXES OUT FLUXES OBJECTIVES

Để biết thông lượng của các phản ứng liên quan đến một chất cụ thể, câu lệnh và kết quả được trình bày như sau:

# Kiểm tra thông tin của chất

2.3.4 Mô phỏng hoạt động của mô hình trong các điều kiện môi trường khác nhau

Trong các mô hình được xây dựng bằng công cụ COBRA, quá trình trao đổi các chất giữa mô hình và môi trường bên ngoài được biểu hiện dưới dạng các phản ứng trao đổi Việc thay đổi thông lượng của các phản ứng này sẽ cho phép giới hạn việc trao đổi chất giữa mô hình và môi trường ở một số chất nhất định Ví dụ các bước thiết lập để mô hình hoạt động trong điều kiện không có O2 được thực hiện như sau:

# Liệt kê danh mục các phản ứng trao đổi của mô hình

model.medium