Xây dựng và thẩm định mô hình in silico mô phỏng quá trình hòa tan của một số dược chất ít tan

Xây dựng được mô hình dự đoán độ hòa tan in vitro của bột dược chất đơn và hỗn hợp bột hai thành phần chứa dược chất - tá dược của một số dược chất ít tan trong nước dựa trên mô hình ản

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRÍ VÂN ANH

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH

MÔ HÌNH IN SILICO MÔ PHỎNG

QUÁ TRÌNH HÒA TAN CỦA MỘT SỐ DƯỢC CHẤT ÍT TAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019

MÔ HÌNH IN SILICO MÔ PHỎNG

QUÁ TRÌNH HÒA TAN CỦA MỘT SỐ DƯỢC CHẤT ÍT TAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin được bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn

Trần Linh là người thầy đã luôn tận tâm hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em trong quá

trình học tập, nghiên cứu cũng như hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Bào chế đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Nhà trường, phòng Đào tạo và các phòng ban liên quan trong Nhà trường đã có nhiều giúp đỡ thiết thực về cơ sở vật chất, trang thiết

bị và hóa chất thí nghiệm trong quá trình em thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn ở bên, giúp đỡ và động viên em trong suốt 5 năm học tập và thực hiện khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh viên Trí Vân Anh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

Vai trò của độ hòa tan và mô hình hóa quá trình hòa tan dược chất từ các dạng bào chế 2

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hòa tan in vitro của dược chất 2

1.2.1 Đặc tính lý hóa của dược chất 3

1.2.1.1 Kích thước tiểu phân 3

1.2.1.2 Độ tan 3

1.2.1.3 Dạng đa hình 4

1.2.1.3 Hệ số khuếch tán 4

1.2.2 Các yếu tố môi trường 4

1.2.2.1 Nhiệt độ 4

1.2.2.2 Khuấy trộn trong quá trình hòa tan 5

1.2.2.3 pH môi trường 5

Một số mô hình giải phóng dược chất từ dạng bào chế : 5

Mô hình ảnh hưởng hỗn hợp phi tuyến tính (non-linear mixed effects model) 6

1.4.1 Giới thiệu về mô hình ảnh hưởng hỗn hợp phi tuyến tính (non-linear mixed effects model, NLMEM) 6

1.4.2 Một mô hình NLMEM mô phỏng quá trình hòa tan in vitro 7

Mạng neuron nhân tạo 10

1.5.1 Cấu tạo 10

1.5.2 Đặc trưng của mạng neuron nhân tạo 10

1.5.3 Một số nghiên cứu sử dụng mạng neuron nhân tạo mô phỏng quá trình hòa tan in vitro 13

Phương pháp đánh giá độ phù hợp của mô hình 14

Một số nghiên cứu trong nước về mô hình mô phỏng độ hòa tan 17

Một số thông tin về dược chất được sử dụng trong nghiên cứu 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

Nguyên liệu và thiết bị thí nghiệm 19

2.1.1 Nguyên liệu 19

2.1.2 Thiết bị 19

Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Chuẩn bị các mẫu thử hòa tan 20

2.2.1.1 Bột dược chất đơn 20

2.2.1.2 Tạo mẫu bột gồm dược chất và tá dược 20

2.2.2 Xác định các thông số hóa lý của dược chất thử hòa tan 20

2.2.2.1 Xác định độ tan của dược chất trong các môi trường pH khác nhau ở 37C 20

2.2.2.2 Xác định phân bố kích thước tiểu phân 21

2.2.2.3 Xác định hệ số khuếch tán 21

2.2.2.4 Xác định nhiệt độ nóng chảy của dược chất 22

2.2.3 Thu thập dữ liệu thử hòa tan thực tế 22

2.2.3.1 Thử hòa tan bột dược chất đơn Error! Bookmark not defined 2.2.3.2 Thử hòa tan mẫu bột chứa dược chất và tá dượcError! Bookmark not defined.

2.2.4 Xây dựng mô hình mô phỏng quá trình hòa tan in vitro của dược chất 23

2.2.4.1 Dựa trên mô hình ảnh hưởng hỗn hợp phi tuyến tính NLMEM 23

2.2.4.2 Dựa trên mạng neuron nhân tạo ANN 25

2.2.4.3 Lựa chọn và thẩm định mô hình tối ưu 26

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

Thẩm định độ tuyến tính của phương pháp định lượng dược chất 27

3.1.1 Mẫu chỉ chứa dược chất đơn 27

3.1.2 Mẫu chứa dược chất và tá dược 28

Xác định các thông số lý hóa của dược chất 29

3.2.1 Xác định độ tan của dược chất ở 37°C 29

3.2.2 Xác định phân bố kích thước tiểu phân 29

3.2.3 Xác định diện tích bề mặt riêng 33

3.2.4 Xác định hệ số khuếch tán của các dược chất 33

3.2.5 Xác định nhiệt độ nóng chảy của các dược chất 34

Kết quả thử hòa tan thực nghiệm 35

3.3.1 Mẫu chứa dược chất đơn 35

3.3.2 Mẫu bột chứa dược chất và tá dược 37

Kết quả xây dựng mô hình mô phỏng quá trình hòa tan in vitro 42

3.4.1 Kết quả xây dựng mô hình ảnh hưởng hỗn hợp phi tuyến tính 42

3.4.2 Kết quả xây dựng mô hình dựa trên mạng ANN 45

3.4.3 Lựa chọn mô hình tối ưu mô phỏng quá trình hòa tan in vitro 47

3.4.4 Thẩm định mô hình tối ưu 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung

tích phân bố d90 Tham số kích thước tiểu phân tại giá trị phân vị 90% thể

tích phân bố

FObs

GRNN

Phần trăm hoà tan thực tế Mạng neuron hồi quy tổng quát

IPRED Độ hòa tan dự đoán theo thông số đặc trưng cho từng

mẫu

NLMEM Mô hình ảnh hưởng hỗn hợp phi tuyến tính

PRED Độ hòa tan dự đoán theo thông số đặc trưng cho quần thể

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số mô hình động học giải phóng dược chất từ dạng bào chế .6

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu sử dụng ANN mô phỏng quá trình hòa tan in vitro 13

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu trong nước về mô hình mô phỏng độ hòa tan 17

Bảng 1.4 Đặc điểm của các dược chất sử dụng trong nghiên cứu 18

Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu 19

Bảng 2.2 Điều kiện thử hòa tan mẫu bột dược chất đơnError! Bookmark not defined Bảng 2.3 Điều kiện thử hòa tan mẫu dược chất và tá dược 23

Bảng 3.1 Đường chuẩn định lượng cefaclor λ = 265 nm (n = 3) 27

Bảng 3.2 Đường chuẩn định lượng cefaclor monohydrat λ = 265 nm (n=3) 27

Bảng 3.3 Đường chuẩn định lượng methylprednisolon λ = 247 nm (n=3) 28

Bảng 3.4 Độ tan của dược chất trong các môi trường ở 37°C (n = 3, TB ± SD) 29

Bảng 3.5 Tham số kích thước tiểu phân của các phân đoạn dược chất 32

Bảng 3.6 Diện tích bề mặt riêng của các phân đoạn dược chất (n=3, TB±SD) 33

Bảng 3.7 Hệ số khuếch tán của các dược chất 34

Bảng 3.8 Nhiệt độ nóng chảy của các dược chất 34

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của các yếu tố dự đoán đến mô hình cấu trúc 42

Bảng 3.10 Các tham số của mô hình NLMEM tối ưu 43

Bảng 3.11 Giá trị -2LL cho từng biến đầu ra 46

Bảng 3.12 Kết quả thẩm định mô hình NLMEM tối ưu 48

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc của ANN 10

Hình 1.2 Mô hình mạng perceptron đa lớp 11

Hình 1.3 Cấu tạo EDNN 11

Hình 1.4 Một số hàm chuyển trong mạng neuron nhân tạo [16] 12

Hình 3.1 Phân bố kích thước tiểu phân của các phân đoạn Cefaclor 30

Hình 3.2 Phân bố kích thước tiểu phân của các phân đoạn Cefaclor monohydrat 30

Hình 3.3 Phân bố kích thước tiểu phân của các phân đoạn Methylprednisolon A 31

Hình 3.4 Phân bố kích thước tiểu phân của các phân đoạn Methylprednisolon B 31

Hình 3.5 Phân bố kích thước tiểu phân của các phân đoạn Methylprednisolon C 31

Hình 3.6 Kết quả thử hòa tan các phân đoạn cefaclor 35

Hình 3.7 Kết quả thử hòa tan các phân đoạn cefaclor monohydrat 35

Hình 3.8 Kết quả thử hòa tan các phân đoạn methylprednisolon A 36

Hình 3.9 Kết quả thử hòa tan các phân đoạn methylprednisolon B 36

Hình 3.10 Kết quả thử hòa tan các phân đoạn methylprednisolon C 36

Hình 3.11 Kết quả thử hòa tan các mẫu bột chứa cefaclor và tá dược 37

Hình 3.12 Kết quả thử hòa tan các mẫu bột chứa cefaclor monohydrat và tá dược 38

Hình 3.13 Kết quả thử hòa tan các mẫu bột chứa methylprednisolon A và tá dược 39

Hình 3.14 Kết quả thử hòa tan các mẫu bột chứa methylprednisolon B và tá dược 40

Hình 3.15 Kết quả thử hòa tan các mẫu bột chứa methylprednisolon C và tá dược 41

Hình 3.16 Biểu đồ biểu diễn độ hòa tan thực tế (DV) theo độ hòa tan dự đoán (IPRED) Error! Bookmark not defined Hình 3.17 Biểu đồ biểu diễn tính khớp của đường cong hòa tan dự đoán (IPRED) và độ hòa tan thực tế (DV) Error! Bookmark not defined Hình 3.18 Biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa phần dư có trọng số (WRES) và độ hòa tan dự đoán (PRED) 45

Hình 3.19 Sơ đồ mô hình ANN xây dựng .46

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đối với dạng thuốc rắn dùng đường uống, thử nghiệm hòa tan là một trong các thử

nghiệm then chốt của quá trình nghiên cứu phát triển Độ hòa tan vừa là chỉ tiêu hàng đầu

để kiểm soát độ ổn định vừa là yếu tố quan trọng để dự đoán sinh khả dụng in vivo của thuốc Mô hình in silico dự đoán độ hòa tan là một công cụ hữu hiệu trong việc rút ngắn

thời gian và nâng cao chất lượng nghiên cứu phát triển, tối ưu hóa công thức

Gần đây, các nhà khoa học trong nước đang đẩy mạnh nghiên cứu mô phỏng độ hòa tan của một số dược chất dùng theo đường uống Ở Việt Nam, các nhà nghiên cứu dược

phẩm đang từng bước tiếp cận với phương pháp in silico trong việc mô phỏng quá trình hòa tan in vitro của một số thuốc Một số nghiên cứu đã được thực hiện nhằm mục đích xây

dựng mô hình mô phỏng quá trình hòa tan một số bột thuốc và hỗn hợp cốm chứa hai thành phần [1], [2], [3], [6] Tuy mới chỉ là những bước đi đầu tiên để tiếp cận với phương pháp

in silico, nhưng một số kết quả thu được đầy hứa hẹn và đang được tiếp tục nghiên cứu sâu

hơn Do đó, đề tài “Xây dựng và thẩm định mô hình in silico mô phỏng quá trình hòa

tan của một số dược chất ít tan” với mục tiêu sau:

1 Xây dựng được mô hình dự đoán độ hòa tan in vitro của bột dược chất đơn và hỗn hợp

bột hai thành phần chứa dược chất - tá dược của một số dược chất ít tan trong nước dựa trên mô hình ảnh hưởng hỗn hợp phi tuyến tính (NLMEM) và mô hình mạng neuron nhân tạo (ANN)

3 dược chất được lựa chọn để nghiên cứu gồm: cefaclor, cefaclor monohydrat, methylprednisolon Trong đó cefaclor, cefaclor monohydrat là các dược chất dễ tan; methylprednisolon là dược chất khó tan

2 Thẩm định được mô hình tối ưu đã xây dựng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Vai trò của độ hòa tan và mô hình hóa quá trình hòa tan dược chất từ các dạng bào chế

Độ hòa tan của một loại thuốc là điều kiện mang ý nghĩa quyết định đối với hiệu quả của thuốc trong cơ thể Điều này là do chỉ các phân tử/ion/nguyên tử thuốc hòa tan mới có thể khuếch tán, ví dụ: thông qua mô sống Các hàng rào lớn như niêm mạc của ruột, dạ dày, chỉ có thể được vượt qua sau khi thuốc hòa tan Độ hòa tan trong dung dịch kém hoặc tỷ lệ hòa tan rất thấp có thể khiến thuốc không có được tác dụng tại đích, dẫn đến việc điều trị

in vivo không thành công, mặc dù cấu trúc hóa học của thuốc đó là lí tưởng đối với đích tác

dụng Do đó, quá trình hòa tan có tầm quan trọng đối với sinh khả dụng của thuốc [26] Phép thử hòa tan là một phần không thể thiếu của sự phát triển lâm sàng và tiền lâm sàng giúp sàng lọc đặc tính của dược chất và lựa chọn công thức lý tưởng [13], [14] Ở giai đoạn đầu phát triển công thức thuốc, phép thử độ hòa tan giúp tối ưu hóa việc giải phóng thuốc từ các công thức Nó cũng đã được sử dụng như một quy trình kiểm soát chất lượng (QC), nghiên cứu và phát triển để phát hiện sự thay đổi của các biến và đóng vai trò quan

trọng trong các nghiên cứu so sánh về tương quan in vitro - in vivo (IVIVC) [20]

Mặc dù có hiệu quả song một vấn đề lớn trong các phép thử độ hòa tan để sàng lọc công thức thuốc là cần có quá trình thử nghiệm Vì vậy, sử dụng mô hình tính toán để dự đoán tốc độ hòa tan của dược chất sẽ loại bỏ vấn đề này và là bước quan trọng hướng nhanh hơn tới quá trình khám phá ra thuốc mới [12] Các mô hình dự đoán độ hòa tan được phát triển bởi Noyes-Whitney, sau đó là Nernst-Brunner, Hixson-Crowell và các phương trình khác cũng đã được phát triển Các mô hình này là chúng cho phép dự đoán dễ dàng độ hòa tan của thuốc thông qua các thông số vật lý như độ hòa tan, mật độ, độ khuếch tán…, đó là các thành phần của phương trình, có thể dự đoán thuận tiện hơn thí nghiệm hòa tan Ngoài

ra, do các thông số quan trọng ảnh hưởng đến mô hình hòa tan thuốc đã được làm rõ, các

mô hình có thể hữu ích để kiểm soát độ hòa tan thuốc [7]

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hòa tan in vitro của dược chất

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hòa tan in vitro có thể chia thành 5 nhóm:

• Các yếu tố liên quan đến đặc tính lý hóa của dược chất

• Các yếu tố liên quan đến công thức dạng bào chế

• Các yếu tố liên quan đến quy trình bào chế

• Các yếu tố liên quan đến thiết bị thử hòa tan

• Các yếu tố thuộc về môi trường hòa tan

Tổng quan này sẽ chỉ phân tích một số yếu tố liên quan đến đặc tính lý hóa của dược

chất và các yếu tố về môi trường hưởng đến quá trình hòa tan in vitro của dược chất

1.2.1 Đặc tính lý hóa của dược chất

1.2.1.1 Kích thước tiểu phân

Tốc độ hòa tan có thể được giải thích bằng phương trình Noyes – Whitney [5]:

𝑑𝐶

𝑑𝑡 =

𝐷 𝑆

𝑉 ℎ (𝐶𝑠− 𝐶) Trong đó dC/dt là tốc độ hòa tan

D là hệ số khuếch tán

S là diện tích bề mặt tiếp xúc của dược chất với môi trường

V là thể tích của dung dịch

h là độ dày của lớp khuếch tán

Cs là nồng độ của bão hòa của dược chất

C là nồng độ dược chất tại thời điểm t

Phương trình cho thấy khi kích thước tiểu phân giảm, diện tích bề mặt tiếp xúc của dược chất với môi trường tăng lên, làm tăng tốc độ hòa tan

1.2.1.2 Độ tan

Độ tan là thông số quan trọng nhất ảnh hưởng đến độ hòa tan của dạng thuốc rắn Những dược chất hòa tan tốt tạo ra chênh lệch gradient nồng độ lớn nên đẩy nhanh quá

trình hòa tan

1.2.1.3 Dạng đa hình

Bất kì hợp chất vô cơ hay hữu cơ đều có khả năng tồn tại ở nhiều dạng tinh thể khác nhau Trong một số trường hợp, các dạng tồn tại của dược chất là kết quả của sự hình thành solvat; trong những trường hợp khác, sự sắp xếp phân tử trong mạng tinh thể tạo ra những khác biệt của các tinh thể Higuchi (1) đã chỉ ra sự khác biệt về năng lượng tự do của đa hình có thể là một yếu tố cực kỳ quan trọng trong việc xác định tính ổn định và tính sẵn có của một số dược phẩm [25] Dạng hydrat hóa có thể có tốc độ hòa tan nhanh hơn hoặc chậm hơn so với dạng khan tương ứng.Sự có mặt của các phân tử nước ảnh hưởng đến các tương tác liên phân tử (ảnh hưởng đến năng lượng bên trong và entanpy), rối loạn tinh thể (entropy) do đó ảnh hưởng đến năng lượng tự do, hoạt động nhiệt động, độ tan, tốc độ hòa tan, độ ổn định và sinh khả dụng của thuốc Giữa dạng vô định hình và tinh thể cũng có thể

có sự khác biệt lớn về khả năng hòa tan Trong dạng vô định hình, các phân tử dược chất sắp xếp một cách hỗn loạn, thiếu liên kết Trong khi đó, ở dạng kết tinh, các phân tử dược chất được liên kết chặt chẽ theo cấu trúc nhất định, cần tác động để có thể phá vỡ mạng lưới tinh thể này, vì vậy tốc độ hòa tan thường thấp hơn so với dạng vô định hình [20]

1.2.1.3 Hệ số khuếch tán

Khuếch tán là một quá trình dẫn đến cân bằng nồng độ chất trong hệ, là kết quả của

sự di chuyển ngẫu nhiên của các yếu tố trong hệ đó Khả năng khuếch tán của mỗi dược chất được đặc trưng bởi hệ số khuếch tán của dược chất đó Về mặt vật lý, hệ số khuếch tán được hiểu là khối lượng của chất khuếch tán qua một bề mặt trong một đơn vị thời gian ở một nồng độ đồng nhất Hệ số khuếch tán phụ thuộc vào khối lượng và thể tích chiếm chỗ trong không gian của phân tử dược chất Phân tử càng nặng, càng cồng kềnh thì hệ số khuếch tán càng nhỏ và có xu hướng hòa tan kém hơn các phân tử nhẹ, kích thước nhỏ Do

đó, dược chất có hệ số khuếch tán cao có xu hướng hòa tan tốt hơn so với dược chất có hệ

tan tăng khi tăng nhiệt độ do hệ số khuếch tán của chất tan trong dung môi tăng cao, độ nhớt của dung môi giảm

1.2.2.2 Khuấy trộn trong quá trình hòa tan

Khuấy trộn làm cấu trúc các lớp khuếch tán bị phá vỡ, đưa lớp dung môi vào gần bề mặt chất tan, nơi có lớp dung dịch bão hòa, do đó làm tăng chênh lệch nồng độ, bề dày lớp khuếch tán trở nên vô cùng nhỏ Khuấy trộn càng mạnh thì tốc độ hòa tan càng nhanh [5]

1.2.2.3 pH môi trường

Khi pH dung dịch tăng sẽ làm tăng độ tan của acid yếu và ngược lại với base yếu.Với chất lưỡng tính, thay đổi độ tan phụ thuộc pH đẳng điện pH ở dưới điểm đẳng điện làm giảm độ tan và trên điểm đẳng điện sẽ làm tăng độ tan pH thay đổi lớn theo các vị trí trong đường tiêu hóa Do vậy, pH là một trong những ảnh hưởng quan trọng đến độ tan bão hòa,

từ đó ảnh hưởng đến tốc độ hòa tan của một chất Ảnh hưởng của yếu tố này đến độ tan của dược chất được xét đến trong phương trình Henderson-Hasselbach:

• Acid yếu:

log 𝑆𝑠 = log 𝑆𝑖+ log(1 + 10𝑝𝐻−𝑝𝐾𝑎)

• Base yếu:

log 𝑆𝑠 = log 𝑆𝑖+ log(1 + 10𝑝𝐻−𝑝𝐾𝑎)

Trong đó S i là độ tan nội tại của các dược chất(độ tan ở dạng không ion hóa)

S s là độ tan dược chất tại các pH khác nhau

Một số mô hình giải phóng dược chất từ dạng bào chế

Hiện nay, việc sử dụng các mô hình động học để mô hình hóa quá trình giải phóng dược chất từ các dạng bào chế đang dần phổ biến Một vài mô hình được trình bày trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số mô hình động học giải phóng dược chất từ dạng bào chế [21]

Động học bậc 0 𝐶(𝑡) = 100 𝐾0 𝑡(%) 𝐾0: hằng số giải phóng bậc

0 Động học bậc 1

Trong đó: C(t) là phần trăm dược chất giải phóng ở thời điểm t

Mô hình ảnh hưởng hỗn hợp phi tuyến tính (non-linear mixed effects model)

1.4.1 Giới thiệu về mô hình ảnh hưởng hỗn hợp phi tuyến tính (non-linear mixed effects

model, NLMEM)

Các mô hình hiệu ứng hỗn hợp phi tuyến đã nhận được rất nhiều sự chú ý trong các

tài liệu thống kê trong những năm gần đây vì tính linh hoạt mà chúng mang lại trong việc

xử lý dữ liệu đo lường lặp lại không cân bằng phát sinh trong các lĩnh vực khác nhau, như

dược động học và kinh tế [23]

Mô hình ảnh hưởng hỗn hợp (mixed effects model) là mô hình cho phép đánh giá

đồng thời tham số ảnh hưởng cố định (fixed effects parameter) và tham số ảnh hưởng ngẫu

nhiên (random effects parameter) [15] Áp dụng phương pháp cho dữ liệu mô phỏng cho

thấy rằng nó có thể tạo ra thông tin định tính đáng tin cậy liên quan đến khả năng tương tác

và chế độ hiệu ứng ngẫu nhiên Mô hình hiệu ứng hỗn hợp phi tuyến ước tính các hiệu ứng

ngẫu nhiên, dữ liệu để vẽ đồ thị và mô phỏng từ ước tính của nó Các tham số cố định của

mô hình và tham số dao động ngẫu nhiên được ước tính cùng nhau theo tối đa khả năng phân tích [11]

1.4.2 Một mô hình NLMEM mô phỏng quá trình hòa tan in vitro

❖ Mô hình cấu trúc (structural sub-model)

Mô hình cấu trúc là những mô hình toán học mô phỏng quá trình giải phóng dược chất từ các dạng bào chế được sử dụng như mô hình căn bản trong NLMEM và chứa các tham số ảnh hưởng cố định Một số mô hình động học mô tả quá trình giải phóng dược chất

từ dạng bào chế đã được trình bày ở mục 1.3.2

❖ Mô hình thống kê (statistical sub-model)

Mô hình thống kê giúp mô tả ảnh hưởng ngẫu nhiên (random effects) bao gồm: dao động thông số giữa các mẫu hòa tan so với toàn bộ mẫu (quần thể) và sai số dự đoán của

mô hình

❖ Mô hình chứa các yếu tố dự đoán (covariate sub-model)

Yếu tố dự đoán là các hiệp biến (covariate) có thể ảnh hưởng tới sự khác biệt dữ liệu

hòa tan in vitro của các mẫu thử hòa tan Các yếu tố dự đoán có thể là yếu tố thuộc về đặc

tính lý hóa của dược chất như kích thước, độ tan, pKa, log P, dạng thù hình hay các yếu tố thuộc về môi trường hòa tan như pH, nồng độ chất diện hoạt cũng như các yếu tố thuộc về thiết bị thử hòa tan như kiểu thiết bị, tốc độ khuấy…

Để làm rõ các khái niệm trên, giả sử dược chất được hòa tan từ bột cốm tuân theo mô hình Hill Khi đó, mô hình Hill sẽ được sử dụng như mô hình cấu trúc (structural sub-model) trong mô hình NLMEM:

𝐶(𝑡) = 100 𝑡𝑏

𝑡𝑏+ 𝑀𝐷𝑇𝑏(%) Trong đó:

C(t) là phần trăm dược chất hòa tan ở thời điểm t

b là độ dốc của đồ thị hòa tan

Tuy nhiên, trong mô hình NLMEM, hằng số b và MDT cho từng mẫu bột cốm (cá thể) sẽ khác nhau và khác các hằng số đặc trưng cho toàn bộ mẫu (quần thể) Do đó, cần thiết lập mô hình thống kê mô tả sự khác biệt này Tham số ngẫu nhiên giúp mô tả sự dao động giữa bi (hằng số b của mẫu bột cốm thứ i) và Ɵ𝑏(hằng số b đặc trưng cho toàn bộ mẫu) được gọi là ղb, giữa MDTi (hằng số MDT của mẫu bột cốm thứ i) và Ɵ𝑀𝐷𝑇 (hằng số MDT đặc trưng cho toàn bộ mẫu) là ղMDT Các thông số này đặc trưng cho từng tham số của từng mẫu bột cốm, được giả định có trung bình là 0 và phân bố log chuẩn với phương sai ɷ2 Khi đó, có thể giả sử:

𝑏𝑖 = Ɵ𝑏 𝑒ɳ𝑏𝑖 (1) 𝑀𝐷𝑇𝑖 = Ɵ𝑀𝐷𝑇 𝑒ɳ𝑀𝐷𝑇𝑖 (2) Tuy nhiên, khi biết được hằng số Ɵ𝑏,Ɵ𝑀𝐷𝑇 đặc trưng cho toàn bộ mẫu cũng như hằng

số bi, MDTi của từng mẫu bột cốm, áp các thời điểm lấy mẫu vào phương trình Hill để tính phần trăm dược chất hòa tan dự đoán theo mô hình, sẽ luôn có sự khác nhau giữa giá trị dự đoán và giá trị thực Tham số ngẫu nhiên mô tả sự dao động giữa phần trăm dược chất hòa tan dự đoán từ mô hình (Cpred) và giá trị thực (Cobs) là epsilon (ε) Biến này đặc trưng cho từng thời điểm lấy mẫu của từng mẫu bột, được giả định phân bố chuẩn với trung bình 0 và phương sai σ2 và tuân theo mô hình tỷ lệ:

𝐶𝑜𝑏𝑠𝑖𝑗 = 𝐶𝑝𝑟𝑒𝑑𝑖𝑗 (1 + ε𝑖𝑗) Trong đó:

• 𝐶𝑜𝑏𝑠𝑖𝑗là phần trăm dược chất hòa tan của mẫu bột cốm thứ i tại thời điểm j

• 𝐶𝑝𝑟𝑒𝑑𝑖𝑗 là phần trăm dược chất hòa tan dự đoán của mẫu bột cốm thứ i tại thời điểm j

• ε𝑖𝑗 là sai số giữa giá trị dự đoán và giá trị thực của mẫu bột cốm thứ i tại thời điểm j

Tiếp theo, mô hình sẽ được đưa thêm các yếu tố dự đoán vào nhằm mô tả sự ảnh hưởng của các hiệp biến (covariate) vào hằng số b và MDT Giả sử quá trình giải phóng có

sự ảnh hưởng của độ tan dược chất Cs và tham số kích thước tiểu phân d90 (phân vị 90% của thể tích phân bố kích thước tiểu phân) của các mẫu bột cốm Phương trình (1), (2) trở thành:

𝑏𝑖 = Ɵ𝑏 𝐶𝑠𝑖𝑑𝑏𝑑𝐶𝑠 𝑑90𝑖𝑑𝑏𝑑𝑑90 𝑒ɳ𝑏𝑖

𝑀𝐷𝑇𝑖 = Ɵ𝑀𝐷𝑇 𝐶𝑠𝑖𝑑𝑀𝐷𝑇𝑑𝐶𝑠 𝑑90𝑖𝑑𝑀𝐷𝑇𝑑𝑑90 𝑒ɳ𝑏𝑀𝐷𝑇𝑖

Trong đó:

Csi là độ tan của dược chất trong môi trường hòa tan

d90i là phân vị 90% thể tích phân bố kích thước tiểu phân của mẫu bột cốm thứ i dbdCs là số mũ biểu diễn bậc phụ thuộc của hằng số b vào Cs

dbdd90 là số mũ biểu diễn bậc phụ thuộc của hằng số b vào d90

dMDTdCs là số mũ biểu diễn bậc phụ thuộc của hằng số MDT vào Cs

dMDTdd90 là số mũ biểu diễn bậc phụ thuộc của hằng số MDT vào d90

Mô hình NLMEM mô tả phần trăm dược chất hòa tan của mẫu bột thứ i tại thời điểm

j xây dựng dựa trên mô hình Hill có dạng:

𝐶𝑖𝑗 = (100 𝑡𝑗

𝑏𝑖

𝑡𝑗𝑏𝑖 + 𝑀𝐷𝑇𝑖𝑏𝑖) (1 + ε𝑖𝑗)(%)Trong đó :

Mạng neuron nhân tạo

1.5.1 Cấu tạo

Mạng thần kinh nhân tạo (ANN) làm một thuật toán học mô phỏng dữ liệu theo cách thức hoạt động của bộ não con người ANN thu thập thông tin bằng cách phát hiện các mô hình và mối quan hệ giữa các biến thông qua kinh nghiệm, không phải từ lập trình Một ANN được hình thành từ hàng trăm đơn vị, neuron nhân tạo hoặc các yếu tố tín hiệu (PE) Tập hợp các đầu vào được nhân với các trọng số; những tập hợp đầu vào đó được ghép lại với nhau và được đưa vào một hàm để tạo ra một đầu ra [27]

ANN gồm 3 lớp Lớp đầu tiên được gọi là lớp nhập, không có hoạt động tính toán

Nó chỉ đơn giản được sử dụng để nhập các biến độc lập như các yếu tố quy trình và là đầu vào cho lớp ẩn đầu tiên Lớp cuối cùng được gọi là lớp xuất, được sử dụng để xử lý kết quả cho các biến phụ thuộc, chẳng hạn như khả năng giải phóng thuốc Các lớp ẩn ở giữa và kết nối lớp nhập với lớp xuất (lớp đầu ra) [16] Kết nối giữa các lớp có thể là đầy đủ hoặc một phần Đối với mô hình ANN được kết nối đầy đủ, mỗi nút trên lớp đầu tiên được kết nối với mọi nút trên lớp thứ hai Đối với các mô hình ANN được kết nối một phần, một nút của lớp đầu tiên không phải kết nối với tất cả các nút trên lớp thứ hai

Hình 1.1 Cấu trúc của ANN

1.5.2 Đặc trưng của mạng neuron nhân tạo

1.5.2.1 Cấu trúc mạng:

Mạng tĩnh:

Trong mạng tĩnh, thông tin chỉ lan truyền theo một hướng duy nhất từ lớp nhập đến lớp xuất Có rất nhiều loại mạng thần kinh tĩnh Mạng thần kinh tĩnh được sử dụng thường

xuyên nhất trong phát triển dược phẩm là mạng perceptron đa lớp (MLP) MLP là cấu trúc mạng neuron đơn giản nhất Một MLP bao gồm nhiều lớp nút trong một biểu đồ có hướng, với mỗi lớp được liên kết hoàn toàn với lớp kế tiếp Cấu tạo của mạng này gồm: lớp nhập (input), tối thiểu một lớp ẩn (hidden) và lớp xuất (output) [27]

Hình 1.2 Mô hình mạng perceptron đa lớp

Mạng động:

Mạng động có khả năng lưu trữ dữ liệu và xây dựng dữ liệu kịp thời Đó là sự bảo đảm của các mạng thần kinh động (so với các mạng tĩnh) Mỗi đầu vào được phân tích như

là một chức năng của đầu vào trước đó Mạng động nhớ các đầu vào trong quá khứ; do đó

có sự kết hợp đầu ra hiện tại của các đầu vào trong quá khứ và kết quả lần trước sẽ ảnh hưởng đến lần sau [27]

Hình 1.3 Cấu tạo EDNN

1.5.2.2 Luật học (thuật toán huấn luyện mạng)

Một mạng lưới thần kinh được huấn luyện để xử lí một tập hợp dữ liệu đầu vào bằng

Lớp ẩn Lớp ra Lớp vào

trọng số được thực hiện bằng cách truyền ngược lỗi trong giai đoạn huấn luyện mạng ANN đọc các giá trị đầu vào và đầu ra trong tập dữ liệu và thay đổi giá trị trọng số để giảm chênh lệch giữa các giá trị dự đoán và giá trị mục tiêu Các lỗi được xử lí cho đến khi mạng đạt đến mức chính xác đề ra Tuy nhiên, nếu một mạng được huấn luyện quá lâu sẽ mất khả năng khái quát hóa [8]

Có ba mô hình huấn luyện chính: giám sát, không giám sát và học tăng cường Trong học có giám sát, mạng được cung cấp đầu ra cho mọi mẫu đầu vào Trọng số được xác định

để cho phép mạng tạo ra câu trả lời gần nhất với giá trị đúng Học tăng cường là một biến thể của học có giám sát, trong đó mạng chỉ được cung cấp một thông tin về đầu ra đúng, chứ không phải là câu trả lời đúng Ngược lại, học tập không giám sát không yêu cầu một câu trả lời đúng liên quan đến từng mẫu đầu vào trong tập dữ liệu đào tạo Nó khám phá cấu trúc cơ bản trong dữ liệu hoặc tương quan giữa các biến và sắp xếp các mẫu thành các loại từ các tương quan này [18]

1.5.2.3 Hàm chuyển

Hàm chuyển đóng vai trò xử lý và biến điệu tín hiệu, được lựa chọn sao cho đáp ứng một số đặc điểm của vấn đề mà ANN cần xử lý Có rất nhiều kiểu hàm chuyển, trong đó có

một số hàm đã được sử dụng trong mô phỏng quá trình hòa tan in vitro và cho kết quả khá

khả quan như hàm tanH, hàm Linear và hàm Gauss

Hình 1.4 Một số hàm chuyển trong mạng neuron nhân tạo [16]

1.5.3 Một số nghiên cứu sử dụng mạng neuron nhân tạo mô phỏng quá trình hòa tan

in vitro

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu sử dụng ANN mô phỏng quá trình hòa tan in vitro

Tác giả Nội dung Kiểu

mạng

Ibric [17]

Mục tiêu

Mô hình hóa quá trình hòa tan in vitro của viên

nén aspirin giải phóng kéo dài nhằm tối ưu hóa công thức thuốc

GRNN Biến đầu

vào

- Tỷ lệ Eudragit RS PO/ Eudragit L polyme

- Lực nén Biến đầu

ra Độ hòa tan in vitro

Faith

Chaibva

[10]

Mục tiêu

Mô hình hóa quá trình hòa tan in vitro của viên

nén salbutamol sulfat giải phóng kéo dài nhằm tối ưu hóa công thức thuốc

BPNN Biến đầu

Xây dựng mô hình mô phỏng quá trình hòa tan

in vitro của viên nén carvedilol kiểm soát giải

phóng theo pH

MLP Biến đầu

Mục tiêu Dự đoán độ hòa tan in vitro của pellet theophylin

Trong đó:

GRNN: Mạng neuron hồi quy tổng quát (Generalized Regression Neural Netwok) BPNN: Mạng neuron sử dụng thuật toán loan truyền ngược (Backpropagation neural network)

Phương pháp đánh giá độ phù hợp của mô hình

Thời gian hòa tan trung bình có thể tính theo công thức sau:

𝑀𝐷𝑇 = ∑ 𝑡̂𝑗 ∆𝑀𝑗

𝑛 𝑗=1

∑𝑛 ∆𝑀𝑗

𝑗=1

Trong đó: j là số thứ tự điểm lấy mẫu, n là số điểm lấy mẫu; t̂j khoảng thời gian giữa

2 thời điểm tj và tj-1 bằng (tj + tj-1)/2; ΔMi lượng chênh lệch hòa tan được giữa hai thời điểm

Giá trị f1 sẽ bằng 0 nếu cả hai mẫu thử và mẫu đối chiếu giống hệt nhau Tuy nhiên giá trị của f1 thường phụ thuộc vào việc chọn mẫu nào là mẫu thử, mẫu nào là đối chiếu

Do vậy, một số tác giả đã đề xuất tính 𝑓1′ như sau:

𝑓1′ = ∑ |𝑅𝑗 − 𝑇𝑗|

𝑛 𝑗=1

∑𝑛 (𝑅𝑗 + 𝑇𝑗)/2

𝑗=1

× 100

f 2 (hệ số tương đồng) là phép chuyển log của tổng bình phương sai khác về hòa tan

giữa mẫu thử và mẫu chứng tại tất cả các thời điểm:

và f2 lớn hơn 50 (50-100) là có thể kết luận hai mẫu tương tự [7]

Khi tăng giá trị của i thì ảnh hưởng của sự sai khác giữa các mẫu đến hệ số Rescigno

sẽ lớn hơn Hệ số này có giá trị nằm trong khoảng từ 0 đến 1 Rescigno bằng 0 khi hai mẫu giải phóng giống hệt nhau và bằng 1 khi một trong hai mẫu không có sự giải phóng [7]

1.6.2 Phương pháp thống kê

Phương pháp thống kê bao gồm phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA) hoặc test cho dữ liệu hòa tan đơn điểm và phân tích phương sai đa biến một chiều (MANOVA)

t-cho dữ liệu hòa tan đa điểm [21]

Tiêu chuẩn hay được xác định là dựa trên hệ số xác định R2 (coefficient of determination)

𝑅2 = 1 −∑ (𝑦𝑖 − 𝑦̂)𝑖 2

𝑖

∑ (𝑦𝑖− 𝑦̅)2 𝑖

mô hình đó có phù hợp hay không

Chính vì vậy, R2 chỉ sử dụng khi so sánh các mô hình có cùng tham số Để so sánh

mô hình có các tham số khác nhau, hệ số xác định hiệu chỉnh (adjusted coefficient of determination) được sử dụng [21]:

𝑅𝑎𝑑𝑗𝑢𝑠𝑡𝑒𝑑2 = 1 −(𝑛 − 1)

(𝑛 − 𝑝)(1 − 𝑅2) Trong đó:

n là số điểm lấy mẫu

p là số lượng tham số của mô hình

Ngoài ra, còn rất nhiều phương pháp được sử dụng để đánh giá độ phù hợp của mô hình cũng như so sánh giữa các mô hình với nhau, nhưng đáng tin cậy hơn cả vẫn là dựa trên chỉ số -2LL (-2 log likelihood) để đánh giá tính phù hợp của mô hình

Trị số -2LL (-2 log likelihood)

Thuật ngữ “likelihood” chỉ khả năng/xác suất mà các giá trị quan sát được mô tả chính xác bởi mô hình được khớp [15] Kí hiệu xác suất này là L; Y là phần trăm dược chất hòa tan đo được, Ŷ là phần trăm dược chất hòa tan dự đoán bởi mô hình cho thí nghiệm tương ứng, 2 là phương sai sai số dự đoán của mô hình, n là số thí nghiệm, trị số L và -2LL (-2log likelihood) được tính theo phương trình sau:

Mô hình có trị số -2LL càng thấp đồng nghĩa với xác suất các giá trị dự đoán và giá trị đo lường càng khớp nhau, hay nói cách khác mô hình càng có tính dự đoán tốt [15], [29]

Một số nghiên cứu trong nước về mô hình mô phỏng độ hòa tan

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu trong nước về mô hình mô phỏng độ hòa tan

Quản Duy Quang [6]

Bước đầu xây dựng mô hình in silico quá trình hòa tan của dạng cốm bột chứa một số hoạt chất nhóm NSAIDs

Nguyễn Thị Hiền [2]

Bước đầu xây dựng mô hình in silico mô phỏng quá trình hòa tan của dược chất ít tan trong nước thuộc nhóm cephalosporin

Nguyễn Quốc Công

[1]

Xây dựng mô hình in silico quá trình hòa tan của một

số dược chất nhóm cephalosporin

Cao Minh Hiếu [3]

Tiếp tục xây dựng mô hình mô phỏng in silico quá

trình hòa tan của một số dược chất ít tan trong nước

Các nghiên cứu đã sử dụng phần mềm JMP Pro để phân tích dữ liệu Biến đầu vào là các đặc tính lý hóa của dược chất: độ tan , nhiệt độ nóng chảy, diện tích bề mặt riêng, hệ

số khuếch tán, d10, d50, d90,… biến đầu ra là phần trăm hòa tan của dược chất Các nghiên cứu cũng đã được tiến hành với mẫu bột hoặc cốm chứa dược chất và tá dược Cuối cùng

đã làm rõ được ảnh hưởng của một thông số lên độ hòa tan của dược chất Từđó đánh giá mỗi tương quan giữa độ hòa tan thực tế và độ hòa tan dự đoán

Một số thông tin về dược chất được sử dụng trong nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các dược chất bao gồm: cefaclor, cefaclor monohydrat, methylprednisolon Một số thông tin cơ bản của các dược chất trên được trình bày dưới đây

Bảng 1.4 Đặc điểm của các dược chất sử dụng trong nghiên cứu

Đặc điểm Cefaclor Cefaclor

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu và thiết bị thí nghiệm

6 Kali dihydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

10 Acid citric monohydrat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

2.1.2 Thiết bị

- Máy thử độ hòa tan hút mẫu tự động Vankel (VK 7010)/Varian (Mỹ)

- Máy đo kích thước tiểu phân MasterSizer (model 3000)/Malvern (Anh)

- Máy đo quang phổ UV-VIS SP-3000 nano/Optima (Nhật)

- Máy đo pH FE 20/Mettler Toledo (Thụy Sĩ)

- Bộ rây các loại

- Bể lắc điều nhiệt Wisebath (model WSB-30) – Daihan (Hàn Quốc)

- Máy phân tích nhiệt vi sai DSC – TGA 131 CETARAM (Pháp)

- Cân phân tích, cân kỹ thuật và các dụng cụ thủy tinh khác

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị các mẫu thử hòa tan

2.2.1.1 Bột dược chất đơn

Rây lần lượt cefaclor, cefaclor monohydrat, methylprednisolon qua các cỡ rây thích hợp để thu được các phân đoạn có phân bố kích thước khác nhau, được kí hiệu [S], [M], [L] theo giá trị d50 tăng dần:

Cefaclor: bao gồm 3 mẫu [S], [M], [L]

Cefaclor monohydrat: bao gồm 3 mẫu [S], [M], [L]

Methylprednisolon loại A: bao gồm 2 mẫu [S], [M]

Methylprednisolon loại B: bao gồm 2 mẫu [S], [M]

Methylprednisolon loại C: bao gồm 2 mẫu [S], [M]

2.2.1.2 Tạo mẫu bột gồm dược chất và tá dược

Trộn đều mỗi loại dược chất và từng phân đoạn kích thước với lactose (tá dược tan) hoặc Avicel (tá dược không tan) theo các tỷ lệ khối lượng dược chất/tá dược là 1:1 hoặc 1:2 hoặc 1:3 Cỡ mẫu < 5g Từ đó xác định hàm lượng dược chất trong các mẫu thử (Q, %)

2.2.2 Xác định các thông số hóa lý của dược chất thử hòa tan

2.2.2.1 Xác định độ tan của dược chất trong các môi trường pH khác nhau ở 37C

Độ tan của dược chất trong từng môi trường thử hòa tan ở 37°C được xác định bằng

bể lắc điều nhiệt như sau:

Đong một lượng khoảng 10 ml dung dịch môi trường vào lọ và thêm vào một lượng

dư dược chất (gấp khoảng 3 lần độ tan dự kiến), sử dụng nắp cao su đóng kín lọ, bên ngoài đóng chặt bằng nắp nhôm

Dùng thiết bị bể lắc điều nhiệt, cài đặt nhiệt độ 37C, thời gian 48 giờ, tốc độ 80 vòng/phút

Sau 48 giờ, hút mẫu và lọc qua màng lọc 0,45 m, tiến hành pha loãng tới nồng độ thích hợp để định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-Vis

Dựa vào đường chuẩn định lượng đã xây dựng của mỗi dược chất tại môi trường pH tương ứng để xác định độ tan của các dược chất ở 37C

Tiến hành 3 lần và lấy kết quả trung bình

2.2.2.2 Xác định phân bố kích thước tiểu phân

Phân bố kích thước tiểu phân dược chất được xác định bằng thiết bị đo phân bố kích thước tiểu phân MasterSizer 3000 theo các bước sau:

Tạo dung dịch bão hòa dược chất trước khi bắt đầu thêm mẫu để hạn chế hiện tượng các tiểu phân bị tan, giảm kích thước trong quá trình đo

Lắc đều phân đoạn cần xác định kích thước và thêm dần nước vào cốc đo đến khi độ che phủ ánh sáng (obscuration) của hỗn dịch trong cốc đạt 5-10%

Đo 3 lần, lấy kết quả trung bình và xuất ra đồ thị phân bố dạng histogram Trong đồ thị này, mẫu sẽ được chia thành nhiều ngăn (bin) và mỗi ngăn được xem như chỉ chứa các tiểu phân đồng nhất về kích thước Kết quả thu được ngoài các bin còn có các tham số kích thước tiểu phân d10 (µm), d50 (µm), d90 (µm) lần lượt là giá trị phân vị 10%, 50%, 90% thể tích phân bố

2.2.2.3 Xác định diện tích bề mặt riêng

Xác định diện tích bề mặt riêng của các phân đoạn dược chất bằng thiết bị bị nhiễu xạ laser MasterSizer 3000 Cách tiến hành tương tự như xác định phân bố kích thước tiểu phân

MW B là khối lượng phân tử

T là nhiệt độ tuyệt đối ( o K)

V A là thể tích trung bình mol (ml/mol)

Ψ B là hằng số tương tác giữa các phân tử

dung môi (Ψ B = 2,6 nếu dung môi là nước)

η B là độ nhớt (cP)

2.2.2.5 Xác định nhiệt độ nóng chảy của dược chất

Nhiệt độ nóng chảy của các dược chất được xác định bằng phương pháp quét nhiệt lượng vi sai (DSC) như sau:

Cân một lượng bột mẫu khoảng 5-10 mg vào một đĩa nhôm trên cân phân tích Tiến hành đục một lỗ nhỏ trên nắp đĩa để tránh ảnh hưởng của sự bốc hơi nước cũng như sự giãn nở của không khí trong quá trình gia nhiệt

Đậy nắp và dùng lực dập để gắn chặt nắp vào đĩa

Sử dụng một đĩa nhôm trắng để làm mẫu so sánh và nắp được đục 2 lỗ để phân biệt với mẫu đo

Đưa mẫu so sánh và mẫu đo vào buồng gia nhiệt, bắt đầu quá trình gia nhiệt với tốc

độ gia nhiệt 10°C/phút

2.2.3 Thu thập dữ liệu thử hòa tan thực tế

Phương pháp thử hòa tan được tiến hành bằng máy thử hòa tan hút mẫu tự động Vankel (VK 7010) pH được lựa chọn sao cho tốc độ hòa tan của dược chất có sự khác nhau

Thời gian thử hòa tan: 120 phút Tần suất lấy mẫu:

5 phút/lần trong 60 phút đầu tiên

10 phút/lần trong 60 phút tiếp theo

Mỗi mẫu làm 3 lần lấy kết quả trung bình

Phương pháp định lượng: Lượng dược chất hòa tan được xác định bằng phương pháp

đo quang tại bước sóng được nêu trong bảng 2.2 và bảng 2.3 sử dụng mẫu chuẩn so sánh:

% Hòa tan = 𝐴𝑡

𝐴𝑐 𝐶𝑐 900.

1

𝑚𝑡 100%

Trong đó: Cc là nồng độ của dung dịch chuẩn (mg/ml); At, Ac lần lượt là độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn; mt là lượng dược chất đem thử hòa tan (mg) Điều kiện thử chi tiết cho từng mẫu được mô tả trong bảng 2.3

Bảng 2.2 Điều kiện thử hòa tan cho mẫu thử Thông số Cefaclor Cefaclor

2.2.4 Xây dựng mô hình mô phỏng quá trình hòa tan in vitro của dược chất

2.2.4.1 Dựa trên mô hình ảnh hưởng hỗn hợp phi tuyến tính NLMEM

Mô hình NLMEM được xây dựng qua các bước chính sau:

Bước 1: Lựa chọn mô hình động học cấu trúc

Hiện nay có rất nhiều mô hình toán học mô phỏng quá trình hòa tan in vitro như đã

trình bày trong mục Tuy nhiên, trong phạm vi nghiên cứu, 3 mô hình Wagner, Hill và

Weibull được sử dụng để xây dựng các mô hình NLMEM

Trong nghiên cứu này, với mỗi mô hình cấu trúc, 12 yếu tố dự đoán được lần lượt được mô hình, bao gồm: d10, d50, d90, Cs, logP, pKa, mp, Sw, Q, pH, Lac và Avi như sau:

Sử dụng phần mềm Phoenix viết chương trình cho mô hình NLMEM chứa một yếu

tố dự đoán, được kí hiệu là Cov1 (code chi tiết xin xem ở phụ lục I)

Lần lượt gán biến Cov1 với 1 trong 12 yếu tố dự đoán Xác định trị số -2 log likelihood (-2LL) của mô hình NLMEM sau khi gán biến Cov1

Đưa yếu tố dự đoán tốt nhất (yếu tố dự đoán cho giá trị -2LL của mô hình thấp nhất) vào mô hình, mô hình chứa yếu tố dự đoán này được coi là mô hình NLMEM cơ bản Tiếp tục viết chương trình cho mô hình NLMEM cơ bản có chứa thêm một số yếu tố

dự đoán tốt nhất Cov2 Tiếp tục gán biến Cov2 cho 12 yếu tố dự đoán còn lại để tiếp tục đưa vào mô hình yếu tố dự đoán tốt nhất Lặp lại bước trên khi mô hình thu được chứa 4 yếu tố

dự đoán Đây chính là 4 hiệp biến (covariate) có ảnh hưởng lớn nhất tới mô hình NLMEM

Mô hình NLMEM thu được có dạng như sau (các tham số xin xem mục 1.3.2 và mục

𝑏𝑖 = Ɵ𝑏 𝐶𝑜𝑣1𝑖𝑑𝑏𝑑𝐶𝑜𝑣1 𝐶𝑜𝑣2𝑖𝑑𝑏𝑑𝐶𝑜𝑣2𝐶𝑜𝑣3𝑖𝑑𝑏𝑑𝐶𝑜𝑣3 𝐶𝑜𝑣4𝑖𝑑𝐾𝑑𝐶𝑜𝑣4 𝑒ɳ𝑏𝑖

𝑎𝑖 = Ɵ𝑎 𝐶𝑜𝑣1𝑖𝑑𝑎𝑑𝐶𝑜𝑣1 𝐶𝑜𝑣2𝑖𝑑𝑎𝑑𝐶𝑜𝑣2𝐶𝑜𝑣3𝑖𝑑𝑎𝑑𝐶𝑜𝑣3 𝐶𝑜𝑣4𝑖𝑑𝐾𝑑𝐶𝑜𝑣4 𝑒ɳ𝑎𝑖

2.2.4.2 Dựa trên mạng neuron nhân tạo ANN

Dựa vào kết quả thực nghiệm ở mục 2.2.2 và 2.2.3, kết hợp tham khảo nghiên cứu của Kozo Takayama và cộng sự [28], sử dụng phần mềm JMP Pro 2013 thiết lập mạng neuron nhân tạo ANN dưới dạng mạng 3 lớp (1 lớp nhập, 1 lớp ẩn và 1 lớp xuất) như sau: Lớp nhập: gồm 12 neuron và mỗi neuron tương ứng với một biến đầu vào, bao gồm: d10, d50, d90, Cs, logP, pKa, mp, Sw, Q, pH, Lac và Avi

Lớp xuất: gồm 7 neuron và mỗi neuron tương ứng với một biến độ hòa tan tại các thời điểm khác nhau: y5, y10, y15, y20, y25, y30, y35, y40, y45, y50, y55, y60, y70, y80, y90, y100, y110 và y120

Lớp ẩn: hàm tang hyperbolic (tanH) được sử dụng như các hàm kích hoạt tại mỗi neuron trong lớp ẩn

Mặc dù có một số lượng vô hạn cấu trúc mạng ANN nhưng trong khuôn khổ nghiên cứu chỉ tiến hành khảo sát 3 cấu trúc mạng với số neuron trong lớp ẩn là 3 Mỗi neuron có hàm chuyển tương ứng là hàm tang hyperbolic (tanH)

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thẩm định chéo 5 nhóm (5-fold) để huấn luyện mạng neuron nhân tạo Phương pháp này chia tập dữ liệu thành 5 nhóm Trong quá trình luyện mạng, 80% số liệu tương ứng với 4 nhóm ngẫu nhiên trong 5 nhóm được sử dụng để huấn luyện mạng Sau đó, 20% số liệu trong 1 nhóm còn lại được sử dụng để thẩm định mô hình dự đoán Quá trình huấn luyện và thẩm định được lặp lại 5 lần với sự thay đổi của tập

dữ liệu huấn luyện và tập dữ liệu thẩm định Phương pháp này là một trong những phương pháp tốt nhất để huấn luyện mạng, đặc biệt là đối với các tập dữ liệu nhỏ do nó cho phép

sử dụng hiệu quả bộ dữ liệu có hạn [28] Để tránh việc mạng chỉ nhớ lặp lại (overfitting) trong khi huấn luyện mạng, phương pháp “squared” được sử dụng như một phương pháp cảnh báo Sau đó, các mô hình ANN được so sánh với nhau dựa trên chỉ số -2 log likelihood

(-2LL) để lựa chọn ra mô hình ANN có cấu trúc tối ưu Từ đó, mô hình ANN mô phỏng

quá trình hòa tan in vitro được xây dựng

2.2.4.3 Lựa chọn và thẩm định mô hình tối ưu

Lựa chọn mô hình tối ưu

Từ các mô hình NLMEM tối ưu và mô hình ANN 3 lớp tối ưu (xây dựng theo phương pháp ở mục 2.2.4.1 và 2.2.4.2), lựa chọn ra mô hình tối ưu dựa trên chỉ số -2 log likelihood (-2LL) Mô hình có trị số -2LL bé hơn sẽ được lựa chọn làm mô hình tối ưu

Thẩm định mô hình tối ưu

Sử dụng phần mềm Phoenix 8.1

Sử dụng hàm Bootstrap để thẩm định mô hình đã được lựa chọn Hàm Bootstrap cho phép lấy một lượng lớn bộ mẫu thẩm định với cỡ mẫu trong mỗi bộ đúng bằng cỡ mẫu trong tập dữ liệu (trong một bộ mẫu, mỗi mẫu có thể được lấy 1 hoặc nhiều lần) Nghiên cứu sử dụng hàm Bootstrap với số bộ mẫu thẩm định là 200 bộ mẫu

Sau đó, các tham số ước tính từ 200 bộ mẫu thẩm định sẽ được so sánh với các tham

số của mô hình tối ưu

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thẩm định độ tuyến tính của phương pháp định lượng dược chất

3.1.1 Mẫu chỉ chứa dược chất đơn

Pha các dung dịch chuẩn gốc cefaclor, cefaclor monohydrat, methylprednisolon trong bình định mức 100 ml bằng 10 ml ethanol, bổ sung thể tích bằng các dung dịch môi trường

Từ dung dịch chuẩn gốc, pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ giảm dần bằng các môi trường Đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn tại các bước sóng rồi xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ và nồng độ dược chất trong các môi trường Kết quả được thể hiện trong các bảng từ 3.1 đến 3.3

Bảng 3.1 Đường chuẩn định lượng cefaclor λ = 265 nm (n = 3)

Môi trường pH 2,2 Môi trường pH 3,2 Môi trường pH 3,6 Nồng độ

A = 23,013C + 0,0067 R² = 0,9996

Bảng 3.2 Đường chuẩn định lượng cefaclor monohydrat λ = 265 nm (n=3) Môi trường pH 2,2 Môi trường pH 3,2 Môi trường pH 3,6 Nồng độ

(g/l)

Độ hấp thụ Nồng độ (g/l)

Độ hấp thụ

Nồng độ (g/l) Độ hấp thụ

A = 23,095C + 0,0081 R² = 0,9996

Bảng 3.3 Đường chuẩn định lượng methylprednisolon λ = 247 nm (n=3)

Môi trường pH 5,2 Môi trường pH 5,8 Môi trường pH 6,8

Nồng độ (g/l) Độ hấp

thụ

Nồng độ (g/l)

Độ hấp thụ

Nồng độ (g/l)

Độ hấp thụ

A = 38,74C + 0,0001 R² = 0,9999

Nhận xét:

Tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ trong các môi trường của cả ba dược chất đều

có tính tuyến tính cao (R2> 0,99) trong khoảng nồng độ khảo sát Do vậy, có thể sử dụng phương pháp hấp thụ UV-Vis tại các bước sóng trên để định lượng dược chất và xác định

phần trăm dược chất hòa tan

3.1.2 Mẫu chứa dược chất và tá dược

Đối với tá dược Avicel, do không tan trong môi trường thử hòa tan nên không ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang của dung dịch

Trong khi đó, mẫu placebo chứa lactose hàm lượng cao nhất (gấp 3 lần khối lượng dược chất) có độ hấp thụ chỉ bằng chưa đến 1% so với mẫu chứa dược chất trong cùng điều kiện ở tất cả các thời điểm hút mẫu định lượng

Nhận xét:

Sự có mặt của các tá dược lactose và Avicel với hàm lượng như trong mục 2.2.1.2

không làm ảnh hưởng tới kết quả định lượng dược chất tại các bước sóng đã chọn

Xác định các thông số lý hóa của dược chất

3.2.1 Xác định độ tan của dược chất ở 37°C

Xác định độ tan của dược chất tại từng môi trường thử hòa tan ở 37°C theo quy trình

đã nêu ở mục 2.2.2.1 Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Độ tan của dược chất trong các môi trường ở 37°C (n = 3, TB ± SD) Dược chất Môi trường Độ tan (g/l)

3.2.2 Xác định phân bố kích thước tiểu phân

Xác định phân bố kích thước tiểu phân của các phân đoạn dược chất như đã trình bày

ở mục 2.2.2.2 Kết quả được thể hiện ở hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 Kết quả các chỉ số d10, d50, d90 được đo bằng thiết bị đo kích thước tiểu phân Mastersizer thể hiện trên bảng 3.5

(số liệu chi tiết xin xem phụ lục II)