Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công nông nghiệp để thu nhận bioethanol tt

Với mục đích như trên đề tài NCS “Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công-nông nghiệp để thu nhận bioethanol” sử dụng hỗn hợp các enzyme

I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Hiện nay, nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất kì quốc gia nào trên thế giới Trong số cácnguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng lượng gió, mặt trời, hạt nhân,…), năng lượngsinh học đang là xu thế phát triển tất yếu, nhất là ở các nước nông nghiệp và nhập khẩu nhiên liệu Dựa vàonguyên liệu sản xuất, người ta chia NLSH thành 4 thế hệ: Thế hệ I (từ tinh bột như ngô, sắn, mía đường), thế hệ

II (từ sinh khối thực vật như thân cây lúa, ngô, lúa mỳ, bã mía), thế hệ thứ III (từ các loài vi tảo) và thế hệ

có giá trị cao hơn chủ yếu do lignocellulose có cấu trúc phức tạp, khó chuyển hóa sinh học Do đó, nhiệm vụ tìmkiếm giải pháp thích hợp để chuyển hóa hiệu quả vật liệu trên thành dạng năng lượng có ích ngày càng trở nêncấp thiết Theo phương thức truyền thống có thể sử dụng phương pháp hóa học (axít/bazơ) hoặc hóa lý(nghiền/nổ hơi) Tuy nhiên, một trong những hướng đi mới để giải quyết nhiệm vụ này là sử dụng xúc tác sinhhọc (enzyme từ các loài nấm), chúng được biết là có hệ enzyme xúc tác hiệu quả giúp chúng phân hủy tốtlignocellulose để giải phóng các đơn vị đường cần thiết cho quá trình lên men bioethanol Tuy nhiên, nhìn chungcác enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp trên cơ chất thô và việc xúc tác chuyểnhóa hiệu quả cơ chất cần kết hợp nhiều enzyme có tác dụng hiệp đồng Với mục đích như trên đề tài NCS

“Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công-nông nghiệp để thu nhận bioethanol” sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme

esterase (acetyl esterase và feruloyl esterase), enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa từ nấm để phân hủy các cấutrúc polymer phức tạp để lên men thu nhận bioethanol Việc sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối phụ phẩmcông - nông nghiệp một mặt tận dụng nguồn nguyên liệu rồi rào thay thế nguồn nguyên liệu truyền thống (vd:ngũ cốc, bắp, sắn), mặt khác tạo thành nguồn năng lượng sạch giúp giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do đốthoặc xử lý theo phương pháp truyền thống gây ra, đồng thời không ảnh hưởng tới an ninh lượng thực quốc gia.Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ lên men sản xuất bioethanol thế hệ II

1

2 Mục tiêu nghiên cứu

Hiên nay, khả năng chuyển hóa các vật liệu thô từ sinh khối giàu lignocellulose bằng các phương pháptruyền thống còn nhiều mặt hạn chế Do vậy, mục tiêu của đề tài luận án nhằm khai thác nguồn đa dạng xúc tácsinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để chuyển hóa hiệu quả sinh khối giàu lignocellulose từ các phụ phẩmcông-nông nghiệp thành các đường (C5 và C6) có khả năng lên men cho sản xuất bioethanol Đặc biệt, luận án sửdụng “enzyme cocktail” xúc tác hiệp đồng để tăng khả năng chuyển hóa sinh học Trong đó, nghiên cứu sử dụngcarbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)] nhằm phối hợp với các enzyme tấn công

mạch chính (cellulase/xylanase) và mạch nhánh để thủy phân cấu trúc lignocellulose Mục tiêu tiếp theo là đánh

giá khả năng lên men nguồn dịch đường sau thủy phân bằng “enzyme cocktail” thành bioethanol

3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu chính đã thực hiện:

- Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)];

- Sinh tổng hợp và tinh sạch protein enzyme hoạt tính FAE và AE từ môi trường nuôi cấy nấm và xác địnhđặc tính của enzyme tinh sạch

- Chuyển hóa vật liệu lignocellulose thành các đường đơn (hexose và pentose) có khả năng lên men sử dụng đơn enzyme và “enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanase và esterase xúc tác hiệp đồng

- Tối ưu quy trình chuyển hóa và nghiên cứu sản xuất bioethanol từ dịch đường chuyển hóa quy mô phòng thí nghiệm

4 Những đóng góp mới của luận án

- 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và nấm Đảm (Basidiomycota) được phân lập và sàng lọc khả năng sinh tổng hợp carbohydrate esterase (feruloyl esterase và acetyl esterase)

- Lần đầu tiên, enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima và acetyl esterase từ nấm Xylaria

polymorpha được phân lập và tinh sạch từ môi trường nuôi cấy giàu lignocellulose Trong đó, feruloyl

esterase từ Alt tenuissima (AltFAE) có trọng lượng phân tử Mw = 30,3 kDa với hoạt tính đặc hiệu 11,2 U/mg

Acetyl esterase từ X polymorpha (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa với hoạt tính đặc hiệu 13,1U/mg Hai enzyme này có độ bền cao trong khoảng nhiệt độ 40 đến 450C và pH 5,0

- Enzyme carbohydrate esterases tinh sạch kết hợp với enzyme thương mại (hỗn hợp “enzyme cocktail”hoạt tính cellulase/xylanse (cell/xyl)) được tối ưu thành phần và sử dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thô(vd

mía bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong túi…) thành các đường đơn có khả năng lên men bioethanol Trong đó, bã mía được chọn làm cơ chất phù hợp để sản xuất các đường C5/C6 (vd: glucose, xylose)

- Bằng quy hoạch thực nghiệm đã xác định điều kiện tối ưu cho chuyển hóa bã mía bằng “enzyme

cocktail” là

ở 400C, pH 5.0, trong 48 giờ và hoạt độ enzyme là cell/xyl: 100 U/g, AltFAE: 7,56 U/g, XpoAE: 10,8 U/g

sinh khối khô Khi đó, tổng các đường lên men là 251,86 mg/g Kết hợp xử lý bã mía bằng “enzyme cocktail”

và axit H2SO4 loãng (0,1%) thì các đường lên men sinh ra là 319,5 mg/g, đạt hiệu suất 49,8%

2

- Các đường đơn thu được bằng chuyển hóa enzyme đã được chứng minh có khả năng lên men bioethanol

(cồn sinh học) bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với hàm bioethanol thu được 178ml/kg bã mía,

đạt hiệu suất 79,8% so với lý thuyết

5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án

Bên cạnh sản xuất bioethanol từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía), bioethanol có thể được sản xuất

từ lignocellulose Lignocellulose là loại sinh khối (biomass) phổ biến nhất trong sinh quyển Sản xuất bioethanol

từ nguồn sinh khối là một giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam.Hàng năm sản xuất công-nông nghiệp trong nước sản sinh hàng trăm triệu tấn phụ phẩm giàu lignocellulose lànguồn cung cấp nguyên liệu vô cùng dồi dào cho sản xuất năng lượng sạch, mặt khác giải quyết vấn đề ô môitrường do không được xử lý hay loại bỏ theo phương pháp truyền thống

Theo các tài liệu công bố và kinh nghiệm nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, nhìn chung các enzyme thủyphân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp (không qua tiền xử lý) trên cơ chất thô Điều này có thểkhắc phục bằng việc sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme thủy phânvà/hoặc oxy hóa để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp Ngoài ra, sàng lọc enzyme bằng nuôi cấy vi sinhvật có vai trò quan trọng trong việc tìm ra các enzyme mới với hoạt tính xúc tác thủy phân cao và các đặc tínhhữu ích

Đề tài luận án không nhằm giải quyết được toàn bộ các bước từ chuyển hóa vật liệu sinh khối thô thànhbioethanol mà mục tiêu chính nhằm khai thác và sử dụng nguồn xúc tác sinh học từ nấm và tối ưu hóa chochuyển hóa sinh khối thành đường có khả năng lên men Đây cũng chính là một trong những khâu then chốttrong công nghệ lên men sản xuất bioethanol thế hệ II

6 Bố cục luận án

Luận án gồm 163 trang với 21 bảng, 58 hình, 144 tài liệu tham khảo Bố cục của luận án: Mở đầu (4 trang),Chương 1: Tổng quan (39 trang), Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (26 trang), Chương 3:Kết quả và thảo luận: (67 trang), Kết luận (2 trang), Danh mục các công trình công bố (1 trang), Tài liệu thamkhảo (13 trang) Phụ lục (39 trang)

Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học, tính mới, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của luận án

Chương 1 Tổng quan Phần này trình bày:

- Tổng quan về phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose, trong đó trình bày về nguồn gốc, hiện trạng sử

dụng phụ phẩm công-nông nghiệp ở Việt Nam nói chung và nguồn gốc, hiện trạng sử dụng, các vấn đề môi trường từ bã mía ở Việt Nam nói riêng

- Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose bằng xúc tác sinh học Trong đó làm nổi bật được cơ chế chuyểnhóa

của enzyme trong thủy phân lignocellulose, nguồn enzyme từ đa dạng nấm ở Việt Nam, enzyme thủy phân lignocellulose từ nấm và vai trò enzyme carbohydrat esterase trong thủy phân lignocellulose

3

- Tổng quan về tình hình sản xuất bioethanol và những nghiên cứu, sản xuất bioethanol trong và ngoài nước.

Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Vi sinh vật

+ Quả thể nấm tươi được thu lượm từ vườn Quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình được sử dụng để phân lập nấm,

sàng lọc và tinh sạch enzyme thủy phân phục vụ cho nghiên cứu

+ Một số chủng nấm được chọn lọc từ bộ chủng giống lưu giữ tại phòng thí nghiệm Sinh học thực nghiệm,Viện

+ Enzyme thương mại được tinh sạch từ nấm Trichoderma reesei (carboxymethyl cellulase and

glucuronoxylanase; 1-1,6 U/mg, Cell/Xyl, AB Enzyme, Darmstadt, Germany) hoạt động tối ưu ở pH 5.0-5.5,nhiệt độ 40-45oC

+ Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 được cung cấp bởi phòng Vi sinh môi trường, Viện

Công

nghệ môi trường

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh vật: Phân lập nấm; Nuôi cấy và bảo quản nấm men; Lên men bioethanol

2.2.2 Định danh nấm: Định danh bằng phương pháp hình thái giải phẫu; Định danh bằng phương pháp sinh họcphân tử

2.2.3 Sàng lọc hoạt tính esterase và lựa chọn chủng nấm

2.2.4 Đánh giá hoạt độ acetyl esterase và feruloyl esterase

2.2.5 Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase

2.2.6 Tinh sạch protein enzyme

2.2.7 Phương pháp hóa sinh: Sắc ký bản mòng (TLC); Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC; Xác định peptide bằngphương pháp phổ khối (MS); Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic (DNS); Xử lýnguyên liệu (bằng kiềm, axít và gia nhiệt); Xác định hàm lượng bioethanol

2.2.8 Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose

2.2.9 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm

2.2.10 Phương pháp xử lý số liêu

2.3 Xây dựng sơ đồ nghiên cứu

2.3.1 Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm

2.3.2 Sơ đồ thủy phân bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail”

2.3.3 Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa

Chương 3: Kết quả và thảo luận 3.1 Phân lập và sàng lọc nấm

Từ các mẫu nấm thu từ rừng QG Cúc Phương (Ninh Bình) đã phân lập được 44 chủng nấm thuộc 13 họ vàđịnh tên khoa học đến loài Các taxon nấm phân lập được:

3.1.1 Ngành nấm đảm Basidiomycota

Họ Polyporaceae: Coriolus unicolor, Tyromyces lacteus, Trametes insularis, Tr consors, Tr gibbosa,

Hexagonia apiaria, Nigroporus aratus

Họ Ganodermataceae: Ganoderma komingshegii, G applanatum, Ganoderma sp.

4

Họ Coriolaceae: Poria versipora

Họ Marasmiaceae: Campanella junghuhnii, Marasmius maximus

Họ Agaricaceae: Coprinus disseminates

Họ Mycenaceae: Mycena galericulata

Họ Auriculariaceae: Auricularia delicate

Họ Hymernochaetaceae: Inonotus substygius, Polystictus didrichsenii

Họ Hygrophoropsidaceaee: Hygrophoropsis aurantiaca

3.1.2 Ngành nấm túi Ascomycota

Họ Xylariaceae: Xylaria polymorpha, X carpophila, Hypoxylon monticulosum (CP629), Rosellinia sp (CP564), Nodulisporium sp (CP582).

Họ Helotiaceae: Bisporella citrine

Họ Pleosporaceae: Alternaria tenuissima (SP66)

Họ Bionectriaceae: Bionectria sp (CP587)

3.2 Khả năng sinh tổng hợp esterase và lựa chọn chủng nấm

3.2.1 Sàng lọc hoạt tính feruloyl esterase (FAE)

Khả năng sinh tổng hợp feruloyl esterase của 44 chủng nấm lựa chọn được đánh giá qua khả năng phân giải

cơ chất ethyl ferulate (ethyl 4-hydroxy-3-methoxycinnamate) trên đĩa thạch Chủng Alt tenuissima SP66 do biểu

hiện hoạt tính feruloyl esterase cao nên được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo để xác định các điều kiệnnuôi cấy như thời gian, cơ chất/nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ và pH

3.2.2 Sàng lọc hoạt tính acetyl esterase (AE)

Dịch lên men của 44 chủng nấm sau khi ly tâm để loại bỏ sinh khối và các thành phần tạp để xác định hoạt

tính acetyl esterase (AE) qua khả năng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl acetate Chủng X polymorpha A35 do

biểu hiện hoạt tính acetyl esterase cao nên được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp Sau khi sàng lọc hoạt tính

feruloyl esterase và acetyl esterase đã lựa chọn hai chủng nấm có hoạt tính cao là Alt tenuissima SP66 và X.

polymorpha A35 Sau đó các nghiên cứu về tối ưu các điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme, tinh sạch và đặc

tính AE và FAE cũng như sử dụng enzyme cho xúc tác chuyển hóa sinh khối lignocellulose sẽ được thực hiện

3.3 Định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử

Từ kết quả phân loại bằng phương pháp sinh học phân tử và phân tích hình thái bào tử có thể kết luận mẫu

nấm phân lập ký hiệu SP66 là loài nấm túi Alternaria tenuissima SP66 thuộc họ Pleosporaceae và chủng nấm A35 là Xylaria polymorpha A35 thuộc họ Xylariaceae.

3.4 Động học sinh tổng hợp enzyme esterase

Tối ưu hóa được các điều kiện sinh tổng hợp acetyl esterase và feruloyl esterase của hai chủng nấm X.

polymorpha A35 và Alt tenuissima Sp66 như sau:

Hoạt tính acetyl esterase: Chủng X polymorpha A35 nuôi cấy trên môi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ

chất rơm, nguồn nitơ là pepton, thời gian nuôi cấy 10 ngày, nhiệt độ 25oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, khi đó,hoạt tính acetyl esterase cao nhất đạt 135,4 U/l

Hoạt tính feruloyl esterase: Chủng Alt tenuissima nuôi cấy trên môi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ

chất rơm, thời gian nuôi cấy 12 ngày, nhiệt độ 25oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, khi đó, hoạt tính acetylesterase cao nhất đạt 1154,4 U/l

3.5 Tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm

3.5.1 Tinh sạch và đặc tính acetyl esterase của nấm X polymorpha A35 (XpoAE)

Dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau 3 tuần được cô đặc bằng siêu lọc (màng lọc 10 kDa

cut-off) Sau đó, protein enzyme biểu hiện hoạt tính XpoAE đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate được tinh sạch

bằng sắc ký lỏng Bước đầu tiên của quá trình rửa giải protein được thực hiện qua cột sắc ký trao đổi anion

DEAE Sepharose và kết quả đã thu được 3 phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE (ký hiệu phân đoạn I, II và III).

Tổng thể tích rửa giải của phân đoạn hoạt tính enzyme cao nhất (phân đoạn III) được nạp tiếp lên cộtSuperdexTM 75 Sau bước sắc ký lọc gel này, một phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE được thu (Hình 3.2).

Sau quá trình tinh sạch đã thu được lượng protein enzyme tinh sạch là 20,6 mg, tương đương 27 U và hiệusuất 26,8 % với độ tinh sạch 18,3 lần Phân đoạn enzyme tinh sạch này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp

theo về đặc tính protein enzyme cũng như nghiên cứu chuyển hóa in vitro vật liệu giàu lignocellulose (Bảng 3.1).

Hình 3.2 Tinh sạch XpoAE từ nấm X polymorpha A35 qua các bước sắc ký lỏng

(A) sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose và (B) sắc ký lọc gel Superdex TM 75; (─) độ hấp thụ ở λ=280 nm

và (●) hoạt tính XpoAE trên cơ chất p-nitrophenyl acetate

6

Bảng 3.1 Các bước tinh sạch enzyme XpoAE

Đặc tính hóa-lý của XpoAE: Điện di SDS-PAGE của phân đoạn III qua các bước tinh sạch ở trên cho thấy

một vạch protein hoạt tính XpoAE sau khi nhộm với Colloidal Blue Staining Kit với trọng lượng phân tử MW =

44 kDa Trong khi đó, điện di điểm đẳng điện IEF cho thấy 2 vạch protein gần kề có giá trị pI lần lượt là 3,5 và

3,6 (Hình 3.3) Đặc tính hóa-lý của XpoAE tương ứng với đặc tính của các AE đã công bố (34-56 kDa).

Hình 3.3 Protein tinh sạch (1,3) biểu hiện hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) trên gel điện di SDS-PAGE (A) và

IEF (B); (2,4) protein marke

Nhiệt độ và pH tối ưu: Để xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu, phản ứng giữa enzyme XpoAE tinh sạch và cơ

chất p-nitrophenyl acetate được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 35-70°C Kết quả cho thấy, hoạt tính XpoAE

tăng dần từ 40% ở nhiệt độ 35°C lên cực đại ở 42°C (100%) Sau đó, khi tăng nhiệt độ thì hoạt tính của enzyme

giảm dần chỉ còn 51% ở 61°C (Hình 3.4-B) Giá trị pH 5,0 thích hợp Hoạt động tương đối giảm dần từ 100% ở

pH 6,5 xuống 57% ở pH 7.0 (Hình 3.4-A).

Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH (A) và nhiệt độ (B) đến hoạt tính enzyme XpoAE tinh sạch

7

Độ bền nhiệt và pH của enzyme XpoAE:

Enzyme tương đối bền ở nhiệt độ 400C sau 3 giờ ủ, sau đó giảm hơn 50% hoạt tính khi ủ thời gian 4 giờ vàlâu hơn Hoạt tính của enzyme giảm nhanh ở 600C và mất hầu hết hoạt tính sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ này Enzymetinh sạch cho thấy bền hoạt tính ở pH 5,0 nhưng mất trên 90% hoạt tính trong thời gian ủ 1 giờ dưới điều kiện

axít mạnh (pH 3; Hình 3.5) Enzyme XpoAE tinh sạch từ nấm X polymorpha A35 tương đối bền trong khoảng

nhiệt độ 40°C ở pH 5

Hình 3.5 Độ bền enzyme XpoAE tinh sạch từ nấm X polymorpha A35 ở các điều kiện nhiệt độ (A) và pH (B)

khác nhau: (A): ♦ 40 o C, ▲60 o C; (B): ▲ pH 3, ● pH 5, ♦ pH 6

3.5.2 Tinh sạch và đặc tính feruloyl esterase của Alt tenuissima SP66 (AltFAE)

Dịch enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau 2 tuần được siêu lọc 10 kDa cut-off, qua đó các protein

và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ cũng được loại bỏ Sau đó, protein enzyme biểu hiện hoạt tính feruloylesterase đối với cơ chất methyl ferulate được tinh sạch bằng sắc ký lỏng Bước đầu tiên của quá trình rửa giảiprotein được thực hiện qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose Sau bước sắc ký thứ nhất độ tinh sạchtăng không đáng kể (từ 1,4 lần) nhưng có thể loại phần lớn các chất mầu (có thể là các hợp chất polyphenolic)khỏi protein hoạt tính FAE đích Tổng thể tích rửa giải của phân đoạn hoạt tính enzyme cao nhất được nạp tiếplên cột SuperdexTM 75 Hiệu quả tinh sạch cao nhất ở bước sắc ký lọc gel này, thể hiện ở độ tinh sạch tăng từ

~12 lên ~30 lần với hiệu suất ~ 44%) Trong khi đó, sử dụng sắc ký trao đổi anion mạnh (Q Sepharose; Hình 3.6) ở bước tiếp theo độ tinh sạch tăng lên 35,8 lần nhưng lượng protein và tổng hoạt tính tương ứng với hiệu suất tinh sạch giảm tới gần ½ (hiệu suất cuối 28,9%; Bảng 3.2) Như vậy, bước tinh sạch cuối cùng cần thiết cho

các nghiên cứu cơ bản (yêu cầu độ tinh sạch tối đa), trong nghiên cứu ứng dụng enzyme AltFAE từ Alt.

tenuissima SP66 có thể sử dụng ngay sau bước sắc ký lọc gel để đảm bảo hiệu suất thu hồi cao và tiết kiệm thời

gian, chi phí.

8

Hình 3.6 Tinh sạch AltFAE từ nấm Alt tenuissima SP66 qua cột sắc ký trao đổi anion Q

Sepharose® (●) Hoạt tính AltFAE đối với cơ chất methyl ferulate, (─) protein hấp thụ ở

SEC SuperdexTM 75

Q Sepharose®

Đặc tính hóa-lý của AltFAE: Điện di SDS-PAGE sau bước tinh sạch cuối cùng qua cột Q Sepharose® cho

thấy một băng protein biểu hiện hoạt tính FAE (cơ chất methyl ferulate) sau khi nhộm với Colloidal Blue

Staining Kit với trọng lượng phân tử MW=30,3 kDa (Hình 3.7).

Hình 3.7 Protein tinh sạch (1) biểu hiện hoạt tính feruloyl esterase (AltFAE) trên

gel điện di SDS-PAGE (A); (2) protein marker

9

Nhiệt độ và pH tối ưu: Nhiệt độ enzyme AltFAE được xác định trong khoảng từ 30-800C và pH từ 4,0-9,0.

Hoạt tính tương đối giảm dần từ 100% ở pH 7.0 xuống 84% ở pH 9.0 (Hình 3.8-A) Enzyme được tinh sạch ổn

định trong suốt 2 giờ ủ ở pH trung hòa với hoạt tính còn lại là 97% ở pH 6.0 và 89% ở pH 8.0 Ngược lại, khi ủ

ở môi trường axit (pH 4.0) làm mất hoạt độ enzyme 57% sau 2 giờ ủ Khi ủ ở 600C làm cho hoạt tính mất hơn50% trong vòng 2 giờ, trong khi hơn một nửa hoạt độ ban đầu vẫn được xác định sau 8 giờ ủ ở 400C, khi nhiệt

độ tăng lên đến 700C hoạt tính enzyme giảm chỉ còn 30% Do vậy, nhiệt độ tối ưu của enzyme AltFAE là 42°C

và pH 7 (Hình 3.8-B).

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) lên enzyme AltFAE

Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ từ 30-80°C và pH từ 4-9 Các thí nghiệm được thực hiện ba lần, độ lệch chuẩn (SD) <5%

Độ bền nhiệt và pH của enzyme AltFAE: Enzyme tương đối bền ở nhiệt độ 250C và 400C sau 2 giờ ủ, sau

đó giảm hơn 10% hoạt tính sau 4 giờ ủ ở 250C và giảm 35% khi ủ lâu hơn 2 giờ ở 400C Hoạt tính của enzymegiảm nhanh ở 60oC và mất hầu hết hoạt tính sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ này Enzyme tinh sạch cho thấy bền hoạt tính

ở môi trường có pH 5 và pH 6 nhưng mất trên 75% hoạt tính trong thời gian ủ 2 giờ dưới điều kiện môi trường

pH 8 (Hình 3.9).

Hình 3.9 Độ bền nhiệt của AltFAE ở nhiệt độ (A) và pH (B) khác nhau theo thời gian

10

(A): 25°C (KH: kim cương), 40°C (KH: vòng tròn), 60°C (KH: tam giác); (B): pH 10 (KH: kim cương),

pH 8.0 (KH: vòng tròn), pH 7.0 (KH: sao), pH 5.0 (KH: tam giác)

Kết quả phân tích peptide của AltFAE: Trình tự chuỗi peptide của protein biểu hiện hoạt tính AltFAE từ nấm Alt tenuissima SP66 được xác định thành công bằng phổ khối lượng ESI-MS (Hình 3.10 & Bảng 3.3) là cơ

sở phân loại ban đầu và có thể sử dụng dữ liệu cho thiết kế mồi (primer) xác định gen mã hóa cho protein này

Hình 3.10 Dữ liệu phổ ESI-MS/MS các đoạn peptide của AltFAE tinh sạch Bảng 3.3 Các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ nấm Alt.tenuissima SP66 xác định bằng thủy phân

với trypsin và LC-ESI-MS/MSPeptide* Trọng lượng phân tử (Da)GAYSLSLR

GFFLFVEGGRGSSIFGLAPGK

GKVALDDLLTQR

LNTLETEEWFFKLNTLETEEWFFK

*Ký hiệu cho các axit amin theo quy định của IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)

3.5.3 Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch esterase từ nấm

+ Tinh sạch enzyme XpoAE từ nấm X polymorpha A35

Quy trình lên men sinh tổng hợp và tinh sạch esterase bao gồm các bước chính sau:

Nuôi cấy nấm và sinh tổng hợp enzyme trên môi trường lên men dịch thể (5 L/mẻ):

Chủng X polymorpha A35 được lên men 5 lít/mẻ trong môi trường cơ bản (cho mỗi 1 lít) với thành phần

như sau: MgSO4: 0,5 g; KH2 PO4: 1,5 g; Cao nấm men: 2,0 g; Dịch nguyên tố vi lượng (vết): 1 mL

Môi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ chất rơm, nguồn nitơ là pepton, nhiệt độ 25oC, pH 7 trong điều kiệnnuôi lắc 200 v/ph, thời gian lên men 10 ngày Song song với quá trình lên men lỏng thì chủng nấm trên cũng được lênmen rắn sử dụng 2-3 kg rơm khô được ngâm trong nước qua đêm sau đó cho vào các túi plastic chịu nhiệt và khửtrùng ở 1210C trong 30 phút Sử dụng 2-3 hộp peptri môi trường thạch-malt có khuẩn ty nấm nghiền đồng thể Tiếptheo, cấy chuyển toàn bộ dịch khuẩn ty vào mỗi túi plastic với cơ chất rơm, toàn bộ quá trình

11

nuôi cấy được thực hiện ở điều kiện vô trùng Khuẩn ty nấm được ủ ở 230C trong khoảng từ 10 - 14 ngày, sau đómôi trường lên men bề mặt được chiết với nước cất (d.H2O) qua đêm trên máy lắc.

Chiết tách dịch enzyme thô bằng siêu lọc:

Sau khi nuôi cấy ở các điều kiện thích hợp trên môi trường rắn và lỏng, enzyme sẽ được lọc sơ bộ qua vảithô và giấy lọc (GF6 và RC 55, WhatmanTM, Trung Quốc) Dịch chiết có hoạt tính esterase được loại khuẩn tynấm và cơ chất bằng ly tâm 5000-10 000 v/ph và siêu lọc 5, 10 và 30 kDa cut-off (hệ LongerPump K235 vớimàng UFP 30MW, Amersham BioScience, Westborough, MA, USA, hoặc Vivaflow200, màng Polyethersulfon10MW, Sartorius, Goettingen, CHLB Đức, hoặc amicon Ultra Centrifugal Filters, 5MW, Millipore, Bedford,USA) ở 11oC

Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký:

Để thu acetyl esterase tinh sạch từ nấm X polymorpha A35 dịch enzyme thô biểu hiện hoạt tính esterase

được tinh sạch qua các bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel sử dụng cột DEAE Sepharose và SuperdexTM

75 (GE Healthcare, Freiburg, CHLB Đức)

Bước đầu tiên được thực hiện trên cột trao đổi ion DEAE Sepharose ở pH 4,5 với đệm Na-acetate 50 mM.Sau khi lọc rửa có thể thu được các phân đoạn hoạt tính với lượng 86,0 mg protein hoạt tính AE (43,2 U)

Bước tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel qua cột SuperdexTM 75 ở pH 6,5 với đệm Na-acetate 50

mM và nồng độ NaCl 100 mM, phân đoạn hoạt tính acetyl esterase (đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate) Các

phân đoạn hoạt tính enzyme được trộn lẫn, cô đặc và thẩm tách qua màng lọc kích thước 10 kDa như trên vớiđệm Na-acetate 10 mM (pH 6,0) và bảo quản ở -200C Sau quá trình tinh sạch thu được 20,6 mg proteinenzyme/mẻ tương đương hoạt tính enzyme tổng là 270 U

Protein sau mỗi bước siêu lọc và sắc ký được đo hoạt độ, đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượngphân tử bằng điện di SDS-PAGE (Novex Xcell SureLock mini cell; Laemmli 1970) và Native-IEF (Novex IEF

gel) (Hình 3.11).

12

Dịch chiết môi trường lên men X.

polymorpha A35