Xây dựng phương pháp định lượng 2MCPD ester và 3MCPD ester trong sữa bột công thức bằng GC MSMS

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 AOAC Association of Official Analytical Communities Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức 2 AOCS American Oil Chemists' Society Hiệp hộ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NHƯ THƯỢNG

MSV: 1401600

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 2-MCPD ESTER VÀ 3-MCPD ESTER TRONG SỮA BỘT CÔNG THỨC BẰNG GC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Đề tài này được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm

Quốc gia, 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thùy

Linh và ThS Vũ Ngọc Tú đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong

quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích trường

Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt, cung cấp cho tôi những kiến thức cần thiết,

bổ ích và thiết thực

Đồng thời tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh

thực phẩm Quốc gia, TS Trần Cao Sơn cùng các cán bộ khoa Độc học dị nguyên,

Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện và giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, đặc

biệt là các bạn Hoàng Mai Anh, Phạm Trung Anh, Vũ Thị Thu Hiền, Lê Công

Trực đã luôn ở bên quan tâm, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Trong quá trình thực hiện đề tài, do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm

thực tiễn còn hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót Rất mong

nhận được sự góp ý của thầy cô cùng các bạn sinh viên

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Như Thượng

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về dẫn xuất của MCPD 2

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý 2

1.1.2 Nguồn gốc 3

1.1.3 Độc tính 5

1.1.4 Quy định hiện hành về MCPD 8

1.2 Phương pháp xác định các dẫn chất của MCPD 8

1.2.1 Phương pháp xử lý mẫu 8

1.2.1.1 Chiết lỏng – lỏng 8

1.2.1.2 Làm sạch mẫu 9

1.2.1.3 Thủy phân 9

1.2.1.4 Dẫn xuất 10

1.2.2 Phương pháp phân tích 10

1.3 Tổng quan về sắc ký khí khối phổ 12

1.3.1 Sắc ký khí 12

1.3.2 Detector khối phổ 13

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15

2.1.3 Hóa chất 15

2.1.4 Pha dung dịch chuẩn 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu 16

2.2.2 Phương pháp phân tích 17

2.2.3 Phương pháp thẩm định 17

2.2.3.1 Độ phù hợp hệ thống 17

2.2.3.2 Tính chọn lọc 17

2.2.3.3 Giới hạn pháp hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 18

2.2.3.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 18

2.2.3.5 Độ lặp lại và độ thu hồi 19

2.2.4 Phương pháp xử lý kết quả 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Khảo sát, lựa chọn các điều kiện GC-MS/MS 20

3.1.1 Điều kiện sắc ký khí 20

3.1.2 Điều kiện khối phổ 20

3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 21

3.2.1 Khảo sát quy trình chiết lỏng – lỏng 22

3.2.2 Khảo sát quy trình làm sạch 24

3.2.3 Khảo sát quy trình dẫn xuất 24

3.3 Thẩm định phương pháp 27

3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 27

3.3.2 Tính chọn lọc 28

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 30

3.3.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 32

3.3.5 Độ lặp lại và độ thu hồi 34

3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 35

3.5 Bàn luận 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

Kết luận 39

Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 AOAC Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội

các cộng đồng phân tích chính thức)

2 AOCS American Oil Chemists' Society (Hiệp hội các nhà hóa dầu

Mỹ )

3 BfR The German Federal Institute for Risk Assessment (Viện

đánh giá rủi ro liên bang Đức)

4 CE Collision energy (Năng lượng va chạm)

5 EFSA European Food Safety Authority (Ủy ban an toàn thực phẩm

Châu Âu)

6 ECD Electron capture detector (Detector cộng kết điện tử)

7 EI Electron impact (Va chạm electron)

8 FID Flame ionization detector (Detector ion hóa ngọn lửa)

9 GC-MS Gas chromatography mass spectrometry (Sắc ký khí khối

phổ)

10 GC-MS/MS Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký khí

khối phổ hai lần)

11 IP Identification point (Điểm nhận dạng)

12 IS Internal standard (Chất chuẩn nội)

13 LC-MS Liquid chromatography mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối

phổ)

14 LC-MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký

lỏng khối phổ hai lần)

15 LD 50 Median lethal dose (Liều chết trung bình)

16 LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

17 LOQ Limit of Quatification (Giới hạn định lượng)

18 MCPD Monochloropropanediol

19 NCI Negative chemical ionization (Ion hóa hóa học âm)

20 NPD Nitrogen phosphorus detector ( Detector nitơ phosphor)

21 PBA Phenylboronic acid

22 PCI Positive chemical ionization (Ion hóa hóa học dương)

23 SCF Scientific Committee for Food (Ủy ban Khoa học về Thực

phẩm Châu Âu)

24 SPE Solid phase extraction (Chiết pha rắn)

25 TCD Thermal conductivity detector (Detector dẫn nhiệt)

26 TDI Tolerable daily intake (mức dung nạp hàng ngày chấp nhận

được)

27 THF Tetrahydrofuran

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Một số phương pháp xác định MCPD ester 11

2 Bảng 2.1 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion 18

4 Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống của 3-MCPD 27

5 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống của 2-MCPD 27

6 Bảng 3.4 Số điểm IP của 3-MCPD, 2-MCPD 30

7 Bảng 3.5 Bảng tỷ lệ ion của 3-MCPD, 2-MCPD 30

10 Bảng 3.8 Độ lặp lại và thu hồi của 3-MCPD và 2-MCPD ở

mức thêm chuẩn 25 µg/kg, 62,5 µg/kg và 125 µg/kg 34

11 Bảng 3.9 Kết quả phân tích các mẫu sữa bột thực tế 35

12 Bảng 3.10 Đánh giá hàm lượng 3-MCPD ester trong sữa bột

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo của 3-MCPD 2

2 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của 2-MCPD 2

3 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của 2-MCPD ester và 3-MCPD ester 3

4 Hình 1.4 Sự tạo thành MCPD từ triacylglycerols 4

5 Hình 1.5 Sơ đồ chuyển hóa 3-MCPD trong cơ thể 6

6 Hình 1.6 Các dẫn xuất hình thành từ phản ứng của 3-MCPD với

9 Hình 3.2 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến 22

10 Hình 3.3 Biểu đồ khảo sát quy trình chiết lỏng – lỏng 23

11 Hình 3.4 Biểu đồ khảo sát quy trình làm sạch 24

12 Hình 3.5 Biểu đồ khảo sát quy trình dẫn xuất 25

13 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu tối ưu 26

14 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Monochloropropanediol (MCPD) và các ester của nó với acid béo được hình

thành trong quá trình chế biến và sản xuất các loại thực phẩm như nước tương, xì

dầu, dầu hào, dầu ăn, mỡ, bánh bông lan, sữa… trong điều kiện nhiệt độ cao và

có mặt ion chlor MCPD ester sau khi vào cơ thể sẽ bị enzym lipase tuyến tụy

thủy phân về dạng tự do Hiện tại có rất ít thông tin về độc tính của 2-MCPD, tuy

nhiên 2-MCPD có cấu trúc tương tự với 3-MCPD MCPD đã được chứng minh là

gây ung thư trên động vật thí nghiệm, 3-MCPD đã được phân loại là chất có khả

năng gây ung thư ở người

Ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã đồng ý với ước tính 100%

hấp thu 3-MCPD ở người là từ dạng ester Ủy ban Khoa học về Thực phẩm (SCF)

đã đề xuất mức dung nạp hàng ngày chấp nhận được (TDI) là 2 µg/kg trọng lượng

cơ thể đối với 3-MCPD Do đó, việc kiểm soát hàm lượng của các MCPD ester

trong các sản phẩm sữa bột công thức là rất cần thiết Đặc biệt, đối với đối tượng

nhạy cảm như trẻ nhỏ, việc kiểm soát hàm lượng các MCPD ester giúp phòng

ngừa nguy cơ mắc ung thư, bảo vệ sức khỏe của trẻ

Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về các phương pháp xác định

MCPD và các ester của MCPD trong các loại thực phẩm Tuy nhiên, ở Việt Nam

lĩnh vực này mới được quan tâm gần đây và mới chỉ có phương pháp tiêu chuẩn

áp dụng cho phân tích các mẫu nước tương, xì dầu và dầu hào Do đó, đề tài “ Xây

dựng phương pháp định lượng 2-MCPD ester và 3-MCPD ester trong sữa bột

công thức bằng GC-MS/MS” được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng 2-MCPD ester và 3-MCPD

ester trong sữa bột công thức bằng GC-MS/MS

2 Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá hàm lượng 2-MCPD ester và

3-MCPD ester trong một số sản phẩm sữa bột công thức

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về dẫn xuất của MCPD

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý

Trong thực phẩm, dẫn chất MCPD tồn tại chủ yếu ở dạng tự do và dạng liên kết ester với các acid béo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của 3-MCPD

Danh pháp IUPAC: 3-chloropropane-1,2-diol

Tồn tại dưới dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân (R) và (S)

Tính chất hóa lý

Khối lượng phân tử: 110,537; là chất lỏng, không màu hoặc có màu vàng; nhiệt độ nóng chảy: 40oC; nhiệt độ sôi: 213oC (760 mmHg); tỉ trọng: 1,32; tan tốt trong cả nước, ethanol, methanol, chloroform và ethyl acetat

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của 2-MCPD

Danh pháp IUPAC: 2-chloropropane-1,3-diol

Tính chất hóa lý

Khối lượng phân tử: 110,537; là chất lỏng, không màu hoặc có màu vàng; nhiệt độ sôi: 146oC (18 mmHg); tỉ trọng: 1,32; tan tốt trong cả nước, ethanol, methanol, chloroform và ethyl acetat

Ester có thể được hình thành ở một trong hai hoặc cả hai vị trí hydroxyl tự

do của MCPD với bất kỳ acid béo tự nhiên nào trong mẫu

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của 2-MCPD ester và 3-MCPD ester

- Ester acid béo của 3-MCPD và 2-MCPD hoà tan trong các dung môi không phân cực, tan kém trong nước

- Có thể được giả định rằng, MCPD monoester có độ hòa tan cao hơn diester trong dung môi phân cực, việc tăng chiều dài chuỗi acid béo trong cả hai mono

và diester làm giảm độ hòa tan trong dung môi phân cực và làm tăng độ hòa tan trong các dung môi không phân cực [8]

- Việc xác định các ester của acid béo với 3-MCPD và 2-MCPD rất phức tạp do nhiều gốc acid béo và sự đa dạng về cấu trúc

1.1.2 Nguồn gốc

- Các dẫn chất của MCPD được hình thành trong quá trình chế biến và sản xuất một số loại thực phẩm Sự hiện diện của chúng được phát hiện lần đầu tiên vào những năm 1980, bên trong thành phần của acid thủy phân protein thực vật

(hydrolyed vegetable protein) được sử dụng như một chất tăng vị mặn trong thành phần thực phẩm Một vài các dẫn chất của MCPD đã được phát hiện trong các hệ thống mô hình nghiên cứu tiếp theo Các hợp chất dễ bay hơi chính được tìm thấy

là 3-chloropropan-1-ol, 1,3-dichloropropan-2-ol, 2,3-dichloropropan-1-ol Các chloropropanols không bay hơi được tìm thấy là 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD), 2-monochloropropane-1,3-diol (2-MCPD) và các ester của chúng với acid béo [27]

- Một số nghiên cứu về việc hình thành MCPD đã được thực hiện, tuy cơ chế tạo thành MCPD vẫn chưa rõ ràng nhưng kết quả đã chỉ ra rằng trong thực phẩm

có yếu tố: nguồn chất béo, xử lý nhiệt và một lượng nhỏ nước, MCPD được hình thành từ glycerol và acylglycerols với ion chlorid

- Cơ chế hình thành MCPD liên quan đến tạo ion trung gian cyclic acyloxonium Glycerol được proton hóa bằng acid hydrochloric ở nhóm hydroxyl thứ nhất và thứ hai để tạo thành ion alkyloxonium Nước được loại đi từ vị trí đầu tiên của cations hydroxyl alkyloxonium tạo thành hỗn hợp racemic của 3-MCPD Nếu nước được loại đi từ vị trí thứ 2 của ion hydroxyl alkyloxonium sau đó phản ứng với chlorid sẽ tạo thành 2-MCPD [7]

Hình 1.4 Sự tạo thành MCPD từ triacylglycerols

- Sự tạo thành 3-MCPD và 2-MCPD từ glycerol và acylglycerols tăng khi tăng nồng độ muối, đạt mức tối đa khi hàm lượng nước khoảng 15%, và được hình thành từ triacylglycerols nhiều hơn so với glycerol Trong trường hợp không

có nước, sẽ không có sự thủy phân trước của nhóm acyl và 3-MCPD được hình thành bởi sự thay thế trực tiếp nhóm hydroxyl glycerol bằng ion chlorua [8]

- Dưới điều kiện nhiệt độ cao và sự có mặt của nước, triacylglycerols sẽ thủy phân tạo hỗn hợp các đồng phân của diacylglycerol (1,2-diacylglycerol, 1,3-diacylglycerol) cũng như monoacylglycerol (1-acylglycerol, 2-acylglycerol) Các acylglycerols phản ứng với chlorua sau đó ester hóa Tốc độ ester hóa tăng lên ở nhiệt độ cao nhưng tỉ lệ phân hủy cũng tăng [25, 26]

- Các acid béo ester hóa phụ thuộc vào loại dầu, những phổ biến nhất là acid lauric, acid myristic, acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic và acid linolenic [8]

- Trong sữa bột công thức, dẫn chất của MCPD tồn tại chủ yếu dưới dạng ester và không có dạng tự do [8, 21, 33]

2,3-ra oxalic acid

Các chất chuyển hóa của 3-MCPD là chất gây độc với cơ thể:

- β-chlorolactic acid: làm giảm khả năng di chuyển của tinh trùng, giảm pH môi trường mào tinh

- Mercapturic acid: gây độc tính đối với thận

- Oxalic acid: tạo dạng muối calci oxalate gây viêm cầu thận, tắc nghẽn tủy tuyến thượng thận

Hình 1.5 Sơ đồ chuyển hóa 3-MCPD trong cơ thể

Chú thích: ADH: alcohol dehydrogenase; ALDH: dehydrogenase aldehyde;

DHPMA: 2,3-dihydroxypropylmercapturic acid

- Liều gây chết 50% (LD50) động vật thí nghiệm được báo cáo là: 150 mg/kg thể trọng [18]

- Tiếp xúc kéo dài với liều 2 mg/kg thể trọng mỗi ngày gây độc tính tiến triển trên thận (đặc trưng bởi tăng sản ống thận), độc với tinh hoàn (teo, viêm động mạch), tăng sản tuyến vú ở chuột [8]

- Độc tính trên thận

Độc tính được báo cáo là chỉ quan sát thấy trên đồng phân R của 3-MCPD [24] Tiêm phúc mạc đơn liều 120 mg/kg cho chuột đực gây suy thận và tử vong thường là trong một tuần sau khi tiêm Liều 100 mg/kg gây lợi tiểu kèm theo protein niệu và glucose niệu cao, kéo dài 7-15 ngày [19]

- Độc tính trên huyết học

Liều 30 mg/kg thể trọng cho chuột mỗi ngày làm suy giảm chức năng hồng cầu bằng cách làm giảm hàm lượng hemoglobin gây thiếu máu đẳng sắc Liều 30 mg/kg thể trọng khỉ nâu gây ức chế tủy xương nghiêm trọng [18]

- Độc tính đối với hệ thần kinh

Không có biểu hiện độc tính ở hệ thần kinh với chế độ liều 10, 20 hoặc 30 mg/kg thể trọng [17]

- Độc tính đối với hệ sinh sản

Liều khoảng 5 mg/kg thể trọng mỗi ngày làm suy giảm khả năng sinh sản ở chuột đực mà không làm thay đổi sản xuất tinh trùng ở chuột Hiệu ứng này được chứng minh là có thể hồi phục Liều cao 90 mg/kg thể trọng mỗi ngày làm suy giảm vĩnh viễn khả năng sinh sản ở chuột bằng cách ngăn cản khả năng di chuyển của tinh trùng từ tinh hoàn [8, 16]

- 3-MCPD liều cao kéo dài gây ung thư ở chuột Có ý kiến cho rằng tỉ lệ mắc ung thư tế bào Leydig và u ở tuyến vú là kết quả của sự mất cân bằng nội tiết tố, các khối u ở thận là do tiến triển mạn tính liên quan đến tích tụ acid oxalic

- Ủy ban Khoa học về Thực phẩm (SCF) kết luận không có bằng chứng gây ung thư in vivo của 3-MCPD, 3-MCPD nên được xem là chất gây ung thư không thay đổi cấu trúc gen

- Có rất ít thông tin về độc tính ngắn hạn của 2-MCPD

- Tuy nhiên, nhiều liều 16 hoặc 30 mg/kg thể trọng mỗi ngày, uống 28 ngày gây ra tổn thương nghiêm trọng dẫn đến chết tế bào cơ vân, đặc biệt là ở tế bào

cơ tim, dẫn đến suy tim gây chết của một số động vật [8]

- Kể từ ngày thứ 8 ảnh hưởng thận bao gồm gia tăng lợi tiểu, tăng trọng lượng thận và thay đổi mô bệnh học ở ống thận đã được quan sát ở liều cao nhất được thử nghiệm (30 mg/kg thể trọng mỗi ngày) [8]

- Không có độc tính gây ung thư được nghiên cứu thấy trên 2-MCPD

Quyết định 11/2005/QĐ-BYT ngày 25/03/2005: Hàm lượng 3-MCPD không vượt quá 1 mg/kg trong nước tương, xì dầu và dầu hào Chưa có thông tin về quy định trên các sản phẩm khác [2]

1.2 Phương pháp xác định các dẫn chất của MCPD

1.2.1 Phương pháp xử lý mẫu

❖ Chiết lỏng – lỏng

- Các mẫu sữa bột công thức được hòa tan vào trong nước và có thể sử dụng

kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để chuyển MCPD ester sang pha hữu cơ [32, 33]

- Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng với chất nhồi có thể được sử dụng Mẫu sữa bột công thức được đồng nhất và hấp phụ vào lớp nước bao quanh các hạt nhồi (polyacrylic acid hặc polyacrylat và cát có cỡ hạt 50-70 mesh) [12, 30], sau đó chiết lại bằng dung môi thích hợp Thường sử dụng kỹ thuật chiết pha lỏng tự động cao áp

- Phương pháp chiết sử dụng các dung môi thông thường như những phương pháp chiết khác nhưng hoạt động ở áp suất và nhiệt độ tương đối cao (150 bar; 100-180oC) Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán hiệu quả hơn Dựa trên nguyên tắc, nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng, người ta tăng áp suất và đưa nhiệt độ của dung môi lên cao nhưng chưa tới vùng giới hạn Cần sử dụng thiết bị chuyên dụng như ASE [12] hoặc PLE [30]

- Tương tự như chiết lỏng – lỏng thông thường Mẫu được chiết với diethyl ether và petroleum ether, thu pha hữu cơ có chứa MCPD ester [13] Tuy nhiên, thời gian đợi tách lớp giữa quá trình chiết là tương đối dài (30 phút)

1.2.1.2 Làm sạch mẫu

Chiết pha rắn (SPE)

- Phương pháp chiết pha rắn được ứng dụng rất phổ biến trong phân tích hàm lượng vết do khả năng làm sạch và làm giàu mẫu rất tốt Dung dịch mẫu được dội lên cột chiết Pha tĩnh nhồi trong cột sẽ tương tác với các chất và giữ một nhóm chất cần phân tích lại trên cột, các nhóm chất khác ra khỏi cột theo dung môi hòa tan Một dung môi hoặc hệ dung môi hòa tan tốt chất phân tích được sử dụng để rửa giải, thu lấy dung dịch có chất phân tích để định lượng

- Mẫu chiết lỏng – lỏng thông thường thường sau đó được chiết pha rắn để làm sạch Mẫu được thêm chất chuẩn đồng vị của ester trước khi qua cột Một số cột đã được nghiên cứu: Fuyu SLE alkaline diatomite, Agela Cleanert, Agilent ChemElut™, Merk Extrelut NT3 [28], cột silica gel 60 [33] đều cho hiệu suất thu hồi đạt trên 90%

1.2.1.3 Thủy phân

Hầu hết các phương pháp sử dụng dung dịch acid hoặc kiềm trong methanol

Có thể thủy phân liên kết ester bằng sodium hydroxide hoặc sodium methoxide trong thời gian ngắn ở nhiệt độ thấp sau đó dừng phản ứng bằng muối không chứa chlor trong môi trường acid [20, 29] Cũng có thể thủy phân bằng sulfuric acid trong 16h, dừng phản ứng bằng muối không chứa chlor trong môi trường kiềm [6, 10] Một số nghiên cứu sử dụng enzym lipase để thủy phân liên kết ester [23]

Nhiệt độ và thời gian là hai yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân do 3-MCPD và glycidol không ổn định và có thể chuyển dạng lẫn nhau [20] Cần dùng muối không chứa chlor để ngăn cản việc glycidol phản ứng với chlor tạo thành một lượng nhỏ 3-MCPD

1.2.1.4 Dẫn xuất

MCPD có cấu trúc hóa học tương đối đơn giản tuy nhiên có một số đặc điểm làm cho MCPD gặp khó khăn trong phân tích: không có nhóm mang màu, điểm sôi cao, trọng lượng phân tử thấp, vì vậy để phân tích bằng GC-MS cần dẫn xuất MCPD nhằm tăng khối lượng phân tử để giảm bớt ảnh hưởng của nền mẫu MCPD có thể dẫn xuất với aceton [22], 4-heptanon [9], cyclohexanon [5],heptafluorobutyrylimidazole (HFBI), acid heptafluorobutyric (HFBA) [4, 28, 31] hoặc PBA [10, 11, 30, 32, 33] Trong đó hiện nay phương pháp tạo dẫn xuất với PBA được áp dụng phổ biến nhất

thể được tách và phát hiện bằng sắc ký lỏng Tuy nhiên cần sử dụng một lượng lớn các chất chuẩn do sự đa dạng trong cấu trúc của 2-MCPD ester và 3-MCPD ester, do vậy phương pháp này ít được sử dụng Hiện nay, MCPD ester chủ yếu được xác định gián tiếp thông qua dạng tự do của chúng

Viện đánh giá rủi ro liên bang Đức (BfR) đã phát triển 2 phương pháp phân

tích MCPD và MCPD ester cho các mẫu sữa bột, kem dâu, bánh bông lan, bánh

mì, onion mỡ lợn, sốt mayonnaise Hiệp hội các nhà hóa dầu Mỹ (AOCS) cũng

đã phát triển 3 phương pháp để định lượng MCDP, MCPD ester, glycidol, glycidol esters được công nhận và sử dụng rộng rãi

Bảng 1.1 Một số phương pháp xác định MCPD ester

Phương

LOD - LOQ (µg/kg)

Tham khảo

LOD: 30 LOQ: 90 [28]

LC-MS/MS Sữa bột

Phân tích trực tiếp, sử dụng nhiều chuẩn MCPD ester LOQ: 400 [21] LC–

TOFMS

Dầu thực vật

Phân tích trực tiếp, sử dụng nhiều chuẩn MCPD ester

LOD:

160-1690 [15] Phương pháp phân tích gián tiếp MCPD ester thông qua dạng tự do bằng GC-MS có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp phân tích trực tiếp như giảm được giới hạn định lượng, giảm chi phí hóa chất mà vẫn đáp ứng được yêu cầu quy định

1.3 Tổng quan về sắc ký khí khối phổ

Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống GC-MS

1.3.1 Sắc ký khí

Sắc ký khí (GC) dựa trên nguyên tắc chung của kỹ thuật sắc ký, là sự phân

bố khác nhau của chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh Pha động trong GC thường sử dụng một số khí trơ (He, Ar, N2 ) Pha tĩnh được chứa trong cột, có thể là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất mang trơ dạng rắn hay phủ đều lên thành phía trong của cột Kỹ thuật sắc ký khí ứng dụng tốt đối với các chất phân tích ít hoặc không phân cực, dễ bay hơi, nhiệt độ sôi thường nhỏ hơn 500°C Các chất phân cực, ít bay hơi cần dẫn chất với thuốc thử thích hợp để tạo dẫn xuất

ổn định, dễ bay hơi và ít phân cực trước khi phân tích bằng sắc ký khí [1, 14]

❖ Khí mang (Carrier gas)

Hệ thống khí mang trong sắc ký khí thường là các khí trơ như heli, hydro, argon, carbonic, nitơ Khí mang cần đáp ứng một số yêu cầu cơ bản như: trơ về hóa học, rẻ, sẵn có, tinh khiết (99,995%- 99,9995%), không gây cháy nổ, phù hợp với detector [1]

❖ Hệ thống tiêm mẫu (Sample injection systems)

Mẫu được tiêm vào hệ thống sắc ký thông qua buồng tiêm mẫu Trong sắc

ký khí có thể sử dụng bộ tiêm mẫu trực tiếp, bộ tiêm mẫu chia dòng hoặc không chia dòng, bộ tiêm mẫu hóa hơi trương trình nhiệt độ [14]

❖ Cột và lò

Trong sắc ký khí có hai loại cột chủ yếu là cột nhồi và cột mao quản Trong

đó, cột mao quản có tính ứng dụng cao nên được sử dụng phổ biến hơn Trước đây người ta sản xuất hai dạng cột mao quản WCOT (pha tĩnh là chất lỏng bao quanh mặt trong thành cột) và SCOT (cột với lớp chất mang pha tĩnh) Dựa vào

sự phát triển của công nghệ cáp sợi quang, cột WCOT được cải tiến với nhiều tính năng ưu việt và cho hiệu lực tách tốt [1]

Cột phân tích được đặt trong lò, lò có nhiệm vụ điều khiển nhiệt độ cột theo chương trình nhiệt độ thích hợp, có thể là đẳng nhiệt, gradien nhiệt hoặc kết hợp

cả hai để tách chất phân tích [1]

❖ Detector

Detector là bộ phận có nhiệm vụ phát hiện chất phân tích, chuyển tín hiệu của chất phân tích thành các tín hiệu điện có thể đo lường được Một số detector thường dùng trong sắc ký khí gồm detector ion hóa ngọn lửa (FID), detector dẫn nhiệt (TCD), detector cộng kết điện tử (ECD), detector nitơ photphor (NPD) và detector khối khổ (MS) [1, 14]

1.3.2 Detector khối phổ

Khối phổ (MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích ion (m/z)

từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Detector MS có độ nhạy và độ chọn lọc cao, rất thích hợp trong phân tích hàm lượng vết [14]

Cấu tạo của máy khối phổ gồm 3 phần là bộ nguồn ion, bộ phân tích khối và

bộ phận phát hiện Mẫu từ máy sắc ký khí chuyển vào máy khối phổ sẽ được ion hóa ở bộ nguồn ion, các ion được tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector

- Ion hóa hóa học ( Chemical ionization, CI): Là kỹ thuật ion hóa “mềm”, sử dụng một thuốc thử khí (methan, amoniac ) va chạm với chùm electron năng lượng cao để tạo ra các ion hoặc gốc tự do Các điện tử này va chạm với chất phân tích và ion hóa chất phân tích Dựa vào đặc điểm của chất phân tích mà có thể sử dụng kỹ thuật ion hóa hóa học dương (PCI) hoặc ion hóa hóa học âm (NCI) [14]

❖ Bộ phân tích khối

- Sau khi đã được ion hoá, các ion được đưa đến bộ phân tích khối nhằm lựa chọn các ion cần thiết Đặc trưng cho các ion là thông số m/z (tỷ số khối lượng trên điện tích) Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phân tích

tứ cực, bộ phân tích ba tứ cực, bộ phân tích bẫy ion, bộ phân tích thời gian bay [14]

- Kỹ thuật MS một lần có nhược điểm là không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, chịu ảnh hưởng rõ rệt của nền mẫu chất phân tích, trên phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử Kỹ thuật MS/MS không chỉ khắc phục được những nhược điểm trên mà còn tăng độ nhạy phân tích, tăng độ chính xác của kết quả phân tích, loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu [14]

- Kỹ thuật MS/MS thường được áp dụng trên bộ phân tích ba tứ cực Tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn tiền ion để chuyển đến để chuyển đến tứ cực thứ 2 (Q2) Tại Q2, các ion phân tử chạm với khí trơ (N2, Ar, He) cùng với năng lượng thích hợp phân ly tạo ra tạo ra các ion sản phẩm Sau đó, tất cả các ion sản phẩm được chuyển đến tứ cực thứ 3 (Q3) Q3 tách các ion được chuyển

từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện [14]

❖ Bộ phận phát hiện

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng điện tích di chuyển Có hai loại là nhân electron (electron multiplier) và nhân quang (photonmultiplier) [1]

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng của nghiên cứu này là 2-MCPD ester và 3-MCPD ester

Đối tượng mẫu được lựa chọn là 72 mẫu sữa bột công thức lấy tại Hà Nội, Hải Phòng, Thái Nguyên, Thừa Thiên Huế

Ethyl actat (Merck); Tetrahydrofuran (Merck); Iso octan (Merck)

Các hóa chất sử dụng đều là các hóa chất tinh khiết sử dụng cho phân tích

2.1.4 Pha dung dịch chuẩn

❖ Dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL

Cân chính xác 10 mg chuẩn 3-MCPD vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng methanol, thu được dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL Bảo quản ở -18oC, sử dụng trong 18 tháng

Cân chính xác 10 mg chuẩn 2-MCPD vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng methanol, thu được dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL Bảo quản ở -18oC, sử dụng trong 18 tháng

❖ Dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL

Cân chính xác 10 mg nội chuẩn 3-MCPD-d5 vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng methanol, thu được dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL Bảo quản ở -18oC, sử dụng trong 18 tháng

Cân chính xác 10 mg chuẩn 2-MCPD-d5 vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng methanol, thu được dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL Bảo quản ở -18oC, sử dụng trong 18 tháng

❖ Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 100 µg/mL

Hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc 3-MCPD và 1 mL dung dịch chuẩn gốc MCPD vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng methanol

2-❖ Dung dịch chuẩn làm việc

Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 100 µg/mL trong methanol

để thu được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 1; 2,5; 5; 10; 25 µg/mL Hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc 3-MCPD-d5 và 1 mL dung dịch chuẩn gốc 2-MCPD-d5 vào bình định mức 100 mL, thu được dung dịch nội chuẩn làm việc

có nồng độ 10 µg/mL

Hút 25 µL dung dịch nội chuẩn làm việc, 25 µL dung dịch chuẩn làm việc tại các nồng độ, tiến hành dẫn xuất với PBA Sau khi phản ứng kết thúc, thổi khô và hòa cắn trong 250 µL iso octan để xây dựng đường chuẩn

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu

Qua tham khảo các nghiên cứu ở trên, phương pháp chiết lỏng – lỏng đã được lựa chọn Mẫu sau đó được làm sạch bằng chiết pha rắn trước khi thủy phân

Tính tương thích hệ thống được đánh giá thông qua sự lặp lại của diện tích

pic và thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn (n=6) Giá trị RSD

(%) của thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2,0%

2.2.3.2 Tính chọn lọc

Tính đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh tín hiệu của chất phân tích trên 3 loại mẫu: Mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không được lên tín hiệu của chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn (chênh lệch không quá 5,0%)

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng (IP)

và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/2002 của Châu Âu

- Số điểm nhận dạng là tổng điểm ion mẹ và ion con, trong đó đối với kỹ thuật GC-MS/MS, mỗi ion mẹ được tính 1 điểm, mỗi ion con được tính 1,5 điểm

Số điểm nhận dạng tối thiểu phải đạt là 4 điểm

- Tỷ lệ ion là tỷ lệ phần trăm của ion con có tín hiệu thấp hơn chia cho ion con có tín hiệu cao hơn của cùng một ion mẹ Tỷ lệ ion cần đáp ứng theo bảng:

Bảng 2.1 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion

Tỷ lệ ion (%) Sai lệch cho phép (%)

2.2.3.3 Giới hạn pháp hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

LOD, LOQ được xác định dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Số lần phân tích lặp lại là 4 Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)

LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)

2.2.3.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Sau khi xác định được khoảng tuyến tính, tiến hành xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn được đánh giá qua hai tiêu chí:

- Hệ số tương quan tuyến tính R2, yêu cầu R ≥ 0,995 (hoặc R2 ≥ 0,99)

- Độ chệch của từng điểm chuẩn so với đường chuẩn, yêu cầu độ chệch không vượt quá 15%, riêng tại điểm LOQ cho phép không vượt quá 20%

Độ chệch được tính theo công thức:

∆𝑖=𝐶𝑖(𝑡𝑡) − 𝐶𝑖(𝑙𝑡)

𝐶𝑖(𝑙𝑡) × 100 Trong đó:

∆𝑖: Độ chệch của điểm chuẩn thứ i

𝐶𝑖(𝑡𝑡): Nồng độ tính được theo đường chuẩn của điểm thứ i

𝐶𝑖(𝑙𝑡): Nồng độ lý thuyết của điểm chuẩn thứ i

2.2.3.5 Độ lặp lại và độ thu hồi

Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi thông qua phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở ba mức nồng độ, mỗi mức làm lặp lại 6 lần Tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn tương đối

Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu thêm chuẩn ở 3 mức hàm lượng: 25; 62,5; 125 µg/kg

- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD (%), theo AOAC, độ lệch chuẩn tương đối tối đa chấp nhận được trong khoảng nồng độ từ

100 – 1000 µg/kg phải nhỏ hơn 15%

RSD% = S

x × 100 S = √∑𝑛𝑖=1(𝑥𝑖 − 𝑥̅)2

𝑛−1Trong đó:

𝑥𝑖: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

𝑥̅: Nồng độ trung bình tính được của n lần thử nghiệm

S: Độ lệch chuẩn

n: Số lần thử nghiệm

- Độ thu hồi trong khoảng nồng độ 100 – 1000 µg/kg yêu cầu trong khoảng

80 – 110%, độ thu hồi trong khoảng nồng độ 10 – 100 µg/kg yêu cầu trong khoảng

60 – 115% (theo AOAC) Độ thu hồi được tính theo công thức sau:

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát, lựa chọn các điều kiện GC-MS/MS

3.1.1 Điều kiện sắc ký khí

- Chuẩn MCPD được dẫn xuất với PBA và tiến hành phân tích

- Các dẫn chất PBA-3-MCPD và PBA-2-MCPD được phân tích đều là các hợp chất ít phân cực Cột sắc ký DB5-MS (30 m x 0,25 mm x 25 µm) Agilent có pha tĩnh là 5% - Phenyl – methylpolysiloxan với bản chất phân cực yếu được lựa chọn cho nghiên cứu này Trên cơ sở tham khảo một số nghiên cứu trước đây, điều kiện sắc kí khí được đưa ra như sau:

- Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 310°C

- Thể tích tiêm: 1 µL

- Chế độ tiêm mẫu: không chia dòng

- Pha động: khí heli tinh khiết 99,99%, tốc độ dòng 1,0 mL/phút

- Chương trình nhiệt độ: ban đầu 60°C (giữ 1 phút), tăng 6°C/phút lên 150°C (giữ trong 2 phút), tăng 40°C/phút lên 270°C (giữ trong 5 phút) Tổng thời gian

26 phút

3.1.2 Điều kiện khối phổ

Hình 3.1 Dẫn xuất của MCPD với PBA

Nguồn EI được sử dụng cho nghiên cứu nhằm tạo thuận lợi cho việc sử dụng rộng rãi phương pháp Sau khi xác định thời gian lưu của PBA-3-MCPD, PBA-3MCPD-d5, PBA-2-MCPD, PBA-2MCPD-d5, chế độ full scan được sử dụng để tìm các mảnh tiền ion cho từng chất Các ion này được lựa chọn làm ion mẹ để bắn phá tạo thành các ion con thông qua việc phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp

1 µg/mL Hai ion được lựa chọn cho mỗi chất, ion có cường độ cao hơn được sử dụng để định lượng, ion còn lại dùng để xác nhận

Bảng 3.1 Điều kiện khối phổ

Chất phân tích Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) CE (eV) Ghi chú

Phổ MS/MS, sắc đồ TIC, MRM được trình bày ở phần phụ lục

3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Trên cơ sở tham khảo một số quy trình xử lý mẫu [6, 13, 31, 33], quy trình

xử lý mẫu được dự kiến như sau:

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến

3.2.1 Khảo sát quy trình chiết lỏng – lỏng

Trên nguyên lý của phương pháp chiết lỏng – lỏng, hai quy trình chiết chất phân tích từ mẫu sữa bột công thức đã được tiến hành khảo sát

• Cân chính xác 1,0 g sữa bột công thức trong ống ly tâm 50 mL, thêm 15

mL nước, lắc xoáy đến khi tan hoàn toàn

• Chuyển lượng mẫu sang bình gạn 100 mL

• Chiết lần 1: Thêm 2 ml dung dịch bão hòa kali oxalat, 20 ml ethanol, 40 ml hỗn hợp hexan – diethyl ether (1:1, v/v) Lắc trong 3 phút Pha nước được chuyển sang bình gạn khác để chiết lần 2

• Chiết lần 2: thêm 10 ml ethanol, 20 ml hợp hexan-diethyl ether (1:1, v/v) Lắc trong 3 phút Loại pha nước Gộp pha hữu cơ với dịch chiết lần đầu

• Dịch chiết thêm 5 ml nước, sau đó loại nước đi Pha hữu cơ được lọc qua giấy lọc có chứa natri sulfat vào bình cầu

• Cân chính xác 1,0 g sữa bột công thức trong ống ly tâm 50 mL, thêm 2 mL amoniac, siêu âm ở 65 ± 5oC trong 15 phút

• Chuyển mẫu sang bình gạn 100 mL

• Chiết lần 1: Thêm 10 ml ethanol, 25 mL diethyl ether Lắc đều trong 5 phút Thêm 25 mL petroleum ether, lắc trong 30s Để yên 30 phút Pha nước được chuyển sang bình gạn khác và chiết lần 2

• Chiết lần 2: Thêm 5 mL ethanol, 15 mL diethyl ether, lắc trong 5 phút Thêm 15 mL petroleum ether, lắc 30s Để yên 30 phút

• Gộp dịch chiết vào bình cầu Đem sấy ở 102 ± 2oC đến khối lượng không đổi

Hình 3.3 Biểu đồ khảo sát quy trình chiết lỏng – lỏng

Kết quả: Sử dụng 2 quy trình chiết cho hiệu suất chiết tương tự nhau Do tính

đơn giản, để thuận lợi cho việc xử lý mẫu số lượng lớn, quy trình chiết 1 được lựa chọn cho các bước nghiên cứu tiếp theo

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000

3.2.2 Khảo sát quy trình làm sạch

Mẫu sữa bột công thức sau khi chiết béo sẽ sử dụng phương pháp SPE để loại tạp Nghiên cứu tiến hành khảo sát cột SPE – NH2 , SPE – Si và không sử dụng cột làm sạch

Hình 3.4 Biểu đồ khảo sát quy trình làm sạch

vậy cột SPE – NH2 được lựa chọn để tiến hành các bước nghiên cứu tiếp theo

3.2.3 Khảo sát quy trình dẫn xuất

❖ Quy trình 1:

Dung dịch chuẩn và nội chuẩn được thổi khô methanol dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ phòng Thêm 2 mL Na2SO4 20%, chiết 2 lần với n – heptan, lớp n – heptan được loại đi, thêm 200 µL dung dịch PBA 25% trong aceton – nước (19:1, v/v), lắc xoáy 30 giây sau đó siêu âm 5 phút Chiết 2 lần với n – heptan Thổi khô dưới dòng khí nitơ Hòa tan cắn với 250 µL iso octan, lắc xoáy 30 giây sau đó ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút Thu phần dịch chạy GC-MS/MS

❖ Quy trình 2:

Dung dịch chuẩn và nội chuẩn được cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 10-50

mg Na2SO4 Thổi khô methanol dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ phòng Thêm 1,8

mL ethyl acetat, thêm 150 µL dung dịch PBA 4% trong diethyl ether, lắc xoáy 30

giây sau đó siêu âm 5 phút Thổi khô dưới dòng khí nitơ Hòa tan cắn với 250 µL iso octan, lắc xoáy 30 giây sau đó ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút Thu phần dịch chạy GC-MS/MS

Hình 3.5 Biểu đồ khảo sát quy trình dẫn xuất

Kết quả: Sử dụng quy trình 2 cho hiệu suất tốt hơn đặc biệt là đối với 3-MCPD

Do vậy quy trình dẫn xuất 2 được sử dụng cho các bước tiếp theo

Các điều kiện tối ưu thu được sau khi tiến hành thực nghiệm như sau: