Mô phỏng trên máy tính và khảo sát mạng lưới trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus subtilis natto

[5] Để góp phần tạo nên một công cụ nghiên cứu và từ đó ứng dụng trong sản xuất, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài nghiên cứu: “Mô phỏng trên máy tính và khảo sát mạng lưới trao đổi

BACILLUS SUBTILIS NATTO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BACILLUS SUBTILIS NATTO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Lời cảm ơn

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này trước hết em xin gửi lời cảm

ơn tới các thầy cô của trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô

ở trong bộ môn Vi sinh và Sinh học đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho em để

hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với

thầy Đỗ Ngọc Quang Thầy chính là người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và

tạo cho em mọi điều kiện tốt nhất để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Sự

nhiệt huyết, lòng đam mê và sự yêu nghề của thầy chính là nguồn động lực

để em phấn đấu hơn nữa để làm việc và cống hiến

Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn

bè đã luôn đồng hành bên em những lúc khó khăn, bận rộn để em hoàn thành

khoá luận tốt nghiệp này

Trong quá trình tham gia khóa luận tốt nghiệp ở bộ môn khó tránh

khỏi sai sót, em rất mong các thầy, cô bỏ qua Đồng thời do trình độ còn hạn

chế nên bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp không thể tránh khỏi những thiếu

sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy, cô để em có thể hoàn

thành tốt hơn bài báo cáo tốt nghiệp này

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Thị Duyên

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về Bacillus subtilis natto 2

1.1.1 Đặc điểm sinh học 2

1.1.2 Ứng dụng 3

1.1.2.1 Acid Poly-γ-Glutamic (γ-PGA) 3

1.1.2.2 Nattokinase 5

1.1.2.3 Acid Dipicolinic (DPA, acid 2,6-pyridinedicarboxylic) 6

1.2 Mô hình hóa quá trình trao đổi chất trên máy tính 7

1.2.1 Nguyên lý trao đổi chất 7

1.2.1.1 Sự chuyển hóa 7

1.2.1.2 Con đường chuyển hóa 8

1.2.1.3 Các dạng năng lượng để vận hành quá trình trao đổi chất 8

1.2.2 Phương pháp Constraint-Based Modeling 10

1.2.2.1 Giới thiệu về Constraint-Based Modeling 10

1.2.2.2 Đặc điểm của Constraint-Based Modeling 11

1.2.2.3 Biểu diễn quá trình trao đổi chất dưới dạng mô hình toán học 12

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Vật liệu 17

2.2 Nội dung 17

2.2.1 Xây dựng mô hình 17

2.2.2 Đánh giá độ tin cậy và khảo sát một số đặc điểm của mô hình 18

2.2.2.1 Khả năng tạo sinh khối của mô hình trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí 18

2.2.2.2 Khả năng sinh tổng hợp L-glutamat của mô hình từ các nguồn carbon khác nhau 18

2.2.2.3 Khảo sát thông lượng của quá trình sinh tổng hợp L-glutamat từ maltose và sucrose 18

2.3 Phương pháp 18

2.3.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu 18

2.3.1.1 Cơ sở dữ liệu KEGG_ BS 18

2.3.1.2 Cơ sở dữ liệu KEGG_RXN và KEGG_MET 19

2.3.2 Xây dựng mô hình 19

2.3.2.1 Tạo chất trao đổi 19

2.3.2.1 Tạo phản ứng 21

2.3.2.1 Tạo mô hình 22

2.3.3 Phân tích thông lượng của mô hình 22

2.3.4 Mô phỏng hoạt động của mô hình trong các điều kiện môi trường khác nhau 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Xây dựng mô hình 25

3.1.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu 25

3.1.2 Xây dựng mô hình sơ bộ 26

3.1.3.1 Bổ sung phản ứng thiếu 28

3.1.3.2 Điều chỉnh chiều phản ứng 29

3.1.3.3 Tạo phản ứng trao đổi với môi trường 30

3.1.3.4 Tạo chuỗi phản ứng hô hấp sinh ATP 31

3.1.3.5 Tạo phản ứng tạo sinh khối 32

3.2 Đánh giá độ tin cậy và khảo sát một số đặc điểm của mô hình 32

3.2.1 Khả năng tạo sinh khối của mô hình trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí 32

3.2.2 Khả năng sinh tổng hợp L-glutamat của mô hình từ các nguồn carbon khác nhau 34

3.2.3 Khảo sát thông lượng của quá trình sinh tổng hợp L-glutamat từ maltose và sucrose 35

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

4.1 Kết luận 37

4.2 Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục 1

Phụ lục 2

Phụ lục 3

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TCA Tricarboxylic acid cycle Chu trình Acid tricarboxylic

tPA Tissue Plasminogen Activator Chất kích hoạt plasminogen mô DPA

2,6-pyridinedicarboxylic acid Acid dipicolinic (acid

2,6-pyridinedicarboxylic)

NAD+ Nicotinamide adenine

KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and

Genomes

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

CBM Mô hình Constrant-Based Mô hình Constrant-Based

COBRA COnstraint-Based Reconstruction

and Analysis

COnstraint-Based Reconstruction and Analysis

COBRApy COnstraint-Based Reconstruction

and Analysis for Python

COnstraint-Based Reconstruction and Analysis cho Python

FBA Flux Balance Analysis Flux Balance Analysis

BIGG BIochemical, Genetic and

Genomic

BIochemical, Genetic and Genomic

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Ví dụ thông tin dưới dạng mã hóa của chuỗi đường phân bso00010, gen BSNT_10368, phản ứng R01070 25

Bảng 3.2 Thành phần tế bào của B subtilis từ nuôi cấy liên tục trong điều kiện hiếu khí

và cung cấp thêm glucose 32Bảng 3.3 Thành phần các môi trường thử nghiệm 33Bảng 3.4 Kết quả thông lượng tạo L-glutamat của mô hình BS195 và hiệu suất sinh tổng hợp -PGA trong thực nghiệm 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ tổng hợp γ-PGA theo con đường nối tiếp 5

Hình 1.2 Quá trình phát triển các mô hình cân bằng hóa học quy mô bộ gen của các sinh vật khác nhau (trước năm 2008) 11

Hình 1.3 Xây dựng ma trận cân bằng hóa học cho một mô hình mạng chuyển hóa mô hình 13

Hình 1.4 Hệ phương trình tuyến tính của toàn bộ ma trận S mô tả nồng độ chất chuyển hóa ở trạng thái ổn định 13

Hình 1.5 Các bước thực hiện FBA 15

Hình1 6 Một số ứng dụng của FBA 16

Hình 2.1 Các bước xây dựng mô hình trao đổi chất của sinh vật 17

Hình 3.1 Ví dụ về một phần mạng trao đổi chất của B subtilis natto BEST195 dưới dạng ma trận 27

Hình 3.2 Con đường chuyển hóa Histidine của B subtilis natto BEST 195 27

Hình 3.3 Con đường sinh tổng hợp valin, leucin và isoleucin của B subtilis natto BEST195 [12] 29

Hình 3.4 Chiều của phản ứng khác nhau giữa các cơ sở dữ liệu 30

Hình 3.5 Chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa của B subtilis natto BEST195 31

Hình 3.6 Kết quả thông lượng tạo sinh khối của mô hình BS195 trong điều kiện hiếu khí (A) và kỵ khí (B) 34

Hình 3.7 Kết quả sản phẩm L-glutamat trong các môi trường 35

Hình 3.8 Con đường tổng hợp L-glutamat từ maltose của B subtilis natto 36

Hình 3.9 Con đường tổng hợp L-glutamat từ sucrose của B subtilis natto 36

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bacillus subtilis là sinh vật được nghiên cứu rộng rãi và trong sản xuất được coi là

vi khuẩn có đặc tính tốt thứ hai chỉ sau Escherichia coli [14] B subtilis được lựa chọn để

sản xuất một số sản phẩm công nghiệp quan trọng, bao gồm enzym, nucleosid, vitamin,

kháng sinh… Bacillus subtilis natto BEST195 là một vi khuẩn điển hình của loài Bacillus

subtilis có khả năng tổng hợp được nhiều sản phẩm có tính ứng dụng cao: nattokinase trong

điều trị các bệnh tim mạch, huyết khối [4] [19]; acid dipicolinic có tác dụng kháng khuẩn[27] [30] [32]; acid polygamaglutamic ứng dụng trong phẫu thuật, nghiên cứu khoa học [10] [20] [24] [35]

Trao đổi chất là một mạng lưới phức tạp của các phản ứng với nhiều yếu tố phụ thuộc lẫn nhau Mô hình hóa là một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu quá trình trao đổi chất của sinh vật, giúp thu ngắn thời gian và chi phí cho các nghiên cứu thực nghiệm Các nghiên cứu mô hình hóa trao đổi chất đã được tiến hành hơn 30 năm với hơn 50 mô hình trao đổi chất của sinh vật đã được công bố [28] Hiện nay, dữ liệu về các đặc điểm sinh học của sinh vật như gen, các con đường trao đổi chất, … ngày một đa dạng Các cơ sử dữ liệu này cùng với sự phá triển của các công cụ tin học đã giúp cho việc mô hình hóa trao đổi chất được thực hiện nhanh chóng với độ tin cậy cao hơn [5]

Để góp phần tạo nên một công cụ nghiên cứu và từ đó ứng dụng trong sản xuất, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài nghiên cứu: “Mô phỏng trên máy tính và khảo sát

mạng lưới trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus subtilis natto.” với hai mục tiêu:

- Bước đầu xây dựng được mô hình trao đổi chất của Bacillus subtilis natto BEST195

trên máy tính

-Sử dụng mô hình này để khảo sát một số đặc điểm trao đổi chất liên quan đến sinh tổng hợp L-glutamat

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về Bacillus subtilis natto

1.1.1 Đặc điểm sinh học

Bacillus subtilis là một loại trực khuẩn gram dương Các tế bào B subtilis thường

dài khoảng 4-10 mcm và đường kính 0,25 mcm, với thể tích tế bào khoảng 4,6 fL ở pha tĩnh [26] Giống như các thành viên khác của chi, nó có thể hình thành bào tử, để tồn tại

trong điều kiện môi trường khắc nghiệt nhiệt độ và độ ẩm cao Trước năm 1998, B subtilis

được coi là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, sau đó đã có bằng chứng nó là một loài kỵ khí tùy

tiện [18] B subtilis được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, đặc

biệt là bào tử, là một ví dụ đơn giản về sự biệt hóa tế bào [31]

B subtilis thường được tìm thấy ở các lớp trên của đất (khoảng 106 bào tử mỗi gram),

trên rễ cây và cũng có trong hệ tiêu hóa của con người, động vật (khoảng 104 bào tử mỗi

gram phân người) Có bằng chứng cho thấy thông qua sự cộng sinh này B subtilis có thể

thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật [16] Có thể giải thích cho việc thúc đẩy tăng trưởng này

là: (i) B subtilis cạnh tranh với các vi khuẩn khác ảnh hưởng xấu đến cây trồng, (ii) B

subtilis kích hoạt hệ thống phòng thủ của vật chủ để cây sẵn sàng chống lại mầm bệnh tiềm

tàng và, (iii) B subtilis sinh ra một số chất dinh dưỡng cần thiết cho cây (ví dụ phốt pho và

nitơ) [16]

B subtilis có thể phân chia đối xứng để tạo ra hai tế bào con (phân hạch nhị phân)

hoặc không đối xứng, tạo ra một bào tử duy nhất có thể tồn tại trong nhiều thập kỷ và chịu được các điều kiện môi trường bất lợi như hạn hán, nhiễm mặn, pH cao, bức xạ Các bào

tử được hình thành tại thời điểm bất lợi về dinh dưỡng và thông qua việc sử dụng sản phẩm thủy phân, cho phép vi khuẩn tồn tại trong môi trường cho đến khi điều kiện trở nên thuận lợi Trước quá trình sinh bào tử, các tế bào có thể trở nên linh hoạt nhờ các roi mọc ra trên

bề mặt, lấy DNA từ môi trường hoặc sản xuất kháng sinh Những phản ứng này được xem

là nỗ lực tìm kiếm chất dinh dưỡng bằng cách tìm kiếm một môi trường thuận lợi hơn, cho phép tế bào sử dụng vật liệu di truyền có lợi mới hoặc đơn giản bằng cách tiêu diệt cạnh tranh

3

B subtilis natto BEST195 có liên quan chặt chẽ với chủng vi khuẩn phòng thí

nghiệm B subtilis Marburg 168, là bộ gen được giải trình tự đầu tiên của B subtilis natto

Bộ gen B subtilis natto BEST195 được giải trình tự đến trạng thái gần hoàn thành bằng

phương pháp lắp ráp bộ gen so sánh, trong đó kết hợp lắp ráp de novo, lắp ráp tham chiếu

và thí nghiệm phản ứng chuỗi polymerase Tuy nhiên, bộ gen BEST195 bao gồm một số vùng không hoàn chỉnh Sau đó, bằng việc sử dụng một số bộ giải mã với chất lượng đọc cao, Kamada đã giải mã hoàn thiện bộ gen BEST195 [17] Vì vậy, để xây dựng mô hình

mạng lưới trao đổi chất của B subtilis natto, chúng tôi sẽ dựa vào cơ sở dữ liệu có sẵn của

B subtilis natto BEST195 bao gồm bộ gen, các con đường trao đổi chất, các phản ứng, các

chất chuyển hóa

1.1.2 Ứng dụng

Bacillus subtilis natto đã được sử dụng từ lâu để lên men đậu nành thành một món

ăn - đậu nành lên men Món ăn này có mặt tại nhiều quốc gia dưới những tên khác nhau: natto - Nhật Bản hay Cheonggukjang - Hàn Quốc Các nhà khoa học đã tách từ đậu nành lên men được rất nhiều hợp chất có tính ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực nattokinase [4] [19]; acid dipicolinic [27] [30] [32]; acid polygamaglutamic [10] [20] [24] [35] Một số ứng dụng quan trọng được sẽ đề cập dưới đây

1.1.2.1 Acid Poly-γ-Glutamic (γ-PGA)

γ-PGA đã được biết đến là thành phần chính trong chất nhầy của Natto - một loại thực phẩm tại Nhật Bản Natto, đã được sử dụng hơn một ngàn năm, được sản xuất bằng

cách hấp đậu nành và lên men với Bacillus subtilis natto [17]

γ-PGA có thể được dùng làm chất mang vì tính tương thích sinh học và khả năng phân hủy sinh học Nó có các nhóm carboxyl cung cấp các vị trí gắn của tác nhân hóa trị liệu, do đó làm cho thuốc hòa tan tốt hơn và dễ dàng kiểm soát hơn Phức hợp thuốc - PGA

có thể xâm nhập vào các khối u và giải phóng thuốc theo thời gian dưới dạng phân hủy sinh học polyme Sản phẩm phân hủy của nó, acid glutamic, có thể đi vào quá trình chuyển hóa

tế bào bình thường và không đào thải qua thận [34] Một loạt các chất chống ung thư đã được liên kết với γ-PGA và các phức hợp đã được thử nghiệm Liên hợp PGA-paclitaxel

(PG-TXL) được tạo ra bằng liên kết cộng hóa trị của paclitaxel tự nhiên với PGA Phức hợp này đã giải quyết được các vấn đề quan trọng khi điều trị bằng paclitaxel tự do: độ hòa tan thấp, độc toàn thân do nồng độ thuốc tự do trong huyết tương quá cao, kém chọn lọc với khối u Trong khi đó, PG-TXL tan trong nước, tập trung trong khối u và giải phóng dần dần dẫn tới tăng thời gian đào thải của paclitaxel ra khỏi cơ thể và giảm nồng độ paclitaxel

tự do trong huyết tương giúp giảm khả năng phơi nhiễm của cơ thể đối với paclitaxel [34]

γ-PGAliên kết với gelatin được biết đến có thể thay thế chất kết dính trong phẫu thuật hiện đang được sử dụng là fibrin Chất kết dính sinh học đã được sử dụng để bám dính mô, cầm máu và giữ không khí và chất lỏng cơ thể không bị rò rỉ trong phẫu thuật Keo hydrogel từ gelatin và PGA đã được nghiên cứu và cho thấy có khả năng hóa rắn nhanh như keo fibrin, bám dính tốt hơn và có hiệu quả hơn trong việc niêm phong rò rỉ không khí phổi so với keo fibrin [35]

Bên cạnh đó, γ-PGA còn được ứng dụng trong quá trình đông khô các mẫu vi sinh vật dùng để nghiên cứu γ-PGA là polyme có trọng lượng phân tử nhỏ, có hoạt tính chống đông cao hơn polymer có trọng lượng phân tử lớn, do đó, γ-PGA làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn trong quá trình sấy khô Kết quả nghiên cứu trên một số vi khuẩn,

Lactobacillus paracasei được bảo vệ trong γ-PGA 10% tốt hơn đáng kể so với sucrose

10%, trong khi đó γ-PGA cho thấy hoạt động bảo vệ lạnh tương đương với sucrose khi nó

được sử dụng để bảo vệ Bifidobacterium breve và Bifidobacterium longum [24] Việc ứng

dụng γ-PGA trong bảo quản các chế phẩm vi khuẩn sinh học là cần thiết giữa các giai đoạn

của sản xuất thực phẩm và dược phẩm B subtilis natto đã được nghiên cứu và chứng minh

có thể sản xuất γ-PGA và không sinh ra độc tố cũng như không có dấu hiệu gây tan máu

của lecithinase [24] Do đó, sử dụng B subtilis natto để sản xuất γ-PGA là một ứng dụng

đang được quan tâm trong thời gian sắp tới

Sự tổng hợp γ-PGA là quá trình được xúc tác bởi enzym gồm hai bước ở vi khuẩn: bước đầu tiên là tổng hợp acid D và L-glutamic và bước thứ hai, các đơn vị acid D và L-glutamic trùng hợp tạo γ-PGA [10] 2-Oxoglutarat là tiền chất trực tiếp của L-glutamat, được cung cấp từ con đường đường phân và chu trình TCA (Hình 1) Hầu hết acid L-glutamic trước tiên được chuyển thành acid D-Glutamic và sau đó cả acid L- và D-glutamic

5

được đồng trùng hợp thành sản phẩm cuối cùng acid γ-Poly-Glutamic γ-PGA được sản

xuất bởi B subtilis gồm 50-70% acid D-glutamic và 30-50% acid L-glutamic [20]

Quá trình tổng hợp γ-PGA từ L-glutamate là một phản ứng nhiều bước, cụ thể như sau [20]:

Acid L- glutamic + ATP → -L- Glutamyl-AMP +Ppi (1)

-L-Glutamyl-AMP + SH-enzym → -X- Glutamyl-S-enzym + AMP (2)

-X-Glutamyl-S-enzym → -D- Glutamyl-S enzym (3)

-D- Glutamyl-S-enzym + [-D- Glutamyl]n → [-D- Glutamyl] n+1 + SH-enzym (4)

1.1.2.2 Nattokinase

Nattokinase được bác sỹ Hyroyuki Sumi phát hiện vào năm 1980 tại Nhật Bản khi cho natto vào cục máu đông trong đĩa thí nghiệm ở điều kiện nhiệt độ tương đương nhiệt

độ cơ thể Về nguồn gốc, hạt đậu nành được ủ ấm với B subtilis natto, khi lên men sẽ tạo

ra nattokinase Nattokinase thu hút sự quan tâm trong điều trị các bệnh gây ra do huyết khối

do hoạt độ phân hủy huyết khối của nó mạnh gấp 4 lần plasmin (enzym tan máu đông nội

sinh) và có thể được hấp thụ an toàn qua đường tiêu hóa [19]

Hình 1.1 Sơ đồ tổng hợp γ-PGA theo con đường nối tiếp [20]

Nattokinase được coi là một thuốc đầy hứa hẹn dùng điều trị huyết khối do hoạt động tiêu sợi huyết mạnh Một số báo cáo cho thấy rằng uống Nattokinase có thể làm giảm nồng độ fibrinogen, yếu tố VIII và yếu tố VII trong huyết tương, có lợi cho bệnh tim mạch Nattokinase cũng có tác dụng điều trị bệnh tim và bệnh Alzheimer Ở người lớn bị tăng cholesterol máu, nattokinase có tác dụng giảm mức cholesterol huyết thanh khi cùng với chế độ ăn kiêng ít cholesterol Nattokinase tiêu sợi huyết trực tiếp trên cục máu đông tương

tự như hoạt động của tPA và urokinase [4] Nó trực tiếp làm suy giảm fibrin cũng như làm tăng sự giải phóng chất kích hoạt plasminogen từ các tế bào để phá vỡ fibrin Nattokinase không chỉ trực tiếp gây ra tiêu sợi huyết mà còn có tác dụng mạnh trong việc kích hoạt các phân tử pro-urokinase [7]

Ngoài ra, nattokinase thực hiện một số chức năng khác đối với các thành phần tế bào

và các quá trình sinh học Hoạt động phân giải protein của nattokinase bị hạn chế nên nó

an toàn khi sử dụng cho người

1.1.2.3 Acid Dipicolinic (DPA, acid 2,6-pyridinedicarboxylic)

Acid dipicolinic (DPA, acid 2,6-pyridinedicarboxylic) là thành phần trong natto đã được biết là có chức năng kháng khuẩn mạnh, và được sử dụng để điều trị các bệnh truyền

nhiễm do vi khuẩn [30] Acid dipicolinic được sản xuất bởi vi khuẩn Bacillus subtilis natto

trong quá trình lên men [27] Hàm lượng trung bình của nó trong các loại natto là 0,3 – 0,8%, trong khi hàm lượng ở vi khuẩn cao hơn nhiều, ở mức 1,2 -1,5% trọng lượng khô

của vi khuẩn Acid dipicolinic là thành phần nội bào của B subtilis, có thể được tách chiết

bằng dung môi nước ở nhiệt độ 120°C trong 30 phút Acid dipicolinic có hiệu quả chống

lại nhiều loại vi sinh vật như Aspergillus oryzae, Penicillium spp., trực khuẩn gây bệnh đại tràng, Escherichia coli O-157 và nấm men [30]

Acid dipicolinic cũng đã được nghiên cứu tác dụng đối với quá trình đông máu Việc

bổ sung DPA với nồng độ cuối cùng là 5×10-3 M dẫn đến ức chế đáng kể sự kết tập tiểu cầu Kết quả cho thấy sự ức chế của DPA mạnh hơn nhiều so với việc bổ sung aspirin.Hơn nữa, phản ứng đông máu của thrombin-fibrinogen cũng được tìm thấy bị ức chế bởi DPA.Những kết quả này cho thấy DPA có trong natto có thể có hiệu quả trong việc ngăn ngừa huyết khối [32]

7

Bên cạnh đó, việc bổ sung acid dipicolinic vào môi trường nuối cấy Bacillus subtilis

natto cũng làm tăng hoạt tính của nattokinase và nồng độ vitamin K2 do vi khuẩn này sinh

ra Ví dụ, khi sản xuất natto bằng đậu nành hấp, việc bổ sung 10-64 mM acid dipicolinic làm tăng hoạt động amidase của nattokinase hơn 10 lần Nồng độ vitamin K2 (menaquinon-7) cũng tăng khoảng 4 lần khi bổ sung 10 mM acid dipicolinic Không có thực phẩm khác

có chứa nồng độ vitamin K2 cao như vậy Nếu nồng độ acid dipicolinic được kiểm soát thích hợp, một sản phẩm với mức độ tuyệt vời cho cả hoạt động nattokinase và nồng độ vitamin K2 có thể được sản xuất trong tương lai [8]

1.2 Mô hình hóa quá trình trao đổi chất trên máy tính

1.2.1 Nguyên lý trao đổi chất

Carbon, oxy, hydro và nitơ là bốn yếu tố chính cần thiết cho việc sản xuất các thành phần hóa học của tế bào Chúng là các nguyên liệu cơ bản nhất để tạo nên tất cả các đại phân tử như ADN và ARN, protein, lipid và polysacarid Các yếu tố khác cũng có thể cần thiết, nhưng với số lượng nhỏ hơn Chúng được gọi là các nguyên tố vi lượng do nồng độ thấp trong tế bào Các nguyên tố vi lượng phổ biến là phốt pho, kali, canxi, magiê, lưu

huỳnh, sắt, kẽm, mangan, đồng, molypden, coban Mặc dù chúng có mặt với số lượng nhỏ hơn, chúng vẫn rất quan trọng đối với chức năng tế bào bình thường Tất cả những yếu tố này phải được cung cấp thông qua môi trường

Phản ứng trao đổi chất thường đòi hỏi các enzym cụ thể để xúc tác chúng [13] Enzym là các protein có chức năng xúc tác, được mã hóa bởi bộ gen của sinh vật Thông thường, mỗi enzym xúc tác cho một phản ứng cụ thể và chỉ chấp nhận một phân tử cơ chất

cụ thể Enzym không tiêu thụ trong các phản ứng, và chúng có sẵn cho các phản ứng tiếp theo Trong cơ sở dữ liệu như KEGG, các enzym được xác định là số EC, một mã đặc biệt

đề cập đến một enzym hoặc một nhóm enzym có chức năng cụ thể

1.2.1.2 Con đường chuyển hóa

Một con đường trao đổi chất là một mạng lưới mà các chất chuyển hóa kết nối với nhau thông qua các phản ứng [13] Hay có thể nói mỗi con đường trao đổi chất chứa một nhóm các phản ứng sinh hóa được liên kết bởi các chất trung gian Nó có nghĩa là trong con đường trao đổi chất, phản ứng phía trước tạo ra cơ chất cho phản ứng phía sau Dòng chảy trong con đường trao đổi chất thường được coi là đơn hướng Con đường trao đổi chất có vai trò đặc biệt trong tế bào, ví dụ, tạo ra năng lượng trong quá trình đường phân (dị hóa) hoặc tạo ra các tiền chất monome trong quá trình đồng hóa (sinh tổng hợp purin) Một số con đường trao đổi chất được gọi là con đường cốt lõi bởi vì liên quan đến các chất dinh dưỡng cơ bản như carbohydrat, acid béo và acid amin Còn một số như đường phân, chu trình TCA, con đường pentose phosphate và chu trình Calvin được gọi là con đường cốt lõi bởi vì chúng gần như giống nhau trong tất cả các sinh vật [13]

1.2.1.3 Các dạng năng lượng để vận hành quá trình trao đổi chất

a) ATP

Các chất dinh dưỡng được hấp thu lấy từ môi trường bị thoái hóa tạo ra ATP, cung cấp năng lượng cho quá trình đồng hóa và các phản ứng vận chuyển Tuy nhiên quá trình sản xuất năng lượng có sự tỏa nhiệt, vậy nên nếu được thực hiện trong một bước thì nhiệt lượng sinh ra sẽ đốt cháy tế bào [13] Do đó năng lượng tạo ra từ từng bước được dự trữ trong phân tử ATP ATP có thể được tạo ra bởi quá trình quang hợp, phosphoryl hóa oxy

9

hóa được thực hiện bởi ty thể, hoặc phosphoryl hóa ở mức cơ chất [13] Trong hai quá trình đầu tiên, ATP synthase tạo ATP bằng cách sử dụng gradient proton qua màng Trong quá trình cuối, ATP được tạo ra bởi các phản ứng nhất định liên quan đến các quá trình chuyển hóa cốt lõi, trong đó ADP đóng vai trò là cofactor Trong các phản ứng này; ADP trực tiếp nhận một nhóm phosphate và trở thành ATP

ADP + Pi → ATP Sản xuất ATP bởi một sinh vật nhân thực hiếu khí không quang hợp xảy ra chủ yếu

ở ty thể ATP có thể được sản xuất bởi một số chu trình tế bào riêng biệt; ba con đường chính trong sinh vật nhân thực là (1) glycolysis (đường phân), (2) chu trình TCA/phosphoryl hóa oxy hóa và (3) beta oxy hóa Toàn bộ quá trình oxy hóa glucose thành

CO2, sự kết hợp của con đường 1 và 2, được gọi là hô hấp tế bào, tạo ra khoảng 30 phân tử ATP từ mỗi phân tử glucose [25]

b) NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) là một trong những coenzym quan trọng nhất trong tế bào NADH đóng vai trò chính trong việc sản xuất năng lượng thông qua các phản ứng oxy hóa khử Trong các tế bào, hầu hết các quá trình oxy hóa được thực hiện bằng cách loại bỏ các nguyên tử hydro NAD đóng một vai trò quan trọng trong việc này Các NAD hoạt động như một chất nhận hydro trong các phản ứng oxy hóa - khử Do điện tích dương trên nguyên tử nitơ trong vòng nicotinamid, nên coenzym thường được viết là NAD+ Mỗi phân tử NAD+ có thể thu được hai electron; đó là, được giảm bởi hai điện tử Tuy nhiên, chỉ có một proton đi kèm với việc giảm điện tử Các proton khác được tạo ra khi hai nguyên tử hydro được loại bỏ khỏi phân tử bị oxy hóa được giải phóng vào môi trường xung quanh Đối với NAD+, phản ứng là:

NAD+ + 2H →NADH + H+NAD+ tham gia vào nhiều phản ứng oxy hóa khử trong các tế bào, bao gồm cả các phản ứng đường phân và hầu hết các phản ứng trong chu trình TCA của hô hấp tế bào, tổng hợp acid béo và tổng hợp sterol Các enzym sử dụng NAD+ để vận chuyển hydro được gọi

là dehydrogenase hoặc oxyoreductase, xúc tác khử NAD+ thành NADH NADH sau đó

được sử dụng bởi chuỗi vận chuyển điện tử và tham gia như một chất nền trong sản xuất ATP của ty thể thông qua quá trình phosphoryl oxy hóa [36]

1.2.2 Phương pháp Constraint-Based Modeling

1.2.2.1 Giới thiệu về Constraint-Based Modeling

Constraint-Based Modeling (CBM, tạm dịch là mô hình hóa dựa trên giới hạn) là phương pháp mô hình hóa đã được sử dụng cho các mạng phản ứng trao đổi chất trong hơn

30 năm Trong những năm đầu phát triển, CBM chủ yếu được sử dụng để phân tích năng suất của các con đường Nghiên cứu của Fell, D.A và Small J.R năm 1986 [6] là một trong

số rất ấn phẩm đầu tiên sử dụng CMB để nghiên cứu tổng hợp acid béo từ glucose Mô hình

đầu tiên được công bố là H influenza vào năm 1999 gồm 400 gen, 461 phản ứng và 451

chất chuyển hóa Những năm sau đó, nhiều mô hình khác cũng được công bố, chủ yếu là vi khuẩn (Hình 2) Năm 2003, sinh vật nhân thực đầu tiên được xây dựng mô hình là

Saccharomyces cerevisiae Mô hình này gồm 708 gen, 842 phản ứng và 584 chất chuyển

hóa Năm 2007, Oh, Y.-K và đồng nghiệp [23] đã trình bày tái cấu trúc chuyển hóa Bacillus

subtilis Mô hình được xây dựng dựa trên sự kết hợp của thông tin genomic, sinh hóa, và

sinh lý và thí nghiệm kiểu hình thông lượng cao Mô hình cuối cùng bao gồm 844 gen,

1020 phản ứng và 988 chất chuyển hóa Năm 2009, Boyle, N.R và Morgan J.A [3] giới

thiệu mô hình của Chlamydomonas reinhardtii, là mô hình đầu tiên cho tảo Mô hình được

xây dựng lại chứa 484 phản ứng và 458 chất chuyển hóa nội bào

Từ năm 2010 đến nay, các nhà khoa học đã nỗ lực để đưa ra những mô hình chất lượng cao của cả những sinh vật chưa được nghiên cứu và những sinh vật trước đấy đã được công bố mô hình Đến nay, trên 50 sinh vật đã được nghiên cứu và xây dựng mô hình

trao đổi chất Mô hình được công bố mới nhất là của Acinetobacter baumannii vào năm

2018, gồm 718 gen, 1016 phản ứng và 890 chất chuyển hóa [21]

11

Hình 1.2 Quá trình phát triển các mô hình cân bằng hóa học quy mô bộ gen của các sinh

vật khác nhau (trước năm 2008) G là viết tắt của số lượng gen được kết hợp trong mô hình,

R là số lượng phản ứng và M là số lượng chất chuyển hóa trong mô hình [33]

1.2.2.2 Đặc điểm của Constraint-Based Modeling

Các chức năng trong hệ thống sinh học, trong đó có hoạt động trao đổi chất, bị hạn chế bởi di truyền, môi trường sống, và các định luật hóa lý [1] Trong mô hình trao đổi chất xây dựng bằng CBM, tốc độ chuyển hóa của các phản ứng (sau đây gọi là thông lượng) nằm trong một khoảng giá trị với các giới hạn tương tự như trong thực tế Do cùng nằm trong một mạng lưới, việc thay đổi thông lượng của một phản ứng sẽ dẫn đến thay đổi thông lượng của nhiều phản ứng khác liên quan Tập hợp các giá trị thông lượng tạo nên một không gian giải pháp (solution space) của mô hình Các giới hạn càng nhiều thì không gian giải pháp càng bị thu hẹp Mô hình trao đổi chất xây dựng bằng CBM cho phép xác định

toàn bộ các thay đổi có thể xảy ra với mạng trao đổi chất dưới ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát

COBRA (COnstraint-Based Reconstruction and Analysis) là công cụ tin học do Thiele và cộng sự phát triển để xây dựng và phân tích mô hình trao đổi chất của sinh vật dựa trên phương pháp Constraint-Based Modeling [9] COBRA được biên soạn bằng ngôn ngữ Matlab Sau đó, Ebrahim và cộng sự biên soạn lại cho ngôn ngữ Python với tên COBRApy [5]

1.2.2.3 Biểu diễn quá trình trao đổi chất dưới dạng mô hình toán học

Các mô hình trao đổi chất có thể được chuyển đổi thành mô hình toán học dưới dạng

ma trận cân bằng hóa học (thường viết tắt là ma trận S) (Hình 3) Trong ma trận cân bằng hóa học, các hàng tương ứng với các chất chuyển hóa trong hệ thống, các cột tương ứng với các phản ứng diễn ra Hệ số âm trong ma trận S đại diện cho một chất chuyển hóa được tiêu thụ trong một phản ứng nhất định Ngược lại, hệ số dương đại diện cho các chất chuyển hóa đang được sản xuất Các thứ nguyên của ma trận là m x n, trong đó m là số lượng chất

chuyển hóa và n là số lượng phản ứng

Một mô hình mạng lưới trao đổi chất bao gồm 7 chất chuyển hóa bên trong và 4 chất bên ngoài với 11 phản ứng Từ mạng này, dựa vào cân bằng khối lượng cho mỗi chất chuyển hóa có thể được thiết lập dưới dạng phương trình tuyến tính và chúng có thể được chuyển đổi thành dạng ma trận S Trong ví dụ này, các phản ứng bên trong được biểu thị bằng r và các phản ứng trao đổi với môi trường ký hiệu là R Các chất phản ứng và sản phẩm trong phản ứng có hệ số cân bằng hóa học âm và dương Ví dụ, hệ số cân bằng hóa học của chất chuyển hóa B là 2 vì phản ứng r1 tạo ra hai phân tử B từ một phân tử A

Tỷ lệ các chất chuyển hóa theo thời gian được mô tả theo phương trình

𝑑𝑡 = 𝑆 𝑣 = 0 Nồng độ của mỗi chất chuyển hóa sau đó sẽ ở trạng thái ổn định có thể được mô tả bởi một phương trình tuyến tính, thay vì một phương trình vi phân, biểu diễn trạng thái ngay trước khi cân bằng đạt được Với mỗi chất chuyển hóa có một phương trình tuyến tính, ta có hệ phương trình tuyến tính cho cả mạng chuyển hóa (Hình 4)

Hình 1.4 Hệ phương trình tuyến tính của toàn bộ ma trận S mô tả nồng độ chất chuyển

hóa ở trạng thái ổn định [33]

1.2.2.4 Phân tích cân bằng thông lượng (FBA)

FBA là phương pháp phân tích dựa trên giới hạn của mạng lưới trao đổi chất được

sử dụng rộng rãi nhất để mô phỏng quá trình trao đổi chất của tế bào FBA dựa trên nguyên tắc bảo toàn khối lượng trong mạng, sử dụng ma trận cân bằng hóa học xác định phân phối thông lượng tối ưu của hàm mục tiêu

FBA bao gồm bốn bước: (i) Xác định hệ thống, (ii) xác lập cân bằng, (iii) xác định chức năng mục tiêu liên quan đến sinh học và bổ sung các ràng buộc sinh hóa khác và (iv) tối ưu hóa (Hình 5) [11] Để xác định hệ thống, các phản ứng riêng lẻ trong mô hình được liệt kê chi tiết về các chất chuyển hóa có liên quan, các gen và các enzym tương ứng liên quan đến việc xúc tác các phản ứng, cũng như ức chế và đảo ngược phản ứng Các phản ứng vận chuyển liên quan và các chất chuyển hóa bên ngoài, liên quan đến trao đổi với phần còn lại của hệ thống, chẳng hạn như nguồn carbon cho sự tăng trưởng, hoặc sản phẩm cuối từ một con đường hoặc các thành phần của sinh khối, là cũng được xác định ở giai đoạn này Các chất chuyển hóa bên ngoài về cơ bản là tiếp theo, sự cân bằng khối động của

hệ thống trao đổi chất được mô tả bằng cách sử dụng ma trận cân bằng Sm x n, liên quan đến

tỷ lệ thông lượng của các phản ứng xúc tác bởi enzyme, vn x 1 là nồng độ các chất chuyển hóa theo thời gian, x m x 1 tính theo dx/dt=Sv với v = [v1 v2 … vni b1 b2 … bn ext]T, vi biểu thị các thông lượng bên trong hệ thống, bi đại diện cho sự trao đổi thông lượng trong hệ thống, ni là số lượng chất chuyển hóa và next là số lượng chất chuyển hóa bên ngoài hệ thống

Để giải quyết hệ thống chưa xác định, các giới hạn thông lượng bổ sung có thể được thêm vào thông qua việc đo lường các thông lượng Thông thường, giới hạn dưới và trên của thông lượng sẽ được bổ sung Ví dụ, giới hạn dưới và trên của các thông lượng có thể được hạn chế như sau:

0 < vi < 

-  < bi <  trong đó đòi hỏi tất cả các phản ứng có một thông lượng theo chiều thuận và thông lượng theo chiều ngược lại để được theo một trong hai hướng Thực tế, một giới hạn trên hữu hạn

15

có thể được áp đặt, cũng có thể được quyết định dựa trên kiến thức nhiệt động lực học của

tế bào hoặc đo lường thực tế

FBA sử dụng lập trình tuyến tính để xác định phân phối thông lượng phản ứng ở trạng thái ổn định phân phối thông lượng trong mạng chuyển hóa bằng cách tối đa hóa một hàm mục tiêu, chẳng hạn như sản xuất ATP hoặc tốc độ tăng trưởng Khi hàm mục tiêu được cố định, hệ phương trình tuyến tính được giải để có được thông lượng trạng thái phân phối ổn định Phân phối thông lượng này sau đó được sử dụng để giải thích khả năng trao đổi chất của hệ thống

FBA đã được sử dụng để phân tích các mô hình chuyển hóa quy mô bộ gen của một

số sinh vật; phân tích khả năng trao đổi chất; phân tích các lỗ hổng chuyển hóa trong tinh chỉnh mạng lưới; nó cũng được sử dụng để phân tích ảnh hưởng của các nhiễu loạn, chẳng

hạn như xóa gen in silico Các ứng dụng của FBA là cơ sở cho các phân tích sự phụ thuộc

về chức năng của các phản ứng trong mạng lưới (flux coupling analyses), kỹ thuật trao đổi chất, xác định đích của thuốc, cũng như cung cấp hiểu biết sâu hơn về sinh học (Hình 6)

Hình 1.5 Các bước thực hiện FBA [11].

Hình 1.6 Một số ứng dụng của FBA [11]

17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

Dữ liệu sử dụng để xây dựng mô hình Bacillus subtilis natto BEST195 được lấy từ

cơ sở dữ liệu Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) tại địa chỉ:

2.2.2 Đánh giá độ tin cậy và khảo sát một số đặc điểm của mô hình

2.2.2.1 Khả năng tạo sinh khối của mô hình trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí

Mô hình được mô phỏng khả năng tạo sinh khối trong các điều kiện có và không

có oxy, kết quả thu được là thông lượng của phản ứng sinh khối

2.2.2.2 Khả năng sinh tổng hợp L-glutamat của mô hình từ các nguồn carbon khác nhau

Mô hình được mô phỏng khả năng tạo L-glutamat từ các môi trường được cung

cấp các nguồn carbon khác nhau: glucose, maltose, acid citric, sucrose Kết quả thu được

là thông lượng của phản ứng sinh L-glutamat

2.2.2.3 Khảo sát thông lượng của quá trình sinh tổng hợp L-glutamat từ maltose và sucrose

Sơ đồ của quá trình sinh tổng hợp L-glutamat từ hai nguồn carbon: maltose và sucrose được xây dựng kèm theo các giá trị thông lượng của từng phản ứng

2.3 Phương pháp

2.3.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu

2.3.1.1 Cơ sở dữ liệu KEGG_ BS

Các dữ liệu trao đổi chất của B.subtilis natto BEST195 trong KEGG được tổ chức

dưới dạng các tệp tin ở định dạng xml Mỗi tệp tin chứa thông tin của một con đường trao

đổi chất Dữ liệu trong các tệp tin KEGG được chiết xuất và chuyển sang định dạng

dictionary với tên gọi KEGG_BS bằng ngôn ngữ lập trình Python 3.6 Cấu trúc của dictionary như sau:

KEGG_BS[‘Con đường trao đổi chất 1’] = {‘Phản ứng 1’: {‘Chất tham gia’: [],

‘Chất tạo thành’: [],

‘Gen’: [], ‘Loại phản ứng’: ‘ ’,}

‘Phản ứng 2’: {…}, …,}

19

KEGG_BS[‘Con đường trao đổi chất 2’] = { }

2.3.1.2 Cơ sở dữ liệu KEGG_RXN và KEGG_MET

Sau khi xây dựng KEGG_BS, toàn bộ tên của các phản ứng và chất trao đổi có trong KEGG_BS được tập hợp vào danh sách tương ứng gọi là RXN và MET Thông tin của từng phản ứng và chất trao đổi trong hai danh sách RXN và MET sẽ được lấy từ cơ sở dữ liệu

KEGG và lưu vào hai dictionary với tên gọi là KEGG_RXN và KEGG_MET Cấu trúc của hai dictionary như sau:

KEGG_RXN[‘Phản ứng 1’] = {‘ID’: ‘ ’,

‘Tên’: ‘ ’, ‘Phương trình’: ‘ ’, ‘Enzym’: ‘ ’,}

Mô hình trao đổi chất của B subtilis natto BEST195 được xây dựng bằng công cụ

COBRApy của Python [5] COBRApy là công cụ xây dựng mô hình theo phương pháp do Thiele và cộng sự đề xuất [9] Các thông số về chất và phản ứng để xây dựng mô hình được lấy từ các cơ sở dữ liệu KEGG_BS, KEGG_RXN, KEGG_MET Mô hình trao đổi chất được xây dựng qua ba bước: tạo chất trao đổi, tạo phản ứng, tạo mô hình

2.3.2.1 Tạo chất trao đổi