Xác định hàm lượng acrylamid trong một số sản phẩm có nguồn gốc tinh bột bằng sắc ký lỏng khối phổ

Điều đó đặt ra yêu cầu cấp thiết phải có phương pháp phân tích đáng tin cậy và có độ nhạy thích hợp để kiếm soát được lượng acrylamid trong các mẫu thực phẩm.. Xuất phát từ yêu cầu thực

1 Viên Kiểm nghiệm ATVSTP QG

2 Bộ môn Hóa phân tí ch – Độc chất

HÀ NỘI - 2019

Lời cảm ơn

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo

TS Trần Cao Sơn, ThS Nguyễn Thị Hà Bì nh và ThS Nguyễn Thị Thùy Linh đã luôn tận tâm hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học cũng như hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Khoa Độc học

và dị nguyên thuộc Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất trong quá trình em làm việc tại Viện

Em cũng xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội và đặc biệt là các thầy cô giáo bộ môn Hóa phân tích và Độc chất đã dành hết tâm huyết, truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, những người bạn, những người anh, chị, em đã luôn ở bên quan tâm, giúp đỡ, động viên, giúp em vượt qua mọi khó khăn, là động lực để em học tập, rèn luyện và hoàn thành khóa luận của mình một cách tốt nhất

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 11 tháng 6 năm 2019 Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Hiếu

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về acrylamid 3

1.1.1 Giới thiệu chung về acrylamid 3

1.1.2 Độ ổn định 4

1.1.3 Phản ứng tạo thành acrylamid 4

1.1.4 Độc tí nh của acrylamid 5

1.1.5 Các quy định về mức tiêu thụ acrylamid 7

1.2 Tổng quan về phương pháp xác định acrylamid 7

1.2.1 Phương pháp chiết- làm sạch 7

1.2.1.1 Phương pháp chiết 7

1.2.1.2 Phương pháp làm sạch 8

1.2.2 Phương pháp phân tích acrylamid 8

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS 11

1.3.1 Nguyên lý hoạt động của thiết bị sắc ký lỏng khối phổ 11

1.3.2 Cấu tạo thiết bị phân tí ch khối phổ ba tứ cực 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 14

2.2.1 Nguyên vật liệu 14

2.2.2 Thiết bị 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích xác định acrylamid 16

2.3.2 Thẩm định phương pháp 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 16

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu sơ bộ 17

2.4.3 Phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS 17

2.4.4 Phương pháp thẩm định 17

2.4.5 Phương pháp xử lý kết quả 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Khảo sát điều kiện tách bằng LC-MS/MS 21

3.1.1 Khảo sát các điều kiện khối phổ 21

3.1.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký lỏng 24

3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 27

3.2.1 Khảo sát việc dùng dung dịch carrez 28

3.2.2 Khảo sát loại cột SPE 28

3.2.3 Khảo sát thể tí ch rửa giải SPE 29

3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng nền 30

3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 32

3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 32

3.3.2 Độ đặc hiệu 32

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 34

3.3.4 Khoảng làm việc và đường chuẩn 35

3.3.5 Độ lặp lại và độ đúng 36

3.4 Ứng dụng phương xác định acrylamid trong một số mẫu thực trên địa bàn Hà Nội 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

AOAC Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội các

cộng đồng phân tích chính thức)

CE Collision energy (Năng lượng va chạm)

CZE Capillary zone electrophoresis (Điện di mao quản vùng) ESI Electrospray ionization (Ion hóa phun điện tử)

GC-MS/MS Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký khí

khối phổ hai lần)

GC-ECD Gas chromatography with Electron Capture Detector (Sắc ký

khi với detector cộng kết điện tử)

HPLC-DAD High-performance liquid chromatography with a diode-array

detector (Sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector mảng diod)

IP Identification point (Điểm nhận dạng)

IS Internal standard (chất chuẩn nội)

LC-MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký

lỏng khối phổ hai lần) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of quantification (Giới hạn định lượng)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Độ tan của acrylamid trong một số dung môi 2

2 Bảng 1.2 Nguy cơ của acrylamid thông qua một số thực phẩm 5

3 Bảng 1.3 Một số phương pháp xác định acrylamid 9

4 Bảng 3.1 Mảnh mẹ, mảnh con của acrylamid và d3-acrylamid 21

5 Bảng 3.2 Các thông số tối ưu của MS để phân tích acrylamid 23

7 Bảng 3.4 Chương trình gradient phân tích acrylamid 26

8 Bảng 3.5 Kết quả thẩm định tính tương thích hệ thống 32

10 Bảng 3.7 Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính 35

11 Bảng 3.8 Độ lặp lại và độ thu hồi của acrylamid tại các nồng độ 37

12 Bảng 3.9 Hàm lượng acrylamid trong một số mẫu bim bim khoai

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo của acrylamid 3

2 Hình 1.2 Cơ chế đề xuất theo phản ứng Maillard, sự hình thành

4 Hình 1.4 Bộ phận phân tích khối ba tứ cực 12

5 Hình 3.1 Phổ khối MS của acrylamid sau khi bắn phá ion 22

6 Hình 3.2 Sắc ký đồ thu được khi khảo sát cột Symmetry® C18,

Atlantilis HILIC, IntertsilTM HILIC và Cosmosil HILIC 25

7 Hình 3.3 Sắc ký đồ thu được khi sử dụng cột Cosmosil HILIC

và chương trình gradient đã chọn tại nồng độ 100 ng/mL 27

8 Hình 3.4 Kết quả khảo sát thể tích carrez 28

9 Hình 3.5 Kết quả khảo sát hiệu suất cột C18 và HLB 29

10 Hình 3.6 Tín hiệu của acrylamid khi không rửa giải và 3 lần rửa

12 Hình 3.8 Sắc ký acrylamid ở mẫu trắng, mẫu chuẩn trên dung

môi 100ng/mL và mẫu trắng thêm chuẩn 100 ng/mL dịch đo 33

13 Hình 3.9 Sắc ký đồ của acrylamid tại LOD 34

14 Hình 3.10 Sắc ký đồ của acrylamid tại LOQ 35

15 Hình 3.11 Khoảng làm việc của acrylamid 36

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, xu hướng tiêu thụ các loại thức ăn nhanh như khoai tây chiên, bánh mì, mì ăn liền…ngày càng trở nên phổ biến Theo đó tiềm ẩn các mối nguy mất an toàn thực phẩm, trong đó có thể có mặt các chất độc sinh ra trong quá trình chế biến Gần đây, các nhà khoa học đã có những cảnh báo về sự xuất hiện của chất có khả năng gây ung thư là acrylamid (theo Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế IARC) [15] Acrylamid được hình thành trong quá trình chế biến thực phẩm có chứa acid amin asparagin và nhóm cacbonyl ở điều kiện nhiệt độ cao như chiên rán [24]

Tháng 4 năm 2002, Cơ quan Quản lý thực phẩm Thuỵ Điển cùng với nhóm nghiên cứu của trường Đại học Stockholm lần đầu tiên đã tìm ra sự hiện diện của acrylamid trong một số thực phẩm có nguồn gốc tinh bột được chế biến ở nhiệt độ cao Nghiên cứu này đã chỉ ra độc tính có thể gây ung thư của acrylamid Ngoài ra, acrylamid cũng được xếp vào nhóm chất có khả năng gây độc tính thần kinh, độc tính sinh sản, độc tính trên gen và ảnh hưởng đến khả năng sinh sản (hiệu ứng gây hại nhiễm sắc thể) ở động vật gặm nhấm [21]

Những nghiên cứu về độc tính của acrylamid trên người còn rất hạn chế Tuy vậy, việc phân loại acrylamid như một chất có nguy cơ gây ung thư ở người

đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu về phát hiện và định lượng acrylamid Từ đó, trên thế giới, nhiều nghiên cứu về định lượng acrylamid trong thực phẩm đã được tiến hành Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện vẫn chưa có phương pháp chính thức để xác định acrylamid trong thực phẩm Điều đó đặt ra yêu cầu cấp thiết phải có phương pháp phân tích đáng tin cậy và có độ nhạy thích hợp để kiếm soát được lượng acrylamid trong các mẫu thực phẩm Xuất phát từ yêu cầu thực tế và nhận thấy trong các nghiên cứu trên thế giới, acrylamid xuất hiện chủ yếu ở các sản phẩm có nguồn gốc tinh bột được chế biến qua quá trình chiên rán,

vì thế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định hàm lượng acrylamid trong một số sản phẩm có nguồn gốc tinh bột bằng sắc ký lỏng khối phổ”

với các mục tiêu sau:

Acrylamid là một hợp chất vinylic có công thức phân tử C3H5NO, khối

lượng phân tử 71,08 g/mol và có tên khoa học là prop-2-enamid

Hì nh 1.1 Công thức cấu tạo của acrylamid

- Tí nh chất hóa lý [8, 18]

Acrylamid là chất rắn kết tinh màu trắng; không mùi; dễ tan trong nước và các dung môi phổ biến khác như aceton, methanol, ethanol; có nhiệt độ nóng chảy là 84,5 ± 0,3 oC; nhiệt đô sôi là 136 oC (ở áp suất 25 mmHg) Acrylamid thể hiện cả tính acid yếu và base yếu Hệ số phân bố (log P) của acrylamid bằng -0,67

Bảng 1.1 Độ tan của acrylamid trong một số dung môi

Hì nh 1.2 Cơ chế đề xuất theo phản ứng Maillard, sự hì nh thành acrylamid

từ asparagin và đường khử [18]

5

Bảng 1.2 Nguy cơ nhiễm acrylamid thông qua một số thực phẩm [20]

Thực phẩm/ Nhóm thực phẩm Nồng độ acrylamid (µg/kg) Khoai tây (chưa qua chế biến) <10 - <50

Khoai tây chiên/bim bim khoai tây (lát mỏng) 177– 4215

Khoai tây chiên/ bim bim khoai tây (dạng thanh) 59–5200

Café thay thế ( không có cafein) 80-5399

Acrylamid được hấp thu từ tất cả các con đường ăn, uống, thở, tiếp xúc qua

da Việc hấp thu acrylamid qua đường ăn uống diễn ra nhanh chóng và hoàn toàn ở tất cả các loài

 Phân bố và chuyển hóa

Các nghiên cứu trên động vật chỉ ra rằng acrylmid và glycidamid được phân bố rộng rãi trong tất cả các mô của cơ thể, bao gồm cả trong sữa Glycidamid, sản phẩm oxy hóa của acrylamid và glutathion, có thể gây ung thư

và gây độc với gen trên động vật cao hơn so với chất gốc sinh ra nó Khi so sánh

về chuyển hóa của acylamid ở người và động vật gặm nhấm kết quả chỉ ra rằng

6

mức độ oxy hóa của acrylamid ở chuột cao hơn động vật gặm nhấm và cao hơn người Ở chuột và động vật gặm nhấm, phần lớn sự hình thành glycidamid là do acrylamid liên hợp với glutathion Ngược lại, ở người, phần lớn sự hình thành này thông qua thủy phân acrylamid, ít thông qua liên hợp với glutathion

Con đường chuyển hóa chính của acrylamid ở người và động vật thí nghiệm là tương đối giống nhau Trong khoảng liều được sử dụng trong các nghiên cứu độc tính trên động vật, mức độ chuyển hóa của chất gốc thành glycidamid tỷ lệ nghịch với lượng acrylamid trong cơ thể- liều càng thấp thì tỷ

lệ chuyển đổi thành glycidamid càng cao

- Độc tính gây ung thư

Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) đã phân loại acrylamid thuộc nhóm 2A - “Có thể gây ung thư cho con người” (IARC 1994) Bằng chứng khoa học về khả năng gây ung thư của acrylamid chủ yếu dựa vào dữ liệu

từ mô hình thử nghiệm Trong thí nghiệm in vivo và in vitro đã chỉ ra rằng: Các

tế bào tiếp xúc với mức độ cao của acrylamid trải qua đột biến di truyền và biến đổi tế bào [25] Động vật tiếp xúc với acrylamid ở mức độ cao thấy có sự phát triển của một số khối u, bao gồm cả các khối u tuyến vú, phổi, đường ruột và đường sinh sản [12, 17]

7

1.1.5 Các quy định về mức tiêu thụ acrylamid

Theo khuyến cáo của Tổ chức FAO/WHO, mức cho phép tiêu thụ acrylamide để không gây ảnh hưởng đến thần kinh là 0,5 mg/kg cân nặng/ngày [11]

Phụ nữ mang thai nên tuyệt đối tránh tiêu thụ acrylamid, đặc biệt hạn chế

ăn khoai tây chiên Vì acrylamid tan tốt trong nước, mà lượng nước trong bào thai là rất lớn Các nhà khoa học khuyến cáo phụ nữ mang thai không tiêu thụ quá 20 µg acrylamid mỗi ngày [11]

Ở Việt Nam chưa có quy định về mức cho phép tiêu thụ tối đa acrylamid trong thực phẩm, hiện chỉ có quy định về mức hàm lượng tối đa trong nước ăn uống là 0,5 µg/L theo QCVN 01:2009

1.2 Tổng quan về phương pháp xác định acrylamid

đó, ta cần lựa chọn phương pháp làm sạch cho phù hợp để loại bớt những tạp này, làm giảm ảnh hưởng của chúng đến kết quả phân tích

Kỹ thuật cơ học để lắc, trộn mẫu thường được sử dụng trong các nghiên cứu là máy lắc vortex

8

1.2.1.2 Phương pháp làm sạch

Bước làm sạch giúp làm giảm ảnh hưởng của các yếu tố nhiễu và từ đó làm tăng khả năng xác nhận của phương pháp phân tích Bước làm sạch cần đáp ứng các yếu tố cơ bản là loại chất béo trước khi chiết và loại protein trong dịch chiết [10] Các nghiên cứu trên thế giới chủ yếu có hai nhóm làm sạch là phương pháp QuEChERS và phương pháp làm sạch bằng cột chiết pha rắn [22]

Phương pháp QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe) ban đầu được ứng dụng để xác định dư lượng các hóa chất bảo vệ thực vật trong cây Sau đó đã có nhiều nghiên cứu phát triển cho nhiều nhóm chất khác nhau

do có các ưu điểm về chiết đồng thời các chất, thực hiện nhanh, giá thành thấp Hiện nay đã có nghiên cứu dùng QuEChERS để xác định acrylamid [22, 6] Tuy nhiên, phương pháp QuEChERS có nhược điểm khó làm giàu mẫu, dịch chiết chứa nhiều tạp và hiệu suất thấp

Với làm sạch bằng cột chiết pha rắn, nhiều nghiên cứu đã sử dụng cột Oasis HLB và cột Accucat (Bảng 1.3) Phương pháp làm sạch bằng chiết pha rắn

có ưu điểm là chọn lọc hơn, ít tốn dung môi và cho hiệu suất cao hơn Do đó, phương pháp làm sạch bằng cột chiết pha rắn đã được lựa chọn sử dụng cho nghiên cứu này

1.2.2 Phương pháp phân tích acrylamid

Để xác định hàm lượng của acrylamid, sắc ký lỏng (LC), sắc ký khí (GC)

và điện di mao quản (CE) đã được sử dụng

a Kỹ thuật điện di mao quản

Một nghiên cứu đã xác định hàm lượng acrylamid trong mẫu bánh quy, ngũ cốc, bánh mì giòn, đồ ăn nhẹ và cà phê bằng việc sử dụng phương pháp CZE với dung dịch đệm phosphat 40mM (pH 8,5) và phát hiện bằng detector UV (210nm) Phương pháp này có LOD là 1 ng/g đối với kỹ thuật tiêm mẫu trường khuếch đại và 20 ng/g đối với kỹ thuật tiêm mẫu xếp chồng [4]

Phương pháp này có ưu điểm là giá thành rẻ, khả năng phân tách tốt, lượng dung môi và mẫu dùng cho CE hầu như không đáng kể so với HPLC Tuy nhiên,

9

phương pháp có độ nhạy thấp nếu không dùng các kỹ thuật tiêm mẫu đặc biệt

trên, độ lặp lại kém và chưa phổ biến ở Việt Nam hiện nay

n-LOD:

5-50 ng/g

[10]

GC-ECD

Khoai tây chiên, bim bim khoai tây, cánh gà chiên

n- hexan, chiết với dung dịch nước của NaCl, dẫn xuất hóa với KbrO3 và KBr, chiết lỏng lỏng với ethyl acetat

Phương pháp chiết siêu pha rắn (SPME) được sử dụng để chiết xuất acrylamid trong nước

Chiết acrylamid với methanol, loại tạp protein bằng dung dịch Carrez I và

II, bay hơi methanol và chuyển dung môi thành nước, làm sạch bằng cột Oasis HLB và cột Accucat

cốc

Chiết với nước và làm sạch bằng cột Oasis HLB và cột Bond Elut-Accucat®

LOD: 10

Mẫu được loại chất béo bằng iso-hexan, chiết bằng nước

và acetonitril, loại protein bằng dung dịch Carrez I, II

LOD: 1.5 ng/g LOQ: 5 ng/g

[16]

LC-MS

Khoai tây chiên, ngũ cốc, vụn bánh mì, cà phê

Mẫu được chiết bằng nước;

làm sạch bằng cột Oasis HLB và cột Accucat

cốc

Mẫu được chiết bằng nước, làm sạch bằng cột SPE là Isolute Multimode 300 mg [27]

LC-MS/MS

Khoai tây chiên, ngũ cốc, đồ ăn qua chế biến như pizza, gà,…

Mẫu được chiết bằng nước

và làm sạch bằng cột Oasis HLB và cột Accucat

LOD: 34 ng/g LOQ: 68 ng/g

[7]

Bảng trên cho thấy:

- Cả phương pháp GC và LC đều được sử dụng phổ biến Tuy nhiên, phương pháp GC cần có quá trình dẫn xuất hóa trước khi phân tích, vì vậy quy trình xử lý mẫu phức tạp và tốn thời gian hơn Ngoài ra, thời gian phân tích cho mỗi mẫu bằng GC thường kéo dài hơn so với LC

- Việc sử dụng detector MS hai lần cho độ nhạy cao, tính chọn lọc cao và phù hợp với điều kiện sẵn có tại phòng thí nghiệm

Từ hai lý do trên, phương pháp LC-MS/MS đã được lựa chọn để phân tích acrylamid trong nghiên cứu này

11

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS

1.3.1 Nguyên lý hoạt động của thiết bị sắc ký lỏng khối phổ

Sắc ký lỏng khối phổ là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa khả năng tách các chất của hệ thống HPLC và khả năng phân tích khối của detector khối phổ Một sắc ký lỏng khối phổ gồm: sắc ký lỏng (LC) và khối phổ

Hì nh 1.3 Mô hì nh hệ thống LC-MS/MS

Sắc ký là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng gữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tư rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điểu chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý

Khối phổ là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Các ion được tạo thành trong buồn ion hóa, được gia tốc (dưới tác dụng của điện trường) và tách riêng nhờ bộ phận tích khối trước khi đến detector Dưới tác dụng của điện trường, các ion có khối lượng , điện tích khác nhau sẽ chuyển động với tốc độ và quỹ đạo khác nhau Do vậy, sau khi đi qua bộ phận phân tích khối, các ion sẽ được phân tách riêng thành từng loại Bộ phận phát hiện sẽ ghi nhận loại ion được lựa chọn thành từng vạch phổ tương tưng trên phổ đồ

12

Năng lượng ion hóa là yếu tố quyết định sự phân mảnh các hợp chất Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của mỗi phân tử và là cơ sở để nhận dạng, định danh, định tính chất phân tích [2]

1.3.2 Cấu tạo thiết bị phân tí ch khối phổ ba tứ cực

1.3.2.1 Bộ phận nạp mẫu

Bộ phận nạp mẫu là đầu ra của một thiết bị phân tích khác được kết nối với khối phổ Với LC/MS, ta cần phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi trước khi chuyển sang bộ phận ion hóa

1.3.2.2 Bộ nguồn ion hóa

Trong máy khối phổ có nhiều cách để ion hóa phân tử và nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi Một số kỹ thuật thường dùng:

- Va chạm electron (Electron Impact- EI)

- Ion hóa hóa học (chemical ionization- CI)

- Nguồn ion bằng phun sương khử solvat (dissolvation nebulization sources)

- Nguồn ion bằng giải hấp (Ionization desorption sources)

- Tứ cực thứ hai (Q2) các ion phân tử mẹ bị phân li do va chạm với khí trơ

có mặt như khí N2, Ar, He, bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion

do Q1 chuyển đến Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3

14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng của nghiên cứu này là acrylamid

- Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

và ứng dụng phương pháp là các mẫu bim bim khoai tây và khoai tây chiên

được lấy trên địa bàn Hà Nội

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.2.1 Nguyên vật liệu

2.2.1.1 Chất chuẩn acrylamid

- Chuẩn acrylamid của hãng Dr Ehrenstorfer GmbH, độ tinh khiết (P%): 99%

Chuẩn được bảo quản ở nhiệt độ 4 ± 4 oC

- Pha dung dịch chuẩn

 Chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 0,1g chuẩn acrylamid vào cốc có mỏ,

hòa tan bằng nước cất hai lần, chuyển vào bình định mức 10 mL và định

mức đến vạch bằng nước cất hai lần Dung dịch được bảo quản trong

vòng 1 tháng ở điều kiện 2-8oC

Thực tế: mchuẩn = 0,1018g, P%= 99% Do đó, chuẩn gốc có nồng độ 1%

(g/100mL)

 Chuẩn trung gian:

Dùng pipet lấy 100 µL dung dịch chuẩn gốc 1% vào bình định mức 10

mL, định mức bằng nước cất tới vạch Ta thu được dung dịch chuẩn có nồng

- Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích với chất

chuẩn nội là d3-acrylamid của hãng Dr Ehrenstorfer GmbH Đây là một

15

đồng vị của acrylamid, cấu trúc giống acrylamid, chỉ hơn acrylamid 3 Dalton

do gắn thêm 3 nguyên tử Deuteri D3-acrylamid đáp ứng yêu cầu cần có của một chất chuẩn nội

- Pha dung dịch chuẩn nội: Tiến hành tương tự như pha dung dịch chuẩn ta thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ 1% (g/100mL) Dùng pipet lấy 50

µL dung dịch chuẩn nội gốc vào bình định mức 10 mL, định mức bằng nước cất tới vạch Ta thu được dung dịch chuẩn nội có nồng độ 50 µg/mL

2.2.1.3 Hóa chất và dung môi

Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích của Merck (Đức):

- Acetonitril loại dùng cho sắc ký

- Amoniacetat, K4[Fe(CN)6] x 3H2O, ZnSO4 x 7H2O

- Dung dịch amoniacetat 10 mM trong nước: cân 0,77 g amoniacetat pha với nước đến 1L

- Dung dịch carrez I: cân 15 g K4[Fe(CN)6] x 3H2O vào bình định mức 100

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo

- Máy lắc xoáy, IKA; máy ly tâm Mikro 200R, Hettich

2.2.2.2 Dụng cụ

Micropipet có thể tích điều chỉnh được 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL

và 1000-5000 µL; bình định mức: 10 mL…; ống ly tâm nhựa 50mL; lọ đựng mẫu 1,8 mL

16

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích xác định acrylamid

2.3.1.1 Khảo sát các điều kiện xác định acrylamide bằng LC-MS/MS

- Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: tìm các điều kiện sắc ký bao gồm pha động,

pha tĩnh

- Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion

mẹ, lựa chọn các ion con phù hợp

2.3.1.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

- Trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trước đây [13, 14, 16, 26, 7], chúng tôi thực hiện phương pháp xử lý mẫu bằng cách chiết bằng nước và làm sạch bằng SPE Từ đó, chúng tôi khảo sát các điều kiện sau:

 Việc sử dụng Carrez để loại protein

 Điều kiện chiết pha rắn: loại cột chiết pha rắn, thể tích rửa giải

- Mẫu kiểm soát là mẫu được thêm chuẩn để kiểm soát hiệu quả chiết Chuẩn được thêm vào mẫu ngay sau khi cân Chất chuẩn nội sẽ được thêm vào tất cả các mẫu ngay sau khi cân bao gồm cả mẫu thêm chuẩn và mẫu thử

2.3.2 Thẩm định phương pháp

- Độ phù hợp hệ thống

- Độ đặc hiệu

- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

- Khoảng làm việc và đường chuẩn

- Độ lặp lại và độ thu hồi

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu

- Mẫu được lấy ngẫu nhiên tại các cửa hàng tạp hóa tại địa bàn Hà Nội, gồm 5 mẫu bim bim (tối thiểu 5 đơn vị/mẫu), 04 mẫu khoai tây chiên (tối thiểu 500 g/mẫu)

17

- Sau khi lấy mẫu, mẫu được mã hóa và bảo quản ở điều kiện thích hợp Mẫu bim bim khoai tây được bảo quản ở nhiệt độ phòng, mẫu khoai tây chiên được bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu sơ bộ

Mẫu được xay nghiền toàn bộ bằng máy nghiền mẫu để đảm bảo độ đồng nhất

Phương pháp chiết bằng nước và làm sạch bằng SPE đã được lựa chọn để chiết acrylamid do sự đơn giản và hiệu quả làm sạch tốt

Độ phù hợp hệ thống được đánh giá thông qua sự lặp lại của diện tích pic

và thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu chuẩn (n=6), giá trị RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2%

có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn Ngoài ra, tính chọn lọc được khẳng định bằng số điểm nhận dạng (IP) và

18

tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC/657/2002 của châu Âu Số điểm IP yêu cầu có tối thiểu 4 điểm IP và tỷ lệ ion trên mẫu thêm chuẩn nằm trong giới hạn cho phép [5]

2.4.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn

Đối với một phương pháp phân tích sử dụng các công cụ có nhiễu đường nên như sắc ký, LOD và LOQ của phương pháp phân tích được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường nền (S/N = signal to noise ratio)

Tiến hành phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện

tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N)

 LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)

 LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10) Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích

N là nhiễu đường nền

2.4.4.4 Khoảng làm việc và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích

Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm các giới hạn này), tại

đó được chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính như đã nêu [1]

Đường chuẩn là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích

Để xác định khoảng làm việc, chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn

ở các mức nồng độ từ LOQ đến 500 ng/mL và khảo sát sự phụ thuộc của tỷ lệ

Độ chệch theo đường chuẩn tại mỗi điểm được tính theo công thức:

∆i = 𝐶𝑡 −𝐶𝑐

𝐶𝑐 × 100

Trong đó:

∆i: độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct: nồng độ tính được theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc: nồng độ của các điểm chuẩn

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp, chúng tôi tiến hành phân tích lặp lại đối với 3 mẫu trắng thêm chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau 0,45; 3,00; 6,00 µg/g (n = 6) và tính kết quả theo các công thức sau:

Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)

𝑥 × 100% SD = √∑𝑛𝑖=1(𝑥𝑖 − 𝑥̅)2

𝑛−1

Trong đó:

xi: nồng độ tính được của lần thí nghiệm thứ “i”

𝑥: nồng độ trung bình tính được của N lần thí nghiệm

SD: độ lệch chuẩn

R: độ thu hồi (%)

C: nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Cc: nồng độ chuẩn thêm theo lý thuyết

Theo AOAC, với các mức nồng độ như trên, độ thu hồi phải nằm trong khoảng 80-110%, độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) đều không vượt quá 11% ở mức nồng độ 450 ng/g, không vượt quá 7,3% ở mức nồng độ 3000 ng/g và 6000 ng/g

2.4.5 Phương pháp xử lý kết quả

Kết quả phân tích được xử lý bằng phần mềm Analysist 1.5.1 của hãng Sciex

21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát điều kiện tách bằng LC-MS/MS

3.1.1 Khảo sát các điều kiện khối phổ

3.1.1.1 Lựa chọn ion mẹ và ion con

Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây [18, 22], nguồn ion hóa phun điện

tử (ESI) đã được sử dụng để khảo sát Các ion mẹ và ion con của acrylamid được xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật tiêm trực tiếp vào khối phổ (MS) Tiến hành bơm trực tiếp dung dịch acrylamid chuẩn nồng độ 1 µg/mL vào

MS để khảo sát Chọn chế độ khảo sát tự động để bắn phá ion mẹ thành các ion con, ion con phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ Ion con có cường

độ cao nhất được chọn để định lượng và ion con có cường độ thấp hơn được chọn để xác nhận

Năng lượng bắn phá (CE) được tối ưu theo phần mềm của thiết bị Kết quả được thể hiện trong bảng và hình dưới đây

Bảng 3.1 Mảnh mẹ, mảnh con của acrylamid và d3-acrylamid

Tên chất

phân tí ch

Mảnh mẹ (m/z)

Mảnh con (m/z)

CE (eV) Ghi chú

22

Hì nh 3.1 Phổ khối MS của acrylamid sau khi bắn phá ion

Từ bảng và hình có thể nhận thấy, ion con m/z 55 có cường độ tín hiệu cao hơn mảnh ion con m/z 27 Do đó, mảnh m/z 55 được sử dụng để định lượng, mảnh m/z 27 được sử dụng để xác nhận

3.1.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện MS

Để tối ưu hóa điều kiện MS cho acrylamid, dung dịch chuẩn có nồng độ

100 ng/mL được tiêm trực tiếp vào máy MS cùng với dòng pha động mà không qua cột sắc ký, với pha động là (A) dung dịch amoniacetat 10 mM và (B) acetonitril

Chế độ khảo sát tự động được chọn đối với từng ion con định lượng và định tính của acrylamid Các thông số cho bộ phận tạo nguồn ion được khảo sát bao gồm:

- ISV (IonSpray Voltage): Thế ion hóa, thế này được áp lên đầu phun và màn chắn của bộ phận phân tích ion Thế này sẽ quyết định loại ion chuyển đến bộ phân tích khối Khoảng ISV khảo sát từ 4000 đến 5500

- TEM (Temperature): Nhiệt độ của nguồn khí nóng thổi vào (Gas 2) Nó thúc đấy quá trình hóa hơi các giọt chất phân tích khi đi ra khỏi đầu phun Khảo sát từ 300 đến 500oC