Tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất (E)N(Hydroxybenzyliden)2Acetohydrazid mang khung 2HBenzob 1,4 oxazin3(4H)on

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhóm enzym này có vai trò quan trọng trong việc hoạt hóa chu trình chết tự nhiên của tế bào apoptosis, từ đó kiểm soát sự phát triển bình thường số lượng

Trang 2

Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI – 2019

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trước khi trình bày khóa luận của mình, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành

nhất đến những người đã hết mình giúp đỡ, động viên tôi để tôi có thể hoàn thiện

khóa luận này một cách tốt nhất

Trước hết, tôi xin được cảm ơn những người thầy, người cô đáng kính của mình:

TS Trần Phương Thảo – Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội và ThS

Lê Công Huân – Khoa Dược, trường Đại học Y Dược Thái Bình Các thầy, cô không

chỉ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tiến hành đề tài khóa luận tốt nghiệp mà luôn có

những chỉ dẫn chính xác và động viên tôi những lúc khó khăn

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kỹ

thuật viên, các bạn thuộc nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Hóa Dược trường Đại học

Dược Hà Nội, Khoa Hóa – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà

Nội, trường Đại học Quốc gia Chungbuk đã giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, bạn bè, đặc biệt là các bạn Hoàng Mai

Anh, Phạm Trung Anh, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Như Thượng, em Lê Minh

Anh đã ở bên chia sẻ buồn vui, hỗ trợ tôi về nhiều mặt trong thời gian tôi thực hiện

nghiên cứu này

Hà Nội, ngày 17 tháng 08 năm 2018

Sinh viên

Lê Công Trực

Trang 4

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Chu trình chết tự nhiên của tế bào (apoptosis) 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Các giai đoạn của apoptosis 2

1.1.3 Chu trình chết tự nhiên của tế bào và bệnh ung thư 3

1.2 Enzym caspase 4

1.2.1 Định nghĩa 4

1.2.2 Phân loại 4

1.2.3 Vai trò của enzym caspase trong chu trình chết tự nhiên của tế bào 5

1.3 Các chất hoạt hóa enzym caspase 3 7

1.3.1 Vai trò của ion kẽm trong sự hoạt hóa và hoạt động caspase 3 7

1.3.2 Một số chất hoạt hóa caspase 3 7

1.4 Tác dụng kháng tế bào ung thư của một số hợp chất mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on 9

1.4.1 Giới thiệu sơ lược một số tác dụng sinh học của một số hợp chất mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on 9

1.4.2 Tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on 10

Trang 5

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13

2.1.1 Hóa chất 13

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.2.1 Tổng hợp hóa học 14

2.2.2 Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.4 Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17

3.1 Hóa học 17

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 27

3.1.3 Xác định cấu trúc 28

3.2 Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư 35

3.3 Bàn luận 38

3.3.2 Khẳng định cấu trúc 40

3.3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang 6

DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị carbon-13

(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

1H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton nuclear magnetic resonance) 5-FU : 5-fluorouracil

AcOH : Acid acetic

ADN : Acid desoxyribonucleic

CGP : Mức độ sinh trưởng tế bào (Cell growth percentage)

d : Pic đôi trong phổ 1H-NMR (Doublet)

DCM : Dicloromethan

dd : Pic chẻ đôi 2 lần trong phổ 1H-NMR (Doublet of doublet) DMF : Dimethylformamid

DMSO : Dimethylsulfoxid

DMSO-d 6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa

ESI : Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)

FDA : Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ

(U.S Food and Drug Administration)

MS : Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

NCI-H23 : Tế bào ung thư phổi

NST : Nhiễm sắc thể

Trang 7

PAC-1 : Chất hoạt hóa procaspase đầu tiên

(Procaspase-activating compound 1) PC3 : Tế bào ung thư tuyến tiền liệt

Rf : Hệ số lưu giữ trong sắc ký lớp mỏng

s : Pic đơn trong phổ 1H-NMR (Singlet)

SW620 : Tế bào ung thư đại tràng

t : Pic ba trong phổ 1H-NMR (Triplet)

tºnc : Nhiệt độ nóng chảy

TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

TMS : Tetramethylsilan

UV : Tử ngoại (Ultraviolet)

δ : Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR

ν : Dao động hóa trị trong phổ IR

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Các chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các chất Va-g 27

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của các chất Va-g 28

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR của các chất Va-g 29

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ MS của các chất Va-g 30

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất Va-g 31

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất Va-g 33

Bảng 3.7 Kết quả thử tác dụng ức chế sinh trưởng một số dòng tế bào ung

thư của các chất Va-g ở nồng độ 30 µg/ml

Trang 9

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1 Các giai đoạn của chu trình chết tự nhiên của tế bào 3

Hình 1.2 Quá trình hoạt hóa chu trình chết tự nhiên thông qua enzym

caspase

6

Hình 1.3 Cấu trúc chung của các acylhydrazon (a) và cấu trúc của phức

chất của acylhydrazon với ion kẽm (b)

8

Hình 1.5 Cấu trúc của các chất WF-208 và WF-210 8

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của chất SB-590885 và dẫn chất 9c 10

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của semaxanib, sunitinib và dẫn chất 4r 11

Hình 3.3 Các dạng đồng phân có thể có của các chất Va-g 42

Hình 3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Vb 43

Hình 3.5 Biểu đồ so sánh mức độ sinh trưởng các dòng tế bào ung thư ở

nồng độ chất ức chế 30 µg/ml

44

Hình 3.6 Biểu đồ so sánh hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất Va,

Vc, Vd, Ve, Vg với 5-FU và PAC-1 trên các dòng tế bào thử nghiệm

45

Trang 11

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là một bệnh hiểm nghèo, khó điều trị, gây hao tổn lượng lớn tiền bạc,

sức lực của người bệnh, gia đình và xã hội Những năm trước đây, các thuốc điều trị

ung thư được lựa chọn chủ yếu theo kinh nghiệm điều trị, đều là các thuốc có độc

tính cao, gây nhiều tác dụng không mong muốn như 5-fluorouracil, doxorubicin,

melphalan… Hiện nay, cùng với sự tiến bộ của ngành sinh học phân tử, cơ chế bệnh

sinh của ung thư ngày càng được hiểu rõ hơn, tạo điều kiện cho việc thiết kế các phác

đồ hướng đích trong điều trị ung thư Rất nhiều mục tiêu phân tử khác nhau đã được

nghiên cứu, hướng tới các quá trình thiết yếu trong sự phát triển của tế bào Một trong

số những mục tiêu đó là nhóm enzym caspase Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhóm

enzym này có vai trò quan trọng trong việc hoạt hóa chu trình chết tự nhiên của tế

bào (apoptosis), từ đó kiểm soát sự phát triển bình thường số lượng các tế bào Các

bất thường trong hoạt động của các enzym này là một trong những nguyên nhân gây

ra ung thư [12, 25] Trong số các chất có khả năng hoạt hóa caspase đã được nghiên

cứu, nhóm các hợp chất mang hợp phần acylhydrazon thể hiện hoạt tính tương đối

tốt, điển hình là PAC-1 – một chất được công bố trong công trình nghiên cứu của K

S Putt và cộng sự [25] đăng trên tạp chí Nature vào tháng 8/2006 Đến năm 2016,

FDA đã đưa PAC-1 vào danh sách các chất được phê duyệt nhanh cho việc điều trị

các bệnh hiếm gặp Bên cạnh đó, các hợp chất mang khung cấu trúc

2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on cũng đang được nghiên cứu nhiều trong thời gian gần

đây Nhiều hợp chất trong số đó đã thể hiện khả năng tiêu diệt tế bào ung thư đầy

triển vọng [15, 26, 41]

Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Tổng hợp

và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất

(E)-Nʹ-(hydroxybenzyliden)-2-acetohydrazid mang khung

2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on” với hai mục tiêu:

1 Tổng hợp được 07 hợp chất acetohydrazid mang khung

2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on

2 Thử được tác dụng gây độc tế bào của các chất tổng hợp được

Trang 12

tế bào mà còn bởi tốc độ chúng chết đi Khi một tế bào trở nên không cần thiết với

cơ thể, nó sẽ tự chết đi thông qua sự hoạt hóa một quá trình diễn ra ngay trong bản thân tế bào, dẫn đến sự tan rã của tế bào đó Quá trình này được gọi là chu trình chết

tự nhiên của tế bào (apoptosis) [18]

1.1.2 Các giai đoạn của apoptosis

Tế bào chết đi do bị tổn thương thường sưng to và vỡ ra, giải phóng vật chất tế bào và kích hoạt quá trình viêm Kiểu chết này của tế bào được gọi là hoại tử (necrosis) [27] Trái ngược với quá trình trên, tế bào đi theo chu trình chết tự nhiên chết một cách “êm dịu”, không gây tổn thương các tế bào lân cận Về cơ bản, chu trình chết tự nhiên của tế bào gồm 5 bước như sau [6]:

- Tế bào nhận được tín hiệu dẫn đến sự khởi phát của apoptosis

- Bộ khung tế bào đứt gãy dẫn đến sự co ngót và thu nhỏ của tế bào

- Tế bào chất trở nên đậm đặc, nhân tế bào và các bào quan bị co ép lại và phân

rã

- Tế bào bị phân chia thành các mảnh nhỏ, được gọi là tiểu thể apoptotic, trong

đó tế bào chất vẫn được bao bọc nguyên vẹn bởi màng sinh học

- Các biến đổi xảy ra trên màng tế bào tạo nên các cảm ứng hóa học để lôi kéo đại thực bào đến Quá trình thực bào xảy ra trước khi vật chất tế bào bị giải phóng ra môi trường

Các giai đoạn này được mô tả trong hình 1.1

Trang 13

Hình 1.1 Các giai đoạn của chu trình chết tự nhiên của tế bào

1.1.3 Chu trình chết tự nhiên của tế bào và bệnh ung thư

Như đã biết, chu trình chết tự nhiên của tế bào là một cơ chế của cơ thể sống để kiểm soát số lượng tế bào ở mức bình thường Trong khi đó, ung thư là tình trạng bệnh lý trong đó tế bào của cơ thể tăng sinh một cách bất thường, mất kiểm soát Điều

đó gợi ý mối liên hệ giữa các bất thường xảy ra trong chu trình chết tự nhiên của tế bào và sự khởi phát ung thư

Thông thường, tế bào có các cơ chế khác nhau để bảo vệ hệ gen của mình nhằm ngăn chặn các đột biến gây ung thư, trong đó vai trò nổi bật thuộc về protein p53 Protein p53 ngăn cản sự hình thành khối u thông qua ngăn chặn sự ảnh hưởng của các tổn thương trên ADN cũng như các biến cố khác như sự tấn công của các gốc tự

do hay các tín hiệu kích thích tăng trưởng quá mức lên tế bào… Tùy vào mức độ nghiêm trọng của biến cố, p53 đưa tế bào vào trạng thái bất hoạt, ngừng phân bào để tiến hành sửa chữa ADN hoặc ra tín hiệu khởi phát chu trình chết tự nhiên của tế bào [36] Tuy nhiên, khi đột biến xảy ra quá mức kiểm soát của protein p53, nhiều sai sót

sẽ diễn ra trong chu trình chết tự nhiên của tế bào Các tế bào này tiếp tục tồn tại, phát triển vượt kiểm soát, hình thành nên các khối u [4]

Trang 14

1.2 Enzym caspase

1.2.1 Định nghĩa

Caspase là một họ các enzym cystein protease, giữ vai trò quan trọng trong việc khởi phát chu trình chết tự nhiên của tế bào (apoptosis) cũng như trong phản ứng

viêm [25] Tên gọi caspase là viết tắt của cụm “cysteine aspartate protease”, thể hiện

trực tiếp cơ chế hoạt động của họ enzym này: phân tử amino acid cystein tại trung tâm hoạt động đóng vai là tác nhân nucleophil tấn công vào phân tử protein đích, từ

đó cắt liên kết peptid tạo bởi nhóm -COOH của acid aspartic [2]

1.2.2 Phân loại

Cho đến nay, đã phát hiện được 14 enzym caspase ở người và động vật và được đánh số từ 1 đến 14 14 enzym này được chia làm 3 nhóm dựa trên tác dụng sinh học của chúng [11], chi tiết được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân loại enzym caspase

Nhóm tham gia chu trình chết tự

nhiên (apoptosis)

Caspase 2 Người và động vật Caspase 3 Người và động vật Caspase 6 Người và động vật Caspase 7 Người và động vật Caspase 8 Người và động vật Caspase 9 Người và động vật Caspase 10 Người

Nhóm tham gia phản ứng viêm

Caspase 1 Người và động vật Caspase 4 Người

Caspase 5 Người Caspase 11 Động vật Caspase 12 Người và động vật Caspase 13 Động vật

Trang 15

Trong số các caspase, nhóm enzym tham gia chu trình apoptosis của tế bào ngày càng được chú ý như là một đích tác dụng mới trong việc nghiên cứu thuốc điều trị ung thư [5, 11, 13, 25]

1.2.3 Vai trò của enzym caspase trong chu trình chết tự nhiên của tế bào

Như đã liệt kê trong bảng 1.1, có 7 loại enzym caspase tham gia vào chu trình apoptosis của tế bào Chúng được chia làm 2 nhóm nhỏ, gồm:

- Nhóm khởi phát (initiator): gồm caspase 2, 8, 9, 10

- Nhóm thi hành (executioner): gồm caspase 3, 6, 7

Thông qua các caspase, có 2 con đường hoạt hóa chu trình chết tự nhiên, gồm: (1) con đường ngoại sinh thông qua receptor tại màng tế bào và (2) con đường nội sinh xảy ra bên trong tế bào [12]

Con đường ngoại sinh được khởi phát khi các cơ chất bên ngoài gắn vào receptor gây chết nằm trên màng tế bào Quá trình này dẫn đến sự tạo thành phức hợp tín hiệu gây chết (death inducing signalling complex) Kế đến, phức hợp này thu nhận và hoạt hóa procaspase 8 thành caspase 8

Trong khi đó, con đường nội sinh liên quan chủ yếu đến hoạt động của ti thể Các biến cố xảy ra như sự chiếu xạ, phơi nhiễm chất độc, tổn thương trên ADN… kích thích sự chuyển các protein tiền apoptosis như Bax/Bak từ tế bào chất vào ti thể, làm thay đổi tính thấm của màng Cytochrom-c, theo chiều ngược lại, được giải phóng

từ khoảng trống giữa hai màng ti thể vào tế bào chất Tại đây, cytochrom-c gắn với các protein tiền apoptosis khác như Apaf1 tạo nên phức hợp được gọi là apoptosom Phức hợp này thu nhận và chuyển procaspase 9 thành caspase 9

Kết quả của việc hình thành enzym caspase 8 theo con đường ngoại sinh hay caspase 9 theo con đường nội sinh đều dẫn đến sự phân cắt procaspase 3 ở dạng không

có hoạt tính thành caspase 3 có hoạt tính nhờ vào tác dụng như một protease của hai enzym này Tương tự, với vai trò của một protease, caspase 3 khởi động một loạt các phản ứng sinh hóa trong chu trình chết tự nhiên khi tác động lên đến hơn 300 cơ chất khác nhau Sự phân cắt ADN thành các đoạn nhỏ xảy ra do sự hoạt hóa endonuclease Song song với đó, các protein trong nhân tế bào cũng bị phân cắt, gây ra sự co ngót

Trang 16

nhân tế bào Một cơ chất khác của caspase 3 là gelsolin bị ly giải, dẫn đến ức chế quá trình polymer hóa tạo các vi sợi actin, làm gián đoạn các quá trình vận chuyển trong nội bào và sự phân chia tế bào, dẫn đến sự phá vỡ bộ khung tế bào Kết quả của quá trình trên là sự hình thành các tiểu thể apoptotic và sau đó bị đại thực bào tiêu hủy Quá trình hoạt hóa chu trình apoptosis dưới tác dụng của enzym caspase được mô tả tóm tắt trong hình 1.2

Hình 1.2 Quá trình hoạt hóa chu trình chết tự nhiên thông qua enzym caspase

Trang 17

1.3 Các chất hoạt hóa enzym caspase 3

Như đã trình bày, caspase 3 là enzym tối quan trọng trong chu trình chết tự nhiên Các sai sót trong hoạt động của enzym này dẫn đến các sai sót trong chu trình chết tự nhiên mà hậu quả có thể dẫn đến sự phát triển của các khối u ác tính Thông thường, caspase 3 tồn tại trong tế bào dưới dạng procaspase 3 không có hoạt tính Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự tăng nồng độ bất thường của proenzym này trong nhiều loại tế bào ung thư khác nhau [9, 19, 21, 23, 25], gợi ý mối liên hệ giữa bệnh sinh của ung thư với các thiếu sót trong quá trình chuyển procaspase 3 thành caspase 3

1.3.1 Vai trò của ion kẽm trong sự hoạt hóa và hoạt động caspase 3

Kẽm là một nguyên tố vi lượng quan trọng trong các tế bào sống Có đến 10 % lượng protein trong cơ thể người có các vùng gắn kẽm trong cấu trúc của chúng [3] Kẽm cũng giữ một vai trò quan trọng trong hoạt động của caspase 3 Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra bằng chứng về tác dụng ức chế enzym này của ion kẽm [1, 14] Theo Eron và cộng sự [7], trong cấu trúc của caspase 3 có ba vùng liên kết gắn ion kẽm Một trong số chúng giữ vai trò ức chế sự hình thành caspase 3 từ proenzym của

nó, gây nên sự tăng nồng độ của proenzym này trong tế bào Bên cạnh bất hoạt quá trình trên, ion kẽm cũng gây ức chế hoạt động của caspase 3 do gây giảm đáng kể các tương tác protein-protein trong quá trình nhận diện cơ chất Trong khi đó, Truong Tran và cộng sự [35] đặt ra giả thiết về tác dụng ức chế caspase 3 của ion kẽm thông qua các tương tác của nó với nhóm thiol của Cys163 tại trung tâm hoạt động của enzym này

Do vậy, sử dụng các chất có khả năng “khóa” ion kẽm, ngăn sự tương tác của

nó với caspase 3 sẽ giúp làm tăng hoạt tính enzym của trong tế bào

1.3.2 Một số chất hoạt hóa caspase 3

Một trong các cơ chế loại bỏ tác động của ion kẽm lên caspase 3 là sử dụng các phân tử có khả năng tạo phức chelat bền vững với nó Để có được khả năng này, các hợp chất mang hợp phần acylhydrazon (-CONHN=) đã được đề xuất thiết kế và tổng hợp Cấu trúc chung của các hợp chất acylhydrazon và phức chất của chúng với ion kẽm được thể hiện trong hình 1.3

Trang 18

Hình 1.3 Cấu trúc chung của các acylhydrazon (a) và cấu trúc của phức chất của

acylhydrazon với ion kẽm (b)

Một trong số các chất đầu tiên hoạt hóa caspase 3 theo cơ chế này được tổng hợp là PAC-1 (hình 1.4) Được công bố trong công trình nghiên cứu của K S Putt

và cộng sự đăng trên tạp chí Nature vào năm 2006, PAC-1 thể hiện tác dụng hoạt hóa enzym caspase 3 tốt, với giá trị EC50 = 0,22 µM Nó cũng đồng thời thể hiện tác dụng gây độc tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như bạch cầu, tế bào ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư gan… [25, 38, 40]

Hình 1.4 Cấu trúc của PAC-1

Từ PAC-1, rất nhiều dẫn chất acylhydrazon khác nhau đã được tổng hợp và thử tác dụng sinh học WF-208 và WF-210 (hình 1.5) – hai dẫn chất của PAC-1 mang khung oxadiazol được công bố bởi Wu và cộng sự [37, 38] cho giá trị độc tính tế bào

IC50 chỉ từ vài trăm nM đến vài µM và chúng đều cho độc tính mạnh hơn PAC-1 trên các dòng tế bào thử nghiệm

Hình 1.5 Cấu trúc của dẫn chất WF-208 và WF-210

Trang 19

Năm 2018, Kassab và cộng sự [17] đã thêm khung benzotriazol vào cấu trúc của các acylhydrazon Trong 17 dẫn chất được công bố, có 5 dẫn chất thể hiện tác

dụng gây độc tế bào ung thư tốt ở nồng độ thấp, trong đó dẫn chất 3q (hình 1.6) thể

hiện tác dụng gây độc trên 34 dòng tế bào ung thư khác nhau với giá trị ức chế sinh trưởng tế bào trung bình là 45,80 % ở nồng độ 10 µM Giá trị ức chế sinh trưởng tế

bào cao nhất của dẫn chất 3q được thể hiện trên dòng tế bào ung thư đại tràng HT-29

Nhiều công trình nghiên cứu được công bố trên thế giới đã chỉ ra rằng nhiều

hợp chất mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on mang nhiều tác dụng sinh

học phong phú, đa dạng Có thể kể đến một số tác dụng sau:

- Tác dụng kháng khuẩn: năm 2010, Fang và cộng sự [8] đã công bố một số dẫn

chất mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on với tác dụng ức chế một số chủng vi khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

nằm trong khoảng 16-64 µg/ml

- Tác dụng chống viêm: là một tác dụng đáng chú ý của một số hợp chất mang khung này Trong công trình nghiên cứu của mình, Lanni và cộng sự [20] đã giới thiệu một dãy các phenethyl benzo[1,4]oxazin-3-on với tác dụng chống viêm thông

cơ chế ức chế enzym PI3 kinase γ Đây là loại enzym có mặt chủ yếu trong bạch cầu, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của viêm khớp dạng thấp cũng như bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD)

Trang 20

- Tác dụng chống kết tập tiểu cầu: công trình nghiên cứu của Tian và cộng sự

[33] vào năm 2011 đã công bố một dãy các chất mang khung benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on thể hiện tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu thông qua

2H-việc ức chế ADP, một tác nhân thúc đẩy quá trình này

1.4.2 Tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất mang khung benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on

2H-Ngoài các tác dụng sinh học kể trên, tác dụng kháng ung thư của các hợp chất

mang khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on cũng rất đáng chú ý Trong các công

trình nghiên cứu công bố gần đây, cấu trúc của nhiều hợp chất kháng ung thư mới

được tìm ra chứa khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on, trong đó nhiều hợp chất

cho tác dụng gây độc tế bào cao

SB-590885 (hình 1.7) là một chất ức chế chọn lọc enzym B-Raf kinase [32],

một enzym đóng vai trò trong cơ chế bệnh sinh của nhiều loại ung thư, trong đó có ung thư tế bào hắc tố ác tính và ung thư tuyến giáp [34] Dựa trên khung cấu trúc 1,3-

imidazol với 3 nhóm thế aryl của SB-590885, Rajitha và cộng sự [26] đã thiết kế và

tổng hợp một số dẫn chất với khung 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on đóng vai trò

là một trong ba nhóm thế Khi tiến hành thử tác dụng ức chế sinh trưởng tế bào ung

thư, dẫn chất 9c (hình 1.7) cho hoạt tính sinh học mạnh với giá trị mức độ sống sót

của tế bào ung thư bạch cầu chỉ là 0,6 % ở nồng độ chất ức chế 20 µM

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của chất SB-590885 và dẫn chất 9c

Nhóm nghiên cứu của Zhou [41] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của benzoxazinon và thử hoạt tính sinh học của chúng trên dòng tế bào ung thư phổi A549 Khi theo dõi ảnh hưởng của các chất lên chu trình sinh trưởng tế bào, nhóm

Trang 21

nhận thấy rằng chất 3c làm tăng thời gian pha G1 lên 24,76 %, đồng thời tăng nhẹ

thời gian pha G2 so với nhóm đối chiếu Kéo dài thời gian pha G1, G2 được xem là một trong các cơ chế giúp kéo dài thời gian phân chia tế bào, giảm sự phát triển của

tế bào ung thư [39]

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của dẫn chất 3c

Hướng tới đích tác dụng là họ enzym tyrosin kinase và dựa trên cấu trúc của semaxinib và sunitinib (là các chất thể hiện hoạt tính ức chế vượt trội nhiều loại tyrosin kinase khác nhau [29, 30]) (hình 1.9), nhóm nghiên cứu của Honda và cộng

sự [15] đã tổng hợp một dãy các dẫn chất mang khung 1,4-benzoxazin-3-on Trong

số các dẫn chất được công bố, dẫn chất 4r (hình 1.9) cho kết quả rất triển vọng với tỷ

lệ ức chế tyrosin kinase là 92,6 % ở nồng độ chất 4 µg/ml và giá trị IC50 chỉ là 0,29

µM

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của semaxanib, sunitinib và dẫn chất 4r

Kết quả từ các nghiên cứu về enzym caspase, các chất hoạt hóa enzym caspase cũng như về tác dụng kháng tế bào ung thư của các hợp chất mang khung 3-oxo-2,3-

dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl đã tạo nền tảng lý thuyết và thực nghiệm cho

khóa luận tiếp cận hướng nghiên cứu tổng hợp và đánh giá tác dụng gây độc tế bào

Trang 22

ung thư của một số hợp chất acetohydrazid mang khung

2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on Khóa luận hy vọng tìm ra các dẫn chất acetohydrazid mới có tác dụng hoạt

hóa enzym caspase-3 với hoạt tính kháng tế bào ung thư cao vượt trội

Trang 23

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Hóa chất

Dung môi, hoá chất dùng phân tích, kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn HPLC

Các dung môi, hóa chất dùng cho tổng hợp hóa học được nhập từ công ty Sigma Aldrich hoặc Merck Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào Bao gồm:

Các dung môi, hóa chất khác như: nước cất, N,N-dimethylformamid (DMF),

aceton, isobutylmethyl ceton, dicloromethan (DCM), ethanol (EtOH), methanol (MeOH), acid acetic (AcOH), K2CO3, KI, Na2SO4, NaOH, NaHCO3, HCl…

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ các loại, sinh hàn hồi lưu

- Bình chạy sắc ký Camag

- Bản mỏng silica gel 60F254 để chạy sắc ký lớp mỏng

- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 366 nm

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu

- Máy cất quay chân không Buchi R-200

- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert

Trang 24

- Máy siêu âm

- Máy Melting pointapparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy

- Máy FTIR Affinity-1S để xác định phổ IR, đặt tại khoa Hóa học – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM để ghi phổ MS, đặt tại khoa Hóa học – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR, 13C-NMR, đặt tại khoa Hóa học – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

(E)-Nʹ-(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-4H Kiểm tra độ tinh khiết: bằng sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy

- Xác định cấu trúc các chất vừa tổng hợp được: bằng phổ IR, MS, 1H-NMR,

13C-NMR

Trang 25

2.2.2 Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

Thử tác dụng gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư, gồm: tế bào ung thư đại tràng (SW620), tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC3), tế bào ung thư phổi (NCI-H23)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học

- Dựa trên các nguyên tắc, phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tiến hành tổng hợp các chất theo thiết kế Các phản ứng cụ thể:

+ N-alkyl hóa với tác nhân ethyl cloroacetat

+ Phản ứng thế ái nhân acyl với tác nhân hydrazin monohydrat

+ Phản ứng ngưng tụ loại nước

+ Một số phản ứng cơ bản khác

- Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau quá trình tinh chế bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy

Trang 26

- Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại khoa Hóa học – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun mù bụi điện tử ESI, dung môi MeOH

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại khoa Hóa học – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz

Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung

môi DMSO-d 6

2.3.4 Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro của các chất

tổng hợp được được thực hiện tại Khoa Dược, trường Đại học Chungbuk, Chonju, Hàn Quốc theo phương pháp SRB [16] và giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probit [10]

Dòng tế bào thử nghiệm: tế bào ung thư đại tràng (SW620), tế bào ung thư

tuyến tiền liệt (PC3), tế bào ung thư phổi (NCI-H23) được lấy từ ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB)

và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)

bổ sung: L-glutamin, penicillin, streptomycin, amphotericin B, heparin, chất kích thích tăng trưởng tế bào và huyết thanh bào thai bò (FBS)

Nguyên tắc thử: Xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ

quang học (Optical Density - OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamin B (SRB) Giá trị OD đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn

Tính kết quả: Giá trị IC50là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi

50 % so với nhóm chứng (mẫu trắng là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy) Giá trị này được tính theo phương pháp Probits và kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của

3 lần đo độc lập với độ lệch chuẩn không quá 10 %

Trang 27

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Hóa học

3.1.1 Tổng hợp hóa học

Quá trình tổng hợp 7 chất được thực hiện theo sơ đồ tổng hợp gồm 4 bước như sau:

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng hợp chung

Tác nhân và điều kiện:

1 Cloroacetyl clorid, isobutylmethyl ceton:nước (1:1), NaHCO3, 0 ºC – đun hồi lưu,

4 giờ

2 Ethyl cloroacetat, K2CO3, KI, aceton, đun hồi lưu, 3,5 giờ

3 Hydrazin monohydrat, ethanol, 0 ºC, 30 phút

4 Các benzaldehyd, acid acetic đặc, ethanol, đun hồi lưu

3.1.1.1 Tổng hợp nguyên liệu 2H-benzo[b][1,4]oxazin-3(4H)-on (II)

Hợp chất II được tổng hợp từ 2-aminophenol theo sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ tổng hợp chất II

Isobutylmethyl ceton:H 2 O (1:1) NaHCO 3 , 0 ºC – đun hồi lưu, 4 giờ

Trang 28

➢ Tiến hành phản ứng:

- Hòa tan 764 mg (7 mmol) 2-aminophenol (I) vào 5 ml isobutylmethyl ceton

trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml, thêm 5 ml nước

- Thêm 1,47 g (17,5 mmol) NaHCO3 vào bình phản ứng

- Làm lạnh hỗn hợp phản ứng xuống 0 ºC bằng nước đá

- Thêm 641 µl (8,05 mmol) cloroacetyl clorid từng giọt vào hỗn hợp phản ứng

- Đun hồi lưu hỗn hợp trong vòng 4 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC, pha động DCM:MeOH = 14:1

- Hòa tan 970 mg (6,5 mmol) 1,4-benzoxazin-3(4H)-on (II) vào 10 ml aceton

trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml

- Thêm 1,4 g (9,75 mmol) K2CO3 vào bình phản ứng, đun hồi lưu 30 phút

- Thêm 1,08 g (6,5 mmol) KI vào bình phản ứng

- Thêm 2,2 ml (19,5 mmol) ethyl cloroacetat từng giọt vào hỗn hợp phản ứng

aceton, đun hồi lưu

K 2 CO 3 , KI

Trang 29

- Đun hồi lưu hỗn hợp trong vòng 3 giờ

➢ Xử lý phản ứng:

- Cô quay ở áp suất giảm, nhiệt độ 50 ºC để loại aceton

- Phân tán phần cặn rắn trong nước

- Chiết dịch nước 3 lần với DCM Gộp dịch chiết pha hữu cơ

- Làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 khan

- Cô quay loại dung môi hữu cơ ở áp suất giảm, nhiệt độ 40 ºC

- Hòa tan 235 mg (1,0 mmol)

2-(3-oxo-2,3-dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetat (III) vào 10 ml ethanol trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml

- Thêm 150 µl (3,0 mmol) hydrazin monohydrat vào bình phản ứng, duy trì nhiệt độ phản ứng ở 0 ºC

- Lọc lấy tủa xuất hiện trong bình phản ứng

- Rửa tủa bằng ethanol lạnh

ethanol, 0 °C

Trang 30

- Sấy tủa trong điều kiện chân không, nhiệt độ 50 ºC

(E)-Nʹ-(2-hydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-Sơ đồ 3.5 (E)-Nʹ-(2-hydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-Sơ đồ tổng hợp chất Va

- Phân tán 155 mg (0,7 mmol)

2-(3-oxo-2,3-dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid (IV) vào 10 ml ethanol trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml

- Thêm 147 µl (1,4 mmol) 2-hydroxybenzaldehyd vào bình phản ứng

- Thêm 1 giọt acid acetic đặc, đun hồi lưu

- Tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, pha động DCM:MeOH = 9:1

Trang 31

- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 3.3, 3.4, 3.5, 3.6

3.1.1.5 Tổng hợp dẫn chất 4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid (Vb)

(E)-Nʹ-(4-hydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-Sơ đồ 3.6 (E)-Nʹ-(4-hydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-dihydro-Sơ đồ tổng hợp chất Vb

- Thêm 171 mg (1,4 mmol) 4-hydroxybenzaldehyd vào bình phản ứng

➢ Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn, màu trắng

- Hiệu suất: 93 % (211 mg)

- Nhiệt độ nóng chảy và Rf được trình bày trong bảng 3.2

ethanol

1 giọt acid acetic đặc đun hồi lưu

Trang 32

3.1.1.6 Tổng hợp dẫn chất dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid (Vc)

(E)-Nʹ-(2,3-dihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-Sơ đồ 3.7 (E)-Nʹ-(2,3-dihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-Sơ đồ tổng hợp chất Vc

- Thêm 193 mg (1,4 mmol) 2,3-dihydroxybenzaldehyd vào bình phản ứng

- Hiệu suất: 60 % (143 mg)

ethanol

Trang 33

3.1.1.7 Tổng hợp dẫn chất dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid (Vd)

(E)-Nʹ-(2,4-dihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-Sơ đồ 3.8 (E)-Nʹ-(2,4-dihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-Sơ đồ tổng hợp chất Vd

- Hiệu suất: 67 % (160 mg)

ethanol

Trang 34

3.1.1.8 Tổng hợp dẫn chất dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid (Ve)

(E)-Nʹ-(2,5-dihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-Sơ đồ 3.9 (E)-Nʹ-(2,5-dihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-Sơ đồ tổng hợp chất Ve

- Hiệu suất: 90 % (215 mg)

ethanol

Trang 35

3.1.1.9 Tổng hợp dẫn chất dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid (Vf)

(E)-Nʹ-(2,3,4-trihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-Sơ đồ 3.10 (E)-Nʹ-(2,3,4-trihydroxybenzyliden)-2-(3-oxo-2,3-Sơ đồ tổng hợp chất Vf

- Thêm 216 mg (1,4 mmol) 2,3,4-trihydroxybenzaldehyd vào bình phản ứng

- Hiệu suất: 92 % (228 mg)

ethanol

Trang 36

3.1.1.10 Tổng hợp dẫn chất 2,3-dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazin-4-yl)acetohydrazid (Vg)

(E)-Nʹ-(2-hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(3-oxo-Sơ đồ 3.11 (E)-Nʹ-(2-hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(3-oxo-Sơ đồ tổng hợp chất Vg

- Thêm 213 mg (1,4 mmol) 2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd vào bình phản ứng

- Hiệu suất: 83 % (206 mg)

Các chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp toàn quá trình của các chất Va-g được

trình bày trong bảng 3.1

ethanol

Trang 37

Bảng 3.1 Các chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các chất Va-g

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các sản phẩm sau khi được tổng hợp, xử lý và tinh chế bao gồm các dẫn chất

Va-g và các sản phẩm trung gian II, III, IV đều được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc

ký lớp mỏng (TLC) và đo nhiệt độ nóng chảy Các kết quả về Rf và tºnc của các dẫn

chất Va-g được trình bày cụ thể ở bảng 3.2

❖ Sắc ký lớp mỏng:

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck

70-230 mesh, với 3 hệ dung môi khác nhau là DCM:MeOH = 9:1, DCM:MeOH = 14:1, DCM:MeOH = 19:1, tiến hành quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm Kết quả TLC cho thấy các sản phẩm đều có vết gọn, rõ, không có vết phụ

❖ Đo nhiệt độ nóng chảy:

Các dẫn chất Va-g sau khi được tinh chế lại đều ở thể rắn, có thể tiến hành xác

định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Kết quả được

trình bày trong bảng 3.2, nhận thấy các dẫn chất Va-g đều có nhiệt độ nóng chảy xác

định (khoảng dao động nhiệt độ hẹp, từ 1-2 ºC)

Trang 38

Bảng 3.2 Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy của các chất Va-g

Dựa trên kết quả khảo sát về giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy có thể sơ bộ kết

luận các chất Va-g là tinh khiết và có thể sử dụng để thực hiện các bước xác định cấu

trúc bằng các loại phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR

3.1.3 Xác định cấu trúc

Cấu trúc của các chất được xác định bằng 4 loại phổ là phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị carbon-13 (13C-NMR) Kết quả ghi phổ chi tiết của các chất được trình bày trong phần phân tích phổ và phụ lục

3.1.3.1 Phổ hồng ngoại

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các chất Va-g được trình bày trong bảng

3.3

Trang 39

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR của các chất Va-g

Nhận xét: Dựa trên bảng 3.3 và phổ đồ (phụ lục 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) có thể sơ bộ

nhận diện sự có mặt của các nhóm chức thông qua vị trí, cường độ, hình dạng pic, ví

dụ như các liên kết N-H, C=O của -CONH-, C=O của nhóm carbonyl, O-H phenol

Trang 40

3.1.3.2 Phổ khối lượng

Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất Va-g

Nhận xét: Dựa vào bảng tổng hợp 3.4 và phân tích phổ đồ của các chất (phụ lục

8, 9, 10, 11, 12, 13, 14) cho thấy trên tất cả các phổ đồ đều có pic giả phân tử [M+H]+phù hợp với giá trị KLPT dự kiến với cường độ mạnh, các pic phân mảnh ít, cường

độ nhỏ Như vậy, có thể khẳng định phổ đồ thu được là phù hợp với công thức phân

tử dự kiến của các chất Va-g

3.1.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR của các chất được trình bày trong bảng 3.5

Định dạng
Số trang	89
Dung lượng	4,22 MB