Nghiên cứu một số phương pháp sàng lọc một số chất dị nguyên trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần

Ứng dụng phương pháp phân tích để sàng lọc một số dị nguyên trong mẫu thực phẩm .... Ứng dụng phương pháp phân tích để sàng lọc một số dị nguyên trong mẫu thực phẩm ..... Do đó, đề tài “

LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

1 Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất

2 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực

phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2019

i

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm an toàn

vệ sinh thực phẩm Quốc gia, 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn TS Trần Cao Sơn

và TS Đặng Thị Ngọc Lan đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và góp ý, giúp đỡ

em thực hiện khóa luận này

Em xin cảm ơn ThS Nguyễn Thị Hà Bình đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp

đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận

Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, cung cấp cho em những kiến thức cần thiết, bổ ích và quan trọng

Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh

thực phẩm Quốc gia, TS Trần Cao Sơn cùng các cán bộ khoa Độc học và Dị

nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện giúp em thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên quan tâm, động viên em trong suốt quá trình vừa qua

Trong quá trình thực hiện đề tài do trình độ lý luận và thực tiễn còn hạn chế, đề tài không thể tránh khỏi có những sai sót, mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh viên

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Ngày 17 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về dị ứng và dị nguyên 2

1.1.1 Cơ chế dị ứng 2

1.1.2 Dị nguyên 2

1.2 Tổng quan về dị ứng thực phẩm 5

1.2.1 Thực phẩm gây dị ứng 5

1.2.2 Các quy định hiện hành về dị nguyên 7

1.3 Phương pháp xác định dị nguyên 8

1.3.1 Phương pháp xét nghiệm miễn dịch 8

1.3.2 Phương pháp phân tích DNA 9

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.2.1 Thiết bị 15

2.2.2 Dụng cụ 16

2.2.3 Hóa chất 16

2.2.4 Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử, dung môi 16

2.3 Nội dung nghiên cứu 17

2.3.1 Xây dựng phương pháp sàng lọc đồng thời một số dị nguyên trong thực phẩm bằng LC-MS/MS 17

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 18

2.3.3 Ứng dụng phương pháp phân tích để sàng lọc một số dị nguyên trong mẫu thực phẩm 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

iii

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu 18

2.4.2 Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần 20

2.4.3 Phương pháp thẩm định 21

2.4.4 Phương pháp xử lý kết quả 21

2.4.5 Phương pháp lấy mẫu 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Xây dựng phương pháp sàng lọc đồng thời một số dị nguyên trong thực phẩm bằng LC-MS/MS 22

3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần 22

3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 26

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 31

3.2.1 Tính đặc hiệu 31

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) 33

3.3 Ứng dụng phương pháp phân tích để sàng lọc một số dị nguyên trong mẫu thực phẩm 36

3.4 Bàn luận 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

Kết luận 40

Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PL1

iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

ACN Acetonitrile Acetonitril

AOAC Association of Official

Analytical Communities

Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức

DNA Deoxyribonucleic acid Acid Deoxyribonucleic DTT Dithiothreitol Dithiothreitol

ELISA Enzyme-linked Immune-sorbent

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

MRM Multi reaction monitoring Kiểm soát đa phản ứng OGS Octyl β-D-glucopyranoside Octyl β-D-glucopyranosid PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymer TLTK Tài liệu tham khảo

TOF Time of flight Thời gian bay

TRIS Tris (hydroxymethyl)

aminomethane

Tris (hydroxymethyl) aminomethan

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu xác định dị nguyên bằng ELISA 9

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu xác định dị nguyên bằng phương pháp PCR 10

Bảng 1.3 Các protein và peptid đặc trưng của một số dị nguyên 12

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu xác định dị nguyên sử dụng hệ LC-MS/MS 14

Bảng 2.1 Các dị nguyên thực phẩm và protein đặc trưng tương ứng 15

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ion mẹ và ion con của từng protein 22

Bảng 3.2 Các thông số đã được khảo sát của MS 23

Bảng 3.3 Chương trình gradient pha động 24

Bảng 3.4 Kết quả xác định nồng độ protein hòa tan 27

Bảng 3.5 Thời gian lưu mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của các peptid 32

Bảng 3.6 Tỷ lệ ion đặc trưng của các dị nguyên 33

Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện của các dị nguyên 33

Bảng 3.8 Kết quả phân tích mẫu thực 36

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cơ chế gây dị ứng 2

Hình 1.2 Phân loại dị nguyên ngoại sinh 3

Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu dự kiến ban đầu 19

Hình 3.1 Sắc đồ của từng dị nguyên 25

Hình 3.2 Sắc đồ tổng của các dị nguyên 26

Hình 3.3 Quy trình chiết xuất protein dự kiến ban đầu 26

Hình 3.4 Kết quả khảo sát nồng độ trypsin 28

Hình 3.5 Kết quả khảo sát thời gian thủy phân 29

Hình 3.6 Quy trình xử lý mẫu 30

Hình 3.7 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn của casein α S1 31

Hình 3.8 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn của trứng 31

Hình 3.9 Sắc đồ của casein α S1(634,3/249,2) trong sữa tại 3 µg/g 34

Hình 3.10 Sắc đồ của ovalbumin (673,4/223,2) trong trứng tại 20 µg/g 34

Hình 3.11 Sắc đồ của Ara h1 (688,8/300,2) trong lạc tại 5 µg/g 35

Hình 3.12 Sắc đồ của Jug r1 (688,2/477,2) trong hạt óc chó tại 10 µg/g 35 Hình 3.13 Sắc đồ của glycinin (575,2/219,2) trong hạt đậu tương tại 10 µg/g 35

da dị ứng, phù mạch, mề đay, ), hệ tiêu hóa (nôn, đau bụng, tiêu chảy, ), hệ hô hấp (thở khò khè, khó thở, viêm họng cấp ), sốc phản vệ và tử vong

Theo FDA, có tám nhóm thực phẩm gây dị ứng chính gồm sữa, trứng, lạc, đậu tương, hạt cây, cá, động vật giáp xác và lúa mì Năm dị nguyên: sữa, trứng, hạt lạc, đậu tương và óc chó thuộc tám nhóm dị nguyên thực phẩm gây dị ứng phổ biến nhất và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây sốc phản vệ do dị ứng thực phẩm Các dị nguyên này có khả năng nhiễm chéo cao trong sản xuất, chỉ với lượng nhỏ

dị nguyên đã có thể gây phản ứng dị ứng nghiêm trọng cho người sử dụng, thậm chí là tử vong Do đó việc xác định sự có mặt các dị nguyên trong thực phẩm là rất cần thiết, đặc biệt là thực phẩm dành cho trẻ em bởi đây là đối tượng ở độ tuổi

có tỉ lệ dị ứng thực phẩm lớn nhất

Ở Mỹ và châu Âu, hiện đã có những quy định chặt chẽ về ghi nhãn thực phẩm gây dị ứng [23], [30] Tại Việt Nam, hiện nay chưa có quy định cụ thể về giới hạn dị nguyên cũng như chưa có phương pháp chính thức để xác định dị

nguyên trong thực phẩm Do đó, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc một số chất dị

nguyên trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần” đã được thực hiện

với hai mục tiêu như sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp sàng lọc một số dị nguyên trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần

2 Ứng dụng phương pháp phân tích sàng lọc sự có mặt của dị nguyên trong một số sản phẩm thực phẩm bao gồm sữa, bánh kẹo, thực phẩm bổ sung dạng bánh cho trẻ em

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về dị ứng và dị nguyên

1.1.1 Cơ chế dị ứng

Bệnh dị ứng phát sinh là kết quả của phản ứng miễn dịch bất thường chống lại protein trong môi trường (kháng nguyên) Mặc dù mọi người đều thường xuyên tiếp xúc với các kháng nguyên, nhưng chỉ một phần nhỏ nhất định các cá nhân xảy ra các phản ứng miễn dịch bất lợi đối với các kháng nguyên này [38] Lần đầu tiên tiếp xúc với dị nguyên, hệ thống miễn dịch của cơ thể sẽ tạo ra kháng thể IgE đặc hiệu chống lại kháng nguyên Khi phơi nhiễm với loại kháng nguyên đó lần nữa, nó sẽ kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể sản sinh ra lượng lớn IgE và các chất trung gian hóa học, đặc biệt là histamin, gây ra các phản ứng dị ứng đặc trưng [17], [22] Hình 1.1 mô tả tóm tắt cơ chế gây dị ứng

3

Hầu hết các dị nguyên là các protein hoặc glycoprotein Phân tử lượng của các dị nguyên thường trong khoảng từ 5 đến 70 kDa, tuy nhiên, cũng có những dị nguyên có khối lượng phân tử lớn hơn 200 kDa [23]

1.1.2.2 Phân loại dị nguyên

Có nhiều cách phân loại dị nguyên như phân loại theo nguồn gốc, phân loại theo cấu trúc hóa học, phân loại theo đặc tính miễn dịch… Phân loại dị nguyên theo nguồn gốc chia dị nguyên thành hai nhóm lớn là dị nguyên nội sinh (dị nguyên tự sinh ra trong cơ thể) và dị nguyên ngoại sinh (dị nguyên lọt từ môi trường ngoài vào cơ thể) Loại dị nguyên gây dị ứng chủ yếu là dị nguyên ngoại sinh, dị nguyên ngoại sinh được phân chia thành các nhóm như hình 1.2 Theo cách phân loại này, thực phẩm là nhóm dị nguyên gây dị ứng phổ biến nhất [8]

Hình 1.2 Phân loại dị nguyên ngoại sinh

Phân loại theo cấu trúc hóa học, dị nguyên có thể là các protein hoặc phức hợp của protein với polysaccharid, lipid, hóa chất đơn giản; phức hợp của polysaccharid với lipid Protein là loại dị nguyên phổ biến nhất trong tự nhiên và

có tính kháng nguyên mạnh nhất [27]

Theo đặc tính miễn dịch, có thể phân loại các dị nguyên (kháng nguyên) thành hai nhóm là kháng nguyên hoàn toàn (complete antigen) và kháng nguyên không hoàn toàn (hapten) Kháng nguyên hoàn toàn là những kháng nguyên có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với kháng thể, gồm các phức hợp protid, phần lớn protein của người, động vật, một vài loại

Dị nguyên ngoại sinh

Vi khuẩn Virus Nấm

4

polysaccharid Các hapten không có khả năng kích thích sinh kháng thể nhưng khi gặp kháng thể thì kết hợp đặc hiệu, thường là acid nucleic, lipid hoặc polysaccharid, các hóa chất đơn giản [1]

1.1.2.3 Đặc điểm của dị nguyên

Dị nguyên có hai đặc điểm chính, đó là tính đặc hiệu và tính sinh kháng thể (tính kháng nguyên) [1], [8]

Tính đặc hiệu của dị nguyên được thể hiện bởi sự kết hợp đặc hiệu của dị nguyên với kháng thể tương ứng Trong đáp ứng miễn dịch dịch thể, kháng thể đặc hiệu là các imunoglobulin như IgE, IgG, IgM Trong đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, các kháng thể đặc hiệu bám trên bề mặt tế bào lympho T Tính đặc hiệu của kháng nguyên thường rất nghiêm ngặt, một kháng thể thường chỉ gắn đặc hiệu với một dị nguyên Nhưng đôi khi cũng xảy ra trường hợp dị ứng chéo, một kháng thể có thể gắn với nhiều dị nguyên khác nhau

 Tính kháng nguyên

Là khả năng kích thích hệ thống đáp ứng miễn dịch của cơ thể sản xuất kháng thể Tính kháng nguyên của dị nguyên phụ thuộc vào một số điều kiện:

- Có bản chất “lạ” đối với cơ thể: Phân tử dị nguyên không được giống bất

cứ thành phần nào của cơ thể Đây là điều kiện tuyệt đối cần thiết đối với

dị nguyên

- Phân tử lượng của dị nguyên phải lớn: Các chất có phân tử lượng nhỏ không

có tính kháng nguyên Những chất có phân tử lượng càng lớn (hơn 600.000 Da), cấu trúc hoá học càng phức tạp thì tính kháng nguyên càng mạnh Tuy nhiên, một số hóa chất có khối lượng phân tử nhỏ (formol, clorid picrin,…) vẫn có tính kháng nguyên do các chất này làm biến đổi protein của cơ thể tạo ra các protein có tính kháng nguyên đầy đủ

- Bản chất và cấu trúc hóa học của dị nguyên: hầu hết các protein đều có tính kháng nguyên mạnh Tính kháng nguyên của protein phụ thuộc vào cấu trúc hóa học, vị trí các nhóm chức đính trong phân tử protein Các protein nguồn gốc thực vật (phấn hoa, các loại hạt, trái cây,…) là những dị nguyên mạnh

1.2.1.1 Sữa

Sữa là nguyên nhân gây dị ứng đầu tiên và phổ biến nhất ở trẻ nhỏ Có khoảng 0,6% đến 3% trẻ em dưới 6 tuổi, 0,3% trẻ lớn và dưới 0,5% người lớn bị dị ứng sữa bò, loại dị ứng sữa phổ biến nhất [30] Trong dị ứng sữa, các triệu chứng điển hình xuất hiện ngay lập tức hoặc trong vòng 2 giờ sau khi uống sữa bao gồm biểu hiện trên da, hệ hô hấp và đường tiêu hóa Trường hợp dị ứng nặng có thể gây sốc phản vệ, dẫn đến nguy cơ tử vong cao Dị ứng sữa là dị ứng thực phẩm phổ biến thứ ba gây ra phản ứng phản vệ, chỉ sau lạc và hạt cây, chiếm khoảng 10% đến 19% của tất cả các trường hợp sốc phản vệ do thực phẩm [19], [31]

Dị ứng sữa liên quan tới phản ứng miễn dịch dịch thể qua IgE chống lại một trong hai hoặc cả hai protein của sữa là casein và protein huyết thanh (whey protein) [19], [31] Casein là thành phần chính của protein sữa (80%), gồm 4 loại

αS1-, αS2-, β- và κ-casein Các casein liên kết với nhau tạo thành micell casein Cấu trúc micell gồm phần kỵ nước ở trung tâm và phần thân nước bên ngoài chứa các vị trí phosphoryl hóa [19]

1.2.1.2 Trứng

Tỉ lệ dị ứng với trứng chiếm khoảng 1,6% đến 3,2% trẻ em, do đó dị ứng với trứng là tình trạng dị ứng phổ biến thứ hai ở trẻ em Triệu chứng thường gặp nhất của dị ứng trứng là viêm da dị ứng, nổi mề đay, đau bụng, tiêu chảy, trường hợp

Lạc là một nguyên nhân chính gây nên các phản ứng dị ứng nghiêm trọng cả

ở người lớn và trẻ em Một số khảo sát tại Hoa Kỳ cho thấy có khoảng 0,7 % trẻ

em bị dị ứng với lạc Người bệnh dị ứng với lạc thường có phản ứng đầu tiên ở

độ tuổi trung bình là 22 tháng tuổi [5] Không như dị ứng trứng hay sữa, dị ứng lạc tồn tại suốt cuộc đời, các triệu chứng của dị ứng lạc thường nghiêm trọng, lạc

là thực phẩm dị ứng có tỉ lệ gây sốc phản vệ và tử vong cao nhất [15] Các protein gây dị ứng chính trong lạc là Ara h1, Ara h2 và Ara h3 [5], [15]

Ara h1 là một glycoprotein có phân tử lượng 64,5 kDa được công nhận gây

dị ứng trên 95% bệnh nhân bị mẫn cảm với lạc Ara h3 có phân tử lượng là 14 kDa và có tính tương đồng cao với protein Glycinin [5]

1.2.1.4 Đậu tương

Dị ứng đậu tương thường gặp ở trẻ em bị viêm da cơ địa Dữ liệu về dị ứng đậu tương ở người lớn chưa rõ ràng [3] Ít nhất 21 protein gây dị ứng đã được phát hiện trong đậu tương, trong đó glycinin (chiếm 19,5% - 23,1% tổng protein trong hạt đậu tương) là chất gây dị ứng chính Glycinin có trọng lượng phân tử khoảng 300-380 kDa, glycinin được tạo thành từ các amino acid có tính acid và base tương ứng liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide Biểu hiện dị ứng đậu tương bao gồm rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, rối loạn chức năng miễn dịch, tăng khả năng trầm cảm Mức độ nghiêm trọng của tình trạng dị ứng phụ thuộc vào lượng đậu tương đưa vào cơ thể, liều lượng càng cao phản ứng càng nghiêm trọng, có thể gây sốc phản vệ [16]

7

1.2.1.5 Các loại hạt cây

Phản ứng dị ứng với hạt cây có thể nghiêm trọng và đe dọa tính mạng Các loại hạt cây thường gây phản ứng dị ứng là hạnh nhân, quả óc chó, hạt điều, hạt dẻ… Cùng với lạc, dị ứng hạt cây chiếm tỉ lệ lớn các ca tử vong được báo cáo do

dị ứng thực phẩm Dị ứng hạt cây khởi phát từ khi còn nhỏ và nó thường kéo dài đến suốt đời [24], [31] Phần lớn các chất gây dị ứng hạt cây là protein có trong hạt Trẻ dị ứng với một loại hạt cây thường cũng sẽ dị ứng với các loại hạt cây khác và có thể dị ứng chéo với lạc [6]

1.2.1.6 Nhóm thực phẩm gây dị ứng khác

Một số loại thực phẩm gây dị ứng phổ biến khác như ngũ cốc chứa gluten,

cá, động vật giáp xác Phản ứng qua trung gian IgE đối với dị ứng cá, động vật

giáp xác là một trong những nguyên nhân gây dị ứng thực phẩm phổ biến nhất Jug r1 đã được chứng minh là một chất gây dị ứng hạt óc chó chính (92% bệnh nhân bị dị ứng quả óc chó) Những triệu chứng thường gặp là nổi mề đay cấp tính, phù mạch, viêm da dị ứng, trên hệ hô hấp (viêm mũi xoang, hen suyễn) và rối loạn tiêu hóa (tiêu chảy, nôn), trong một số trường hợp có sốc phản vệ gây tử vong [29]

1.2.2 Các quy định hiện hành về dị nguyên

Nhật Bản quy định bắt buộc phải ghi nhãn thực phẩm gây dị ứng khi có trên

10 µg/g (protein gây dị ứng hòa tan/thực phẩm) [26]

Hoa Kỳ đã ban hành Đạo luật bảo vệ người tiêu dùng và dán nhãn thực phẩm (FALCPA) yêu cầu trình bày rõ ràng về nguồn gốc của các thành phần có nguồn gốc là thực phẩm gây dị ứng chính Bất kỳ thành phần nào có nguồn gốc từ những thực phẩm thường gây dị ứng đều phải được ghi trên công bố thành phần của sản phẩm bất kể mức độ sử dụng Trong liên minh Châu Âu (EU), luật ghi nhãn thực phẩm quy định phải ghi các thành phần chiếm tỉ lệ từ 5% trở lên, cũng yêu cầu ghi nhãn của bất kỳ thực phẩm thường gây dị ứng hoặc thành phần gây dị ứng có nguồn gốc từ thực phẩm đó ngay cả khi có ít hơn 5% [23], [30]

Việc ghi nhãn sản phẩm thực phẩm về sự hiện diện của thực phẩm dị ứng hoặc các thành phần có nguồn gốc từ chúng là cách hiệu quả cho những người dị ứng thực phẩm tránh việc vô tình ăn phải các chất dị ứng Tuy nhiên các quy định ghi nhãn không bao gồm ô nhiễm chất dị ứng của các thực phẩm bằng cách tiếp xúc chéo [23] Vì thế vấn đề xác định chất gây dị ứng trong thực phẩm là mối quan tâm lớn cho cả ngành công nghiệp thực phẩm, cơ quan quản lý thực phẩm

và người tiêu dùng Do đó, cần có phương pháp phân tích đủ độ nhạy, độ đặc hiệu

để xác định nhanh chóng, chính xác, thậm chí sàng lọc sự có mặt các dị nguyên

1.3 Phương pháp xác định dị nguyên

Hiện nay, một số phương pháp phân tích phát hiện dị nguyên trong thực phẩm đã được phát triển và áp dụng Các phương pháp phân tích được chia làm

ba nhóm chính là phương pháp xét nghiệm miễn dịch, phương pháp phân tích

DNA, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

1.3.1 Phương pháp xét nghiệm miễn dịch

Nhóm phương pháp xét nghiệm miễn dịch gồm ELISA, dot plot, dipstick, protein biosensor Trong số đó, phương pháp ELISA đang được dùng phổ biến nhất hiện nay [13], [14], [28]

Có ba loại ELISA là: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp và ELISA sandwich Loại ELISA sử dụng phổ biến nhất để phân tích dị nguyên là ELISA sandwich Nguyên tắc của ELISA là dựa trên sự kết hợp đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể Kháng nguyên được gắn trên một bề mặt, kháng thể được “rửa” qua bề mặt

đó, các kháng thể có gắn với enzym Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphat) vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một chất

9

có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và cường độ màu tỉ lệ với nồng độ kháng nguyên cần phân tích Một số nghiên cứu về xác định dị nguyên trong thực phẩm bằng ELISA được tóm tắt trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu xác định dị nguyên bằng ELISA

1.3.2 Phương pháp phân tích DNA

Nhóm phương pháp phân tích DNA gồm có real time PCR, PCR-ELISA, DNA biosensor Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) là một phương pháp gián tiếp nhằm mục đích phân đoạn gen mã hóa và khuếch đại sự hiện diện của nó bằng phản ứng enzym DNA polymerase

Nguyên tắc của PCR là sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzym polymerase Phương pháp được áp dụng phát hiện các chất gây dị ứng với bản chất là các protein Mỗi đoạn DNA gồm có 2 oligonucleotid ở đầu được coi như mồi cho phản ứng, khuếch đại bởi polymerase Các phản ứng bao gồm ba bước trong mỗi chu kỳ khuếch đại Thông thường sẽ thực hiện 25 đến 45 chu kỳ khuếch đại để tạo ra một lượng bản sao DNA đủ lớn đem nhuộm thuốc nhuộm huỳnh quang và thực hiện phân tích bằng điện di gel agarose [7], [11], [23]

10

Một số nghiên cứu về xác định dị nguyên bằng phương pháp PCR được tóm tắt ở bảng 1.2 Sự kết hợp giữa các DNA là duy nhất, do đó, phương pháp có tính đặc hiệu cao và ít bị phản ứng chéo với các dị nguyên khác Vì PCR là một phản ứng khuếch đại, chỉ cần một lượng nhỏ dịch chiết mẫu nên cho phép xác định chất

dị ứng ở mức hàm lượng thấp Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là không xác định được cụ thể loại protein gây dị ứng và có thể mắc sai số lớn do protein

có thể bị thay đổi biến dạng trong các quá trình xử lý nhiệt [10], [23]

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu xác định dị nguyên bằng phương pháp PCR

Dị nguyên Nền mẫu LOD TLTK

Hạt dẻ Các loại bánh 0,001% [11] Đậu phộng, hạt dẻ, cần tây, đậu

nành, trứng, sữa, hạnh nhân và vừng Bánh gạo 0,01% [12]

Sữa bò Sữa trâu 0,5% [7]

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

1.3.3.1 Nguyên lý chung

Hiện nay phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đang được chú ý để phân tích xác định các dị nguyên trong thực phẩm do có ưu điểm về độ tin cậy và khả năng xác định đồng thời nhiều dị nguyên trong cùng một lần phân tích [23] Phương pháp LC-MS/MS đã khắc phục được hai nhược điểm lớn nhất của phương pháp ELISA và phương pháp PCR Các protein trong mẫu được chiết bằng dung dịch đệm phù hợp, sau đó thủy phân cắt mạch thành các peptid có kích thước nhỏ hơn Các peptid này sẽ được phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ hai lần với chế

độ theo dõi đa phản ứng MRM Mỗi dị nguyên được đặc trưng bởi 1 đến 2 protein, mỗi protein được đặc trưng bởi các peptid Mỗi peptid được đặc trưng bởi 1 ion

mẹ và 2 ion con

1.3.3.2 Phương pháp xử lý mẫu

Theo một số nghiên cứu trên thế giới, quy trình xử lý mẫu của phương pháp xác định dị nguyên bằng sắc ký lỏng khối phổ đều gồm hai bước cơ bản là chiết

Protein trong dịch chiết sau đó được phân giải thành các peptid ngắn hơn bằng các enzym thủy phân Phương pháp thủy phân bằng enzym để phân cắt các liên kết peptid có tính đặc hiệu tương đối cao, chúng cắt mạch protein ở những vị trí xác định, ví dụ, enzym trypsin cắt liên kết peptid đầu carboxyl của các acid amin lysin hoặc arginin Trong hầu hết các nghiên cứu, trypsin đều được chọn làm tác nhân thủy phân trong quá trình cắt mạch các protein gây dị ứng [4], [10], [20], [25], [32] Trypsin là một protease serin được tìm thấy trong hệ tiêu hóa, ruột non của nhiều loài động vật có xương sống, nơi chúng thủy phân protein [23]

1.3.3.3 Phương pháp phân tích

Sau khi phân giải protein, các peptid đặc trưng cho mỗi protein được lựa chọn để phân tích trên thiết bị LC-MS/MS Mỗi dị nguyên được đặc trưng bởi 1 đến 2 protein gây phản ứng dị ứng, protein được xác định bởi peptid đánh dấu (còn được gọi là các marker), mỗi peptid được đặc trưng bởi 1 ion mẹ và 2 ion con bằng việc sử dụng chế độ theo dõi đa phản ứng MRM Các dữ liệu mảnh phổ được đối chiếu với dữ liệu chuẩn MASCOT, đảm bảo đặc trưng riêng cho từng peptid [10] Bảng 1.3 giới thiệu một số protein và các peptid đặc trưng cho từng

dị nguyên thực phẩm

12

Bảng 1.3 Các protein và peptid đặc trưng của một số dị nguyên

STT Dị nguyên Protein Peptid

5 Hạt óc chó Jug r1

DLPNECGISSQR QCCQQLSQMDEQCQCEGLR GEEMEEMVQSAR

Trong đó, A: Alanin, C: Cystein, D: Acid aspartic, E: Acid glutamic, F: Phenylalanin, G: Glycin, H: Histidin, I: Isoleucin, K: Lysin, L: Leucin, M: Methionin, N: Asparagin, P: Prolin, Q: Glutamin, R: Arginin, S: Serin, T: Threonin, V: Valin, W: Tryptophan, Y: Tyrosin

13

Để xác định các peptid có trong dịch chiết, các nghiên cứu sử dụng thiết bị khối phổ phân giải cao (Qtrap hoặc Q-TOF) Một số nghiên cứu phân tích dị

nguyên bằng phương pháp LC-MS/MS được giới thiệu trong bảng 1.4

Tham khảo các nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ trên thế giới cho thấy các nhà nghiên cứu thường ưu tiên sử dụng khối phổ phân giải cao loại Qtrap cho các nghiên cứu về dị nguyên Với thiết bị khối phổ Qtrap, mẫu sau khi được tách chất trên hệ thống sắc ký lỏng, các chất sẽ đi vào nguồn ion hóa

Ở đây các chất sẽ được ion hóa và đi vào tứ cực thứ nhất Các ion sẽ được tách ra dựa trên trị số m/z và đi vào tứ cực thứ hai Tại đây quá trình phân mảnh xảy ra , ion mẹ sẽ bị vỡ thành các ion con, các ion con này sẽ được đi vào bẫy ion (ion trap) Tại bẫy ion, các ion con sẽ được tách ra để đi vào bộ phận nhận tín hiệu (phổ MS2) hoặc được bẫy lại, cho phân mảnh tiếp rồi mới vào bộ phận nhận tín hiệu (phổ MS3) Ngoài ra, một số nghiên cứu sử dụng thiết bị khối phổ kết hợp

tứ cực với thời gian bay (QTOF) nhằm xác định chính xác số khối cũng như tìm

ra các peptid điển hình cho từng loại dị nguyên

Các ứng dụng này liên quan đến việc xác định khối lượng phân tử và giải trình tự protein, peptid trong mẫu Mục đích nhằm xác định hợp chất hoặc nghiên cứu cấu trúc trong lĩnh vực sinh học phân tử Nhìn chung, các ứng dụng này thường dành cho các nhà nghiên cứu muốn xác định các mảnh khối lượng phân

tử đặc biệt hoặc trình tự của các protein hoặc các peptid có trong mẫu

Chưa có nghiên cứu nào sử dụng hệ khối phổ ba tứ cực (Triple Quad), tuy nhiên sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực cũng được xem là một sự thay thế phù hợp với nhu cầu sàng lọc xác nhận sự có mặt của dị nguyên dựa vào việc xác định các marker đặc trưng của chúng Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng đến sử dụng chế độ MRM trong sắc ký lỏng khối phổ loại ba tứ cực nhằm sàng lọc các dị nguyên trong thực phẩm

Đệm TRIS-HCl,

pH 8,2

Trypsin 0,1µg/µL

Aligent Qtrap 4000

Sữa, hạt dẻ, lạc, hạnh nhân: 10 µg/g Trứng, đậu tương:

Đệm Tris, ure,

OGS

Trypsin 1µg/µL

LC/MS-ESI QTOF

Bánh quy: 1,25 ppm Xúc xích: 5 ppm [32]

15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là năm dị nguyên sữa, trứng, hạt lạc, đậu tương và

óc chó Đây là những dị nguyên có tỉ lệ gây dị ứng cao nhất và sẵn có trên thị trường Việt Nam Sự có mặt của các dị nguyên trong mẫu thực phẩm được xác định thông qua các protein đặc trưng của chúng

Bảng 2.1 Các dị nguyên thực phẩm và protein đặc trưng tương ứng

TT Thực phẩm gây dị ứng Loại protein đặc trưng

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.2.1 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ gồm thiết bị sắc ký lỏng HPLC

LC20AD-XR của Shimadzu kết nối với thiết bị khối phổ ABSciex Triple Quad 5500

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Mettler Toledo

- Cân kỹ thuật (có độ chính xác 0,01 g), Mettler Toledo

- Thiết bị lắc xoáy, IKA

- Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich

- Thiết bị đồng nhất mẫu, Phillips

Các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu, gồm:

- Acetonitril, loại dùng cho sắc ký

- Acid formic đặc, loại dùng cho sắc ký

- Tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS), NH4HCO3, Iodoacetamid (IA), Dithiothreitol (DTT), Trypsin (>250 N.F.U/mg), Acid acetic, Natri clorid, N-hexan, Ure, (loại tinh khiết phân tích)

- Chất chuẩn:

+ Casein chuẩn 99,5% từ Sigma, lô C7078

+ Các protein khác chưa có chất chuẩn nên các loại thực phẩm trứng (công ty DTK Phú Thọ), hạt lạc và đậu tương (công ty TNHH du lịch Phú Hải), hạt óc chó (Thăng long) mua tại siêu thị được lấy làm chất chuẩn

2.2.4 Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử, dung môi

- Dung dịch iodoacetamid (IA) 1M: hòa tan 0,9248g IA trong 5 mL nước cất hai lần Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng

- Dung dịch dithiothreitol (DTT) 200mM: cân 3,0862g DTT vào cốc có mỏ 100mL, thêm khoảng 70mL H2O, khuấy đến tan hoàn toàn, chuyển vào bình định mức 100mL và định mức đến vạch bằng nước cất hai lần

- Dung dịch đệm chiết 1 (đệm TRIS- HCl pH 8,2): cân 1,5006g TRIS vào cốc có mỏ 500mL, thêm khoảng 400mL H2O, khuấy đến tan hoàn toàn,

- Dung dịch NH4HCO3 100 mM: cân 0,7920g NH4HCO3 vào cốc có mỏ 100mL, thêm khoảng 80 mL H2O, khuấy đến tan hoàn toàn, chuyển vào bình định mức 100mL và định mức đến vạch bằng nước cất hai lần

- Dung dịch NH4HCO3 200 mM: cân 0,1581g NH4HCO3 vào cốc 10mL, thêm khoảng 7mL H2O, lắc đến tan hoàn toàn, chuyển vào bình định mức 10mL và định mức đến vạch bằng nước cất hai lần

- Dung dịch CH3COOH 50mM: Hút 285mL CH3COOH băng vào bình định mức 100mL, định mức đến vạch bằng nước cất hai lần

- Dung dịch Trypsin 1 (4 mg/mL trong CH3COOH 50 mM): cân 40mg trypsin vào cốc 10 mL, thêm khoảng 8 mL dung dịch CH3COOH 50 mM, lắc nhẹ đến tan hoàn toàn, chuyển vào bình định mức 10mL và định mức đến vạch bằng dung dịch CH3COOH 50mM Bảo quản ở -20oC

- Pha động acid formic (kênh B): Hút 1 mL acid formic vào bình định mức 1L và định mức đến vạch bằng nước cất hai lần

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp sàng lọc đồng thời một số dị nguyên trong thực phẩm bằng LC-MS/MS

2.3.1.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Khảo sát và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu tối ưu:

- Khảo sát dung dịch đệm chiết xuất protein

- Khảo sát nồng độ trypsin thủy phân protein

18

- Khảo sát thời gian thủy phân

2.3.1.2 Khảo sát các điều kiện phân tích

- Khảo sát điều kiện khối phổ: Xác định các ion mẹ, ion con của từng peptid

và các thông số tối ưu ở chế độ MRM

- Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: các điều kiện tách sắc ký bao gồm cột sắc

ký, dung môi pha động

2.4.1.1 Quy trình xử lý mẫu dự kiến

Chất béo trong các mẫu gây ảnh hưởng đến hiệu suất chiết protein và giảm hiệu quả quá trình thủy phân protein bằng enzym, do đó cần loại béo trước khi thực hiện bước chiết protein ra khỏi nền mẫu Nền mẫu casein và lòng trắng trứng chứa hàm lượng chất béo rất thấp nên không cần thực hiện bước loại béo

Loại béo các mẫu hạt lạc, hạt óc chó, hạt đậu tương bằng phương pháp chiết soxhlet Quy trình loại béo như sau: cân chính xác khoảng 5g mẫu, cho vào ống chiết của máy chiết béo bán tự động VELP, chiết mẫu bằng n- hexan, chiết 3 tiếng, sau khi chiết xong lấy phần bã và làm khô trong chân không để thực hiện các bước

xử lý mẫu tiếp theo

Tham khảo tài liệu [4], [10], các mẫu sau khi loại béo bằng phương pháp chiết Soxhlet được xử lý theo quy trình dự kiến ban đầu như hình 2.1

19

Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu dự kiến ban đầu

Lắc xoáy 5 phút, Siêu âm 10

20

2.4.1.2 Khảo sát dung dịch đệm chiết xuất protein

Dung dịch đệm chiết quyết định lượng protein hòa tan được chiết ra khỏi mẫu Trên cơ sở các nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới, hai điều kiện chiết protein từ mẫu đã được khảo sát:

- Đệm chiết 1, theo Heick và cộng sự [10]: Chiết protein bằng dung dịch đệm TRIS-HCl pH 8,2

- Đệm chiết 2, theo Boo và cộng sự [4]: Chiết protein bằng dung dịch đệm TRIS đẳng trương 50 mM có thêm ure 2M và DTT 25 mM

Sau khi xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl, dịch chiết protein được pha loãng tới nồng độ khoảng 1 mg/mL để tiếp tục tiến hành bước thủy phân protein

2.4.1.3 Khảo sát điều kiện thủy phân protein bằng enzym

Trypsin là enzym được nhiều nghiên cứu sử dụng để thủy phân protein Trong giai đoạn thủy phân, hai yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

là nồng độ enzym và thời gian thủy phân mẫu, do đó nghiên cứu tập trung khảo sát hai điều kiện thủy phân sau:

- Nồng độ trypsin thủy phân protein

- Thời gian thủy phân

2.4.2 Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần

2.4.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ

Mỗi peptid lựa chọn 1 ion mẹ và 2 ion con ở chế độ MRM, nguồn ion hóa ESI (+) , chọn 1 ion con có tín hiệu cao hơn là ion định tính

2.4.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng

Khảo sát các điều kiện tách sắc ký qua cột sắc ký C18 (150 mm × 4,6 mm × 3,5 µm) với 3 chương trình dung môi pha động khác nhau

- Mẫu trắng không được cho tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích Bột

mì được sử dụng làm mẫu trắng trong nghiên cứu do nó là thành phần chủ yếu trong nhiều loại bánh ăn dặm và bánh kẹo

- Thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn phải tương ứng với thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ mẫu chuẩn Độ lệch thời gian lưu không được quá 5%

Ngoài ra, độ đặc hiệu còn được thẩm định thông qua điểm nhận dạng (IP) yêu cầu có tối thiểu 4 điểm IP và tỉ lệ ion của mỗi peptid phải đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn 657/2002/EC của Ủy ban châu Âu

2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ S/N, LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3) Phân tích lặp lại mỗi mẫu 6 lần để đảm bảo độ tin cậy của giá trị LOD

Trong nghiên cứu này, LOD được xác định là giới hạn phát hiện các dị nguyên thực phẩm (sữa, trứng, hạt lạc, hạt đậu tương và hạt óc chó) có mặt trong các mẫu thực phẩm

2.4.4 Phương pháp xử lý kết quả

Kết quả phân tích trên thiết bị được xử lý bằng phần mềm Mass Hunter của Agilent

Kết quả thẩm định được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel

2.4.5 Phương pháp lấy mẫu

- Lấy mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên

- Tổng số mẫu: 30 mẫu

- Địa điểm lấy mẫu: Các chợ và cửa hàng ở Hà Nội

22

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xây dựng phương pháp sàng lọc đồng thời một số dị nguyên trong thực phẩm bằng LC-MS/MS

3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần

3.1.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ

Mẫu chuẩn đối chứng được chuẩn bị như quy trình trong hình 2.1, mục

2.4.1.1, và thực hiện khảo sát trên thiết bị LC-MS/MS loại ba tứ cực Điều kiện

tối ưu lựa chọn ion mẹ, ion con cho từng dị nguyên được khảo sát tham khảo theo nghiên cứu [10] Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ion mẹ và ion con của từng protein

TT Dị nguyên Protein Ion mẹ

(m/z)

Điện tích

Ion con (m/z) CE

1 Trứng

(lòng trắng) Ovalbumin 673,4 +2

223,2 30 1095,6 25

2 Casein

Casein α S1 634,3 +2

249,2 30 991,3 23 Casein α

S2 598,3 +2

158,3 25 911,4 20

5 Hạt óc chó Jug r1 688,2 +2 477,2 30

1147,4 25

Nhận xét: Các kết quả thu được cho thấy, với mỗi dị nguyên thực phẩm có

ít nhất 1 protein đã được xác định So sánh với kết quả của các nghiên cứu trước

23

đây, có thể thấy thiết bị khối phổ ba tứ cực có thể ứng dụng để xác định các dị nguyên trong thực phẩm Đây là lần đầu tiên, kết quả xác định các dị nguyên bằng sắc ký lỏng khối phổ loại ba tứ cực được thực hiện

Chế độ ion hóa được thực hiện bằng nguồn ion hóa phun điện tử, rất phù hợp với các peptid Tuy nhiên, số khối lớn của các phân mảnh của peptid có thể ảnh hưởng đến khả năng thu được ion mẹ ở chế độ ion hóa với điện tích bằng +1 Do

đó, điện tích bằng +2 đã được sử dụng trong nghiên cứu và thu được các kết quả phù hợp

Thực hiện cố định các điều kiện như trên để xác định các thông số khác của thiết bị khối phổ Hỗn hợp chuẩn các dị nguyên được bơm trực tiếp vào MS cùng với dòng pha động gồm acid formic 0,1% trong nước và ACN (tỉ lệ 50:50, v/v), tốc độ dòng 0,5 mL/phút Khảo sát tự động các thông số: thế ion hóa (ISV), nhiệt

độ nguồn ion (TEM), áp suất khí nguồn 1 (GS1), áp suất khí nguồn 2 (GS2), áp suất khí màng (CUR), áp suất khí (CAD) Các thông số đã được chọn tối ưu và trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Các thông số đã được khảo sát của MS

STT Thông số Giá trị tối ưu

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng

Cột sắc ký pha đảo C18 được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu, phù hợp với chất cần phân tích là các peptid phân cực tan trong nước Cột sắc ký C18 150mm x 4,6mm x 3,5µm và tiền cột tương ứng được lựa chọn sử dụng cho nghiên cứu này

24

Pha động gồm hỗn hợp ACN và acid formic với các tỷ lệ khác nhau được khảo sát:

- Khảo sát 1: kênh A là acid formic 0,05% và ACN 10% trong nước; kênh B

là acid formic 0,05% trong ACN, gradient trong 16 phút

- Khảo sát 2: kênh A là acid formic 0,1% trong nước; kênh B là acid formic 0,1% trong ACN, chạy đẳng dòng tỷ lệ 99,5A : 0,5B trong 15 phút

- Khảo sát 3: kênh A là acid formic 0,1% trong nước; kênh B là ACN, gradient trong 15 phút

Kết quả khảo sát pha động cho thấy khi sử dụng pha động là hỗn hợp acid formic 0,1% trong nước và acetonitril cho các pic có thời gian lưu phù hợp, có kha năng tách ra khỏi nền mẫu và các tạp tốt nhất, do đó pha động được lựa chọn như bảng 3.3

Bảng 3.3 Chương trình gradient pha động

Thời gian (phút)

Acid formic 0,1%

(%)

Acetonitril (%)

8,5 10 90

12 10 90 12,5 95 5

Với điều kiện gradient đã được khảo sát lựa chọn, kết quả phân tích hỗn hợp chuẩn được trình bày ở hình 3.1 và 3.2

25

Hình 3.1 Sắc đồ của từng dị nguyên (A: Casein α S1; B: Casein α S2; C: Ovalbumin từ lòng trắng trứng; D: Ara h1

từ lạc; E: Ara h3 từ lạc; F: Glycinin từ đậu tương; G: Jug r1 từ hạt óc chó)

26

Hình 3.2 Sắc đồ tổng của các dị nguyên

Nhận xét: Từ sắc ký đồ cho thấy các pic sắc ký hoàn toàn tách khỏi nền

mẫu, không có các tạp chất ở gần thời gian lưu của các chất Tuy về mặt sắc ký, các chất không tách hoàn toàn nhưng trên sắc đồ của từng chất đã có thể phân biệt từng loại dị nguyên dựa vào số khối

3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

3.1.2.1 Khảo sát dung dịch đệm chiết protein

Thực hiện khảo sát trên nền mẫu trắng bột mì thêm chuẩn từng dị nguyên casein, lòng trắng trứng, hạt lạc, đậu tương, óc chó nồng độ 100 mg/g Quy trình chiết mẫu ban đầu được tóm tắt trong hình 3.3

Hình 3.3 Quy trình chiết xuất protein dự kiến ban đầu

Lắc xoáy 5 phút, Siêu âm 10

Chiết 2 lần Cân 1g mẫu/ ống ly tâm 15ml