NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC THEO NGUYÊN LÝ ĐIỆN HÓA KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ĐÁNH DẤU ỨNG DỤNG

Lời cam đoanTôi xin cam đoan Luận văn Thạc sỹ khoa học - ngành Hóa Học, đề tài “Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử dụng chất đánh dấu ứng dụng trong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-NGUYỄN THỊ MỸ THỦY

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC THEO NGUYÊN

LÝ ĐIỆN HÓA KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ĐÁNH DẤU ỨNG DỤNG

TRONG Y SINH Chuyên ngành: HÓA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan Luận văn Thạc sỹ khoa học - ngành Hóa Học,

đề tài “Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử dụng chất đánh dấu ứng dụng trong y sinh” là công

trình nghiên cứu độc lập của mình , các kết quả phân tích đ−ợc thựchiện là chính xác không sử dụng của các tác giả khác

Trong luận văn tôi có tham khảo kết quả nghiên cứu của một số tácgiả đ−ợc chỉ rõ trong danh mục tài liệu tham khảo Mọi số liệu, tàiliệu sử dụng trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng

Hà Nội, ngày 26 tháng 03 năm

2012

Tác giả

Nguyễn Thị Mỹ Thủy

MỤC LỤC MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT

TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

I.1.CẢM BIẾN SINH HỌC 3

I.1.1 Sơ lược quá trình phát triển của cảm biến sinh học 3

I.1.2 Cấu tạo chung của cảm biến 4

I.1.3 Cảm biến theo nguyên lý điện hóa 7

I.1.4 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học 8

I.1.5 Một số ứng dụng của cảm biến sinh học 9

I.2.ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL 10

I.2.1 Enzyme 10 I.2.2 Cholesterol oxidase 17 I.2.3 Phản ứng với xúc tác ChOx 17

I.3.POLYME DẪN VÀ POLYANILIN 18

I.3.1 Polyme dẫn 18 I.3.2 Polyanilin 22

I.4.HẠT NANO OXIT SẮT TỪ TÍNH 29

I.4.1 Giới thiệu chung 29

I.4.2 Tính chất của hạt nano 30 I.4.3 Phương pháp tổng hợp hạt nano sắt từ 32

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU 37

II.1.PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 37

II.1.1 Điện cực làm việc 37

II.1.2 Chế tạo hạt nano Fe 3 O 4 được bọc bằng copolyme poly 38

II.1.3 Trùng hợp điện hóa màng PANi và .40

II.1.4 Cố định enzyme Cholesterol 41

II.1.5 Các phân tích điện hóa 43

II.1.6 Phân tích cholesterol bằng phương pháp CHOD-PAP 44

II.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

II.2.1 Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier 45

II.2.2 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét 46

II.2.3 Các phương pháp nghiên cứu điện hóa 48

II.2.4 Phương pháp

trắc quang 50

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

III.1 TỔNG HỢP ĐIỆN HÓA MÀNG NANOCOMPOSITE PANi/Fe3O4 52

III.2 HÀNH VI ĐIỆN HÓA CỦA ĐIỆN CỰC PANi VÀ PANi-Fe3O4 54

III.3 PHÂN TÍCH HÌNH THÁI HỌC QUA ẢNH FE-SEM 1

III.5 CÁC PHÉP

ĐÁNH GIÁ ĐIỆN HÓA ĐỐI VỚI CẢM BIẾN ChOx 58

III.5.1 Phương pháp Von-Ampe vòng (CV) 58

III.5.2 Phương pháp quét thế tuyến tính (LSV) 59

III.5 3.

So sánh đáp ứng dòng của các cảm biến ChOx, PANi-Fe 3 O 4 /ChOx và PANi-Fe 3 O 4 /Fe 3 O 4 -ChOx 60 III.6.KHOẢNG TUYẾN TÍNH,GIỚI HẠN PHÁT HIỆN,GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG 62 III.6.1 Khoảng tuyến tính 62

III.6.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 66

III.7.ĐÁNH GIÁ CẢM BIẾN ChOx 66

III.7.1 Kiểm tra độ đặc hiệu của cảm biến ChOx 66

III.7.2 Độ nhạy của cảm biến 67

III.7.3 Phân tích mẫu giả lập 68

KẾT LUẬN 70

ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Copolyme polystyren và polyacrylic axit

FT-IR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier

IDE Điện cực có cấu trúc răng lược

IUPAC Hiệp hội quốc tế về hoá học lý thuyết và hóa

SEM Kính hiển vi điện tử quét

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng III 1 Chênh lệch cường độ dòng khi thêm cholesterol vào hệ điện hóa64Bảng III 2 Kết quả đo chênh lệch cường độ dòng của mẫu trắng 66

Bảng III 3 Độ nhạy của cảm biến 68

Bảng III 4 Kết quả xác định hiệu suất thu hồi cholesterol trên mẫu giả

lập theo hai phương pháp

69

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình I 1 Mô hình cảm biến Glucose thế hệ đầu tiên [11] 3

Hình I 2 Phòng sạch tại Viện ITIMS, ĐH Bách Khoa Hà Nội 4

Hình I 3 Sơ đồ cấu tạo chung của cảm biến sinh học 5

Hình I 4 Một số phần tử được sử dụng làm đầu thu sinh học 6

Hình I 5 Một hệ cảm biến điện hóa 7

Hình I 6 (a) Mô hình Fisher (b) Mô hình Koshland 12

Hình I 7 Xúc tác Enzyme làm giảm năng lượng của phản ứng 14

Hình I 8 Cholesterol Oxidase (ChOx) 17

Hình I 9 Vinylferrocene 19

Hình I 10 Một số polyme dẫn điện tử 20

Hình I 11 Polyme trao đổi ion (poly 4-Vilynpyridine với Fe(CN)63-) 20

Hình I 12 Công thức tổng quát của PANi 23

Hình I 13 Quá trình chuyển đổi cấu trúc điện tử PANi trong môi trường oxy hóa- khử

24 Hình I 14: Đường CV của PANi trong dung dịch HCl 1M và sự thay đổi màu của PANi ở các giai đoạn oxy hoá khác nhau ở tốc độ quét thế 50 mV/s [2]25 Hình I 15 Dạng bipolaron của PANi 26

Hình I 16 Cấu trúc hạt nano Fe3O4 [38] 30

Hình I 17 Cơ chế hình thành và phát triển hạt nano trong dung dịch 32

Hình I 18 Công thức phân tử của glutaraldehyde 35

Hình I 19 Phương pháp liên kết chéo (cross-linking) 35

Hình II 1 Sơ đồ chế tạo vi điện cực tích hợp 38

Hình II 2 Vi điện cực tích hợp 38

Hình II 3 Hệ điện hóa đa năng Autolab/PGSTAT12 41

Hình II 4 Hệ ủ hơi GA cố định enzyme 42

Hình II 5 Sơ đồ nguyên lý của máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier 46

Hình II 6 Sơ đồ các bộ phận của kính hiển vi điện tử quét 48 Hình II 7 Phương pháp quét thế tuyến tính đa chu kỳ 49 Hình II 8 Quan hệ giữa điện thế và dòng điện trong phương pháp CV 49

Hình II 9 Sơ đồ nguyên lý máy trắc quang 51

Hình II 10 Đường chuẩn và cách xác định nồng độ (Cx) theo phương

pháp đường chuẩn từ Ax đo được

51

Hình III 1 Phổ trùng hợp điện hóa theo phương pháp CV màng (a) PANi

và (b) PANi-Fe3O4 trên vi điện cực Pt

Hình III 3 Ảnh hệ điện cực trước và sau khi trùng hợp 54

Hình III 4 Phổ CV của điện cực Pt/PANi và Pt/PANi-Fe3O4 trong đệm

PBS (KCl 0,9%)

54

Hình III 5 Ảnh FE-SEM màng (A) PANi và (B) PANi-Fe3O4 trùng hợp

theo phương pháp CV trên vi điện cực Pt

55

Hình III 6 ảnh FE-SEM của (A) hạt nano Fe3O4, điện cực (B)

Pt/PANi/ChOx, (C) Pt/PANi-Fe3O4/ChOx và (D)

Hình III 9 Phổ CV điện cực Pt/PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx trong PBS khi

không có cholesterol và khi có 0,5mM cholesterol

59 Hình III 10 Đường LSV của điện cực Pt/PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx trong đệm PBS (đường a) 0,0mM cholesterol, (đường b) khi thêm 0,15mM cholesterol và (đường c) khi thêm 0,3mM cholesterol

60 Hình III 11 So sánh khả năng đáp ứng dòng của cảm biến PANi-ChOx, PANi- Fe3O4/ChOx và PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx

61 Hình III 12 Cơ chế phản ứng oxy hóa cholesterol trên điện cực PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx 62

Hình III 13 Đặc tuyến đáp ứng dòng của cảm biến ChOx 63

Hình III 14 Đường chuẩn của cảm biến ChOx 65

Hình III 15 Độ đặc hiệu của cảm biến ChOx 67

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, xã hội ngày càng phát triển, đời sốngvật chất và tinh thần của con người được nâng cao Chất lượng bữa ănđược cải thiện nên một số căn bệnh và các yếu tố nguy cơ cũng gia tăng,điển hình trong đó là các bệnh về tim mạch, huyết áp cao, tai biến mạchmáu não Có rất nhiều nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch, nhưngmột trong những nguyên nhân quan trọng là do hàm lượng cholesteroltrong cơ thể tăng cao Con người ngày càng chăm lo đến sức khỏe củabản thân và điểm đến của họ là các bệnh viện để kiểm tra sức khỏe củamình Để chẩn đoán chính xác tình trạng bệnh, các bác sĩ chuyên khoatrong bệnh viện cần có sự kết hợp của các khoa cận lâm sàng, đó là cácxét nghiệm, chụp chiếu x-quang v.v Hiện nay các xét nghiệm sinh hóa

và huyết học đã tiến bộ rất nhiều nhờ sự phát triển của các ngành khoahọc kỹ thuật Đối với một số bệnh thường gặp hiện nay như: đái tháođường, tăng huyết áp, rối loạn mỡ máu thì kết quả xét nghiệm cầnđược kiểm tra thường xuyên để có hướng điều trị kịp thời Tuy nhiên cácphương pháp phân tích được sử dụng ở các bệnh viện, các trung tâmnghiên cứu thường đòi hỏi đầu tư máy móc của các hãng nước ngoài rấtđắt tiền, thời gian phân tích lâu, người sử dụng phải có chuyên môn,người bệnh phải chịu chi phí cao, mất nhiều thời gian chờ đợi

Cảm biến sinh học đo tín hiệu điện hóa (electrochemical biosensor)đáp ứng được các yêu cầu của hóa học phân tích hiện đại đó là có khảnăng phân tích nhanh theo thời gian thực (real-time), có độ nhạy, độ chọnlọc và độ chính xác cao; thiết bị phân tích nhỏ gọn, sử dụng đơn giản, cógiá thành phù hợp Với sự phát triển của công nghệ vi điện tử, công nghệnano và các loại vật liệu mới, khả năng chế tạo và ứng dụng cảm biến

sinh học ngày một hiện thực hơn, phương pháp không đòi hỏi nhiều hóachất, dung môi; chỉ cần lượng mẫu phân tích nhỏ đây là tiền đề của hóahọc phân tích xanh là chủ đề của hóa học hiện đại đang hướng tới Dovậy việc dùng cảm biến sinh học xác định nồng độ các chất như ure,glucose, cholesterol,

amylase được coi là một phương pháp bổ sung cho các phương

pháp phân tích tiêu chuẩn hiện có tại các bệnh viện

Do tính hữu ích và khả năng ứng dụng cao, luận văn “Nghiên cứuphát triển cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử dụng chấtđánh dấu ứng dụng trong y sinh”, hướng tới chế tạo cảm biến sinh họcvới điều kiện công nghệ hiện có ở trong nước, khảo sát các kết quả củacảm biến đã chế tạo, so sánh với các kết quả đã được kiểm tra đối chứngtại khoa hóa sinh Bệnh viện Bạch mai Qua đó ứng dụng để xác địnhnhanh chỉ số cholesterol trong các chế phẩm sinh học

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN I.1.CẢM BIẾN SINH HỌC (BIOSENSORS)

I.1.1 Sơ lược quá trình phát triển của cảm biến sinh học

Năm 1962, các nhà khoa học là Clark và Lyons đã có công bố lầnđầu tiên về cảm biến sinh học (cảm biến enzyme glucose) [1]; trong hơn

50 năm qua cảm biến sinh học đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứucủa nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm hoàn thiện công nghệ chế tạo,nâng cao hiệu quả phân tích, hạ giá thành sản phẩm và đưa ra thươngphẩm phục vụ đời sống con người Ở Việt Nam, khái niệm “cảm biếnsinh học” và polyme dẫn điện lần đầu tiên được nghiên cứu tại trườngĐại học Bách Khoa Hà Nội bởi tác giả Doãn Thái Hòa vào năm 1993 [2]

Từ đó tới nay, một số nhóm nghiên cứu tại Đại học Bách Khoa Hà Nội,Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Đại học Quốc gia thành phố HồChí Minh đã đi sâu nghiên cứu và thu được các kết quả tương đối khảquan như cảm biến xác định glucose [3, 4], cảm biến phát hiện sự biếnđổi gen ở đậu tương [4, 5], cảm biến phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu,cảm biến phát hiện virut Herpes, virus cúm A, HIV [6-9] , cảm biếnmiễn dịch phát hiện ung thư cổ tử cung [10]

Hình I 1 Mô hình cảm biến Glucose thế hệ đầu tiên [11]

Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)thì: “Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năngcung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng,bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp vớimột phần tử chuyển đổi” [12]

Nhờ có sự phát triển về khoa học và công nghệ cũng như sự đầu tưtrọng điểm của nhà nước, phòng thí nghiệm công nghệ vi cơ điện tử tạitrường Đại học Bách Khoa Hà Nội và Viện Khoa học Vật liệu – ViệnKhoa học và Công nghệ Việt Nam đã có thể chế tạo đựa các vi linh kiện

ở kích thước micromet với độ ổn định và chính xác cao Đây chính là cơ

sở để tác giả có được các vi linh kiện là các vi điện cực tích hợp trên nền

silic ứng dụng cho chế tạo cảm biến sinh học đo theo nguyên lý điệnhóa

Hình I 2 Phòng sạch tại Viện ITIMS, ĐH Bách Khoa Hà Nội

I.1.2 Cấu tạo chung của cảm biến

Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm bốn bộ phận chính:

- Đầu thu sinh học

- Tác nhân cố định

- Bộ phận chuyển đổi tín hiệu

- Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra

Mục đích là để dò tìm, phân tích các tác nhân cần phát hiện một cách chọn lọc.

Hình I 3 Sơ đồ cấu tạo chung của cảm biến sinh học

- Tác nhân cần phát hiện : được phân loại theo cấu tạo như sau

+ Các vi khuẩn như vi khuẩn E-coli, vi khuẩn Candida

+ Các phân tử nhỏ như glucose, ure, thuốc trừ sâu,…

+ Các phân tử sinh học có kích thước lớn như phân tử ADN, RNA, protein

- Đầu thu sinh học (Biological Receptor) có tác dụng bắt cặp và

phát hiện sự có mặt của các tác nhân sinh học cần phân tích Đầu thu

sinh học phản ứng trực tiếp với các tác nhân cần phát hiện và có nguồn

gốc từ các thành phần sinh học

+ Đầu thu sinh học làm từ enzyme là dạng phổ biến nhất: đầu thu

làm từ các enzyme urease, glucose oxidase,

+ Đầu thu làm từ các kháng thể/kháng nguyên

+ Ngoài ra đầu thu sinh học làm từ các protein , các axit nucleic như ADN, ARN

Protein Kháng thể ADN

Hình I 4 Một số phần tử được sử dụng làm đầu thu sinh học

- Tác nhân cố định: đây là một phần rất quan trọng trong cảm biến

sinh học Các tác nhân này có nhiệm vụ gắn kết các đầu thu sinh học lêntrên đế, đây là bộ phận trung gian có tác dụng liên kết các thành phầnsinh học (có nguồn gốc từ cơ thể sống) với thành phần vô cơ Nhữngtác nhân này vừa phải đảm bảo độ bền cơ học, vừa phải đảm bảo khảnăng chuyền tải tín hiệu giữa bộ phận sinh học và bộ phận chuyển đổi

Vì vậy việc nghiên cứu lựa chọn những tác nhân cố định thích hợp giúpnâng cao độ nhạy, độ ổn định cho cảm biến sinh học là cần thiết Việcphát minh polyme dẫn điện vào năm 1977 đã nhanh chóng trở thành tâmđiểm chú ý của các nhà khoa học đặc biệt trong lĩnh vực chế tạo cảm biến[13, 14] Những nghiên cứu gần đây cho thấy pha tạp (doping) các vậtliệu vô cơ có kích thước nano vào màng polyme dẫn không những làmtăng độ dẫn điện của màng mà còn tăng độ bền hơn nhiều lần so vớipolyme tinh khiết [15] Một số loại polyme dẫn điện đang được ứngdụng phổ biến hiện nay đó là polyanilin, polypyrrol, polythiophen

- Bộ phận chuyển đổi tín hiệu giúp chuyển các biến đổi sinh họcthành các tín hiệu có thể đo đạc được Có nhiều dạng chuyển đổi nhưchuyển đổi điện hoá, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổibằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ Trong đó,chuyển đổi theo nguyên lý điện hoá có nhiều ưu điểm như chế

tạo đơn giản, có độ nhạy và độ chính xác cao phù hợp trong chế tạo cảmbiến sinh học ứng dụng phân tích nhanh Chuyển đổi điện hoá bao gồmchuyển đổi dựa trên điện thế (potentiometric), dòng điện (amperometric)

và độ dẫn (conductometric)

- Bộ phận xử lý và đọc tín hiệu: bộ phận này có tác dụng chuyển,khuếch đại thành các tín hiệu điện để máy tính và các thiết bị hiển thịkhác đưa ra kết quả cho người cần phân tích

I.1.3 Cảm biến theo nguyên lý điện hóa

Cảm biến sinh học dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa có tính ứngdụng cao đo nguyên lý đơn giản, độ ổn định và độ nhạy cao Nhờ nhữngphản ứng hóa học hay sinh học đều có thể gây ra các tương tác sinh điện

tử một cách trực tiếp (như lai hóa của ADN, oxy hóa khử của enzyme…)

nên rất thích hợp để phát hiện nhanh trong phân tích cận lâm sàng

Hình I 5 Một hệ cảm biến điện hóa

Quá trình nhận biết tín hiệu có thể thực hiện bằng các phép đodòng, đo thế và độ dẫn [11, 16, 17].

Phép đo dòng: Dựa trên sự thay đổi dòng điện gây ra do sự oxy hóa

- khử điện hóa của chất cần phát hiện Phương pháp này được thực hiệnbằng cách áp một điện thế giữa điện cực làm việc (WE) và điện cực sosánh (RE), tín hiệu dòng sẽ được đo giữa điện cực làm việc (WE) vàđiện cực phụ trợ (CE) Khi điện thế đạt đến một giá trị nào đó (thường

là điện thế oxi hoá), thì hiện tượng oxi hoá xuất hiện và các electron đượcsinh ra Dòng điện thu được liên quan trực tiếp đến nồng độ chất cầnphân tích [16, 18]

Phép đo thế: Liên quan đến việc xác định sự chênh lệch thế giữa

một điện cực chỉ thị và một điện cực chuẩn hoặc hai điện cực chuẩn sosánh cách nhau bởi một lớp màng mỏng nào đó không có dòng đi qua

Bộ chuyển đổi này có thể là điện cực chọn lọc ion (ISE) Hầu như cácthiết bị đo thế phổ biến nhất hiện nay là các điện cực pH; hay các ionnhư F-, I-, CN-, Na+, K+, Ca2+, NH4+ [16]

Đo độ dẫn: Độ dẫn điện là đại lượng đặc trưng cho khả năng dẫn

điện của vật liệu Phản ứng giữa đầu dò và các phần tử đích làm thayđổi thành phần của chất dẫn điện khiến độ dẫn điện của chất đó thay đổi.Các phản ứng enzyme như urê và nhiều thụ thể màng sinh học có thểđược kiểm soát bởi các thiết bị đo trở kháng hay độ dẫn ion sử dụng các

vi điện cực xen kẽ nhau [16]

I.1.4 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học

Một số tiêu chí đánh giá, cũng như các yêu cầu đối với cảm biến sinh học:

- Khoảng tuyến tính (Linearity): giá trị hàm lượng lớn nhất của

chất phân tích mà tín hiệu phân tích còn tuân theo phương trình tuyếntính bậc nhất

- Độ nhạy (Sensitivity): là tính đáp ứng của cảm biến khi thay đổi

nồng độ chất phân tích hay khả năng phát hiện sự thay đổi tín hiệu khi có

sự thay đổi nhỏ nhất về nồng độ chất phân tích

- Độ chọn lọc (Selectivity): chỉ mức độ ảnh hưởng của các chất nền

tới phép xác định chất phân tích

- Thời gian đáp ứng (Response time): là khoảng thời gian cần thiết

để dòng của hệ đo đạt được 90% giá trị dòng cân bằng, khi có sự tiếp xúccủa điện cực nghiên cứu với dung dịch đo hoặc khi có sự thay đổi nồng

độ chất trong dung dịch tiếp xúc với điện cực Đây là một trong nhữngtiêu chuẩn của cảm biến mà các nghiên cứu đang tập trung cải tiến

Bên cạnh đó là các tiêu chuẩn khác khi thực hiện các phép phântích định lượng như độ lặp lại (repeatability), độ nhiễu, độ chụm(precision), độ phân giải, độ chính xác (accuracy)

I.1.5 Một số ứng dụng của cảm biến sinh học

Các cảm biến sinh học đã tỏ ra có nhiều ưu điểm so với các phươngpháp truyền thống như tính chọn lọc cao, đáp ứng nhanh, đơn giản vàchính xác Chính vì vậy nó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộcsống

- Thực phẩm và kiểm soát môi trường

Ngày nay vấn đề môi trường và vầ sinh an toàn thực phẩm là mốiquan tâm của toàn xã hội Các hệ cảm biến được phát triển và ứng dụng

đó là phân tích nhanh dư lượng các loại thuốc trừ sâu, dư lượng các chấtkháng sinh, các nâm mốc độc hại tồn tại trong lưới thức ăn nhưsabutamon, aflatoxin [19]

-An ninh Quốc phòng :

Một số báo cáo gần đây cho thấy đã chế tạo thành công mũi điện tửphát hiện thuốc nổ TNT [20], phát hiện các vụ tấn công hóa sinh và cácchất phóng xạ với độ nhạy cao

- Y học, sinh học:

Cảm biến sinh học ứng dụng phát hiện các protein ung thư và cácsiêu vi trùng tiềm ẩn Nhiều loại cảm biến như cảm biến đo nồng độ oxi,lượng glucose trong máu, cảm biến huyết áp, … những cảm biến giúpngười bệnh có thể thường xuyên theo dõi

tình hình bệnh tật của mình mà không nhất thiết phải đến các trung tâm y

tế Ngày nay, các cảm biến dạng này không những tăng độ tin cậy, giảmthời gian hồi đáp mà còn được chế tạo theo hướng càng ngày càng nhỏgọn, rẻ và dễ sử dụng

Nếu như cảm biến glucose đã được thương mại hóa trên thị trường,bất cứ người nào đều có thể mua và sử dụng dễ dàng với giá thành ngàymột hạ thì cảm biến xác định nhanh cholesterol toàn phần vẫn còn khámới mẻ [21] Chính vì thế trong nội dung luận văn này đã lựa chọncholesterol là đối tượng nghiên cứu

I.2.ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL

I.2.1 Enzyme [22]

Sự sống là mộtquá trình trao đổi chất liên tục Quá trình trao đổichất bao gồm hang loạt các phản ứng hóa học diễn ra liên tục và liênquan chặt chẽ với nhau Trong quá trình hóa học ấy đều có vai trò xúc táccủa các chất mà người ta gọi là enzyme (E) Do vậy enzyme là chất xúctác sinh học, bản chất là protein,được tạo ra bởi cơ thể sống Nhờ cóenzyme mà các quá trình hóa học trong và ngoài cơ thể xảy ra rất nhạyvới tốc độ nhanh trong điều kiện sinh lý bình thường

I.2.1.1 Cấu trúc phân tử của Enzyme

Bản chất enzyme là những protein đặc hiệu có cấu tạo phân tử rấtphức tạp, do vậy nó có tất cả các thuộc tính hóa học của protein Enzyme

có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu rất cao Để đảmbảo cho chức năng của enzyme là chất xúc tác sinh học, cấu trúc củaenzyme phải rất tinh vi và phức tạp Enzyme là những loại phân tử lớn,phần nhiều những enzyme đã được nghiên cứu có trọng lượng phân tử từ10.000 đến 1.000.000 dalton

những chất hữu cơ đặc biệt, có nhiệm vụ cộng tác với enzyme trong quá trình xúc tác, phần chất hữu cơ này gọi là coenzyme (CoE).

Tính chất cơ bản của enzyme do apoenzym quyết định Đa số cácenzyme có chứa kim loại Kim loại có thể là thành phần cấu tạo phân tửenzyme hoặc phức hợp enzyme - cơ chất, có thể là chất cộng tác tronghoạt động xúc tác của enzyme, hoặc cũng có thể vừa là thành phần cấutạo, vừa là chất cộng tác của enzyme

Trung tâm hoạt động của enzyme

- Tất cả các enzyme đều hoạt động xúc tác thông qua những bộphận đặc hiệu của phân tử enzyme, được gọi là trung tâm hoạt động(TTHĐ)

- Trung tâm hoạt động bao gồm những nhóm chức hóa học củamạch bên (gốc R) của các axit amin (a.a) trong phân tử, phân tử H2O liênkết, các nhóm chức của CoE Các nhóm chức của a.a thường gặp trongTTHĐ là nhóm SH của Cys; nhóm – OH của Tyr; nhóm carboxyl củaGlu, Asp; nhóm amin ở đầu N hoặc nhóm ε-amin của Lys, vòng imidazolcủa His…Các nhóm chức trong TTHĐ của E có thể có vai trò khácnhau :kết hợp hoặc xúc tác , các gốc khác thì có vai trò đối với tính đặchiệu của E

- TTHĐ có cấu hình không gian xác dịnh được giữ vững nhờ mạnglưới liên kết hydrogen mạng lưới này đủ linh động để có thể thay đổi cấuhình không gian của TTHĐ dưới tác dụng của các yếu tố bên ngoài,khitương tác với cơ chất hoặc các chất khác

- Sự tương ứng về cấu hình không gian giữa TTHĐ và cơ chấtđược hình thành trong quá trình E tiếp xúc với cơ chất (S)

E Fisher đề ra giả thuyết giữa E và S , theo đó sự tương ứng về cấutrúc của TTHĐ của E và S sắn có và cố định trong quá trình E kết hợpvới S, thuyết này đã được thừa nhận trong nhiều năm vì giải thích đượctính đặc hiệu của E , nhưng không phù hợp với đặc tính cấu trúc khônggianmềm dẻo của phân tử protein Năm 1958, Koshland đã đưa ra giảthuyết “ khớp phản ứng”,theo đó quá trình E kết hợp S sẽ làm thay đổi cấutrúc không gian ,tạo nên sự tương ứng về cấu trúc giữa E và S.

Hình I 6 (a) Mô hình Fisher (b) Mô hình Koshland

- Tương tác giữa E và S là các tương tác yếu ,dễ dàng bị cắt đứttrong quá trình phản ứng để giải phóng E và sản phẩm tương ứng

I.2.1.2 Đặc điểm sự xúc tác của enzyme

Chất xúc tác là chất làm tăng cường phản ứng hóa học, nhưngkhông bị biến đổi tiêu hao và tham gia vào thành phần sản phẩm củaphản ứng.Chỉ cần một lượng nhỏ xúc tác cũng đủ biến đổi một lượng lớnchất tham gia phản ứng Chất xúc tác làm giảm năng lượng hoạt hóa củaphản ứng hóa học bằng cách tạo nhiều phản ứng trung gian mà các cácphản ứng này chỉ đòi hỏi năng lượng hoạt hóa ít hơn nhiều so với khikhông có chất xúc tác tham gia Chất xúc tác không làm thay đổi chiềuphản ứng

Enzyme có đầy đủ các tính chất cơ bản của chất xúc tác, ngoài ra nócòn có đặc điểm riêng là tính chất đặc hiệu rất cao và hiệu lực xúc tác rấtlớn Enzyme làm giảm năng lượng hoạt hóa nhiều hơn so với các chất xúctác hóa học Hoạt tính của enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố lý,

hóa và sinh học như nhiệt độ, ánh sáng, tia cực tím, sóng siêu âm, pH củamôi trường,bản chất hóa học và nồng độ của cơ chất, nồng độ của enzyme,thời gian tác dụng của enzyme, tác dụng của chất ức chế, tác dụng của chấthoạt hóa, sản phẩm của phản ứng enzyme và các chất chuyển hóa khác.

Những đặc tính ưu việt của E với các chất xúc tác khác

- Có hiệu quả xúc tác cao, có thể làm tăng vận tốc phản ứng lên 105

- 1012 lần so với khi không có chất xúc tác

- Có thể hoạt động ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường

(nhiệt độ 20- 40oC, pH từ 5-8)

- Có tính đặc hiệu cao: chỉ tác dụng lên những cơ chất nhất định và

xúc tác cho những phản ứng nhất định do vậy ít có sản phẩm phụ tạo ra

đồng thời hiệu suất thu được sản phẩm chính cao

- Nhiều E không bị mất hoạt tính trong dung môi hữu cơ

- Sử dụng E đem lại hiệu quả kinh tế lớn không gây ảnh hưởngxấu dến môi trường

Điều chỉnh các yếu tố vật lý, hóa học thích hợp cho hoạt động của

E sẵn có để chuyển hóa cơ chất sẵn có trong nguyên liệu khi không tách

E khỏi nguyên liệu.Tách E khỏi nguyên liệu, sản xuất các chế phẩm E có

độ sạch khác nhau để sử dụng trên nhiều đối tượng khác nhau và nhiềulĩnh vực khác nhau: nghiên cứu cấu trúc phân tử;phân tích các chất, xác

định chính xác hàm lượng các chất; ứng dụng trong các ngành công

nghiệp;ứng dụng trong y, dược

I.2.1.3 Cơ chế xúc tác của E

Các phản ứng do E xúc tác có thể được khái quát bằng phương trình phảnứng chung dưới đây:

E + S  ES  ES*  E + P

Trong đó E là enzyme; S là cơ chất (substrate); ES là phức chấthình thành giữa E và cơ chất; ES* là phức chất giữa E với cơ chất, trong

đó cơ chất đã được biến đổi thành dạng gần như sản phẩm của phản ứng;

P là sản phẩm (product) của phản ứng

Bước 1: cơ chất gắn vào trung tâm hoạt động của E tạo thành

phức hợp enzyme – cơ chất (ES)

E + S  ES

Bước 2: dưới tác dụng nhóm hoạt động của E ,cấu tạo điện tử của

cơ chất bị biến đổi, những liên kết chịu tác dụng của enzyme bị căng ra,

độ bền vững của liên kết giảm đi,hoạt tính hóa học của cơ chất tăng lênrất nhiều, do đó chỉ cần năng lượng hoạt hóa rất nhỏ cũng làm phản ứngxảy ra rất nhanh

ES  ES*

Bước 3: cơ chất được biến đổi thành sản phẩm (P) và enzyme được

giải phóng ra dưới dạng tự do

Hình I 7 Xúc tác Enzyme làm giảm năng lượng của phản ứng I.2.1.4 Tính đặc hiệu của enzyme

Mỗi E đều có tác dụng chọn lọc đối với một cơ chất hoặc một loại

cơ chất nhất định đối với một loại phản ứng nhất định.Tính chất xúc tácchọn lọc này được gọi là tính đặc hiệu của E Đây là một trong những đặctính cơ bản quan trọng nhất của E, do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử

E và đặc biệt là trung tâm hoạt động mà E có tính đặc hiệu rất cao so vớinhững chất xúc tác thông thường khác

Tính chất đặc hiệu gắn liền với cơ chất : mỗi E chỉ xúc tác cho sự

chuyển hóa một chất nhất định(hoặc một cặp cơ chất nhất định trongphản ứng hai cơ chất) theo một phản ứng xác định tạo thành các sảnphẩm xác định.Ví dụ: Urease chỉ xúc tác quá trình thủy phân ure.Các E

có tính đặc hiệu tuyệt đối được sử dụng để định lượng chính xác cơ chấtcủa chúng.Trên thực tế ,nhiều E không có tính đặc hiệu tuyệt đối,tínhđặc hiệu của chúng chỉ là tương đối Chúng có tác dụng với cả một nhóm

cơ chất có cấu trúc gần giống nhau hoặc có một bộ phận phân tử giốngnhau.Ví dụ: một số esterase xúc tác cho phản ứng có thể tác dụng vàoliên kết ester của nhiều axit béo với những alcol khác nhau

Tính chất đặc hiệu gắn liền với phản ứng: phần lớn mỗi E đều có

tính đặc hiệu với mỗi loại phản ứng nhất định.Những chất có khả năngxảy ra nhiều loại phản ứng hóa học thì mỗi loại phản ứng phải có một

E đặc hiệu xúc tác Ví dụ: a.a có khả năng xảy ra phản ứng khửcacboxyl, phản ứng oxy hóa khử amin và phản ứng trao đổi nhóm amin,

vì vậy mỗi loại phản ứng trên cần có một E đặc hiệu tương ứng xúc tác làdecacboxylase,axit amin oxydase,aminotransferase Ngược lại, có những

E có khả năng xúc tác nhiều loại phản ứng Nhiều enzyme protease nhưtrypsin, chymotrypsin ngoài xúc tác đặc hiệu phản ứng thủy phân liênkết peptid, còn xúc tác phản ứng liên kết este

I.2.1.5 Đơn vị đo hoạt độ chế phẩm Enzyme

Hoạt độ của enzym là đơn vị dùng để đo khả năng xúc tác củaenzym Đơn vị hoạt độ là lượng cơ chất mà emzym xúc tác chuyển hóahoặc lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian và các điềukiện như nhiệt độ, pH, xác định

Hoạt độ riêng (specific activity): Hoạt độ riêng của enzyme đượctính bằng số đơn vị hoạt độ enzyme trên một đơn vị khối lượng(miligam hay gam) protein.

Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạttính Một đơn vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phươngpháp

Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) do Hiệp hội Hóa

sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa:Một đơn vị chuẩn của

enzyme (1U) là lượng enzyme xúc tác sự biến đổi 1 µmol cơ chất sau 1

phút ở điều kiện nhất định

1 U = = 1 µmol cơ chất (10-6mol)/phút

Đơn vị Katal(kat): Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB

khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme

Một Katal là lượng enzyme xúc tác sự biến đổi 1 mol cơ chất trong 1

giây và trong những điều kiện nhất định

1 Kat = 1 mol cơ chất/

giây 1µKat/l = 60 U/lU/l = 16,67 nKat/l (nanokatal)Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI)

I.2.1.6 Enzyme không tan và điện cực enzyme

E không tan là các E bị giữ hoặc được cố định trong một vùng, một

khoang nhất định, không bị hòa tan trong các điều kiện bình thường,vẫn

giữ được hoạt động xúc tác,có thể sử dụng liên tục và lặp lại nhiều lần

Do đặc tính không bị hòa tan mà vẫn giữ được hoạt độ xúc tác ,nên ưu

điểm của E không tan là : có thể sử dụng lặp lại nhiều lần một lượng E

xác định,do đó làm giảm đáng kể giá thành chế phẩm E Ngoài ra nó còn

có độ bền với các yếu tố hóa lý hơn khi ở dạng hòa tan Một số E xúc tác

cho quá trình oxi hóa khử cũng là dạng E không tan

Biosensor điện cực enzyme, cũng gọi là điện cực E không tan có

thành phần cấu tạo sinh học của điện cực này là E, được cố định trên bề

mặt của điện cực, đáp ứng với nồng độ của một trong các cơ chất, hoặc