Nghiên cứu xác định người lành mang gen và ứng dụng chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia a

Mặc dù không có vai trò trong việc mã hóa hay tham gia vào quá trìnhhoạt hóa yếu tố VIII nhưng các vùng intron của gen F8 lại là tác nhân chínhgây ra các dạng đột biến đảo đoạn ở bệnh nh

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội,nạn ô nhiễm môi trường và những nguy cơ phơi nhiễm với các tác nhân gây độtbiến như virus, khói thuốc, phóng xạ, ngày càng tăng dẫn đến sự gia tăng độtbiến và sự vô hiệu hóa bộ máy sửa chữa thông tin di truyền trong tế bào Hậuquả là các tổn thương thông tin di truyền được lưu giữ trong bộ gen người bệnh

và có khả năng truyền lại cho các thế hệ sau Mặc dù không phổ biến như một sốnhóm các bệnh lý khác nhưng thực tế cho thấy hàng năm có một số lượng lớn trẻsinh ra bị dị tật hoặc mắc các bệnh lý di truyền Đây là nhóm bệnh lý gây nhiềukhó khăn trong điều trị và để lại hậu quả rất nặng nề về sức khỏe, tinh thần cũngnhư chất lượng cuộc sống.Vì vậy, vấn đề cấp bách đặt ra là chúng ta phải tìmhướng giải quyết một cách sớm nhất và triệt để nhóm bệnh lý di truyền, trong đó

ưu tiên các bệnh lý thường gặp tại Việt Nam [1], [2]

Bệnh máu khó đông hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên quan đếniới tính, gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X không có alen tương ứng trênnhiễm sắc thể Y, do vậy người mẹ mang gen bệnh có thể truyền bệnh cho 50%con trai và truyền gen bệnh cho 50% con gái [3], [4], [5], [6] Bệnh có thể ditruyền qua nhiều thế hệ và có nhiều người mắc bệnh trong cùng một gia đình.Bệnh ảnh hưởng đến tâm sinh lý, thể chất trẻ nhỏ và là gánh nặng cho giađình và xã hôi Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnhhemophilia [7] và khoảng 30.000 người mang gen bệnh hemophilia Mặc dùtrong thời gian qua, công tác chăm sóc bệnh nhân hemophilia A tại Việt Nam đã

có nhiều tiến bộ, số lượng bệnh nhân được chẩn đoán và quản lí đã tăng lên đáng

kể, tuy nhiên mới chỉ chiếm chưa tới 30% tổng số người bị bệnh và đa số ngườimang gen bệnh chưa được chẩn đoán và quản lí [8]

Việc phát hiện người phụ nữ mang gen bệnh bằng các xét nghiệm thôngthường như xác định hoạt tính yếu tố VIII trong máu còn gặp khó khăn vì

hoạt tính yếu tố VIII của họ không giảm hoặc giảm ít, có thể dao động từ 50 –150%, chỉ có khoảng 10% tổng số những phụ nữ này có hoạt tính yếu tố VIIIhuyết tương <10% và có biểu hiện chảy máu [3], [4], [9], [10] Có thể khẳngđịnh chắc chắn người phụ nữ mang gen bệnh, nếu người đó có bố hoặc có hơn

2 con trai bị hemophilia A Người phụ nữ có nguy cơ cao mang gen bệnh nếungười đó có 1 con trai bị bệnh hemophilia A hoặc là con gái của người mẹmang gen bệnh; hoặc là chị em con dì với người bị bệnh hemophilia A [3], [4]

Việc phát hiện người lành mang gen bệnh đóng vai trò quan trọng trongcông tác tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh để có thể giúp ngăn ngừa sinhcon bị bệnh và giảm tỷ lệ mắc bệnh [4], [10] Ở Việt Nam, một số công trìnhnghiên cứu về bệnh hemophilia A đã được công bố, chủ yếu là các nghiên cứu

về đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng, tần suất mắc bệnh và đánh giá hiệuquả điều trị bệnh bằng các chế phẩm thay thế 11,12,13, [14]; nghiên cứu

về tính chất gia đình của bệnh hemophilia A, nghiên cứu phát hiện người lànhmang gen bệnh bằng phân tích một số yếu tố đông máu; nghiên cứu phát hiệnngười lành mang gen bệnh sử dụng kỹ thuật enzym cắt giới hạn (RFLP -Restriction Fragment Length Polymorphisms) chỉ phát hiện được 4/9(44,44%) người mẹ mang gen bệnh [16] Tuy nhiên các nghiên cứu này dựatrên cỡ mẫu nhỏ, phương pháp phát hiện gián tiếp, tỷ lệ người lành mang genphát hiện được thấp và như vậy vẫn chưa có một nghiên cứu đầy đủ và toàndiện về tình trạng mang gen bệnh của các thành viên nữ có nguy cơ cao tronggia đình bệnh nhân hemophilia A để có cơ sở tư vấn di truyền và chẩn đoán

trước sinh Vì vậy đề tài “Nghiên cứu xác định người lành mang gen và ứng dụng chẩn đoán trước sinh bệnh Hemophilia A” được thực hiện với các

mục tiêu sau:

nhân hemophilia A đã xác định được đột biến gen F8.

cho những thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh hemophilia A.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

là bệnh rối loạn đông máu di truyền hay gặp nhất [17],18

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu

Bệnh máu khó đông là một trong những bệnh di truyền đã được biết đến

từ thời cổ đại, tuy nhiên không có tên gọi chính thức cho nó Trong các văn thư

cổ của người Do Thái từ thế kỷ thứ 2 trước công nguyên đã miêu tả những đứatrẻ bị chết do chảy máu không cầm sau khi cắt bao qui đầu (tục lệ của người DoThái: trẻ em trai sinh ra đều cắt bao qui đầu) Vào thế kỷ 12 một bác sĩ ngườiArap- Albucasis cũng miêu tả những đứa trẻ bị chết do chảy máu từ những vếtthương nhỏ Bệnh máu khó đông được cho là bệnh di truyền hàng trăm năm quacác thế hệ trong gia đình [9],[10] Sự di truyền của bệnh máu khó đông liên kếtvới giới tính được phát hiện từ những năm 80 của thế kỷ 19 Vào thời điểm này,các nhà khoa học nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năngtruyền bệnh cho con trai nhưng truyền gen bệnh cho con gái và người con gáinày có thể truyền gen bệnh cho con trai mình Bệnh hemoliphia còn được biếtđến như căn bệnh của Hoàng Gia vì nữ hoàng Anh Victoria 1838-1901 manggen bệnh này và truyền nó cho nhiều thế hệ sau [5], [6]

1.1.3 Dịch tễ học bệnh Hemophilia A

Theo thống kê của tổ chức Hemophilia thế giới (WFH), hiện nay cókhoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia và chỉ có khoảng 50.000được điều trị đặc hiệu [19] Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A gần giống nhau ởcác vùng địa lý, các nước, các chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng30-100/1.000.000 dân 20 Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/4000 1/5.000 trẻ trai [11],[21]

Tại Việt Nam, theo những thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng

6000 bệnh nhân hemophilia Số liệu điều tra những năm 19941996 về tìnhhình bệnh hemophilia ở miền Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh hemophilia là2560/1.000.000 dân [11] 6000 người bị bệnh chảy máu di truyền, đó là sốliệu được Hội Rối loạn đông máu Việt Nam và Viện Huyết học - Truyền máuTrung ương công bố ngày 15-4-2014 tại mít tinh hưởng ứng ngày Hemophiliathế giới (17-4) [7]

Hiện nay trên toàn quốc mới có khoảng 2.200 (chiếm gần 40%) bệnhnhân được phát hiện và chăm sóc thường xuyên Như vậy, tỷ lệ bệnh nhânchưa được chẩn đoán và điều trị vẫn còn ở mức cao [7]

Tại Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học-Truyền máu Trung ươngđang quản lý và điều trị khoảng 1.200 bệnh nhân, trong đó bệnh hemophilia Achiếm 85%, bệnh hemophilia B chiếm 13,16% và còn lại là những bệnh nhân

bị các bệnh rối loạn đông máu khác Trung bình mỗi ngày có từ 80 đến 100bệnh nhân tới điều trị nội và ngoại trú [7], [8]

1.2 Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh Hemophilia A

1.2.1 Đặc điểm chảy máu trong bệnh Hemophilia A

Bệnh hemophilia đặc trưng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăngnguy cơ chảy máu Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết Xuất huyết cóthể tự nhiên hoặc sau chấn thương nhẹ Đặc điểm xuất huyết là các đám bầmmáu dưới da, tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp 12,13,17

Chảy máu khớp

Thường gặp nhất là chảy máu khớp háng, khớp gối, khửu tay….trênbệnh nhân Hemophilia A sau khi bị chấn thương hoặc trên những bệnh nhânthể nặng.Nếu điều trị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp

sẽ sưng và việc điều trị bị kéo dài tới vài ngày Trẻ lớn có thể nhận biết đượcchảy máu khớp trước khi đau và sưng xảy ra với cảm giác gai châm hoặckiến bò trong khớp Điều trị sớm sẽ dự phòng được tình trạng đau mạn tính

và biến dạng khớp

Hình 1.1 Hình ảnh chảy máu khớp (khớp gối, khớp khuỷu tay)

ở bệnh nhân hemophilia A

(Nguồn: http://hemoviet.org.vn)

Chảy máu trong cơ

Chảy máu trong cơ cũng thường gặp và xuất hiện tự nhiên hoặc sauchấn thương Những cơ hay bị chảy máu là: cơ cẳng chân, cơ đùi, cơ cánh tay.Chảy máu cơ gây ra sưng đau trong vài ngày Một dấu hiệu quan trọng và kínđáo trong chảy máu cơ là cảm giác đau, nóng, ngứa ran hoặc tê bì Nếu khôngđược điều trị sớm cơ sẽ bị tổn thương và có thể gây liệt.

Hình 1.2 Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A

(Nguồn: http://hemoviet.org.vn)

Chảy máu não

Có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương, ví dụ như ngã hoặcđập đầu vào vật cứng Triệu chứng chảy máu não có thể xảy ra ngay hoặc vàingày sau chấn thương, bao gồm: dễ kích ứng, ngủ gà, đau đầu, lú lẫn, nôn,buồn nôn, nhìn đôi Tất cả những sang chấn ở đầu đều nghiêm trọng và cầnđược điều trị sớm để tránh chảy máu não và các hậu quả của chúng

Chảy máu trong cổ và ngực

Chảy máu ở mặt, cổ và ngực có thể được coi là nghiêm trọng vì sưng

nề có thể gây chèn ép đường thở Nhiễm trùng cũng có thể làm sưng cổ vàđôi khi khó có thể phân biệt hiện tượng sưng là do nhiễm trùng hay do chảymáu

Chảy máu ở vị trí khác

Bệnh nhân hemophilia rất dễ bị chảy máu nhưng hiếm gặp xuất huyết dưới da Chảy máu từ vết cắt sâu hoặc xước da có thể kéo dài và hồi phục sau vài ngày mà không cần điều trị Chảy máu miệng, lợi và mũi cũng hay gặp Có thể xuất huyết tiêu hoá và đái máu.

Hình 1.3 Hình ảnh chảy máu không cầm sau nhổ răng và từ vết xước da

ở bệnh nhân hemophilia A

(Nguồn: http://hemoviet.org.vn)

1.2.2 Những thay đổi về huyết học ở bệnh nhân Hemophilia A [14]

- Thời gian máu chảy kéo dài, thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1

giờ; chất lượng cục máu đông kém; thời gian Howell kéo dài…

+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm hoặc không có.

+ Yếu tố von- Willebrand trong máu bình thường.

+ Số lượng tiểu cầu trong máu bình thường.

1.2.3 Chẩn đoán bệnh [18]

1.2.3.1 Chẩn đoán xác định

- Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu

- Dựa vào tiền sử gia đình

- Dựa vào xét nghiệm máu:

+ Số lượng tiểu cầu bình thường, PT (prothrombin time: thời gianprothrombin) bình thường, fibrinogen bình thường, APTT (Activated PartialThromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa) kéo dài >1,5 giá trị bình thường

+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm dưới 40%

+ Yếu tố von Willebrand bình thường

+ Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII.

Trung bình

Chảy máu tự nhiên hoặc liênquan đến chấn thương nhỏ.Chảy máu nặng sau chấnthương, phẫu thuật

- Chảy máu cấp nên được điều trị càng sớm càng tốt, tốt nhất là sau 2 giờ.

- Yếu tố đông máu cần được bổ sung để có thể đạt được hoạt tính tronghuyết tương đủ để cầm chảy máu

1.2.4.2 Điều trị đặc hiệu

Việc điều trị thay thế phụ thuộc rất nhiều vào tính chất của các chế phẩmmáu có sẵn và thời gian bán hủy của yếu tố đông máu Thời gian bán hủy củayếu tố VIII là 8-12 giờ, của yếu tố IX là 24 giờ Thời gian bán hủy có thể rútngắn nếu bệnh nhân chảy máu nhiều hoặc có chất ức chế

- Truyền yếu tố VIII trong hemophilia A (Hemophil M, Dried Factor)

- Các chế phẩm điều trị khác:

+ Tủa lạnh, mỗi đơn vị tủa lạnh chứa 80 – 100 đơn vị yếu tố VIIIc/100ml+ Plasma tươi.

+ Plasma sau khi lấy tủa lạnh (truyền cho hemophilia B)

+ Các thuốc cầm máu hỗ trợ → điều trị khi có chất ức chế

1.2.4.3 Dự phòng chảy máu [23],[24]

- Cần hết sức tránh chấn thương

- Tránh dùng các thuốc ảnh hưởng đến chức năng tiểu cầu, đặc biệt làacetylsalicylic acid (Aspirin) Để giảm đau cho bệnh nhân có thể dùngparacetamol hoặc paracetamol kêt hợp codein

- Tránh tiêm bắp, châm cứu

- Tiêm văc xin đầy đủ, đặc biệt tiêm phòng viêm gan virut B và A (khôngdùng đường tiêm bắp mà chuyển sang tiêm dưới da)

- Tập thể dục hàng ngày để tăng thể lực, tăng sức mạnh cơ bắp, giúpkhớp hoạt động tốt hơn và giúp hạn chế chảy máu cơ khớp Tránh các hoạtđộng thể thao mang tính chất đối kháng như boxing, đá bóng, đấu vật Nêntập bơi, đi bộ và đi xe đạp

1.3 Cơ chế phân tử bệnh hemophilia A

Bệnh hemophilia A (còn gọi là bệnh máu khó đông) là một bệnh ditruyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của yếu tố đông máu huyếttương - yếu tố VIII Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đã chothấy những hiểu biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein yếu

tố VIII, mở đường cho các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh hemophilia A

và các dạng đột biến gen F8 gây bệnh [25]

1.3.1 Vai trò yếu tố VIII trong đông máu huyết tương

Trong con đường đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò là đồngyếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) với sự có mặt của Ca2+ vàphospholipidtiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sự hình thànhthrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố định fibrin từ

fibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng với tiểu cầu và yếu

tố thành mạch [17]

Thiếu hụt hoặc bất thường chức năng yếu tố VIII làm ngừng trệ dòngthác đông máu theo con đường nội sinh, dẫn đến tình trạng chảy máu kéo dài,không cầm ở bệnh nhân hemophilia A [22],[24]

(Nguồn: www.hemophilia.com)

Hình 1.4 Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương 1.3.2 Cơ chế phân tử bệnh hemophilia A

1.3.2.1 Vị trí và cấu trúc của gen mã hóa yếu tố VIII – protein yếu tố VIII

Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII nằm ở vị trí Xq28 trên NST giớitính X, là một trong những gen lớn nhất của người, có kích thước 186 Kbgồm 26 exon, trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp đến 262 bp và 2 exonlớn nhất là exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp), mã hóa 9 Kb mRNA.Người đột biến gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làmrối loạn quá trình đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnhhemophilia A 25,[26],28,29

Hình 1.5 Cấu trúc gen và protein yếu tố VIII

(Nguồn: Ye Jee Shim, Kun Soo Lee (2010))[30]

A) Vị trí gen yếu tố VIII trên NST giới tính X B) Gen F8 bao gồm 25 intron

và 26 exon trong đó exon 26 mã hóa cho vùng 3’UTR; vùng intron 22 chứa 2 gen F8A và F8B C) Phân tử mRNA được phiên mã có kích thước 9 kb D) Protein yếu tố VIII dạng tiền thân có 2332 acid amin, gồm vùng dẫn tín hiệu (SP), các vùng chức năng lớn A1, A2, B, A3, C1, C2, các vùng chức năng xen kẽ a1, a2, a3 Các yếu tố thuộc hệ thống đông máu như yếu tố X, Xa, IXa, vWF, Phospholipid tương tác với yếu tố VIII tại những vị trí acid amin nhất định E và F) Các bước hoàn thiện phân tử protein F8 thành một yếu tố VIII hoàn chỉnh được hoạt hóa.

Gen F8 mã hóa protein yếu tố VIII gồm 2332 acid amin, trọng lượng phân tửkhoảng 300 kD Bản chất yếu tố VIII là polypeptid có cấu trúc A1-A2-B-A3-Cl-C2, gồm hai chuỗi: chuỗi nặng là đoạn A1-A2-B có kích thước 200 kD,chuỗi nhẹ là đoạn A3-C1-C2 có kích thước 80 kD Cấu trúc của phức hợp nàyđược giữ ổn định nhờ sự tương tác giữa các liên kết ưa nước và kỵ nước vớiyếu tố von Willebrand (vWF - là một kháng nguyên liên quan đến yếu tốVIII) và Ca2+ Chuỗi nặng có đầu cuối là N, gồm các domain A1-A2-B, chuỗinhẹ có đầu cuối là C, gồm các domain A3-C1-C2 Vùng B được mã hóa bởimột exon lớn và không có sự tương đồng với bất kỳ gen nào đã biết Khi thủyphân hoàn toàn domain B tạo thành asparagin, serin và threonin Vùng Bkhông cần cho chức năng của yếu tố VIII và sau quá trình dịch mã, domain B

bị cắt khỏi chuỗi nặng của yếu tố VIII 26,28],30

Yếu tố VIII được sản xuất chủ yếu từ tế bào gan, ngoài ra còn được sảnxuất tại thận, lách Hàm lượng yếu tố VIII trong huyết tương thấp (20-50mg/ml) Đầu tiên, yếu tố VIII được tổng hợp như một chuỗi đơn gồm 2351acid amin ở lưới nội bào, sau đó được chuyển vào thể Golgi Tại đây đã xảy

ra các phản ứng để hình thành phân tử của yếu tố VIII Nó được lưu thôngdưới dạng tiền “cofactor” không hoạt động [5]

Yếu tố VIII được hoạt hóa nhờ quá trình phân giải bởi thrombin hoặcyếu tố Xa với nguyên lý hoạt động cắt yếu tố VIII ở vịt trí Arg 372 (chỗ nối

A1-A2), vị trí Arg 740 (chỗ nối A2-B) và vị trí Arg 1689 (chỗ nối B-A3) Khivùng A2 tương tác với phức hợp A1/A3-C1-C2 thì yếu tố VIII thực sự được hoạthóa [31],[32]

1.3.2.2 Các dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A

Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A Nghiên cứucủa Oldenburg và cộng sự đã chỉ ra rằng các dạng đột biến điểm (thay thế

nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao nhất(47,5%) tiếp đến là dạng đột biến đảo đoạn gồm đảo đoạn intron 1 vàintron 22 (36,7%), còn lại là đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10 –15% Tùy thuộc vào kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thểbệnh nặng nhẹ khác nhau 28,33,34,[35].

vị trí 2119 (vùng C2) làm giảm đột ngột khả năng tương tác giữa yếu tố VIII

và yếu tố vWF, dạng đột biến này thường gặp ở thể nhẹ và trung bình 33.Điều đáng chú ý là mặc dù các đột biến nằm rải rác trên 26 exon mà khôngtập trung vào một vùng hotspot, Goodeve A.C và Jochen Graw chỉ ra phầnlớn các đột biến điểm đều có xu hướng xuất hiện ở đoạn trình tự CpG gâythay thế acid amin Arginin thành một acid amin khác hoặc tạo mã kết thúc, vídụ: tại vị trí Arg 527, Arg531, Arg593, Arg 1689, Arg1781, Arg1941,Arg2209, Arg2304…5,35

Theo thống kê, khoảng gần 60% các đột biến điểm ảnh hưởng tới acid aminArginin, phần lớn các bệnh nhân mang đột biến này đều ở thể nặng 28,35

Do phần lớn các đột biến gây bệnh là đột biến điểm vì vậy cho đến nayphương pháp giải trình tự gen được coi là một tiêu chuẩn vàng trong việc pháthiện các đột biến gen F8 [36]

Đột biến đảo đoạn

Mặc dù không có vai trò trong việc mã hóa hay tham gia vào quá trìnhhoạt hóa yếu tố VIII nhưng các vùng intron của gen F8 lại là tác nhân chínhgây ra các dạng đột biến đảo đoạn ở bệnh nhân hemophilia A thể nặng [37].Dạng đột biến đảo đoạn phổ biến nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm hơn50% các thể bệnh nặng Cách gen F8 một đoạn 500kb về phía đầu múttelomere, nhiễm sắc thể X tồn tại hai vùng int22h2 và int22h3 có trình tựtương đồng đến 99,9% với một đoạn thuộc intron 22 gen F8 (vùng int22h1).Quá trình tái tổ hợp tương đồng giữa vùng int22h1 và một trong hai vùngint22h2 và int22h3 chia cắt gen F8 thành 2 đoạn (exon 1-22 và exon 23-26)cách nhau 400kb gây bất hoạt hoàn toàn gen mã hóa yếu tố VIII [30], [37] Hiện tượng tái tổ hợp tương tự cũng diễn ra giữa intron 1 (int1h1) vàvùng trình tự tương đồng int1h2 cách gen F8 một đoạn 140kb về phía đầumút telomere gây nên dạng đột biến đảo đoạn intron 1 xuất hiện ở 5% cácthể bệnh nặng [30],[37],[38],[39]

Đột biến mất đoạn của gen yếu tố VIII

Đột biến mất đoạn lớn chiếm 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng

Có thể mất 1 exon hoặc mất toàn bộ gen Cơ chế phân tử của dạng đột biếnnày đã được kết luận là do quá trình tái tổ hợp dẫn đến hiện tượng lặp lại Alu[30] Đột biến chèn đoạn lớn và hiện tượng Alu làm đứt gãy gen F8 và gâybệnh hemophilia A thể nặng Xóa đoạn và chèn đoạn nhỏ cũng thường thấytrong hemophilia A thể nặng, trong đó thay đổi 1-55 nucleotid Phổ biến nhất

là xóa hoặc chèn nucleotid Adenin vào exon 14, thường xảy ra trong vùng từc.3637 đến c.4379 [40]

trên protein yếu tố VIII vẫn bình thường nhưng các vị trí hoạt tính thì bị thayđổi, thậm chí có thể chỉ là do mất, thêm hoặc thay thế một acid amin trênchuỗi polypeptid làm cho các yếu tố đông máu huyết tương (IX, X, ion Ca2+,

Cu2+) không có vị trí bám trong quá trình đông máu hoặc yếu tố vWF, X vàcác phân tử phospholipid tiểu cầu không có vị trí để bám vào khi yếu tố VIIIđược hoạt hóa [41], [42]

1.3.3 Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A

Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên quan đến giới tính, bệnh làhậu quả của bất thường phân tử protein do thương tổn gen cấu trúc nằmtrên thể nhiễm sắc X Nam giới có cặp nhiễm sắc thể giới tính XY, vì vậy 1phần thể nhiễm sắc X không có sự tương đồng trên thể nhiễm sắc Y, nênkhi gen nằm trên đoạn đó (gen chỉ đạo tổng hợp yếu tố chống hemophiliaA) bị thương tổn, đã biểu hiện bệnh Ngược lại ở nữ giới, tất cả nhiễm sắc

X này có thể nhiễm sắc X kia tương đồng (cặp thể nhiễm sắc giới tính của

nữ là XX) nên phụ nữ mang một thể nhiễm sắc X thương tổn vẫn khôngbiểu hiện bệnh vì đã được bù trừ Nam giới bị bệnh tức là mang trong mìnhnhiễm sắc thể X bị thương tổn, có thể đó là do hậu quả của một quá trình ditruyền phả hệ hoặc do đột biến

Hình 1.6 Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ con

Cơ chế di truyền của bệnh:

1/ Mẹ mang gen bệnh, bố bình thường: trong một gia đình có bố bìnhthường (XHY), mẹ mang gen bệnh (XHXh) (người truyền bệnh) thì 50% số congái sẽ là người mang gen bệnh (XHXh), 50% con gái bình thường (XX), 50%con trai bị bệnh (XhY) và 50% con trai bình thường (XHY)

2/ Bố bị bệnh, mẹ bình thường: 100% con gái là người mang gen bệnh(XHXh) và 100% con trai bình thường (XHY)

3/ Bố bị bệnh, mẹ mang gen bệnh: 50% con gái bị bệnh (XhXh) đồnghợp tử, 50% con gái mang gen bệnh (XHXh), 50% con trai bị bệnh và 50% contrai bình thường (XHY) Như vậy nữ mắc bệnh khi mang đồng hợp tử genbệnh (cả 2 thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XhXh), nữ mang gen bệnh khi mang

dị hợp tử gen bệnh (một thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XHXh )

4/ Do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc

từ người mẹ: thường chiếm khoảng 1/3 các trường hợp hemophilia Tỉ lệ độtbiến gây bệnh hemophilia xẩy ra là 3 x 106 trên gen và trên một giao tử trongmột thế hệ [6] Tỷ lệ đột biến mới xảy ra ở tế bào mầm sinh dục của nam caohơn 5 lần so với ở tế bào mầm sinh dục của nữ Gần đây, người ta đã chứngminh rằng tần suất đột biến theo giới tùy thuộc vào loại đột biến Đột biến đảođoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần so với ở tế bàomầm sinh dục nữ Hiện tượng này giải thích cho sự vắng mặt nhiễm sắc thểthứ hai tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đảo đoạn trong giai đoạn phânbào giảm nhiễm ở nam 43

Trong quá trình di truyền phả hệ, gen bệnh lý sẽ mất dần khi ngườibệnh không sinh đẻ hoặc khi thể nhiễm sắc X bị thương tổn không đượctruyền cho thế hệ sau mà chỉ truyền thể nhiễm sắc X bình thường Song do có

vấn đề đột biến gen mới nên tần suất của bệnh qua các thế kỷ vẫn giữ nguyêntính hằng định của nó

2 NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A

2.1 Đặc điểm chung

Người lành mang gen bệnh hemophilia A là người mang một nhiễmsắc thể X bị đột biến gen F8 và một nhiễm sắc thể X bình thường, chính vìvậy mà đa số họ không biểu hiện bệnh Trong trường hợp nhiễm sắc thể Xbình thường bị bất hoạt khi đó người mang gen bệnh có biểu hiện chảy máuvới mức độ tương đương với trường hợp bệnh nhân hemophilia A thể nhẹtrên lâm sàng [3]

Con gái của một bệnh nhân hemophilia A, người mẹ của hai con trai bịbệnh; người mẹ của một con trai bị bệnh hoặc một con gái mang gen bệnh và

có một người nam cùng huyết thống trong phả hệ gia đình bị bệnh; là nhữngngười chắc chắn mang gen F8 bị đột biến theo quy luật di truyền, được gọi làngười lành mang gen bệnh bắt buộc (obligate carrier) Bà ngoại của một cháutrai bị bệnh hemophilia A, con gái của một người mẹ mang gen bệnhhemophilia A, dì và em gái của một bệnh nhân hemophilia A là những người

có nguy cơ cao mang gen bệnh (possible carrier) [3], [44]

Người có biểu hiện bệnh máu khó đông tương tự như một trường hợphemophilia A thể nhẹ thì khi đó gọi là người lành mang gen bệnh có triệuchứng (symptomatic carriers) [44] Khoảng 10% người mang gen có hoạt tínhyếu tố VIII huyết tương thấp hơn so với bình thường, thậm chí một số íttrường hợp người mang gen bệnh có hoạt tính yếu tố VIII huyết thanh rất thấpdưới 4% gây chảy máu tương tự thể bệnh nặng, với nồng độ yếu tố VIII từ5% đến 40% có thể bị chảy máu tương tự như bệnh nhân thể nhẹ Khoảng20% người lành mang gen bệnh biểu hiện triệu chứng chảy máu với các mức

độ khác nhau, bao gồm cả những người có hoạt tính yếu tố VIII huyết tươngtrong giới hạn bình thường (40 đến 60%) [10], [45], [46]

2.2 Đặc điểm chảy máu của người lành mang gen bệnh hemophilia A

Chảy máu ở những người lành mang gen bệnh gồm hai loại chính [3], [44]:

- Chảy máu sản, phụ khoa:

+ Kinh nguyệt kéo dài (hơn bảy ngày), rong kinh là một trong nhữngtriệu chứng phụ khoa phổ biến nhất Có thể nặng nề với số lượng máu mấttrong khoảng thời gian dài Theo thống kê, có đến 1/3 số phụ nữ bỏ lỡ đáng

kể thời gian học hoặc làm việc do rong kinh Đó cũng có thể là nguyên nhâncủa tình trạng thiếu sắt, thiếu máu và làm giảm chất lượng cuộc sống ở phụ nữmang gen bệnh Chảy máu nặng trong kỳ kinh nguyệt đầu tiên của một ngườilành mang gen bệnh có thể dẫn đến phải nhập viện

+ Chảy máu bất thường âm đạo (băng huyết)

Băng huyết liên quan đến chảy máu bất thường xảy ra ngoài chu kỳ kinhnguyệt bình thường Chảy máu bất thường xảy ra đôi khi trong khoảng thờigian giữa phần cuối của một chu kỳ kinh nguyệt với kỳ kinh bắt đầu tiếp theo.Nếu chảy máu nặng nề cần nghỉ ngơi tại chỗ hoặc nhập viện để theo dõi + Đau bụng kinh

Người mang gen bệnh hemophilia A có nhiều khả năng có đau bụnggiữa chu kỳ kinh nguyệt hơn những người không mang gen bệnh (đau bụng

do xuất huyết lúc rụng trứng)

+ U nang buồng trứng

Trong quá trình rụng trứng, một lượng nhỏ máu bị chảy có thể xảy rakhi trứng được giải phóng khỏi nang (túi chứa đầy dịch, trong đó một quảtrứng phát triển) Chảy máu này có thể gây ra một loại u hình thành trênbuồng trứng, gọi là u nang thể vàng Người mang gen bệnh hemophilia A cónhiều khả năng bị chảy máu đáng kể và kéo dài lúc rụng trứng, gây ra đaubụng vùng hạ vị Hơn nữa, một u nang buồng trứng có nguy cơ bị vỡ vào kỳ

kinh nguyệt, gây ra chảy máu trong và đau đột ngột ở vùng bụng dưới, trườnghợp này gọi là u nang buồng trứng xuất huyết

+ Chảy máu ổ bụng (hemoperitoneum)

Máu có thể chảy vào các mô xương chậu và dây chằng, đôi khi vào ổbụng và vùng chậu gọi là chảy máu ổ bụng, là một cấp cứu ngoại khoa có thể

đe dọa đến tính mạng

+ Chảy máu sau khi sinh:

Người mang gen bệnh hemophilia A có nguy cơ bị xuất huyết trong thai

kỳ Tuy nhiên trong thực tế, do ảnh hưởng của hormon làm tăng hoạt tính yếu

tố VIII trong huyết tương nên nguy cơ này giảm xuống

Người mang gen bệnh hemophilia A cũng có thể có nguy cơ chảy máunặng lúc chuyển dạ Nhìn chung, nguy cơ xuất huyết trong vòng 24 giờ đầutiên sau khi sinh con của người bình thường là 4-5% thì nguy cơ này tăng lên22% cho những người mang gen bệnh hemophilia A 11% người mang genbệnh bị xuất huyết muộn sau khi sinh con so với 1% sản phụ nói chung Chảymáu muộn ở người mang bệnh hemophilia A thường xảy ra vào khoảng 5đến10 ngày sau khi sinh con, khi hoạt tính yếu tố VIII huyết tương của họ trở

về giá trị trước khi mang thai [44], [46]

- Các chảy máu khác:

 Dễ bầm tím

 Chảy máu kéo dài từ vết thương nhỏ

 Chảy máu cam

 Chảy máu kéo dài sau khi nhổ răng

 Chảy máu nặng sau khi chấn thương hoặc phẫu thuật

 Chảy máu khớp và cơ bắp không phải là triệu chứng hay gặp ở nhữngngười mang bệnh hemophilia A trừ trường hợp hoạt tính yếu tố VIIIhuyết tương rất thấp (dưới 4%) Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằngnguy cơ chảy máu kéo dài (nhiều hơn năm phút) từ vết thương nhỏhoặc sau khi phẫu thuật ở người mang gen bệnh hemophilia A có triệuchứng có thể cao gấp đôi so với những người mang gen bệnh khôngbiểu hiện triệu chứng trong cùng một gia đình

2.3 Quản lý và điều trị dự phòng cho người lành mang gen bệnh hemophilia A [3], [22], [44]

Những người được xác định là người lành mang gen hoặc có nguy cơcao mang gen bệnh cần được:

- Thực hiện các xét nghiệm chẩn đoán thích hợp và theo dõi chảy máubất thường Cần xác định chính xác bệnh phụ khoa và huyết học cơ bản

- Điều trị thích hợp và chăm sóc phòng ngừa cho người có rối loạn chảy máu

- Điều trị như một bệnh nhân hemophilia A thường xuyên (nếu cần)

- Tránh những phẫu thuật không cần thiết

- Tránh sử dụng các sản phẩm máu nếu không thực sự cần thiết

- Thông báo cho bác sĩ về tình trạng mang gen bệnh để có phương ánchuẩn bị cho gây mê, phẫu thuật, mang thai, sinh con và chăm sóc sau sinh

- Tư vấn di truyền và hỗ trợ tâm lý

2.4 Vai trò của việc xác định người lành mang gen bệnh

Với những thành viên nữ mang gen bệnh, việc xác định chính xác tìnhtrạng mang gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử giúp các nhà tư vấn sớm đưa

ra lời khuyên di truyền trước khi kết hôn để họ tăng cường nhận thức về bệnh,

làm giảm tỷ lệ mang thai và tỷ lệ trẻ sinh ra bị mắc bệnh hemophilia A [47] Xác định tình trạng mang gen để giúp người phụ nữ có các biện pháptăng hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh tật, đồng thời nâng cao chất lượngchăm sóc sức khỏe cho cộng đồng và xã hội [48], [49], [50].

3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A

3.1 Các xét nghiệm đông máu

- Xét nghiệm định lượng hoạt tính yếu tố VIII huyết tương thường thấp

hơn giá trị bình thường (50-150%) [51] Tuy nhiên cũng chỉ phát hiện đượckhoảng 10-20% người lành mang gen có biểu hiện bệnh thể nhẹ và có hoạttính yếu tố VIII huyết tương < 35%, số người còn lại có hoạt tính yếu tố VIIIhuyết tương dao động trong khoảng 40 – 60% và không có triệu chứng bệnh[44], [46] Do vậy xét nghiệm này không phát hiện được rất nhiều các trườnghợp mang gen bệnh

3.2 Phát hiện người lành mang gen bệnh dựa vào phân tích phả hệ

Cây phả hệ của một gia đình chứa thông tin tối thiểu về 3 thế hệ: thế hệ IIIgồm bệnh nhân, anh chị em ruột và anh chị em họ của bệnh nhân; thế hệ II gồmcha mẹ, cô dì, chú bác của bệnh nhân; thế hệ I gồm ông bà nội hoặc ông bàngoại và ông bà họ của bệnh nhân [52]

Dựa vào phả hệ có thể xác định được những người có thể là người manggen bệnh trong gia đình bệnh nhân hemophilia A Đối với những trường hợpbệnh nhân có tiền sử gia đình rõ ràng, dựa vào kết quả phân tích phả hệ có thểxác định chắc chắn tình trạng mang gen của các thành viên nữ trong gia đìnhbệnh nhân Tuy nhiên phương pháp này cũng chỉ phát hiện được số lượng hạnchế người mang gen bệnh và các thông tin được thu thập để xây dựng phả hệđòi hỏi phải thật chính xác và bị ảnh hưởng bởi yếu tố chủng tộc Kỹ thuậtnày cũng không áp dụng được cho những trường hợp bệnh đơn lẻ trong giađình [52], [53]

3.3 Phát hiện người lành mang gen bệnh bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

3.3.1 Phương pháp phát hiện đột biến trực tiếp

Là phương pháp phát hiện tình trạng mang gen của người mẹ và cácthành viên nữ trong gia đình dựa trên đột biến chỉ điểm đã xác định được trênbệnh nhân Hemophilia A Phương pháp này phát hiện được 99-100% cáctrường hợp người lành mang gen bệnh [52]

 Phát hiện đột biến điểm gen F8 bằng kỹ thuật giải trình tự gen

Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như trình tự mẫu cho phảnứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi Sử dụng máy giải trình tựgen tự động được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng dideoxynucleotid (ddNTP)

do Sanger và CS phát minh Dựa vào màu huỳnh quang, máy sẽ nhận diệnđược các nucleotid, từ đó biết được trình tự của DNA đích

So sánh trình tự gen của mẫu DNA bệnh phẩm với trình tự gen chuẩncủa GeneBank (National center for biotechnology information, NCBI) vàphân tích theo phương pháp ABI Prism 3100 genetic analyzer (AppliedBiosystems) (Hình 1.7)

Hình 1.7 Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 [54]

Trình tự exon 14 gen F8 (mồi ngược) của bệnh nhân so sánh với trình tự GeneBank (NM_000132) phát hiện có đột biến thêm 1 nucleotid C trên exon

14 tại vị trí c.4201insC Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 của người mẹ

và chị gái bệnh nhân từ vị trí c.4201C xuất hiện 2 đỉnh chồng lên nhau chứng

tỏ người mẹ và chị gái bệnh nhân mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử.

 Phát hiện đột biến đảo đoạn gen F8

a/ Phương pháp phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22

Phương pháp I-PCR được miêu tả bởi Rosetti và cộng sự năm 2005

[55] Quy trình gồm 3 bước: 1/Cắt DNA bằng enzym BclI; 2/Nối sản phẩm

cắt bằng T4 ligate; 3/Khuếch đại sản phẩm nối bằng phản ứng multiplex PCR Phương pháp I-PCR có ưu điểm là dễ tiến hành Enzym BclI tác dụng

rất đặc hiệu nên sản phẩm cắt enzym có tính đặc hiệu cao Sản phẩm PCRđược khuếch đại dễ dàng trong thời gian khoảng 30 phút do các đoạn DNA cókích thước ngắn (487 và 559 bp) Như vậy xét nghiệm phân tích gen đượctiến hành nhanh chóng, kết quả thu được có độ tin cậy cao, dễ thực hiện

Hình 1.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 bằng phương pháp I-PCR (Nguồn: Rossetti và cộng sự 2005)

Sản phẩm DNA người bình thường ở vị trí giếng số 2 có 1 băng kích thước tương ứng 487 bp Sản phẩm DNA ở giếng số 1 và 3 của bệnh nhân hemophilia A thể nặng có 1 băng kích thước tương ứng 559 bp bệnh nhân bị

559bp

487bp

đột biến đảo đoạn intron 22 Sản phẩm DNA người mẹ bệnh nhân ở giếng số

4 có 2 vạch DNA kích thước tương ứng là 487 và 559b, là người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử.

b/ Phương pháp phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1

Phương pháp xác định đảo đoạn intron 1 theo quy trình chuẩn củaTizzano và cộng sự [38] Thiết kế hai phản ứng PCR có thể phát hiện được cácbệnh nhân có đột biến và người lành mang gen bệnh Một phản ứng có chứacác cặp mồi đặc hiệu cho int1h -1 cộng với mồi đặc hiệu cho chuỗi int1h -2(9F, 9CR, int1h - 2F ); phản ứng còn lại chứa các cặp mồi đặc hiệu cho int1h -2cộng với mồi đặc hiệu cho của int1h -1 (int1h - 2F, int1h -2R, 9F) Dựa vàokích thước các đoạn DNA sau khi điện di để phát hiện đột biến (hình 1.9)

Hình 1.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra đảo đoạn intron1 [38].

Phản ứng đầu (A) cho một sản phẩm kích thước 1908bp từ DNA người bình thường do mồi 9F và mồi 9cR bắt cặp với nhau (93-2); một sản phẩm 1323bp từ bệnh nhân bị đột biến đảo đoạn do mồi 9cR và mồi int1h-2F bắt cặp với nhau (93-1), trong khi DNA ở phụ nữ mang thai có cả hai sản phẩm này (93-

1191bp 1776bp 1908bp 1323bp

3) Phản ứng sau (B) cho thấy một đoạn DNA kích thước 1191bp của người bình thường do mồi int1h - 2F và int1h -2R bắt cặp với nhau(93-2); một sản phẩm kích thước 1776bp của người bị đảo đoạn do mồi 9F và int1h -2R bắt căp (93- 1), người phụ nữ mang gen có cả hai đoạn DNA kích thước trên (93-3).

 Phát hiện đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen F8

Trong những năm gần đây, MLPA (Multiplex Ligation-dependent ProbeAmplification) là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán độtbiến mất đoạn, lặp đoạn gen F8 Ngoài ra, MLPA còn giúp chẩn đoán dị hợp

tử với độ chính xác cao, cho kết quả nhanh chóng [56]

Nghiên cứu của Rost, Loffler và cộng sự năm 2008, khi phân tích mẫuDNA của 80 bệnh nhân hemophiliaA bằng phương pháp MLPA (Kit P178,MRC Hà Lan, Amsterdam, Hà Lan) để phát hiện những trường hợp đột biếnlặp đoạn, xóa đoạn [56] Nghiên cứu sử dụng 44 probe để thăm dò toàn bộ 26exon trong gen F8 Với đột biến xóa đoạn, các đỉnh tương ứng với từng exon

sẽ bị mất Với đột biến lặp đoạn, kết quả được tính toán dựa vào tỉ lệ RPA(Relative Peak Area) tương ứng với từng exon so với mẫu chứng, RPA củamỗi exon được tính bằng cường độ tín hiệu tương ứng (A) chia cho tổngcường độ tín hiệu của 44 đỉnh trong probemix (ΣA), exon lặp đoạn khi mà tỉ

lệ RPA lớn hơn 1,6 Nghiên cứu của Michelle O’Brien (2013) cũng ứng dụng

thành công phương pháp này trong phát hiện đột biến xóa đoạn lớn gây bệnhhemophilia A và bệnh Von Willerbrand [57]

A Bệnh nhân có đột biến xóa đoạn mất exon 15-22 B Người bình thường

Hình 1.10 Kết quả MLPA xác định đột biến xóa đoạn gen F8

của bệnh nhân hemophilia A

(Nguồn: Michelle O’Brien et al (2013)).

Dựa vào tính chất định lượng để phát hiện các dạng đột biến lànguyên lý của phương pháp MLPA, do đó phương pháp này được lựa chọn

để phát hiện các trường hợp người nữ mang gen có đột biến lặp đoạn hayxóa đoạn gen F8

Đối với trường hợp thêm hoặc xóa đoạn nhỏ dưới 50bp có thể sử dụng

kỹ thuật giải trình tự gen F8 để phát hiện người lành mang gen bệnh ở trạngthái dị hợp tử

3.3.2 Phương pháp phát hiện gián tiếp

Phân tích liên kết được sử dụng trong nhiều năm gần đây, phổ biến nhất

là phương pháp đa hình sử dụng được trong hai nghiên cứu gần đây ở Ấn Độ

và Brazil [58], [59] SNPs được nhận biết bởi enzym cắt giới hạn Bcl I, Hind

III và intron7 G>A (c.1010 – 27G>A) cộng với đa hình STR trong intron 13

Trong một nghiên cứu khác, Kim và cộng sự xác định rằng STRs trongintron 1 và 24 cùng với intron 13 và 22 có thể được dùng để multiplex PCR

đã cung cấp thông tin về tình trạng mang gen bệnh hemophilia A của 77%phụ nữ Hàn Quốc [64] Harraway và cộng sự cũng thiết kế mồi cho phản ứngmultiplex PCR, nhưng sử dụng 3 STRs ngoài gen F8 kết hợp với intron 13 và

22 lặp lại để đạt được một thông tin về tình trạng mang gen bệnh của 100%phụ nữ New Zealand [65] Những đoạn lặp lại này nằm ngoài gen gần và ở 2đầu F8 nhưng vẫn có nguy cơ xảy ra hiện tượng tái tổ hợp Marker bên tronggen được khuyến cáo sử dụng để loại bỏ bất kỳ nguy cơ lỗi do tái tổ hợp giữacác marker và đột biến gây bệnh hemophilia A

Phương pháp phân tích liên kết thực hiện nhanh, tương đối rẻ tiền, đángtin cậy để phát hiện các trường hợp bị bệnh hemophilia A trong phả hệ giađình có nhiều người bị bệnh Tuy nhiên, phương pháp phân tích liên kếtkhông thể phát hiện được người lành mang gen trong các gia đình có đột biếnmới phát sinh trong quá trình hình thành giao tử [52], [66].

4 CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH HEMOPHILIA A

Hiện nay chưa có biện pháp điều trị đặc hiệu bệnh hemophilia A, bởi vậyviệc xác định người lành mang gen bệnh, chẩn đoán trước sinh đóng vai tròrất quan trọng và là cơ sở đưa ra lời khuyên di truyền nhằm làm giảm tỷ lệmắc bệnh trong cộng đồng [44]

4.1 Sàng lọc thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh hemophilia A [67]

Các thai phụ đã có con bị bệnh hemophilia A là những người có nguy

cơ cao mang gen bệnh, do vậy được xếp vào nhóm thai phụ có nguy cơ caosinh con bị bệnh hemophilia A

Như vậy, kết quả phân tích gen cho biết thai phụ có mang gen bệnh hay không

là yếu tố sàng lọc quan trọng nhất [68] Nếu thai phụ mang gen bệnh ở trạngthái dị hợp tử, việc lấy mẫu tế bào thai nhi để phân tích phát hiện đột biến làđiều không tránh khỏi, cho dù việc lấy mẫu xâm phạm thai có thể ảnh hưởng

an toàn đến thai nhi Nếu thai phụ không mang gen F8 đột biến, có thể tư vấncho gia đình không cần tiến hành chẩn đoán trước sinh vì các phương phápchẩn đoán trước sinh hiện nay vẫn thực hiện quy trình lấy mẫu bằng kỹ thuậtchọc hút dịch ối, ảnh hưởng không tốt đến thai phụ và thai nhi

Sau quá trình phân tích sàng lọc, những thai phụ có nguy cơ cao sinhcon bị bệnh hemophilia A sẽ được tiến hành lấy mẫu tế bào thai nhi để phântích và xác định đột biến

4.2 Xét nghiệm chẩn đoán trước sinh

Muốn chẩn đoán xác định thai bị bệnh lý di truyền phải dựa vào các xétnghiệm di truyền Các xét nghiệm này có thể phân tích ở mức độ tế bào (phântích NST), ở mức độ phân tử (phân tích DNA, RNA) hoặc cả ở mức độ tế bào

và phân tử (kỹ thuật FISH) Tất cả xét nghiệm này cần phải lấy được tế bàohoặc DNA có nguồn gốc từ thai, do đó việc lấy được mẫu tế bào và DNA cónguồn gốc từ thai nhi trong chẩn đoán trước sinh đóng một vai trò quan trọng.Hai phương pháp lấy mẫu xét nghiệm để chẩn đoán trước sinh là phươngpháp xâm phạm thai và phương pháp không xâm phạm thai

4.2.1 Phương pháp chẩn đoán trước sinh lấy mẫu xâm phạm thai

Phương pháp lấy mẫu này ảnh hưởng trực tiếp đến thai nhi và có thể gâytai biến cho thai cũng như cho thai phụ (sẩy thai, rỉ ối, ) Để giảm bớt rủi rotrên, việc sàng lọc xác định những thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh

sẽ giảm đáng kể số thai phụ phải thực hiện xét nghiệm này Có nhiều kỹ thuậtlấy mẫu tế bào thai theo phương pháp xâm phạm thai

* Chọc hút dịch ối: được thực hiện khi thai được 16 đến 18 tuần Dịch ối

có các loại tế bào ối, da, phổi và tế bào biểu bì đường tiết niệu của thai nhi.Những tế bào này sẽ được nuôi cấy với các môi trường thích hợp để thu đượclượng tế bào thai nhi nhiều hơn; mặt khác, nuôi cấy tế bào dịch ối còn giúp loại

bỏ tế bào máu của người mẹ Tỉ lệ sẩy thai do chọc ối khoảng 0,5-1,0% [69]

Hình 1.11 Chọc hút dịch ối dưới hướng dẫn của siêu âm

(Nguồn:http://babywash.vn)

* Lấy mẫu nhung mao màng nuôi (Chorionic Villus Sampling-CVS):

kỹ thuật CVS được thực hiện đầu tiên vào những năm 1960 Từ năm 1983,CVS đã trở thành một xét nghiệm phổ biến để chẩn đoán trước sinh trong 3tháng đầu của thai kỳ CVS được thực hiện vào vào khoảng tuần thứ 9 đếntuần 12 của thai kỳ Lợi điểm quan trọng nhất của CVS so với chọc ối là cóthể cho kết quả nhanh hơn, đồng thời có thể thực hiện vào giai đoạn sớm hơncủa thai kỳ Các bất thường của thai nhi có thể được phát hiện vào giai đoạnsớm hơn, do đó việc quyết định chấm dứt thai kỳ sẽ được chấp nhận dễ dànghơn về mặt tâm lý, kỹ thuật thực hiện và hậu quả Một bất lợi của CVS so vớichọc ối là tỷ lệ sẩy thai cao hơn, chiếm 2-3% trường hợp; theo nghiên cứu củaViện Sức khỏe Hoa Kỳ, tỷ lệ sẩy thai ở nhóm chọc hút nhung mao màng nuôităng 0,8% so với nhóm chọc ối [70]

Hình 1.12 Lấy mẫu nhung mao màng nuôi hướng dẫn của siêu âm

Hình 1.13 Lấy máu cuống rốn qua da

(Nguồn:http://babywash.vn)

4.2.2 Phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai

Hiện nay, các nhà khoa học đang quan tâm đến phương pháp lấy mẫuthai nhi bằng phương pháp không xâm phạm thai Phương pháp lấy mẫukhông xâm nhập giúp tránh được nguy cơ có thể xảy ra đối với thai nhi vàthai phụ Có hai phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai đó là:

4.2.2.1 Phương pháp thu thập tế bào thai nhi trong máu mẹ

Sự xuất hiện tế bào thai nhi trong máu mẹ là do tế bào máu thai nhi cóthể đi vào tuần hoàn mẹ thông qua nhung mao nhau thai Những tế bào thainhi có thể được thu thập một cách an toàn từ khoảng tuần thứ 18 của thai kỳtrở đi Hiện nay, với những kỹ thuật hiện đại, người ta có thể thu thập các tếbào này vào tuần thứ 12 của thai kỳ [71], [72]

Có nhiều loại tế bào thai nhi xuất hiện trong máu mẹ, tuy nhiên nguyênhồng cầu được sử dụng nhiều nhất để phân tích và xác định bệnh lý di truyềnnói chung Sau khi lấy máu mẹ, cần phải tiến hành các công đoạn gồm (1) làmgiàu các tế bào thai nhi do số lượng của chúng trong một mẫu máu là rất hạnchế, (2) nhận diện tế bào thai nhi trong số các tế bào được làm giàu và (3)thực hiện các chẩn đoán di truyền học [73]

4.2.2.2 Phương pháp tách DNA thai nhi tự do trong máu mẹ

Đầu tiên, kỹ thuật phát hiện DNA thai nhi từ tế bào thai nhi lưu hànhtrong máu mẹ được sử dụng để chẩn đoán giới tính thai nhi và định nhómmáu hệ Rh Sau đó kỹ thuật này được sử dụng để chẩn đoán các bệnh lý ditruyền đơn gen

Việc xác định giới tính thai nhi được thực hiện bằng cách phát hiện cácdãy trình tự đặc hiệu của NST Y Nếu phát hiện được dãy trình tự đặc hiệuNST Y thì thai nhi là nam Ngược lại, vắng mặt các chuỗi trình tự trên chứng

tỏ thai nhi là nữ Các dãy trình tự đặc hiệu cho NST Y thường được dùngtrong chẩn đoán giới tính thai nhi là SRY, DYS và DAZ

Bất đồng nhóm máu Rh giữa một thai phụ có Rh(-) và thai nhi có Rh(+)

có thể gây nên đáp ứng miễn dịch ở mẹ với những hậu quả trầm trọng như tánhuyết ở con gây nên vàng da nặng nề, thậm chí vàng da nhân hoặc có thể gâynên sẩy thai liên tiếp ở các lần có thai sau Vì vậy, việc xử trí kịp thời nhữngngười mẹ có nhóm máu Rh(-) mang thai Rh(+) là rất quan trọng DNA thainhi tự do trong máu mẹ đã được sử dụng để chẩn đoán sớm nhóm máu Rh củathai nhi ở những người mẹ có Rh(-)

Năm 2000, Saito và CS lần đầu tiên thành công trong việc sử dụng DNAthai nhi tự do trong máu mẹ để chẩn đoán bệnh tạo xương bất toàn Sau đó,DNA thai nhi tự do trong máu mẹ cũng được sử dụng để chẩn đoán trước sinhcác bệnh lý xơ nang tụy, beta-thalassemia và tăng sản thượng thận bẩm sinh.Phương pháp này có thể sử dụng để chẩn đoán một gen bất thường của thai nhi

có nguồn gốc từ bố hoặc một đột biến không phải từ mẹ Nếu gen bệnh của thainhi có nguồn gốc từ mẹ (như bệnh DMD, hemophilia,…) thì phương pháp nàykhông sử dụng được [74] Chính vì lý do này mà phương pháp chẩn đoán bệnh

lý di truyền đơn gen sử dụng DNA thai nhi tự do có chỉ định hạn chế và không

áp dụng cho chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A [75]

5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH Ở VIỆT NAM

Hiện nay, tại Việt Nam ước tính có khoảng gần 6 nghìn người mắc bệnhhemophilia, song trong đó số được chẩn đoán và quản lý mới chỉ chiếm 30%.Thực tế, hemophilia là một căn bệnh rất nguy hiểm Chảy máu cơ khớp táiphát nhiều lần làm teo cơ, cứng khớp, biến dạng khớp, nặng có thể dẫn đến tửvong nếu không điều trị kịp thời Do hiểu biết của cộng đồng, của bệnh nhân

và gia đình bệnh nhân về bệnh còn hạn chế nên đa số bệnh nhân được chẩnđoán muộn và chưa biết cách tự chăm sóc Bên cạnh đó chế phẩm máuđiều trị cho bệnh nhân còn chưa được cung cấp đầy đủ Vì vậy, tỷ lệ bệnhnhân tàn tật còn cao, chiếm hơn 60%

Khó khăn trước tiên là hiểu biết của cộng đồng cho tới nay vẫn còn hạnchế Nhiều người còn không biết tới căn bệnh này, chính vì vậy ngay cả khimắc bệnh họ vẫn cho rằng mình không có vấn đề gì, cho tới khi bệnh nặngmới tới viện để chẩn đoán và điều trị thì bệnh đã ở giai đoạn nghiêm trọng và

từ đó chi phí điều trị ngày càng tăng cao

Nhiều bệnh viện tuyến tỉnh chưa có xét nghiện đông máu hoặc mới cóxét nghiệm bước đầu nên chưa chẩn đoán được những trường hợp biểu hiệnkín đáo Trong khi đó, điều kiện điều trị cho bệnh nhân còn hạn chế, chếphẩm máu, kể cả chế phẩm nhập khẩu không đủ điều trị cho bệnh nhân Bệnhnhân ở hầu khắp các độ tuổi, có những em nhỏ còn đang đi học, việc điều trịcủa các cháu cũng chịu sự chi phối không nhỏ của chương trình học tại nhàtrường, điều này cũng gây khó khăn cho quá trình điều trị

Năm 1999, Nguyễn Minh Hiệp thực hiện nghiên cứu về “Đặc điểmlâm sàng và phân loại bệnh Hemophilia ở trẻ em tại Viện Nhi Trung Ương”

Nghiên cứu mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, phân loại bệnh và mộtvài biến chứng hay gặp ở bệnh nhân hemophilia A [14] Năm 2001, Vũ ThịMinh Châu cũng nghiên cứu về triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng của bệnhhemophilia A song trên đối tượng nghiên cứu là người lớn [12]

Năm 2012, Ngô Thị Hường thực hiện “Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ họclâm sàng bệnh Hemophilia A và hiệu quả sử dụng Hemofil M trong điều trị bệnhhemophilia A” tại viện Nhi Trung Ương [14] Một số đề tài nghiên cứu thuộccác lĩnh vực khác của bệnh hemophilia như tổn thương khớp, đánh giá hiểu biếtcủa người nhà bệnh nhân về bệnh hemophilia…đã được thực hiện

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Mai và cộng sự năm 2012, áp dụng phươngpháp “lần theo dấu vết”, từ 55 phả hệ của 54 bệnh nhân hemophilia đã đượcchẩn đoán tại viện Huyết học – Truyền máu TW, qua phân tích 874 thành viên

có quan hệ huyết thống với bệnh nhân đã phát hiện 101 bệnh nhân mới chiếm

tỉ lệ 11,56% trong đó có 82 bệnh nhân hemophilia A (chiếm 81,2%) và 19bệnh nhân hemophilia B (chiếm 18,8%); đa số bệnh nhân ở thể bệnh nhẹ vàtrung bình, thể bệnh nặng chiếm 14,85%; các bệnh nhân mới được phát hiện

có tuổi trung bình là 20,05 ± 17,46, dao động trong khoảng 1- 65 tuổi Đa sốcác phả hệ có thể khai thác được trong vòng 3- 5 thế hệ Đây là một phươngpháp phát hiện bệnh nhân mới hiệu quả đối với những trường hợp có tiền sửgia đình [8]

Tuy nhiên, các nghiên cứu về căn bệnh này ở nước ta mới chỉ tập trung chủyếu vào tỉ lệ mắc bệnh, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, điều trị và những tácđộng tâm lý của bệnh đối với bệnh nhân và thành viên gia đình Như vậy còn đểngỏ việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc phân tích, phát hiệnđột biến gen F8, người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh

Nghiên cứu về đột biến gen F8

Với các kiểu đột biến đa dạng và phong phú trên gen F8 như vậy thìviệc xây dựng một quy trình phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩnđoán trước sinh, đưa ra lời khuyên thích hợp sẽ giúp chúng ta ngăn ngừa vàgiảm tỷ lệ mắc bệnh, cung cấp liệu pháp điều trị tối ưu, chế độ chăm sóc tốthơn cho từng bệnh nhân và giảm gánh nặng về kinh tế cho gia đình ngườibệnh cũng như toàn xã hội

Năm 2008, nhóm nghiên cứu tại Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein,Trường Đại học Y Hà Nội đã thành công trong việc tách dòng gen mã hóa yếu

tố VIII của người bình thường Đồng thời, nhóm nghiên cứu đã thành côngtrong việc tạo ra yếu tố VIII bị xóa vùng gen B mà không bị mất hoạt tính.Nhóm nghiên cứu đã thiết kế vector, biểu hiện và tinh chế thành công yếu tố

VIII người trên E.coli, vector thuộc hệ retrovirus mang gen mã hóa yếu tố

VIII tái tổ hợp cũng được thiết kế thành công, mở đường cho các nghiên cứuứng dụng liệu pháp điều trị gen sau này ở Việt Nam 76

Nghiên cứu phát hiện người lành mang gen

Nghiên cứu của Trần Thị Phương Túy và cộng sự tại Trung tâm Huyếthọc - Truyền máu Bệnh viện Trung ương Huế ”Tìm hiểu tính chất gia đìnhcủa bệnh nhân hemophilia A điều trị tại Bệnh viện Trung ương Huế” cho thấy47,9% bệnh nhân hemophilia A có tiền sử gia đình rõ; tuổi phát hiện bệnh,hình thái, vị trí, tính chất xuất huyết, mức độ tổn thương khớp ở các bệnhnhân trong cùng một gia đình dù có cùng thể bệnh không hoàn toàn giốngnhau Tỷ lệ tử vong không liên quan đến mức độ bệnh [16]

Nghiên cứu của Lê Nhật Minh và CS năm 2004 về phát hiện ngườilành mang gen bệnh F8 trên 9 gia đình có con mắc bệnh hemophilia A sử

dụng kỹ thuật enzym cắt giới hạn (PCR-RFLP), tác giả và CS chỉ pháthiện được 44,44% các bà mẹ mang gen bệnh, còn lại trên 50% không pháthiện được [15].

Như vậy, nghiên cứu về người lành mang gen bệnh Hemophilia A còn ít,đặc biệt là việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định chính xáctình trạng mang gen của các thai phụ để thực hiện chẩn đoán trước sinh chưađược thực hiện

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp I-PCR phát hiệnđột biến đảo đoạn intron 22, kĩ thuật giải trình tự toàn bộ 26 exon để phát hiệnđột biến điểm và xóa đoạn là phương pháp hiện đại, chính xác, xác định tìnhtrạng mang gen bệnh của các thành viên viên nữ có nguy cơ cao trong các giađình bệnh nhân Hemophilia A (đã phát hiện được đột biến)

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

50 gia đình bệnh nhân hemophilia A đã được xác định đột biến gen F8 (13bệnh nhân đột biến đảo đoạn intron 22; 35 bệnh nhân đột biến điểm và 2 bệnhnhân đột biến mất đoạn nhỏ) tại Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, TrườngĐại học Y Hà Nội, bao gồm:

- 20 người (10 nam, 10 nữ) khỏe mạnh, tiền sử gia đình không có người mắc

bệnh di truyền, được dùng để chuẩn hóa kỹ thuật và làm mẫu đối chứng cùng vớimẫu nghiên cứu khi thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích gen

2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.2.1 Trang thiết bị nghiên cứu

 Máy PCR (Eppendorf)

 Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)

 Máy soi gel và chụp ảnh tự động (Dolphin Chemi Wealtec, USA)

 Máy quang phổ kế Nano- Drop (Nhật Bản)

 Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm các loại (Đức)

 Lò vi sóng

 Tủ lạnh âm sâu: -300C và - 800C (Sanyo-Nhật Bản)

 Máy đọc trình tự gen 3100-Avant Genetic Analyzer của hãng ABI-PRISM

 Tủ ấm.

2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu

Dụng cụ được vô trùng tuyệt đối bằng hấp ướt 1200C trong 20 phút

 Pipet, đầu côn các loại

 Ống Eppendorf các loại

2.2.3 Hóa chất nghiên cứu

- Hóa chất tách chiết DNA từ máu ngoại vi và tinh sạch DNA:

 Kít tách chiết DNA (Hàng QIAGEN-Đức)

 Dung dịch lysis buffer

 Ethanol tuyệt đối và Ethanol 70%

 Dung dịch TE để hòa tan DNA và bảo quản DNA sau khi tách

 Kít tinh sạch DNA từ gel (Hãng QIAGEN-Đức)

Quy trình pha một số hóa chất:

Dung dịch Lysis buffer

Thêm nước vừa đủ 500ml, chỉnh pH=7,7 bằng HCl

 Taq DNA polymerase 1000U (Hãng QIAGEN-Đức)

 Taq PCR Master Mix kit (Hãng QIAGEN-Đức, 1000 units

 dNTP set, PCR grade (Hãng QIAGEN-Đức, 250µl)

 Các mồi khuếch đại gene (100nmol)

- Hóa chất chạy điện di:

- Hóa chất dùng để giải trình tự gen:

 Capillary array, 4x50cm (Hãng ABI)

 POP-4 for 3130 (Hãng ABI)

 Hi-Di Formamide (Hãng ABI)

 GA 10x buffer/EDTA (Hãng ABI)

 BigDye V3.1 kit (Hãng ABI)

 FG, BigDye xterminator (Hãng ABI)

 Dynabeads sequencing clean (Hãng invitrogen)

2.2.4 Trình tự mồi cho các phản ứng PCR

- Trình tự mồi của phản ứng Inversion – PCR xác định đột biến đảo đoạnintron 22 của gen F8 [55]

ID (mồi xuôi trong gen F8) ACATACGGTTTAGTCACAAGT

IU (mồi ngược trong gen F8) CCTTTCAACTCCATCTCCAT

ED (mồi xuôi ngoài gen F8) TCCAGTCACTTAGGCTCAG

- Trình tự mồi của phản ứng PCR khuếch đại 26 exon của gen F8

Thiết kế 34 cặp mồi riêng biệt để khuếch đại 26 exon David 1994 [77].Trong đó exon 14 có kích thước lớn nhất 3,1 kb nên cần 9 cặp mồi để khuếchđại toàn bộ exon này