BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

BÁO CÁO HẾT MÔN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU DỰA VÀO ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY CÀ NA Elaeocarpus hygrophilus Kurz, Elaeo

BÁO CÁO HẾT MÔN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

DỰA VÀO ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY CÀ NA

( Elaeocarpus hygrophilus Kurz, Elaeocarpaceae)

Người hướng dẫn: PGS Ts Huỳnh Ngọc Thụy Học viên: Trì Kim Ngọc

Lớp cao học khóa 2016 - 2018 Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền

1 Đặt vấn đề

2 Mục tiêu nghiên cứu

3 Tổng quan tài liệu

4 Phương pháp nghiên cứu

5 Kết quả dự kiến

NỘI DUNG

o Lĩnh vực sức khỏe hiện nay nói đến nhiều tác hại của chất oxy hoá

o Gốc tự do luôn được sinh ra trong cơ thể con người

o Tăng quá nhiều gốc tự do gây viêm nhiễm ở các cơ quan, các bệnh lý như tim mạch, bệnh thần kinh…

o Đặt ra vấn đề dùng các chất chống oxy hóa ngoại sinh với mục đích phòng bệnh, nâng cao sức khỏe, chống lão hóa

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz, Elaeocarpaceae) mọc hoang ở các tỉnh miền Tây, lá Cà na là nguồn nguyên liệu tiềm năng, nhưng chưa được khai thác, sử dụng đúng mức

Đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác

dụng chống oxy hóa của lá Cà na ( Elaeocarpus hygrophilus Kurz, Elaeocarpaceae)” được thực hiện

nhằm: làm sáng tỏ thành phần và hoạt tính chống oxy hóa

từ lá Cà na, phục vụ cho các thử nghiệm sinh học sau này

ĐẶT VẤN ĐỀ (tt)

• Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm dập tắt gốc tự do DPPH của các cao chiết từ lá cây Cà na

• Phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất chính từ cao có tác dụng chống oxy hóa mạnh qua sàng lọc trên mô hình DPPH

• Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của chất tinh khiết thu được sau khi phân lập

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

• Thực vật học

• Thành phần hóa học

• Các phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa

TỔNG QUAN

Tên gọi:

•Tên Việt Nam: Cà na, Côm háo ẩm

•Tên khoa học: Elaeocarpus hygrophilus Kurz

•Tên khác: Elaeocarpus glandulosus Wall Ex Merr

Elaeocarpus madopetalus Pierre [40]

Phân bố:

- Thế giới: Thái Lan, Myanma, Campuchia [39]

- Trong nước: Đồng Nai, Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp [39]

Bộ phận dùng: Lá khô

Thu hoạch: Quanh năm

TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT

Đặc điểm:

• Cây gỗ lớn (đến 25 m), gỗ màu trắng, nhánh non ít lông

• Phiến lá bầu dục, thon ngược, dài 7-9 cm, rộng 2,5-3 cm, chóp lá tròn hay tà, bìa có răng cưa thưa, cuống dài 1-2 cm, trước khi rụng có màu đỏ

TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT

Hình 1.1 Toàn cây và lá Cà na

• Cụm hoa chùm, búp hoa hình chóp, 5 lá đài có lông màu bạc, hoa năm cánh, cánh hoa có 18-20 rìa, 25-27 nhị, bầu nhụy có lông, bầu 3 ô

• Quả nhân cứng hình bầu dục nhọn, dài 3 cm, 1 hạt [39]

TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT

Công dụng

• Rễ, quả, lá người dân dùng làm thuốc có tác

dụng thanh nhiệt, giải độc, sinh tân dịch

• Vỏ cây có tinh dầu và tanin dùng tắm ghẻ,

chống dị ứng sơn và hoá chất bảo vệ da, lọc máu cho phụ nữ mới sanh

• Uống nước sắc của lá và rễ có tác dụng lọc

máu, bảo vệ gan Quả dùng làm mứt, muối dưa, ô mai [39]

Thành phần hóa học của cây Cà na: Flavonoid, tanin, acid hữu cơ, đường khử tự do…

Caffeic acid

(Quả) Siringic acid (Quả) p-Coumaric acid (Quả) Ferulic acid (Quả)

Sinapicnic acid (Quả) Myricetin (Quả) Vitamin C (Quả)

Rutin (Quả) Quercetin (Quả) Apigenin (Quả)

CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

• Phương pháp thử nghiệm độ ổn định của dầu béo

• Phương pháp xác định giá trị Peroxid

• Phương pháp theo dõi liên hợp dien

• Phương pháp peroxy hóa lipid – định lượng malonyl dialdehyd (MDA)

• Phương pháp đo quang phổ cộng hưởng điện tử spin (Electron spin Resonance_ESR)

• Phương pháp ức chế tạo thành gốc cation ABTS·+ ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)

(2,2'-azinobis-(3-• Thử nghiệm dập tắt gốc tự do DPPH_ 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

• Thử nghiệm đánh giá khả năng khử ion sắt III (Ferric reducing antioxidant power_FRAP)

• Thử nghiệm phycoerythyrin

CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

Trong đó, thử nghiệm DPPH là thử nghiệm đơn giản, dễ thực hiện Thử nghiệm này dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm ban đầu

• Nguyên liệu – hóa chất – trang thiết bị

• Phương pháp nghiên cứu

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

Lá cây Cà na ( Elaeocarpus hygrophilus Kurz, Elaeocarpaceae) được thu hái tại huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang vào tháng 11 năm 2016

Dung môi hóa chất

Dung môi chiết:

ethanol 96 %, n-hexan, chlorofom, ethylacetat

Trang thiết bị nghiên cứu

 Bếp cách thủy (Memmert, Model ULM 500)

 Cân phân tích BP 221S (Sartorious)

 Máy đo phổ UV-Vis (Shimadzu UV-1700)

 Máy HPLC Hitachi L – 2000 với đầu dò PDA L – 2455

 Các thiết bị thông dụng khác trong phòng thí nghiệm

NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT – THIẾT BỊ

• Nghiên cứu thực vật học, thử tinh khiết

• Xác định hàm lượng chất chiết được

• Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

• Chiết cao toàn phần và cao phân đoạn

• Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao toàn phần và các cao phân đoạn bằng thử nghiệm DPPH

• Phân lập các chất trong phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa mạnh

• Khảo sát tác dụng chống oxy hóa trên các chất tinh khiết được phân lập

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Vi phẫu Soi bột

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Xác định hàm lƣợng chất chiết đƣợc

Sử dụng dung môi cồn với các nồng độ khác nhau, thực hiện theo phụ lục 12.10, DĐVN – IV

Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

Thực hiện theo phương pháp Ciulei cải tiến

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

SƠ ĐỒ QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT

Cao EtOAc Cao nước

Khảo sát tác dụng chống oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH

Khảo sát tác dụng chống oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH

Tiến hành

• Pha dung dịch DPPH: 0,2-1 mM/MeOH

• Các cao chiết và các chất phân lập được pha trong MeOH, nếu cao ít tan thì pha trong DMSO (dimethylsulfoxid) để trợ tan Nồng độ 1 mg/ml

• Pha dd đối chiếu acid ascorbic nồng độ: 6, 8, 10, 12, 14,

16, 18, 20 µg/ml trong MeOH để xác định IC50 và so sánh kết quả với mẫu thử

• Phản ứng được thực hiện ở chỗ tối, sau 30 phút đến khi ổn định thì đo quang ở bước sóng 517nm

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

• Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO):

HTCO(%) = [(Abschứng - Absthử)/ (Abschứng - Abstrắng)]x100 Abs: độ hấp thu ở bước sóng 517 nm

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

28

Phân lập và xác định cấu trúc

Phân lập các chất chính trên cao có HTCO mạnh

Dùng các kỹ thuật sắc ký: sắc ký cột nhanh, cột cổ điển,… để tách các chất

Tinh khiết hóa

Dùng các phương pháp loại tạp thích hợp: than hoạt, lọc rửa, sắc ký cột, kết tinh lại …để làm sạch

Xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc

Dựa vào điểm chảy, phổ UV, IR, MS và các phổ NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY)

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Dự kiến khi hoàn tất sẽ thu đƣợc các kết quả sau

• Cao chiết toàn phần và cao các phân đoạn phân cực tăng dần của lá Cà na

• Cao phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất

• Chất tinh khiết phân lập được từ cao phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất

• Hoạt tính chống oxy hóa của chất tinh khiết

• Dữ liệu phổ xác định cấu trúc chất tinh khiết

KẾT QUẢ DỰ KIẾN

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1 Trần Văn Bảo (2001), "Nghiên cứu hoạt độ một số enzym chống oxy hóa hồng cầu và trạng thái chống oxy hóa toàn phần huyết tương ở người bị thâm nhiễm chì" Luận văn thạc sỹ y học, Trường đại học y Hà Nội

2 Bộ y tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV Hà Nội: Nhà xuất bản

Y học

3 Trương Ngọc Dương (2009), "Nghiên cứu nồng độ c-peptid, insulin, tự kháng thể kháng insulin, một số chỉ số oxy hóa/chống oxy hóa ở bệnh nhân đái tháo đường typ 1" Luận án tiến sĩ y học, Học viện Quân y, Hà Nội

4 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam quyển 1 NXB trẻ

5 Hoàng Tích Huyền (1992), Gốc tự do trong dược lý học và độc chất học, Một số chuyên đề hóa sinh tập 1 Nhà xuất bản Y học

TÀI LIỆU THAM KHẢO

6 Nguyễn Liễu, Nguyễn Bá Vượng (2011), Gốc tự do và hệ thống chống oxy hóa NXB Học viện Quân Y

7 Viện dược liệu (2006), "Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo" Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật: p 279 – 292

8 Lê Thị Thu (2008), "Nghiên cứu một số chỉ số đánh giá tình trạng stress oxy hóa và tác dụng chống oxy hóa của Belaf ở bệnh nhân đái tháo đường týp 2" Luận án tiến sĩ y học, Học viện Quân

y, Hà Nội

9 Nguyễn Bá Vượng (2011), "Nghiên cứu sự thay đổi hoạt độ một số enzym chống oxy hóa ở công nhân tiếp xúc nghề nghiệp với trinitrotoluen và động vật thực nghiệm-Tác dụng của Belaf" Luận án tiến sĩ y học, Học viện Quân y, Hà Nội

14 Rice.-Evans CA and Diplock AT (1993), "Current status of antioxidant therapy" Free Radic Biol Med Vol 15: p 77-96

15 Chase, M.W (2009), "An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III"

16 Cord, Joe M (1993), "Human disease, free radicals, and the oxidant_antioxidant balance" The Canadian Society of Clinical Chemist

17 Birben E Sahiner U.M and et al (2012), "Oxidative stress and antioxidant defense" WAO Journal Vol 5: p 9-19

18 Cadenas E and Boveris A (2005), "Mitochondrial free radical production, antioxidant defenses and cell signaling" The Handbook of Environmental

19 Sugawara E., Nakamura K and et al (1991), "Lipid peroxidation and concentration of glutathione in erythrocytes from workers exposed to lead"

20 Wang H., Cao G and et al (1996), "Total antioxidant capacity of fruits"

21 Barry H and John M.C G (2001), "Antioxydant defences" Free Radicals in

22 Shi HL, Noguchi N and et al (1999), "Comparative study on dynamics of antioxidative action of α- tocopheryl hydroquinone, ubiquinol and α- tocopherol, against lipid peroxidation" Free Radical Biology & Medicine Vol 27(3-4): p 334-346

23 Sastre J., Pallardo F V and et al (2005), "Glutathion" The Handbook of

24 Brown JE and Rice.-Evan CA (1998), "Luteolin-rich Artichoke extract protects low density lipoprotein from oxidation in vitro" Free Radic Res Vol 29(3): p 247-255

25 Lin JK., Lin CH and et al (1998), "Survey of catechins, gallic acid and methylxantines in green, oolong, puerh and black teas" Agricultural ang

26 Bokara K.K, Blaylock I and et al (2009), "Influence of lead acetate on glutathione and its related enzyms in different regions of rat brain" Journal

27 Jomova K., Valko M (2011), "Advances in metal- induced oxidative stress and human disease" Toxicology Vol 283(2-3): p 65-87

28 K., S., Powers and et al (2008), "Exercise-induced oxidative stress: cellular mechanisms and impact on muscle force production" Physiological

29 Kubola, J., S Siriamornpun, et al (2011), "Phytochemicals, vitamin C and sugar content of Thai wild fruits" Food Chemistry Vol 126(3): p 976-

977

30 Kuposak, S and M Manomaiwajee (2016), "Oxidative stability of salad dressing with spanish plum leaf extract" journal of food mesurement and

189

34 Krinsky NI (1992), "Mechanism of action of biological antioxidants"

35 Acharya U.R., Rathore R M and et al (2003), "Role of vitamin C on lead acetate induced spermatogensis in swiss mice" Environmental

36 Griffiths HR (2004), "Chemical modifications of biomolecules by oxidants" The Handbook of Environmental Chemistry 20: p 33-62

37 Furuta S., Nishiba Y and et al (1997), "Fluorometric assay for screening antioxidative activities of vegetables" Journal of Food Science Vol 62(3): p 526-528

38 Kasperczyk S., Birkner E and et al (2004), "Activity of superoxide dismutase and catalase in people protractedly exposed to lead compounds" Ann Agric Environ Med Vol 11(2): p 291-296