Đánh giá mối liên quan giữa kiểu gen FTO với bệnh loãng xương trên phụ nữ mãn kinh

Phụ nữ mãn kinh là đối tượng nguy cơ cao bị loãng xương do buồng trứng suy giảm chức năng sản xuất hormone estrogen - là một trong những hormone đóng vai trò quan trọng trong quá trình t

ĐẶT VẤN ĐỀ

Loãng xương là một vấn đề y tế nghiêm trọng mang tính toàn cầu do

sự phổ biến và hậu quả nặng nề đối với sức khỏe cộng đồng Bệnh loãngxương được đặc trưng bởi tình trạng mật độ xương (MĐX) thấp và cấu trúcxương bị suy yếu dẫn đến làm tăng nguy cơ gãy xương [1] Gãy xương là hậuquả nghiêm trọng nhất của loãng xương, trong đó hay gặp nhất là gãy cổxương đùi [2] Một khi gãy xương xảy ra sẽ làm thay đổi mô hình bệnh tật,tăng tỉ lệ tử vong, gây nên những ảnh hưởng lớn về kinh tế và xã hội ở mỗiquốc gia Theo thống kê, hàng năm trên toàn thế giới bệnh loãng xương gây rakhoảng 8,9 triệu trường hợp gãy xương, và trung bình cứ mỗi 3 giây trôi quathì có 1 trường hợp bị gãy xương do loãng xương Một nửa các trường hợpgãy cổ xương đùi trên thế giới xảy ra ở châu Á [3], [4] Số tiền mà xã hội bịmất đi do chi phí cho bệnh loãng xương ở châu Âu trong năm 2010 được ướctính khoảng 37 tỉ Euro [5] Ở châu Á, năm 2006 Trung Quốc đã chi khoảng1,5 tỷ USD cho việc điều trị gãy cổ xương đùi [6]

Phụ nữ mãn kinh là đối tượng nguy cơ cao bị loãng xương do buồng trứng suy giảm chức năng sản xuất hormone estrogen - là một trong những hormone đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo xương, hậu quả là dẫn đến loãng xương và gãy xương Phụ nữ mãn kinh từ 50 tuổi, trong suốt cuộc đời còn lại có nguy cơ gãy xương do loãng xương là 10%, cao tương đương với nguy cơ mắc bệnh ung thư vú [7] Tại Việt Nam, theo Hồ Phạm Thục Lan,

tỉ lệ loãng xương trên phụ nữ mãn kinh tại thành phố Hồ Chí Minh là 28,6% ở

cổ xương đùi và 17,8% ở xương cột sống [8], tỉ lệ này ở miền Bắc qua nghiêncứu của tác giả Nguyễn Thị Thanh Hương lần lượt là 23,1% và 49,5% [9].Hiện nay, tỉ lệ phụ nữ trên 50 tuổi trong dân số Việt Nam là khoảng 15% và ước tính có khoảng 2 triệu phụ nữ trên 50 tuổi đang ở trong tình trạng loãng xương[10] Tỉ lệ loãng xương của phụ nữ Việt Nam cao tương đương với phụ

nữ da trắng ở Úc (21%) [11], Mỹ (20%) [12], và cao hơn nhiều so với phụ nữĐông Á như: Trung Quốc (10%)[13], Nhật Bản (17%) [14] và Hàn Quốc (10%) [15].

Các yếu tố nguy cơ của gãy xương do loãng xương bao gồm: tuổi cao, tiền

sử té ngã, MĐX thấp, chỉ số khối cơ thể (BMI) thấp và các yếu tố di truyền Giảm 1 độ lệch chuẩn của MĐX làm tăng nguy cơ gãy xương tới 2-3 lần

Nghiên cứu trên các gia đình phả hệ và cặp song sinh cùng trứng cho thấy khoảng 50-85% sự thay đổi MĐX là do gen qui định, khẳng định vai trò của

di truyền với bệnh loãng xương và gãy xương do loãng xương [16] Hiện nay trên thế giới đã tìm thấy khoảng 56 locus liên quan đến sự thay đổi MĐX với mức có ý nghĩa (P<5x10-8), trong đó có 14 locus liên quan đến gãy

xương(P<5x10-4) [17] Một số gen đã được xác định có liên quan độc lập với

gãy xương bao gồm: Apoliprotein E, Collagen I alpha 1(COLIA1), thụ thể estrogen, thụ thể vitamin D và gen Fat mass and Obesity Associated (FTO)

Trong một nghiên cứu của Yan Gou và cộng sự (2011) tại Trung Quốc, đã cho

thấy mối liên quan của các biến thể trong gen FTO với sự thay đổi của MĐX

[18] Nghiên cứu gần đây của Bich Tran và cộng sự (2013) tại Úc cũng đưa ra

kết luận gen FTO có liên quan đến nguy cơ gãy xương ở phụ nữ và gen FTO có

thể giúp dự đoán nguy cơ gãy xương do loãng xương [19] Tuy nhiên, cho tới nay chưa có nghiên cứu nào về gen và loãng xương được tiến hành tại Đông Nam Á nói chung cũng như trên người Việt Nam nói riêng Xuất phát từ thực tế

trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá mối liên quan giữa kiểu gen FTO

với bệnh loãng xương trên phụ nữ mãn kinh” với mục tiêu:

1 Xác định kiểu gen FTO trên phụ nữ bình thường mãn kinh.

2 Đánh giá mối liên quan giữa kiểu gen FTO trên phụ nữ mãn kinh bị bệnh loãng xương.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về bệnh loãng xương

1.1.1 Giới thiệu chung về xương và phân loại xương

Khung xương con người có 206 xương Các xương này có nhiều chứcnăng quan trọng, như: góp phần tạo nên dáng dấp cơ thể, nâng đỡ trọnglượng và bảo vệ các bộ phận quan trọng trong cơ thể, cùng với hệ thống

cơ giúp cho việc di chuyển

- Phân loại xương

+ Về giải phẫu:

* Theo hình dáng của xương có:

Xương dài: xương tứ chiXương ngắn: các xương đốt sốngXương dẹt: xương sườn, xương vòm sọ, đa số các xương mặt

* Quan sát theo mặt cắt ngang qua xương có:

Xương đặc (không có các hốc nhỏ): chiếm khoảng 80% tổng khối lượngxương, có chức năng bảo vệ Xương đặc thường bao quanh xương xốp, làmthành vòng đai bảo vệ xương xốp Xương đặc thường hay thấy ở phần giữacác xương dài, như: xương chày, xương mác, xương đùi, xương quay, xươngtrụ, và xương cánh tay

Xương xốp (có những hốc nhỏ liên hệ với nhau): chiếm khoảng20% tổng khối lượng xương, có chức năng chuyển hóa Xương xốp thườnghay thấy ở hai phần đầu của những xương dài, như: xương đùi và xương tay

Xương xốp là loại xương chính, bao gồm xương phẳng như xương ức, xươngchậu, và 33 đốt sống.

Xương được hình thành từ thời kì bào thai, bắt đầu từ tuần 26 sau khi thụthai Sau khi sinh, xương phát triển nhanh trong giai đoạn trước dậy thì.Khoảng 90% (MĐX) của một người được tạo thành trong thời gian trước tuổidậy thì Sau thời kỳ tăng trưởng, MĐX trải qua một giai đoạn ổn định kéo dàikhoảng 5 đến 15 năm Đây chính là giai đoạn MĐX đạt mức tối đa Sau độtuổi 35, MĐX bắt đầu suy giảm, nhất là sau mãn kinh Mức độ suy giảmMĐX ở nữ thường cao hơn nam MĐX suy giảm làm cho xương trở nên yếu

và dễ gãy

1.1.2 Định nghĩa loãng xương

Theo Tổ chức Y tế Thế giới WHO năm 1991, loãng xương được địnhnghĩa là một bệnh với đặc điểm: khối lượng xương suy giảm, vi cấu trúc củaxương bị hư hỏng dẫn đến tình trạng xương bị yếu và hệ quả là tăng nguy cơ

bị gãy xương [1] Năm 2001, Viện Y tế Hoa Kỳ đã đưa ra một định nghĩa mới

về loãng xương như sau: loãng xương là một bệnh với các đặc điểm sức bềncủa xương bị suy giảm dẫn đến gia tăng nguy cơ gãy xương Sức bền củaxương phản ánh sự kết hợp của mật độ chất khoáng trong xương và chấtlượng xương [1]

Mô xương bình thường gggggggggbìnhttttthường

Loãng xương

Hình 1.1 Mô xương bình thường và mô xương bị loãng xương

(Nguồn: www.google.com.vn)

1.1.3 Đặc điểm dịch tễ của loãng xương

Loãng xương là một hệ quả gây nên bởi nhiều yếu tố môi trường

và di truyền Sự phân bố và tần suất bệnh có liên quan chặt chẽ đến độ tuổi,giới tính, tình trạng hormone, chế độ dinh dưỡng và thói quen sinh hoạt Cácnghiên cứu về loãng xương chỉ ra tuổi càng cao MĐX càng giảm Tỉ lệ gãyxương do loãng xương cũng tăng theo độ tuổi Ở phụ nữ, sự giảm MĐX tăngnhanh từ tuổi mãn kinh, thường là từ 40 tuổi trở lên Tỉ lệ loãng xương ở phụ

nữ thường cao hơn nam giới Theo quỹ loãng xương quốc gia Mỹ - NOF(National Osteoporosis Foundation), trong khoảng 10 triệu người Mỹ bịloãng xương, phụ nữ chiếm 80% [20] Nhìn chung tỉ lệ loãng xương nguyênphát giữa nữ và nam là 4:1 [21] Các nghiên cứu trên phụ nữ có thiếu hụtestrogen như: phụ nữ sau mãn kinh, mãn kinh sớm (trước 45 tuổi), phụ nữ bịcắt buồng trứng trước 45 tuổi cho thấy có tỉ lệ loãng xương tăng cao [22].Chế độ ăn uống không đủ canxi, vitamin D sẽ ảnh hưởng tới việc tạo xươngtrong giai đoạn dậy thì và trưởng thành, đồng thời cũng ảnh hưởng tới quátrình tái tạo xương sau đó Ở những phụ nữ nhẹ cân, sự mất xương xảy ranhanh hơn và tần suất mắc gãy cổ xương đùi và xẹp đốt sống do loãngxương cao hơn Ngoài ra uống rượu, hút thuốc lá đều ảnh hưởng tới MĐX.Một nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thanh Hương tại miền Bắc - ViệtNam cũng phát hiện ra rằng có sự khác biệt về MĐX giữa người dân thànhthị và nông thôn [23] Theo đó, tỉ lệ người dân thành thị có MĐX thấp hơn

và loãng xương nhiều hơn ở nông thôn Điều này cũng phù hợp với cácnghiên cứu chung trên thế giới: các yếu tố nguy cơ của loãng xương và gãyxương do loãng xương như tình trạng hormone, chế độ dinh dưỡng, lối

sống, chỉ đóng góp 15%-50% sự thay đổi của MĐX, trong khi đó di truyềnchiếm 50-85% vai trò quyêt định MĐX [16].

Loãng xương được phát hiện ra ở nhiều nước trên thế giới, chủ yếutập trung ở Châu Âu, Châu Mỹ, Tây Thái Bình Dương và khu vực Đông Nam

Á Trên thế giới, ước tính có khoảng hơn 200 triệu người bị loãng xương [3]

và trung bình cứ 3 phụ nữ trên 50 tuổi sẽ có 1 người bị loãng xương Ở châu

Âu, tỉ lệ tử vong do gẫy xương ở phụ nữ là 50% đối với gãy cổ xương đùi,28% đối với gãy xương cột sống và 22% do gãy các xương khác [5] và trongnăm 2010 có khoảng 22 triệu phụ nữ (trong đó 5,5 triệu trong độ tuổi từ 50-84) mắc bệnh loãng xương [6] Tại Bỉ, trong năm 2010 có 80.000 trường hợpgãy xương và số người nằm trong độ tuổi từ 50 mắc bệnh loãng xươngkhoảng 60.000 người Theo NOF, năm 2010 ở Mỹ có khoảng 9,9 triệu ngườitrưởng thành bị loãng xương và 43 triệu người thiếu xương [24] Ở Châu Á,

số liệu năm 2003 tại Ấn Độ cho biết số lượng bệnh nhân loãng xương khoảng

26 triệu và dự kiến sẽ tăng lên 36 triệu vào năm 2013 [25] 70 triệu người dântrên 50 tuổi ở Trung Quốc bị ảnh hưởng bởi bệnh loãng xương và khoảng687.000 trường hợp gãy cổ xương đùi xảy ra mỗi năm tại nước này [26] Dựbáo xu thế chung của toàn cầu đến năm 2050 tỉ lệ gãy xương đùi sẽ tăng240% ở nữ và 310% ở nam giới [21] Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu của cáctác giả ở hai miền Bắc, Nam đã cho thấy tỉ lệ loãng xương ở cả nam và nữcao tương đương với người da trắng và cao hơn hẳn một số nước ở Đông Á,đặc biệt là Trung Quốc Một nghiên cứu tại Hà Nội về MĐX trên 328 phụ nữbằng máy DXA cho thấy phụ nữ từ 50 tuổi có tỉ lệ loãng xương là 26% [23] Mộtnghiên cứu khác ở phụ nữ Việt Nam sau mãn kinh sống ở Mỹ cũng cho thấy tỉ lệloãng xương là 37% [27] Theo số liệu nghiên cứu của tác giả Nguyễn ThịThanh Hương, khoảng một phần tư phụ nữ trong độ tuổi từ 50 trở lên ở miềnBắc Việt Nam có nguy cơ cao bị gãy xương [9] Điều này cho thấy loãng

xương và gãy xương do loãng xương thực sự là gánh nặng của xã hội nóichung và ngành y tế công cộng nói riêng tại Việt Nam Loãng xương thườngkhông có triệu chứng, bệnh diễn biến âm thầm và phần lớn chỉ được chẩn đoánsau khi có biểu hiện gãy xương trên lâm sàng Do vậy, việc xác định các yếu tốnguy cơ để chẩn đoán và điều trị sớm bệnh loãng xương là cần thiết.

1.1.4 Chẩn đoán loãng xương

Hiện nay, trên lâm sàng tiêu chuẩn vàng để sàng lọc và chẩn đoán bệnhloãng xương ở cả nam giới và phụ nữ là đo mật độ khoáng xương bằng cáchhấp phụ tia X năng lượng kép (DXA- Dual energy X-ray Absorptiometry) Cụthể, máy DXA ước tính khối lượng chất khoáng (bone mineralcontent – BMC),tính diện tích mà khối chất khoáng đó được đo, và lấy BMC chia cho diệntích Bởi vậy đơn vị đo lường MĐX đo bằng máy DXA là g/cm2 Sau khi đoMĐX, để chẩn đoán loãng xương người ta so sánh MĐX hiện tại với MĐXtối đa (là MĐX lúc 20-30 tuổi) Kết quả của so sánh này là chỉ số T (T-scores) Chỉ số T trong thực tế là số đo lệch chuẩn (SD-Standard Deviation)của MĐX hiện tại với MĐX tối đa MĐX tối đa phải được tính trong mộtquần thể mang tính đại diện cao cho một dân tộc (do MĐX khác biệt giữa cácmàu da dân tộc) Chỉ số T được tính theo công thức sau đây:

T

Trong đó: iBMD là MĐX của đối tượng i.

pBMD là MĐX trung bình của quần thể trong độ tuổi 20-30

(còn gọi là peak bone mineral desity)

SD-Standard Deviation là độ lệch chuẩn của MĐX trung bình

của quần thể trong độ tuổi 20-30

Theo Tổ chức Y tế thế giới WHO, tiêu chuẩn để chẩn đoán loãngxương được đề nghị như sau (Bảng 1.1) [28]:

Chẩn đoán Tiêu chuẩn chỉ số T

Chỉ sổ T trong khoảng -2,5 đến -1,0 Thiếu xương

Chỉ sổ T thấp hơn hoặc bằng -2,5 Loãng xương

Loãng xương + tiền sử gãy xương gần đây Loãng xương nghiêm trọng

Chú ý: Các tiêu chuẩn chẩn đoán trên chỉ áp dụng cho các phụ nữ sau mãn

kinh và nam giới sau 50 tuổi, không áp dụng cho các phụ nữ ở độ tuổi trước

mãn kinh.

1.1.5 Phân loại loãng xương: loãng xương được chia thành các thể như

sau

- Loãng xương nguyên phát:

Là tình trạng thiểu sản xương bệnh lý do sự lão hóa của các tế bàotạo xương

1.1.6 Điều trị:

+ Mục tiêu của điều trị:

- Tăng MĐX.

- Phòng chống hay giảm thiểu nguy cơ gãy xương

- Ngăn nguy cơ gãy xương lần tiếp theo trên bệnh nhân đã bị gãy xương

- Phòng tình trạng mất chất khoáng trong xương, nhất là sau thời kì mãn kinh

+ Các biện pháp dự phòng, không dùng thuốc:

- Duy trì thể thao và các hoạt động thể lực thường xuyên

- Chế độ dinh dưỡng đầy đủ đặc biệt là cung cấp đủ nhu cầu canxicho cơ thể theo các giai đoạn của cuộc sống (giai đoạn thơ ấu, có thai…)nhằm tạo MĐX đỉnh tốt

- Tránh lạm dụng rượu bia, thuốc lá

- Giảm các yếu tố nguy cơ loãng xương như yếu chi, giảm thị lực…

+ Điều trị:

- Kết hợp canxi và vitamin D: Cung cấp đủ canxi trung bình 1g mỗi ngày và/

hoặc kết hợp vitamin D3 (800UI/ngày)

- Nhóm Bisphosphonates Bisphosphonatest ức chế các hoạt động hủy xương

và kích hoạt qua tế bào tạo xương và đại thực bào Hiện thuốc được coi là cóhiệu quả nhất trong điều trị loãng xương Gồm: Alendronat (Fosamax),Riesdronat (Artonel), Acid zoledronic (Aclasta)…

- Thuốc điều hòa thụ thể estrogen chọn lọc (SERM): Là chất điều hòa thụ thể

estrogen nên có tác dụng ức chế hủy xương Raloxifen (Bonmax, Evista): 1viên 60mg/n gày

- Calcitonin (Miacalcin): Tác dụng ức chế tế bào hủy xương Là thuốc chống

loãng xương duy nhất có tác dụng giảm đau

- Các steroid tăng đồng hóa: Gồm các dẫn xuất tổng hợp của

androgentestosteron Durabolin 25mg, mỗi tuần tiêm 1 ống

- Hormon cận giáp trạng – PTH: Thuốc chống loãng xương mới nhất hiện

nay có khả năng tân tạo xương Fosteo 20-40µg/ngày.

1.1.5 Nguyên nhân gây loãng xương ở phụ nữ mãn kinh

Quá trình phát triển của xương phải trải qua hai giai đoạn: tạo môhình (modelling) và tái tạo mô hình (remolling) để biệt hóa các nhóm tếbào xương giúp cho sự tạo thành xương hoặc làm mới xương [29] Tạo môhình là quá trình chu chuyển xương lúc còn nhỏ (tuổi vị thành niên) cóchức năng là tạo hình dạng và chiều dài cho xương Tái tạo mô hình là quátrình bộ xương liên tục sửa chữa và tự làm mới Quá trình này có chứcnăng duy trì MĐX ở mức tối ưu

Các tế bào tham gia vào quá trình tạo xương bao gồm: tế bào hủyxương, tế bào tạo xương, cốt bào và các tế bào liên kết Trong điều kiệnbình thường, chức năng của tế bào hủy xương và tế bào tạo xương hoạtđộng song song và mức độ tương đương nhau, với tín hiệu của loại tế bàonày ảnh hưởng tới loại tế bào kia do đó lượng xương bị phân hủy bằnglượng xương mới tạo thành

+ Tế bào hủy xương: Là tế bào khổng lồ đa nhân (50-60 nhân), đườngkính 20-100µm Xuất phát từ tề bào tạo máu(hematopoietic cell) Tác độngđến sự thay đổi cấu trúc xương Di chuyển theo chiều dài của xương đặckhoảng 40 µm/ngày

+ Tế bào tạo xương: Là những tế bào nhiều nhánh dài, thân tế bào dài20-30µm, nhân hình trứng, sẫm màu, màng nhân có nhiều lỗ và các tế bào nàynằm trong các ổ xương Xuất phát từ trung bào mầm (mesenchymal stem cell,MSC) Tác động đến sự thay đổi cấu trúc xương.Tế bào tạo xương tạo xươnghình thành osteoid với tốc độ khoảng 1µm/ngày

+ Cốt bào: Chiếm đến 95% số tế bào có mặt trong xương Xuất phát từtrung bào mầm Đóng vai trò như là những tác nhân thụ cảm cảm nhận tínhiệu trên xương và khởi động qui trình tái tạo mô hình.

+ Tế bào liên kết: Là những tế bào tạo xương đã làm xong nhiệm vụ Đóng vai trò như là những tác nhân thụ cảm, cảm nhận tín hiệu trên xương và

khởi động qui trình tái mô hình

Trong giai đoạn tái tạo mô hình, các tế bào tạo xương sinh ra nhiềuprotein có chức năng kiểm soát quá trình tạo xương Protein m-CSF(macrophage colony stimulating factor) tương tác với thụ thể MCSF làm tăngcác tế bào tạo xương Tế bào hủy xương sản xuất protein RANKL (receptoractivator of nuclear factor kappa B ligand) và protein này liên kết với một thụthể trên tế bào hủy xương (RANK) có tác dụng kích thích chúng trở thành các

tế bào hủy xương hoàn chỉnh Sự tương tác giữa RANKL/RANK làm tăngmức độ hủy xương Ngoài ra, tế bào hủy xương còn tiết ra một protein khác

có tên là OPG (osteoprotegerin), protein này liên kết với RANKL để ngănchặn tế bào hủy xương, không cho tương tác với RANK, do đó có chức nănglàm giảm tế bào hủy xương (hình 1.2)

Hình 1.2 Tương tác giữa các dòng tế bào tạo xương và hủy xương.

(Nguồn: thời sự y học 07/2011 - số 62)

Sự cân đối của RANKL và OPG quyết định MĐX Trong các yếu tốảnh hưởng đến chuyển hóa của xương thì hormon estrogen đóng vai trò quantrọng trong quá trình tạo xương [30] Hormon estrogen do tế bào hạt củabuồng trứng bài tiết ra, gọi là tiết tố nữ Tác động của estrogen đến xương làqua thụ thể estrogen (Estrogen Receptor-ER) [31], [32] Ảnh hưởng củaestrogen đến quá trình tái mô hình là làm giảm số lượng và hoạt động của tếbào hủy xương để ức chế sự phân hủy xương trong mọi giai đoạn của quátrình tái tạo mô hình xương [22]

Trong cơ thể người có nhiều dạng estrogen lưu hành và chúng được sảnxuất từ các tổ chức khác nhau dưới các dạng như estradiol, estron … Thời kìtrước mãn kinh 95% lượng estradiol trong máu do buồng trứng bài tiết, phầncòn lại có nguồn gốc từ sự chuyển hóa estron do androgen của vỏ thượng thận

và lớp áo của nang trứng bài tiết Mãn kinh là một giai đoạn mà buồng trứng

giảm tiết và dần đi đến ngừng hoạt động, thường kéo dài khoảng 5 – 10 năm.Mãn kinh được định nghĩa là khi người phụ nữ mất kinh liên tục trong vòng

12 tháng Ở thời kỳ mãn kinh, có sự thay đổi về hàm lượng, nguồn gốc cũngnhư các dạng estrogen lưu hành trong cơ thể người phụ nữ do hiện tượngngừng hoạt động có chu kì theo sinh lí của buồng trứng Nồng độ estradiol,estron giảm rõ trong 12 tháng đầu tiên mãn kinh, sau đó chúng tiếp tục giảmnhưng với tốc độ chậm hơn trong vài năm sau đó Lượng estradiol, estrogen

bị tụt giảm đột ngột và trầm trọng làm cho các tế bào hủy xương thoát khỏi sựkìm hãm về số lượng và hoạt động, dẫn đến mất cân bằng giữa hai quá trìnhtạo xương và hủy xương, quá trình hủy xương mạnh hơn làm cho MĐX bịsuy giảm, dẫn đến tình trạng loãng xương Mãn kinh có thể diễn ra bìnhthường với sự già hóa sinh lí của các cơ quan, tổ chức khác Tuy nhiên ở đa sốphụ nữ tình trạng này đã gây nên một loạt những thay đổi về tâm sinh lí vớibiểu hiện: bốc hỏa, rối loạn giấc ngủ, thay đổi huyết áp, thay đổi về tâm lí, timmạch, teo bộ phận sinh dục, rối loạn chuyển hóa xương như đau xương, loãngxương … Một trong những vấn đề sức khỏe được quan tâm nhất ở phụ nữ độtuổi mãn kinh là loãng xương bởi hậu quả nặng nề đến sức khỏe cũng nhưnhững hệ lụy lâu dài về xã hội và kinh tế mà bệnh gây nên

Mối liên quan giữa mãn kinh và loãng xương đã được biết đến từ lâu

Đo MĐX cho thấy sự mất xương ở cổ xương đùi bắt đầu ở độ tuổi 30 và tiếpdiễn với tốc độ hằng định ở những năm tiếp theo, tuy nhiên có một giai đoạn

mà tình trạng mất xương nhanh hơn là trong khoảng 5 năm đầu sau mãn kinh

ở nữ Trước mãn kinh, MĐX ở cổ xương đùi giảm khoảng 30% và sẽ tiếp tụcmất thêm 25% ngay sau mãn kinh Mức độ mất xương ở cột sống là khoảng5-7% mỗi năm và chỉ khoảng 93-95% diện tích các khoang huỷ xương đượcthay thế xương mới Việc thay thế không hoàn toàn này làm xương bè mỏngdần đi và mất liên tục trong cấu trúc của xương Ở phụ nữ sau thời kỳ mãn

kinh, các bè xương của họ mỏng đi, xuất hiện các khoảng trống và có thểthậm chí mất hết các bè xương Vỏ xương cũng mỏng đi và trở nên xốp Điềunày làm thay đổi hoàn toàn cấu trúc của xương, tuy nhiên các thành phần cấutạo hóa học của xương không thay đổi.

1.1.6 Gen quyết định 50-85% MĐX

Trong những năm gần đây với sự phát triển vũ bão của khoa học, sự ra đờicủa genome-wide đã tạo những bước đột phá trong nghiên cứu các gen cấu trúccủa các bệnh phổ biến và phức tạp [33] Những hiểu biết mới về gen này sẽ làmsáng tỏ bản chất, cơ chế bệnh sinh và từ đó chúng ta có thể xây dựng chiến lược

để đánh giá nguy cơ cũng như được những giải pháp can thiệp mới có hiệu quả

Các yếu tố nguy cơ gây loãng xương được xác định bao gồm: tuổi, tìnhtrạng hormon, các yếu tố về lối sống (thói quen ăn uống và tập luyện) và ditruyền Các nghiên cứu trên các cặp song sinh cùng trứng cho thấy yếu tố ditruyền đóng vai trò quan trọng với bệnh loãng xương, quyết định 50%-80%MĐX [16] Hiện nay trên thế giới đã tìm được khoảng 56 locus liên quan tớithay đổi MĐX với mức có ý nghĩa (P<5x10-8 ), trong đó có 14 locus MĐX

cũng liên quan đến nguy cơ gãy xương (P<5x10-4) [17] Bởi vậy một giảthuyết được đặt ra, qua việc xác định tính đa hình và sự liên quan giữa cácgen với loãng xương đã được phát hiện ở người Châu Âu và Đông Á, liệugen có thể giúp tiên lượng được loãng xương trên người Việt Nam haykhông?

1.1.7 Tình hình nghiên cứu về mối liên quan giữa gen và loãng xương, gãy xương

Vai trò của di truyền đối với sự thay đổi MĐX đang ngày càng đượckhẳng định và làm rõ Cùng với sự ra đời của nghiên cứu trên toàn hệ gen-GWAS (genome wide association study) đã mở ra nhiều bằng chứng về mốiliên quan giữa gen và loãng xương Các nghiên cứu về gen liên quan đến loãng

xương và gẫy xương đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên,không phải tất cả các trường hợp bị loãng xương đều gẫy xương và một số gengây gẫy xương không liên quan đến MĐX cũng đã được phát hiện Nghiên cứutrên toàn bộ hệ gen của Karol Estrad và cộng sự (2012) đã xác định 56 locus liênkết với MĐX, 14 locus liên quan tới nguy cơ gãy xương Trong đó, 6 locus có sựliên quan cao nhất với P<5x10-8 là: 18p11.21 (C18orf19), 7q21.3 (SLC25A13), 11q13.2 (LRP5), 4q22.1 (MEPE), 2q16.2 (SPTBN1) và 10q21.1 (DKK1) [17].

Cho tới nay đã có nhiều gen được chứng minh có liên quan đến MĐX như: gen

sFRP3 c.970 C> G và gen sFRP4 c.958 C>A do Lee Do và cộng sự (2014)

nghiên cứu trên quần thể phụ nữ sau mãn kinh ở Hàn Quốc [34], RANK [35],

SP7 [36] (chủ yếu ở phụ nữ), SOX6 [37] và FTO [18] Một số kết quả nghiên

cứu gần đây ở một số nước Châu Âu, Mỹ và Đông Á cũng đã cho thấy gen FTO

thực sự là một ứng viên tiềm năng liên quan đến MĐX, như: Yan Gou và cộng

sự (2011) trong nghiên cứu của mình đã chỉ ra 6 SNP của gen FTO (rs16952955, rs2540766, rs2540784, rs16952951, rs12447427, rs2689247) có liên quan tới sự

thay đổi MĐX trên quần thể người Trung Quốc, trong đó rs16952955 có mối

liên quan mạnh nhất với P = 1.47×10-4 [18] Nghiên cứu tại Úc (2013) của BichTran và cộng sự được tiến hành trên 6 SNP (rs1421085, rs1558902, rs1121980,

rs17817449, rs9939609 và s9930506 ) của gen FTO ở 934 phụ nữ mãn kinh Châu Úc, kết quả có 5 SNP có liên quan tới gãy cổ xương đùi do loãng xương, trong đó SNP rs 1121980 có mối liên quan mạnh nhất ở mức có ý nghĩa (P =

0,02) [19] Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nào giữa gen

FTO với bệnh loãng xương và gãy xương được tiến hành tại Việt Nam.

Từ lâu gen FTO đã được chứng minh có liên quan đến bệnh béo phì và

đái tháo đường typ II qua nhiều nghiên cứu trên thế giới Gen FTO là một gen

lớn, gồm hơn 400kb và 9 exon có chứa rất nhiều vùng bảo thủ Vùng intron 1

của gen FTO nằm trong một LD block dài 49 kb có chứa các SNP rs9939609,

rs1421085, rs17817449 và rs8050136 đã được biết là liên quan mạnh vớibệnh đái tháo đường và béo phì [38] Các SNP trên gen FTO có liên quan tớiđái tháo đường đã được nghiên cứu nhiều ở các cộng đồng trên thế giới baogồm: rs9940128, rs7191344 [39], rs8050136 [40], rs9939609 [41] (nằm ởintron 1), rs918031 và rs1588413 (nằm ở intron 8), rs11076023 (nằm ở vùng3’ không dịch mã) [42, 43] Năm 2007, nghiên cứu genome (GWAS) đưa ra

kết luận: các SNPs trong intron đầu tiên của FTO có liên quan BMI, bệnh béo phì Một số nghiên cứu sau đó cũng tiết lộ hơn 31 locus thuộc gen FTO có

liên quan với bệnh béo phì Tuy nhiên, 2 SNP được nghiên cứu nhiều nhất và

có mối liên quan mạnh nhất đối với bệnh đái tháo đường và béo phì làrs9939609 và rs8050136 Tại Việt Nam, nghiên cứu của tác giả Trần QuangBình và cộng sự (2011) đã cung cấp bằng chứng về sự liên quan của SNP

rs9939609 của gen FTO với bệnh béo phì ở trẻ em tiểu học [44] Một nghiên

cứu khác của cùng tác giả Trần Quang Bình (2013) cũng chỉ ra SNP

rs9939609 của gen FTO có liên quan đáng kể với tăng nguy cơ đái tháo

đường týp II, độc lập với béo phì ở người Việt Nam [43]

Ở Việt Nam, với tỉ lệ cao bị loãng xương ở phụ nữ mãn kinh, việchiểu được ảnh hưởng của yếu tố di truyền và cơ chế tác động của nó đối với

bệnh sẽ giúp thiết kế các chiến lược phòng bệnh có hiệu quả và tìm ra cácphương pháp điều trị mới, cũng như ứng dụng để sản xuất thuốc điều trị

1.2 Tổng quan nghiên cứu về gen FTO

1.2.1 Lịch sử phát hiện gen FTO

Gen FTO được phát hiện từ năm 1999, là một trong sáu gen liên tiếp (ba thành viên của gia đình gen Iroquois: Irx3, Irx5, Irx6, tạo thành các cụm IrxB,

và ba gen khác chưa rõ chức năng: FTO, RPGRIP1L và FTS) nằm trong một

đột biến mất đoạn 1.6Mb xảy ra tự nhiên ở mô hình chuột gọi là fused toes(Ft) Đột biến này khiến cho chuột có nhiều ngón chân và ngón chân bị dính

vào nhau Tên của gen FTO ban đầu là Ft được rút gọn từ “Fatso – sự rủi ro”,

do các nhà khoa học nghiên cứu mất đoạn fused toes đặt ra bởi vì Ft là gen

lớn nhất trong sáu gen bị mất đoạn Những con chuột đồng hợp tử Ft dễ bị

chết từ phôi thai do dị tật của thần kinh trung ương, với các đặc điểm: tăngtrưởng chậm và mất cân xứng trái-phải của não, tăng sản tuyến ức Chuột dịhợp tử cho kiểu hình có nhiều ngón chân và dính các ngón của các chi phía

trước Ngay sau đó Ft được phát hiện là có mối liên quan với cân nặng và tên

“Ft” nhanh chóng được hiểu theo nghĩa là “yếu tố liên quan tới khối lượng

mỡ và béo phì – fat mass and obesity associated”[45] Gen FTO có ở tất cảcác loài có xương sống, tảo biển, nhưng không có ở các loài không xương

sống, nấm và thực vật [46], bởi vậy người ta cho rằng gen FTO đã có từ

khoảng 450 triệu năm trước

Hình 1.3 Các gen đột biến Ft ở chuột

(Nguồn:http://www.frontiersin.org/cellular_endocrinology/10.3389/fendo.201

1.00004/full)

1.2.3 Vị trí và cấu trúc của gen FTO

Ở người gen FTO nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 16, tại vị trí 16q12.2 FTO là một gen lớn gồm 9 exon dài hơn 410kb (từ nucleotid:

53.5737.874 đến nucleotid 54.148.378) (Hình 1.3) Hầu hết các SNP (Singel

nucleotid pholymorphism) trên gen FTO đã được phát hiện cho tới nay đều

nằm ở vùng intron 1, đây là vùng intron lớn nhất của gen và trình tự có tínhbảo thủ lớn giữa các loài

Hình 1.4 Vị trí và cấu trúc gen FTO trên nhiễm sắc thể 16

(Nguồn: http:// ghr.nlm.nih.gov/gen/FTO

1.2.4 Protein FTO

Protein FTO ở người là một enzym nằm trong họ protein AlkB Các

thành viên của họ protein này có chức năng sửa chữa DNA, chuyển hóa acid

béo và biến đổi sau dịch mã ở sinh vật nhân chuẩn và vi khuẩn Protein FTO

có kích thước 50 kDa, gồm 505 acid amin Cấu trúc tinh thể của protein FTO

gồm 2 vùng: vùng đầu amin (N terminal domain, NTD) và vùng đầu cacboxyl(C terminal domain, CTD) (Hình 1.4) Vùng đầu amin NTD, từ acid amin thứ

32 đến acid amin 325, chứa lõi xúc tác của protein và một phần có cấu trúcxoắn kép β-helix Vùng đầu cacboxyl CTD, từ acid amin thứ 326 đến acidamin 505, có cấu trúc xoắn ốc tự nhiên Chức năng chính xác của CTD vẫnchưa được biết rõ, tuy nhiên người ta thấy rằng CTD tạo nên những tương tác

mở rộng với vùng NTD giúp giữ ổn định cấu trúc của vùng NTD và hoạt tínhxúc tác của protein FTO

Phân tích cấu trúc tinh thể giúp xác định sự khác biệt về cơ chất của

FTO và một số loại trong họ AlkB Cấu trúc tinh thể cho thấy trong vùng

NTD của protein FTO có thêm một đoạn, gọi là "vòng số 1- loop 1", có

tính bảo thủ cao giữa các loài khác nhau, “loop1” cản trở các sợi DNAchưa được methyl hóa tiếp cận với vùng gắn cơ chất, giải thích lý do tại sao

FTO không có ái lực cao với axid nucleic chuỗi đôi, và gợi ý rằng cơ chất

của nó có thể là RNA thay vì là DNA Tuy nhiên đầu loop này không có ở

các protein khác trong họ AlkB, điều này khiến cho FTO khác biệt hoàn

toàn so với các protein trong họ AlkB [45]

Hình 1.5 Cấu trúc protein FTO

(Nguồn:http://www.frontiersin.org/cellular_endocrinology/10.3389/fendo.201

1.00004/full)

1.2.5 Chức năng sinh hóa của FTO

Protein FTO có chung một trình tự với enzym Fe (II) 2-oxoglutarate

(2OG) phụ thuộc oxygenase, gần với họ protein AlkB – một họ enzym sửachữa DNA ở vi khuẩn, tương ứng ở động vật là ABH2 và ABH3 Đặc biệt làtrong vùng đầu amin NTD, năm 5 acid amin bắt buộc đều có trong tất cả cácenzym nằm trong họ enzym này: hai gốc bảo toàn: histidine (H) và acidaspartic (D) cần thiết cho sự gắn Fe(II); và ba gốc khác: 1 Histidine(H) và 2arginines (R) cách nhau bởi sáu axit amin, cần thiết cho gắn 2 - OG Trong

nghiên cứu in vitro, FTO có khả năng xúc tác khử methyl của 3 -methyl

thymidine (3-metT) và 3 -methyl uridine (3-metU) trong DNA mạch đơn

và RNA mạch đơn, với sự có mặt của Fe 2(II) và 2 - OG FTO (Hình 1.5).Phản ứng này đồng thời tạo ra succinat, formaldehit và carbon dioxit Sựmethyl hóa DNA rất cần thiết cho việc sửa chữa những sai hỏng của DNA.Những sai hỏng này nếu như không được kiểm tra thì có thể dẫn tới nhữngthay đổi về trình tự gen [45]

Hình 1.6 Hoạt tính hóa sinh của FTO

(Nguồn:.

http://www.frontiersin.org/cellular_endocrinology/10.3389/fendo.2011.0

0004/full)

Mặc dù vai trò và cơ chế ảnh hưởng chính xác của FTO đối với các quá

trình sinh lý trong cơ thể vẫn chưa được làm sáng tỏ tuy nhiên qua những

nghiên cứu ở người và chuột người ta thấy FTO có vai trò rất quan trọng đối

với sự phát triển bình thường của hệ thần kinh và tim mạch

1.2.6 Ảnh hưởng ở người bị thiếu chức năng gen FTO

Một nghiên cứu của Boissel và cộng sự (2009) trong một gia đình bà

cùng huyết thống có nguồn gốc Ả Rập với 9 thành viên bị ảnh hưởng bởi mộthội chứng đa dị tật mà không rõ nguyên nhân, hội chứng polymalformation,tất cả họ đều có kiểu gen đồng hợp tử đối với một đột biến glutamine ở vị trí

316 (R316Q) đc thay thế bởi arginine ở gen FTO vì R316 là một trong những

vị trí bắt buộc cho liên kết của 2 - OG (được bảo tồn tuyệt đối trong họ AlkB

ở tất cả các loài), nên đột biến R316Q làm mất hoàn toàn hoạt động

demethylase của FTO Các biểu hiện của hội chứng polymalformation bao

gồm: chậm phát triển sau khi sinh, chức năng não giảm sút nghiêm trọng, hộp

sọ bé, hở hàm ếch, dị dạng mặt và bất thường ở tim Tất cả trẻ em mắc hộichứng này thường bị chết trong vòng 30 tháng đầu tiên sau khi sinh Các

nghiên cứu thực nghiệm trên chuột khi cắt bỏ hoàn toàn gen FTO cũng cho

kết quả tương tự: chuột bị tử vong sớm có tỉ lệ cao, tuy nhiên khoảng 50%những con chuột đồng hợp tử có thể sống sót qua thời gian cai sữa (4 tuần sau

sinh) Kiểu hình của những con chuột còn sống sót không có gen FTO rất phức tạp [45] Nguyên nhân gây chết sau khi sinh vẫn còn chưa biết Dường như việc cắt bỏ hoàn toàn gen FTO ở chuột làm cho chuột sau khi sinh chậm phát triển, phù hợp với tình trạng thiếu hụt FTO ở người, hỗ trợ cho giả thuyết

FTO có liên quan đến quá trình phát triển cơ thể bình thường Vì vậy người ta

cho rằng FTO rất cần thiết đối với sự phát triển bình thường của nhiều hệ

thống cơ quan trong cơ thể bao gồm cả hệ thần kinh trung ương, hệ tuần hoàn

Sự thiếu hoàn toàn hoạt tính xúc tác của FTO khiến cho cá thể không thể tồn

tại lâu hay khỏe mạnh được sau khi sinh Những bất thường chức năng não và

sự phát triển của những người bị thiếu chức năng của gen FTO giống với kiểu hình của những bệnh nhân bị lặp một đoạn nhiễm sắc thể nhỏ mang gen FTO

1.2.7 Liên quan giữa gen FTO với loãng xương và gãy xương

Nghiên cứu của Yan Gou và cộng sự (2011) được tiến hành trên hai quầnthể người Trung Quốc không có quan hệ huyết thông và một quần thể người da

trắng đã, kết quả cho thấy 6 SNP cùng nằm trong intron 8của gen FTO (rs16952955, rs2540766, rs2540784, rs16952951, rs12447427, rs2689247) có

liên quan tới MĐX cổ xương đùi ở hai quần thể người Trung Quốc, trong đórs16952955 có mối liên quan mạnh nhất với P = 1.47×10-4 , 5 SNP còn lại daođộng từ 4,99- 2,55×10-4 Tuy nhiên, không thấy sự liên quan trong quần thể

người da trắng [18] Một nghiên cứu khác tại Úc được tiến hành từ năm

1989-2007 trên 934 phụ nữ sau mãn kinh 60 tuổi trở lên để tìm mối liên quan giữa các

SNPs (rs1421085, rs1558902, rs1121980, rs17817449, rs9939609 và rs9930506)

cùng nằm trong intron 1 của gen FTO với gãy xương, kết quả có 102 phụ nữ

(11%) có ít nhất một lần gãy xương cổ xương đùi Khoảng 23 % phụ nữ (n =291) có loãng xương (T- score ≤ -2,5) Tỷ lệ gãy cổ xương đùi ở phụ nữ loãngxương là khoảng 23%, cao gấp 6,8 lần so với phụ nữ không loãng xương (3,3%).Người ta thấy rằng, tỷ lệ gãy cổ xương đùi là lớn hơn ở phụ nữ đồng hợp tử chocác alen nhỏ của tất cả các SNPs, và phụ nữ đồng hợp tử cho alen nhỏ (TT) củars1121980 có nguy cơ gãy cổ xương đùi cao hơn đáng kể so với phụ nữ đồnghợp tử cho các alen lớn (CC) Khoảng 17% các trường hợp gãy cổ xương đùi là

do rs1121980 Từ đó, đưa ra kết luận: biến thể phổ biến trong gen FTO có liên quan đến nguy cơ gãy cổ xương đùi ở phụ nữ, và gen FTO có thể giúp nâng

cao giá trị dự đoán nguy cơ gãy cổ xương đùi [19] SNP rs9939609 trong cácnghiên cứu của GWAS được xác định là có liên quan mạnh với bệnh béo phì vàđái tháo đường thì trong hai nghiên cứu này đều cho thấy không có sự liên quanđến MĐX, loãng xương

kỹ thuật RFLP-PCR, là kỹ thuật liên quan đến việc xác định kiểu gen FTO

trong nghiên cứu này Sau đó kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen

Về cơ bản, kỹ thuật RFLP-PCR được tiến hành dựa trên cơ sở khuếch đạiđoạn gen nghi ngờ mang gen đột biến bằng kỹ thuật PCR

1.3.1 Kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tínhcủa DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNApolymerase Với nguyên liệu là bốn loại nucleotid, enzym DNA polymerasexúc tác sự tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn Phản ứng đòihỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với haiđầu của trình tự DNA khuôn

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm

ba bước:

- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Trong một dung dịch

phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNAđược biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử,thường là 94oC - 95oC trong vòng 30-60 giây

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp cho

phép các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC-70oC tuỳ thuộc Tmcủa các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ được

tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất.

Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéodài từ 30 giây đến nhiều phút

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng

để làm các DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo.Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằngkhoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm đượcxác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi

Hình 1.7 Minh họa chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR [47]

(Nguồn: https://www.google.com.vn/search?q=phản+ứng+PCR)

Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNAban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấpđôi lượng mẫu của lần trước Như vậy sau n chu kỳ, từ một DNA đích đãnhân bản được thành 2n bản sao Nhờ vậy đủ số lượng DNA để có thể tách rakhi điện di và có thể phát hiện được sau khi nhuộm và để có thể tạo dònghoặc giải trình tự Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, ở những chu kỳsau lượng khuôn tăng nhưng lượng mồi và dNTP (deoxyribonucleosidetriphosphate) tự do giảm, enzym DNA polymerase hoạt động yếu dần Do đó,cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP và enzym để đảm bảo phản ứng PCR chokết quả tốt nhất [48]

1.3.2 Kỹ thuật RFLP-PCR

Kỹ thuật PRFP–PCR là phương pháp nghiên cứu tính đa hình chiều dài

của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt của các enzym giới hạn(Restriction Enzym, RE) Nói cách khác, đây là phương pháp so sánh DNAcủa các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu bằng một enzym giới hạn nhằm tìmhiểu xem có hay không đột biến điểm (mất hay xuất hiện một vị trí giới hạnmới) hoặc có hay không sự thay đổi một trình tự DNA Nếu trình tự DNA củahai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số lượng và kích thước thì sẽ có

sự giống nhau về các băng DNA sau khi chạy điện di Ngược lại nếu có sựxuất hiện đột biến điểm hoặc thay đổi một trình tự đoạn DNA trên sợi DNAthì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA Quá trình thực hiện kĩ thuật RFLP-PCR gồm các giai đoạn sau [49]:

- Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để khuyếch đại đoạnDNA chứa SNP cần phân tích

- Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzym giới hạn thích hợp

- Điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết luận

Enzym giới hạn: Enzym giới hạn (hay enzym cắt) - là một enzym quan

trọng trong các enzym endonulease tác động lên phân tử DNA và có đặc điểm

là cắt DNA ở những vị trí xác định Cho đến nay người ta đã biết khoảng trên

500 loại enzym giới hạn khác nhau Đặc điểm chung của các loại enzym giớihạn:

- Đều được chiết tách từ vi khuẩn và tên enzym mang tên của vi khuẩn

- Cắt phân tử DNA xoắn kép ở những trình tự base đặc hiệu (hay còn gọi

là vị trí giới hạn, trình tự giới hạn) với từng loại enzym

- Vị trí cắt thường có 4-8 Nucleotid, đặc trưng quan trọng nhất của trình

tự giới hạn là đoạn DNA gồm 4-8 cặp Nucleotid này có trình tự giống nhaukhi đọc theo chiều 3’-5’ và 5’-3’ Vì vậy, vị trí cắt của enzym giống nhau trên

cả 2 mạch

- Sau khi cùng bị cắt với cùng loại enzym giới hạn, các sợi đơn DNA cócác đầu kết dính với các Nucleotid bổ sung cho nhau [50]

Điện di DNA: Acid nucleotid là các đại phân tử tích điện âm, trong điện

trường có điện thế và cường độ thích hợp, DNA di chuyển từ cực âm đến cựcdương của điện trường Để kiểm tra và xác định tính chất của DNA, cần điện

di DNA trên gel Phân tử DNA càng nhỏ di động càng nhanh Có 2 loại gelđược sử dụng để điện di DNA đó là gel polyacrylamid và gel agarose, trongnghiên cứu này chúng tôi sử dụng gel agarose Tùy theo chiều dài của sảnphẩm mà lựa chọn nồng độ gel thích hợp, thường dao động trong khoảng 0.8-3% Để quan sát hình ảnh DNA khi điện di, người ta nhuộm DNA bằngRedsafe hoặc Ethidium bromide, dưới ánh sáng tử ngoại, DNA gắn vớiRedsafe/ Ethidium bromide sẽ phát sáng Khi cho chạy điện di DNA nghiêncứu thường có DNA mẫu (Marker) cùng chạy để so sánh, xác định kích thướccủa đoạn DNA [49]

1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp

DNA là cơ sở của gen Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạchđơn được tạo thành từ 4 loại nucleotid, khác nhau nhờ các base của chúng, đólà: A (Adenine), C (Cytosine),G (Guanine), T (Thymine) Các nucleotid nàyliên kết với nhau theo một trật tự xác định Giaỉ trình tự của một gen tức làphát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotid này trên phân tử DNA

Có nhiều phương pháp giải trình tự gen, bao gồm: giải trình tự gen bằngphương pháp hóa học, phương pháp enzym và bằng máy tự động Phương

pháp hóa học để xác đinh trình tự DNA được Maxam và Gilbert phát hiệnnăm 1977, nhưng trên thực tế phương pháp này không dễ để thực hiện, vì nóđòi hỏi phải xác định nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm Chính vì sự phứctạp này nên hiện nay phương pháp hóa học ít được sử dụng, thay vào đó cácnhà khoa học dùng phương pháp enzym với nhiều ưu điểm vượt trội hơn.Phương pháp enzym cũng được phát hiện vào năm 1977, ngày càng đượchoàn thiện và sử dụng dễ dàng tại các phòng thí nghiệm Các phòng thínghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương pháp enzym,nhưng khi làm giải trình tự thì thường dùng máy tự động chứ không dùng kỹthuật xạ kí tự ghi như trước đây Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụngphương pháp giải trình tự bằng máy tự động

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nhóm bệnh

Chọn 60 bệnh nhân là phụ nữ mãn kinh, được chẩn đoán loãng xươngtại khoa Nội- Thận- Khớp, Bệnh viện Quân đội Trung ương 108 với cáctiêu chuẩn:

Tiêu chuẩn lựa chọn:

Đo MĐX: MĐX được đo ở cổ xương đùi bên phải và cột sống thắt lưng

từ L1 đến L4 cho tất cả đối tượng đủ điều kiện Được chẩn đoán là loãngxương nếu có chỉ số T- score ≤ -2,5 ở cổ xương đùi hoặc cột sống thắt lưnghoặc ở cả hai vị trí

Tiêu chuẩn loại trừ:

- Bệnh nhân không có đầy đủ các tiêu chuẩn trên

- Bệnh nhân có các bệnh mãn tính như đái tháo đường, béo phì hoặc cácrối loạn liên quan chuyển hóa Vitamin D và chuyển hóa xương như ung thư,hội chứng kém hấp thu

- Bệnh nhân sử dụng các loại thuốc liên quan đến chuyển hóa xương vàvitamin D trong 6 tháng vừa qua, như: corticoid, hormon estrogen

- Bệnh nhân có tiền sử bất động từ 1 tháng trở lên

- Bệnh nhân bị cắt bỏ tử cung/buồng trứng, hoặc đang mang thai và chocon bú

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2 Nhóm chứng

Chọn 15 đối tượng là phụ nữ mãn kinh, khỏe mạnh, không bị loãng xương

Tiêu chuẩn lựa chọn:

Đo MĐX: MĐX được đo ở cổ xương đùi bên phải và cột sống thắt lưng

từ L1 đến L4 cho tất cả đối tượng đủ điều kiện Được chẩn đoán là khôngloãng xương nếu chỉ số T-score ở cả hai vị trí cổ xương đùi và cột sống thắtlưng đều ≥ -1

Tiêu chuẩn loại trừ:

- Đối tượng không có đầy đủ các tiêu chuẩn trên

- Đối tượng mắc các bệnh mạn tính như đái tháo đường, béo phì

- Đối tượng mắc các bệnh liên quan đến chuyển hóa canxi, phosphat,virtamin D

- Đối tượng không đồng ý tham gia nghiên cứu.

2.1.3 Phương pháp lấy mẫu

Nhóm bệnh: Những phụ nữ mãn kinh đến khám và điều trị tại khoa

Nội Thận – Khớp (A15) – Bệnh viện TƯQĐ 108 sẽ được thăm khám lâmsàng và theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu theo một mẫu bệnh án nghiên cứu

thống nhất bao gồm chiều cao, cân nặng, BMI, các yếu tố nguy cơ loãng

xương, tiền sử và bệnh kèm theo

Cận lâm sàng: làm các xét nghiệm công thức máu (CTM); Các chỉ sốsinh hóa thường qui; Đo MĐX ở cổ xương đùi bên phải, cột sống thắt lưng từL1 đến L4; Chụp X.Quang từ tháng 4/2014 đến tháng 10/2014 (kết quả cụ thể

về các chỉ số cận lâm sàng được trình bày ở phụ lục 2)

Các bệnh nhân có loãng xương đều được bác sĩ chuyên khoa tư vấn vềchế độ dinh dưỡng, sinh hoạt, tập luyện và điều trị bệnh loãng xương

Bệnh phẩm là 2ml máu tĩnh mạch ngoại vi chống đông bằng EDTA Nếubệnh phẩm chưa phân tích ngay sẽ được bảo quản trong tủ âm sâu -800C

Quy trình thu thập mẫu nhóm bệnh

Nhóm chứng: Các đối tượng đến bệnh viện Trung ương Quân đội 108

khám sức khỏe định kì, không có biểu hiện loãng xương trên lâm sàng Cậnlâm sàng: các xét nghiệm huyết học, đo MĐX ở cổ xương đùi bên phải, cộtsống thắt lưng từ L1 đến L4; Chụp X.Quang Được ghép cặp với nhóm bệnh

về độ tuổi, số năm mãn kinh

Loãng xương CXĐ Loãng xương Loãng xương CSTL CSTL

Quy trình thu thập mẫu nhóm chứng

Tại phòng đo MĐX

2.1.4 Các tiêu chuẩn và qui trình xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu

- Chẩn đoán loãng xương:

Bảng 2.1: Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương do WHO đề nghị

Chỉ sổ T trong khoảng -2,5 đến -1,0 Thiếu xương

Chỉ sổ T thấp hơn hoặc bằng -2,5 Loãng xương

Loãng xương + tiền sử gãy xương gần đây Loãng xương nghiêm trọng

- Người khỏe mạnh, không mắc các bệnh mạn tính có thể gây loãng xương thứ phát

- Không có tiền sử gia đình

có người bị loãng xương, gãy xương

Nhóm chứng

- MĐX bình thường ở cả 2

vị trí cột sống và cổ xương đùi

- Người khỏe mạnh, không mắc các bệnh mạn tính có thể gây loãng xương thứ phát

- Không có tiền sử gia đình

có người bị loãng xương, gãy xương

Đo MĐX cột sống và

cổ xương đùi

Đối tượng ký đồng ý tham gia nghiên cứu

- Qui trình đo MĐX: Đo MĐX theo phương pháp hấp thụ tia X nănglượng kép (DEXA-Dual Energy X-ray Absorption)

+ Thiết bị sử dụng: Máy Explorer của hãng Hologic – Mỹ, tại khoa Yhọc hạt nhân – Bệnh viện TƯQĐ 108, là máy đo hấp phụ tia X năng lượngkép thế hệ 3 chùm tia hình dẻ quạt góc rộng, có hệ thống tự động định kích

cỡ Mức sai số 1% Khoảng cách các vùng quét: 1mm Thời gian quét: 5-7phút Liều tia thấp 2-4mrem Nguồn điện sử dụng: 110VAC-5A-60H Bảoquản máy ở nhiệt độ: 18-270C

+ Vị trí đo và phân tích kết quả: tại cột sống thắt lưng và cổ xương đùi

Tại cột sống thắt lưng: đo ở 4 vị trí từ L1 - L4

Khối lượng xương được đo ở mặt cắt theo chiều trước sau ở từng vùngtương ứng với vùng đo MĐX Kết quả cuối cùng được tính bằng trung bìnhcộng của các chỉ số vùng đo MĐX hiển thị bằng chỉ số T-score do máy tựđộng tính theo công thức của TCYTTG

Tại cổ xương đùi: đo tại 4 vị trí là cổ xương đùi, tam giác Ward, mấu

chuyển lớn, liên mấu chuyển

Khối lượng xương được đo ở mặt cắt theo chiều trước sau ở từng vùngtương ứng với vùng đo MĐX Kết quả cuối cùng được tính bằng trung bìnhcộng của các chỉ số vùng đo MĐX hiển thị bằng chỉ số T-score do máy tựđộng tính theo công thức của TCYTTG

Chỉ số T (T-score) được tính theo công thức:

T

Trong đó: iMĐX là mật độ xương của đối tượng i.

pMĐX là mật độ xương trung bình của quần thể trong độ tuổi 20-30 (còn

gọi là peak bone mineral desity)

SD-Standard Deviation là độ lệch chuẩn của MĐX trung bình của quần

thể trong độ tuổi 20-30

Khi có kết quả iMĐX chúng tôi tiến hành tính lại T-score với pMĐX và

SD được sử dụng theo giá trị tham chiếu của người Việt Nam Lấy theo số

liệu nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thanh Hương (2012) MĐX đỉnh của

quần thể phụ nữ Việt Nam ở các vị trí (đo bằng máy Hologic) như Bảng 2.2

Bảng 2.2: MĐX đỉnh của quần thể phụ nữ Việt Nam[23]

pMĐX (SD)

Tuổi đo mật độ xương đỉnh

Từ đó tính được T-score mới phù hợp cho người Việt Nam

- Phân loại chỉ số khối cơ thể (BMI) theo tiêu chuẩn Hiệp Hội Đái tháođường Đông Nam Á:

Bảng 2.3: Phân loại chỉ số khối cơ thể (BMI)

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2014 đến tháng 10/2014

- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Hóa Sinh – Trường Đại Học Y Hà Nội

2.3 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu: Bệnh - chứng Kết quả thu được được xử lý trên

hệ thống máy tính bằng các thuật toán y học

2.3.1 Cỡ mẫu

Áp dụng công thức:

N

Trong đó: r là tỷ số cỡ mẫu giữa hai nhóm nghiên cứu =1/3

C là hệ số liên quan đến sai lầm loại I và sai lầm loại II với C=7,58 Bảng 2.4: Hằng số C liên quan đến sai lầm loại I và II

OR là tỉ số nguy cơ mà nghiên cứu đang muốn biết OR=2

P là tỉ lệ lưu hành của SNP rs 1121980 trong quần thể ở nghiên cứutrước [19] P=0,17

Từ đó, ta có cỡ mẫu cần thiết để tiến hành nghiên cứu là:

N

N = 596

Vậy đối tượng nghiên cứu bao gồm nhóm bệnh: 60 phụ nữ mãn kinh,loãng xương và nhóm chứng: 15 phụ nữ mãn kinh, không loãng xương.

2.4 Phương tiện nghiên cứu

2.4.1 Dụng cụ và máy móc

- Máy li tâm Kubota 3300, hoặc máy Centrifuge 5424 R (Eppendorf),

- Máy minispin

- Máy lắc vortex

- Máy đo mật độ quang Nanodrop 1000 (Thermo)

- Máy ủ nhiệt Thermomixer comfort (Eppendorf)

- Máy PCR mastercycle epgradient (eppendorf)

- Máy điện di Mulpid Exu (Japan)

- Đầu côn các loại khử trùng và không có DNAase

- Giá để ống, Phiến lạnh để mẫu

- Găng tay, áo choàng, giấy thấm

- Bút dạ, đồng hồ bấm giờ, thùng đựng rác

2.4.2 Hóa chất và sinh phẩm

Bộ hóa chất để tách DNA (Kít Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega Cat #A1125,USA)

- Cell Lysis Solution 28

- Nucleic Lysis Solution

- RNaseSolution

- DNA rehydration Solution

- Protein precipitation Solution

- Ethanol 70% ở nhiệt độ phòng (bảo quản ở 40C)

- Isopropanol tinh sạch (96 -100%) ở nhiệt độ phòng (bảo quản ở 40C)

Hóa chất để PCR, ủ enzym, điện di

- 10X FastDigest® Green Buffer(Thermo)

- PCR Master mix 2x (Fermantas)

- FastDigest® NdeI (FD0583, Thermo)

- Thang DNA chuẩn X174 DNA/ HaeIII Digest(Biolabs)

- Dung dịch EDTA (0.5M,PH= 8)

- Đệm điện di UltrapureTMTBE buffer0.5X (Invitrogen)

- RedsafeTM (Intron Biotechnology)

- Thạch Agarose (Promega, Spain)

- Nước tinh sạch GIBCO® UltraPure Distilled Water (Invitrogen)

- Mẫu bệnh phẩm DNA đã được tách chiết

2.5 Quy trình nghiên cứu

Bình thường (n= 30)

Bình thường (n= 30)

Nhóm chứng (n=15) (n=30)

Bệnh nhân (n=100)

Bệnh nhân (n=100)

Phân tích SNP rs1121980 bằng phương pháp RFLP- PCR

Phân tích SNP rs1121980 bằng phương pháp RFLP- PCR

- Khám LS

- Đo MĐX

- Chụp X.Q

- 2ml máu, chống đông bằng EDTA

- Tách DNA Đo nồng độ DNA và OD

Kết luận

LX CSTL (n= 30)

LX CSTL (n= 30)

cận lâm sàng

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

2.6 Kỹ thuật nghiên cứu

2.6.1 Tách DNA, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng phương pháp đo mật độ quang bằng máy Nano Drop 1000 (Thermo)

Kết Luận