Xác định đặc điểm các điểm đa hình trên gen DKK1 ở phụ nữ mãn kinh có gãy xương cột sống do loãng xương

Mức độ nặng nề của biếnchứng gãy xương trong bệnh loãng xương được xếp tương đương với bệnhmạch vành, tai biến mạch máu não.. Định nghĩa loãng xương Theo Tổ chức Y tế Thế Giới WHO năm 19

ĐẶT VẤN ĐỀ

Loãng xương và gãy xương do loãng xương là một vấn đề y tế quantrọng, được coi là vấn đề sức khỏe cộng đồng đáng được quan tâm trên toàncầu Hậu quả đáng ngại nhất của loãng xương là gãy xương dẫn đến thay đổi

mô hình bệnh tật và làm giảm chất lượng cuộc sống Mức độ nặng nề của biếnchứng gãy xương trong bệnh loãng xương được xếp tương đương với bệnhmạch vành, tai biến mạch máu não Loãng xương là nguyên nhân của hơn 8,9triệu ca gãy xương mỗi năm và dẫn tới mất khoảng 5,8 triệu năm sống có chấtlượng [1] Gãy xương do loãng xương gây tổn thất lớn cho nền kinh tế quốcgia Ở châu Âu năm 2010 số tiền mà xã hội phải chi trả cho bệnh loãng xương

là 37 tỷ Euro [2] Ở Mỹ mỗi năm có khoảng 1,5 triệu ca gãy xương tươngđương với khoảng 17 tỷ đô la chính phủ Mỹ phải chi trả Theo ước tính thìmột nửa số ca gãy cổ xương đùi sẽ xẩy ra ở Châu Á [3],[4] Mặc dù vậy cácnghiên cứu để làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh của loãng xương và gãy xương doloãng xương trên người Châu Á còn hạn chế

Loãng xương là một bệnh được đặc trưng bởi tình trạng mật độ xươngthấp và cấu trúc xương bị suy đồi dẫn tới làm tăng nguy cơ gãy xương [5] Đomật độ xương bằng phương pháp hấp thụ tia X năng lượng kép là tiêu chuẩnvàng để chẩn đoán loãng xương và là yếu tố tốt nhất để tiên lượng nguy cơgãy xương trên cả nam và nữ [6],[7]

Phụ nữ mãn kinh là đối tượng có nguy cơ cao bị loãng xương do buồngtrứng suy giảm chức năng sản xuất hormon estrogen Tại Việt Nam theo số liệucủa Nguyễn Thị Thanh Hương tại Hà Nội năm 2009 tỷ lệ loãng xương ở phụ nữtrên 50 tuổi là 23,1% ở CXĐ và 49,5% ở CSTL Theo Hồ Phạm Thục Lan, phụ

nữ mãn kinh ở thành phố Hồ Chí Minh có tỷ lệ loãng xương CXĐ là 28,6% [8]

Tỷ lệ loãng xương của phụ nữ Việt Nam cao tương đương với phụ nữ da trắng ở

Úc (21%) [11], Mỹ (20%) [12], và cao hơn nhiều so với phụ nữ Đông Á như:Trung Quốc (10%) [13], Nhật Bản (17%) [14], Hàn Quốc (10%) [15].

Nghiên cứu trên các cặp song sinh và phả hệ đã chỉ ra rằng gen quyếtđịnh khoảng 50 - 80% trong sự thay đổi của mật độ xương [16] Tới nay đã có

56 loci được tìm thấy là có liên quan đến sự thay đổi mật độ xương [17], 14loci mật độ xương liên quan đến nguy cơ gãy xương và 6 loci trong số đó đạtmức có ý nghĩa (p<5x108) bao gồm: 18p11.21 (C18orf19), 7q21.3 (SLC25A13),11q13.2 (LRP5), 2q16.2 (SPTBN1), 4q22.1 (MEPE) và 10q21.1 (DKK1)[17] Khi sinh thiết xuyên xương chậu, biểu hiện của năm gen tương quan vớimật độ xương CXĐ và/hoặc CSTL với p<0,001 bao gồm PSME4 (2p16.2),DKK1 (10q21.1), C17orf91 (17p13.3), SOST (17q21.31.1) và DUSP3(17q21.31.1) Trong số đó DKK1 là tương quan đáng kể nhất với MĐX CXĐ(P = 1,3 x 10-3) và MĐX CSTL (p = 3,2 x 10-4) [18] Các nghiên cứu tại TrungQuốc và Iran đưa đến kết luận nồng độ DKK1 huyết thanh của những bệnhnhân là phụ nữ mãn kinh bị loãng xương thì cao hơn phụ nữ mãn kinh không bịloãng xương [64],[65].Tuy nhiên cho tới nay chưa có nghiên cứu nào về đahình gen DKK1 và loãng xương được tiến hành ở Đông Nam Á nói chungcũng như Việt Nam nói riêng Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề

tài: "Xác định đặc điểm các điểm đa hình trên gen DKK1 ở phụ nữ mãn kinh có gãy xương cột sống do loãng xương" với mục tiêu:

1 Xác định kiểu gen DKK1 trên phụ nữ mãn kinh.

2 Mô tả sự liên quan giữa kiểu gen DKK1 với gãy xương cột sống do loãng xương trên phụ nữ mãn kinh.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về bệnh loãng xương

1.1.1 Định nghĩa loãng xương

Theo Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) năm 1993, loãng xương được địnhnghĩa là một bệnh lý của xương, đặc trưng bởi sự giảm khối lượng xương kèmtheo hư biến cấu trúc của xương, dẫn đến tăng tính dễ gãy của xương, tức là

có nguy cơ gãy xương Đến năm 2001 WHO định nghĩa loãng xương, đặctrưng bởi sự thay đổi sức mạnh của xương Sức mạnh này đặc trưng bởi mật

độ xương và chất lượng của xương Chất lượng xương được đánh giá bởi cácthông số: cấu trúc của xương, chu chuyển xương, độ khoáng hóa, tổn thươngtích lũy, tính chất của các chất cơ bản của xương Trong các thông số này chuchuyển xương đóng một vai trò quan trọng

Hình 1.1 Mô xương bình thường và mô xương bị loãng xương

(Nguồn:http://tuoitre.vn/tin/can-biet/20150703/bien-chung-loang-xuong-co-the-gay-tan-tat-suot-doi/770961.html)

1.1.2 Đặc điểm dịch tễ của loãng xương

Loãng xương với hậu quả là gãy xương là một bệnh phổ biến nhất hiệnnay ở người lớn tuổi, chỉ đứng sau bệnh tim mạch [18] Bệnh gây nhiềuhậu quả ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống và là nguyên nhân gia tăng tỷ

lệ tử vong

Loãng xương được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới, trong đó Châu

Âu, Châu Mỹ, Tây Thái Bình Dương và khu vực Đông Nam Á là những nơi

có tỷ lệ loãng xương cao Trên thế giới ước tính có khoảng hơn 200 triệungười bị loãng xương [3]

Ở Châu Âu năm 2010 có khoảng 22 triệu người phụ nữ mắc bệnh loãngxương trong đó 5,5 triệu người trong độ tuổi từ 50 đến 84 tuổi Tỷ lệ tử vong

do gãy xương ở phụ nữ là 50% đối với gãy CXĐ, 28% đối với gãy xương cộtsống và 22% do các gãy xương khác [19] Tại Bỉ năm 2010 có khoảng 60 000người trên 50 tuổi bị gãy xương do loãng xương [20]

Ở Châu Á tại Trung Quốc có 70 triệu người dân trên 50 tuổi bị ảnhhưởng bởi bệnh loãng xương và khoảng 687 000 trường hợp gãy CXĐ xẩy ramỗi năm tại nước này [21] Ở Ấn Độ năm 2003 có khoảng 26 triệu bệnh nhân

bị loãng xương và dự kiến sẽ tăng lên 36 triệu vào năm 2013 [22]

Tại Việt Nam, tỷ lệ loãng xương và gãy xương do loãng xương cao tươngđương với người da trắng và cao hơn so với một số nước Đông Á [9],[23].Theo số liệu của Nguyễn Thị Thanh Hương tại Hà Nội năm 2009 tỷ lệ loãngxương ở phụ nữ trên 50 tuổi là 23,1% ở CXĐ và 49,5% ở CSTL [23] Tỷ lệloãng xương của nam giới là 8,5% ở cổ xương đùi và 12,4% ở đốt sống thắtlưng [24] Nhìn chung tỷ lệ loãng xương nguyên phát giữa nữ và nam là 4:1[26] Nghiên cứu của tác giả Hồ Phạm Thục Lan tại thành phố Hồ Chí Minhnăm 2011 thì tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ trên 50 tuổi ở CXĐ là 28,6% [8] Các

số liệu về tỷ lệ loãng xương của phụ nữ mãn kinh người Việt tại Hà Nội, thànhphố Hồ Chí Minh đều cao hơn Trung Quốc (10%), Nhật Bản (17%), Hàn Quốc(10%) và tương đương với người da trắng ở Úc (21%) và ở Mỹ (20%).

Khi tập trung nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến mật độ xươngnhư lối sống, hormon sinh dục (estrogen và testosterone), vitamin D, pháthiện ra rằng có sự khác biệt giữa dân cư thành thị và nông thôn Cư dân ởthành thị có mật độ xương thấp hơn và loãng xương nhiều hơn ở nông thôn[24] Các nghiên cứu về loãng xương cũng chỉ ra rằng tuổi càng cao mật độxương càng giảm, tỷ lệ gãy xương do loãng xương cũng tăng theo độ tuổi[25] Các nghiên cứu trên phụ nữ có thiếu hụt estrogen như phụ nữ sau mãnkinh, mãn kinh sớm, phụ nữ bị cắt buồng trứng trước 45 tuổi cho thấy tỷ lệloãng xương tăng cao [27] Tuy nhiên, nếu xem xét trong mô hình phân tích

đa biến thì tất cả các yếu tố như tuổi, cân nặng, lối sống, hormone cũng chỉgiải thích được 15% - 50% sự thay đổi của mật độ xương [24] Kết quả nàyphù hợp với kết quả nghiên cứu song sinh và phả hệ là gen quyết định 50% -85% sự thay đổi của mật độ xương [16],[27]

1.1.3 Nguyên nhân và phân loại loãng xương

Loãng xương được chia làm hai loại là loãng xương nguyên phát vàloãng xương thứ phát Loãng xương nguyên phát bao gồm loãng xương saumãn kinh (typ 1) và loãng xương tuổi già (typ 2)

1.1.3.1 Loãng xương nguyên phát: (chiếm khoảng 80%) Là loại loãng xương

không tìm thấy căn nguyên nào khác và/hoặc tình trạng mãn kinh ở phụ nữ.Nguyên nhân do quá trình lão hóa của tạo cốt bào, làm xuất hiện tình trạngmất cân bằng giữa hủy xương và tạo xương gây nên tình trạng suy giảm mật

độ xương và hư hỏng cấu trúc xương, làm gia tăng nguy cơ gãy xương Loãngxương nguyên phát được chia thành 2 typ

* Loãng xương sau mãn kinh - typ 1: Thường gặp ở phụ nữ đã mãn kinhvài năm hoặc cắt buồng trứng, khoảng từ 50 đến 60 tuổi.

Mãn kinh được định nghĩa là sự chấm dứt vĩnh viễn kinh nguyệt và khảnăng sinh sản do việc mất hoạt tính nang buồng trứng Mãn kinh tự nhiênđược công nhận là đã xẩy ra sau 12 tháng liên tiếp vô kinh mà không có bất

kỳ nguyên nhân sinh lý hoặc bệnh lý nào khác

Nguyên nhân chủ yếu của loãng xương sau mãn kinh là do sự thiếu hụtestrogen, ngoài ra có sự giảm tiết Parathyroid hormon (PTH), tăng thải canxiqua nước tiểu [25] Tổn thương chủ yếu là mất chất khoáng ở xương xốp, biểuhiện bằng sự gãy lún các đốt sống hoặc đầu dưới xương quay [18]

Quá trình phát triển của xương phải trải qua hai giai đoạn: Tạo mô hình vàtái tạo mô hình để biệt hóa các nhóm tế bào xương giúp cho sự tạo thành xươnghoặc làm mới xương [32] Tạo mô hình là quá trình chu chuyển xương lúc cònnhỏ để tạo hình dạng và chiều dài xương Tái tạo mô hình là quá trình xươngliên tục sữa chữa và tự làm mới để duy trì mật độ xương ở mức tối thiểu

Tế bào hủy xương, tế bào tạo xương, cốt bào và các tế bào liên kết lànhững tế bào tham gia vào quá trình tạo xương

Hormon sinh dục estrogen và testosteron đóng vai trò quan trọng trongquá trình tạo xương ở cả nam và nữ [29],[30] Hormon estrogen do tế bào hạtcủa buồng trứng bài tiết ra tác động đến xương thông qua thụ thể estrogen [30],[31] Ảnh hưởng của estrogen là làm giảm số lượng và ức chế hoạt động của tếbào hủy xương, dẫn đến kìm hãm quá trình phân hủy xương trong mọi giaiđoạn của quá trình tái tạo mô hình [27] Vì một lý do nào đó lượng estrogen bịsụt giảm đột ngột và trầm trọng, các tế bào hủy xương thoát khỏi sự kìm hãm

về số lượng và hoạt động dẫn đến mất cân bằng giữa hai quá trình tạo xương vàhủy xương, quá trình hủy xương mạnh hơn làm cho lượng khoáng trong xương

bị suy giảm, xẩy ra tình trạng mất xương và loãng xương

Estrogen tồn tại trong cơ thể người gồm ba dạng chính là estradiol,estron và estriol Trước thời kỳ mãn kinh 95% lượng estradiol trong máu dobuồng trứng bài tiết, một phần nhỏ do chuyển hóa từ estron dưới tác dụng củaandrogen vỏ thượng thận Khi phụ nữ mãn kinh tức là buồng trứng giảm tiết

và dần đi đến ngừng hoạt động do đó sẽ ảnh hưởng đến quá trình bài tiếtestrogen Nồng độ estradiol, estron giảm rõ trong 12 tháng đầu tiên sau mãnkinh và tiếp tục giảm với tốc độ chậm hơn trong những năm tiếp theo

Androgen tác động lên xương thông qua cơ chế chuyển androgen thànhestrogen tại chỗ và một phần thông qua tác động trực tiếp của androgen lênxương Tác dụng chủ yếu của androgen là kích thích quá trình phân chia tếbào tạo xương và ức chế quá trình chết theo chương trình [28] Huber và cộng

sự nghiên cứu năm 2001 đã tìm thấy sự có mặt của các recepter đặc hiệuandrogen trên tế bào tạo xương được nuôi cấy [28] Năm 2004, Vanderschueren

và cộng sự đã nghiên cứu và cung cấp thêm bằng chứng củng cố cho tác dụngtrực tiếp của androgen lên xương khi cho chuột điều trị bằng dihydrotestosteron

đã cho kết quả làm tăng tạo xương

Năm 2014 Nguyễn Thị Thanh Hương và cộng sự đã công bố sự thay đổicủa nồng độ estrogen và testosteron huyết thanh toàn phần của nam và nữngười Việt tuổi từ 18 đến 83 Ở phụ nữ người Việt, nồng độ estrogen tươngđối hằng định trước tuổi 40, sau đó giảm rõ rệt trong giai đoạn từ 40 đến 60tuổi, sau tuổi 60 thì đạt giá trị hằng định thấp Trong khi đó nồng độtestosteron toàn phần giảm rõ rệt theo tuổi, xung quanh tuổi 50 nồng độtestosteron chỉ bằng một nửa so với tuổi 20 Đồng thời kết quả nghiên cứunày cũng cho thấy cả hai hormon sinh dục đều có ý nghĩa thống kê trong môhình tiên lượng MĐX ở cả nam và nữ [33]

Mối liên quan giữa loãng xương và mãn kinh đã được biết đến từ lâu.Trước mãn kinh MĐX ở cổ xương đùi giảm 30% và sẽ tiếp tục giảm thêm

25% ngay sau mãn kinh Mức độ mất xương ở cột sống là khoảng 5-7%mỗi năm và khoảng 93-95% diện tích các khoang hủy xương được thaythế xương mới [34] Như vậy càng ngày các bè xương càng mỏng dần,xuất hiện các khoảng trống và có thể mất hết các bè xương Vỏ xươngmỏng dần và trở nên xốp, làm thay đổi cấu trúc xương dẫn đến loãngxương [34].

* Loãng xương tuổi già - typ 2: Thường gặp ở cả nam và nữ trên 70tuổi Là hậu quả của sự mất xương trong nhiều năm, liên quan đến 2 yếu tốgiảm hấp thu canxi ở ruột và giảm chức năng của tế bào tạo xương gâycường cận giáp thứ phát làm tăng bài tiết canxi qua nước tiểu Tổn thươngmất chất khoáng toàn thể cả xương xốp và xương đặc, biểu hiện chủ yếu làgãy CXĐ

* Các yếu tố nguy cơ gây loãng xương: Tuổi, oestrogen, yếu tố dinhdưỡng, tình trạng vận động, yếu tố di truyền và các bệnh lý ảnh hưởng đếnmật độ xương

- Gene quyết định 50-85% mật độ xương

Nghiên cứu các gen cấu trúc của các bệnh phổ biến và phức tạp đã đạtđược những bước đột phá trong khoảng 5 năm gần đây với sự ra đời củagenome-wide [35] Những hiểu biết mới về gen sẽ làm sáng tỏ bản chất cơchế bệnh sinh giúp chúng ta xây dựng chiến lược đánh giá nguy cơ và đưa rađược những giải pháp can thiệp mới Nghiên cứu trên các cặp song sinh vàphả hệ đã chỉ ra rằng gen quyết định khoảng 50-85% trong sự thay đổi củamật độ xương [16] Tuy nhiên gãy xương do loãng xương di truyền theo cơchế không hoàn toàn phụ thuộc vào mật độ xương [36] Hiện nay đã tìm thấy

56 loci liên quan đến sự thay đổi mật độ xương trong đó có 14 loci mật độxương liên quan đến gãy xương và 6 loci trong số đó đạt mức có ý nghĩa

(p<5x108) bao gồm: 18p11.21 (C18orf19), 7q21.3 (SLC25A13), 11q13.2(LRP5), 2q16.2 (SPTBN1), 4q22.1 (MEPE) và 10q21.1 (DKK1) [17].

- Dựa vào Hiệp hội Loãng xương Quốc (IOF) tế ta có bảng đánh giánguy cơ loãng xương trên cơ sở trả lời các câu hỏi sau:

1 Cha mẹ bạn có bị gãy cổ xương đùi sau chấn thương rất nhẹ không?

2 Bản thân bạn có bị gãy cổ xương đùi sau chấn thương rất nhẹ không?

3 Bạn đã từng dùng cortisol, prednisolon trên 3 tháng?

4 Chiều cao của bạn có bị giảm trên 3 cm?

5 Bạn có thường xuyên uống rượu không?

6 Bạn có hút trên 20 điếu thuốc lá mỗi ngày không?

7 Bạn có thường bị tiêu chảy không?

8 Bạn đã mãn kinh hoặc cắt bỏ buồng trứng trước 45 tuổi?

9 Bạn có mất kinh trên 12 tháng (không liên quan đến thai kỳ) không?

10 Riêng đối với nam: Bạn có bị bất lực, giảm ham muốn tình dục hoặc

có các tình trạng liên quan đến giảm testosteron ?

Càng có đồng thời nhiều yếu tố nguy cơ, khả năng loãng xương và/hoặc

có nguy cơ gãy xương càng lớn

1.1.3.2 Loãng xương thứ phát

Là loại loãng xương tìm thấy nguyên nhân do một số bệnh hoặc một sốthuốc gây nên như: Cường vỏ thượng thận, dùng nội tiết tố thượng thận kéodài, cường giáp trạng, cường cận giáp, thiếu calci, suy sinh dục rối loạn hấpthu, đa u tủy xương

1.1.4 Chẩn đoán loãng xương

1.1.4.1 Triệu chứng lâm sàng

Loãng xương là bệnh diễn biến âm thầm không có triệu chứng lâmsàng đặc trưng mà các triệu chứng đầu tiên có thể là biến chứng của loãngxương

* Xẹp đốt sống: Khi đốt sống bị xẹp sẽ xuất hiện triệu chứng đau, đauxuất hiện tự nhiên hoặc liên quan đến gắng sức, cũng có thể đau sau chấnthương nhẹ Đau cột sống khởi phát đột ngột, cấp tính, không có triệu chứngchèn ép thần kinh kèm theo, đau không lan, giảm khi nằm và giảm dần rồibiến mất trong vài tuần Tuy nhiên một tỷ lệ rất lớn bệnh nhân không có biểuhiện đau khi xẹp đốt sống

* Rối loạn tư thế cột sống: Cột sống có thể bị biến dạng đặc biệt là khixẹp nhiều đốt sống, bệnh nhân gù cong đoạn cột sống lưng, thắt lưng có thểtới mức các xương sườn 10-12 cọ sát vào thành chậu và bệnh nhân giảmchiều cao Khi có biến dạng cột sống thắt lưng thì bệnh nhân sẽ đau cột sống

*Gãy xương: Các vị trí thường gặp là đầu trên xương đùi, đầu trên xươngcánh tay, đầu dưới xương cẳng tay, xương chậu, xương sườn và xương cùng

1.1.4.2 Triệu chứng cận lâm sàng

* X- quang

- Giai đoạn sớm là hình ảnh đốt sống tăng thấu quang đồng nhất hoặc cóthể thấy hình ảnh đốt sống hình răng lược tức là chỉ mất các bè xương ngangcòn lại bè dọc

- Giai đoạn muộn ngoài hình ảnh đốt sống tăng thấu quang có thể thấybiến dạng cột sống,

Hiện nay có nhiều phương pháp để chẩn đoán gãy xương trên X-Quang+ Sử dụng thang bán định lượng Genant, phương pháp này đánh giá bằngcách quan sát chiều cao, ước lượng sự giảm chiều cao và thay đổi hình dángđốt sống [69]

Đốt sống được xác định là bị lún ép khi chiều cao bờ trước hoặc bờ giữanhỏ hơn chiều cao bờ sau của thân đốt sống từ 20% trở lên, hoặc chiều cao

của bờ sau thân đốt sống nhỏ hơn từ 20% trở lên so với chiều cao của thân đốtsống kề cạnh Nếu chỉ giảm chiều cao bờ giữa thân đốt sống gọi là lún ép kiểulõm 2 mặt, nếu chiều cao cả bờ trước và bờ sau đều giảm so với đốt sống kềcạnh thì gọi là lún xẹp đốt sống

INCLUDEPICTURE

"http://www.iofbonehealth.org/sites/default/files/osteofound/filemanager/health_professionals/images/vert_fract_grading.gif" \* MERGEFORMAT

- Độ 0: Bình thường

- Độ 1: Biến dạng nhẹ: giảm chiều cao đốt sống từ 20-25%.

- Độ 2: Biến dạng trung bình: giảm chiều cao đốt sống từ 25-40%.

- Độ 3: Biến dạng nặng: giảm chiều cao đốt sống trên 40%.

Hình 1.2 Phân loại gãy xương cột sống qua đánh giá bằng X- quang

(chỉ số Genant)

+ Thang định lượng: Phương pháp này khắc phục được tính ước lượngcủa thang bán định lượng Phương pháp này tính cụ thể chiều cao đốt sốngtrước (Ha), giữa (Hm) và sau (Hp) bằng cách đặt 6 điểm trên phim, 3 điểm ởđĩa cùng trên và tương ứng với 3 điểm ở đĩa cùng dưới Từ đó suy ra tỷ lệ(Ha/Hp, Hm/Hp, Hp(n)/Hp(n-1), Hp(n)/Hp(n+1)), so sánh với giá trị thamchiếu của người bình thường và đưa ra kết luận, là gãy xương khi thay đổi lớn

hơn 3 lần độ lệch chuẩn.

Hình1.3 Cách xác định 3 trục đốt sống

Bảng 1.1 Bảng giá trị tham chiếu người Việt [71]

Triệu chứng âm tính quan trọng trên X-quang là không có tổn thương hủyxương ở đốt sống, khe liên đốt sống không bị hẹp, các cung sau gần như bìnhthường.

* Đo mật độ xương: Từ năm 2002 các hội nghị quốc tế về loãng xương

đã thống nhất quan điểm về giá trị các loại máy đo mật độ xương, chỉ có sửdụng máy đo hấp thụ tia X năng lượng kép (DEXA-Dual Energy X-rayAbsorptiometry) tại các vị trí trung tâm như CSTL, CXĐ mới có giá trịchẩn đoán

* Các xét nghiệm sinh hóa

Trong loãng xương nguyên phát xét nghiệm hội chứng viêm, bilanphospho- calci bình thường

Ngay sau khi xuất hiện một lún xẹp đốt sống mới, tốc độ máu lắng giờđầu có thể tăng tới 30mm, phosphatase kiềm tăng thoáng qua, song các chỉ sốnày sẽ trở về bình thường trong vòng 1 tuần

1.1.4.3 Chẩn đoán xác định

Hiện nay trên lâm sàng tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh loãng xương

là dựa vào đo mật độ xương bằng phương pháp hấp thụ tia X năng lượng képtại các vị trí trung tâm như CXĐ và CSTL Tiêu chuẩn chẩn đoán loãngxương của WHO dựa vào mật độ xương (BMD- Bone Mineral Density) tínhtheo T-score T- score của một cá thể là chỉ số mật độ xương BMD của cá thể

đó so với BMD của nhóm người trẻ tuổi làm chuẩn

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương của WHO 1994 dựa vào

mật độ xương tính theo T-score

T-score >(-1,0) Bình Thường

(-2,5) < T-score ≤ (-1.0) Thiểu xương

T-score ≤ (-2,5) và có gãy xương Loãng xương nặng

Trích từ nguồn WHO 1994

Chỉ số T trong thực tế là số đo lệch chuẩn của MĐX hiện tại với MĐXtối đa MĐX tối đa phải được tính trong một quần thể mang tính đại diện caocho một dân tộc Chỉ số T được tính theo công thức sau:

T= iMĐX – pMĐX SD

Trong đó: iMĐX là MĐX của đối tượng i

pMĐX là MĐX trung bình của quần thể trong độ tuổi từ 20-40

SD là độ lệch chuẩn của MĐX trung bình của quần thể trong độ

tuổi 20-40Giá trị pMĐX của trung bình trong quần thể ở các quốc gia khác nhau làkhác nhau Do vậy để có thể chẩn đoán chính xác một người Việt Nam bịloãng xương cần áp dụng giá trị tham chiếu của người Việt Nam (bảng 1.2 )

Bảng 1.3 Mật độ xương đỉnh trung bình (g/cm 2 ) trong quần thể của phụ nữ

Việt Nam đo bằng máy Hologic [70]

1.2 Tổng quan nghiên cứu về DKK1

1.2.1 Vị trí và cấu trúc của gen DKK1

Ở người gen DKK1 nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 10 tại vị trí10q21.1 từ nucleotid 52314281 đến nuceotid 52317657

Hình 1.4 Vị trí cấu trúc gen DKK1 trên nhiễm sắc thể 10.

(Nguồn từ NCBI)

1.2.2 Chức năng sinh hóa của protein DKK1

Protein DKK1 thuộc gia đình Dickkopf gồm DKK1-4 Protein DKK1 cókích thước 266aa với khối lượng phân tử 28.672 Da

DKK1 là một glycoprotein đối kháng đường truyền tín hiệu Wnt catenin

và disheveled Wnt tín hiệu catenin là trung tâm của sự phát triển xương Điềuchỉnh tín hiệu Wnt bằng cách gắn vào các dòng thụ thể Wnt lipoprotein liên quanđến LRP5-6 và Kremen 1-2 DKK1 đối kháng tín hiệu Wnt có vai trò quan trọngcho sự phát triển của phôi thai có xương sống, tham gia vào trung bì và hìnhthành đốt sống, ngoại bì để tạo khuôn mẫu chi và tăng trưởng DKK1 thamgia trong điều chỉnh mật độ xương, tăng trưởng tóc, liên quan đến viêm loét,

ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư trong đa u tủy xương, ung thư vú, ung thưtiền liệt tuyến (cùng với P53 là một chất ức chế khối u) [61],[62],[63]

Cơ chế để DKK1 đối kháng tín hiệu Wnt còn chưa rõ ràng Một số tác giảcho rằng DKK1 ái lực cao với LRP6/LRP5 và thúc đẩy chúng thoái hóa do đógiảm mức độ LRP6/LRP5 trên bề mặt tế bào nên không đáp ứng với proteinWnt Một số tác giả khác lại cho rằng DKK1 ràng buộc để phá vỡ LRP6Wnt/LRP5Wnt gây ra Frizz Led-LRP6/LRP5 và ức chế tín hiệu Wnt [61] DKK1 điều chỉnh sự phát triển của xương và duy trì khối lượng xương.Ảnh hưởng qua lại của DKK1 và LRP6/LRP5 là cơ chế đặc trưng nhất điều

chỉnh tín hiệu Wnt trong xương ở người Dữ liệu di truyền ảnh hưởng củaDKK1 về khối lượng xương được hỗ trợ bởi các thí nghiệm trên chuộtOvariectoniezed đã khẳng định DKK1 làm tăng tác dụng của sự thiếu hụtestrogen và glucocorticoid trên trọng lượng xương DKK1 là yếu tố quyếtđịnh chính của trọng lượng xương và khớp trong các bệnh lý khớp ProteinDKK1 tăng trong nguyên bào sợi hoạt dịch và tăng trong huyết thanh củabệnh nhân viêm khớp dạng thấp Tác dụng của DKK1 trên xương thông qua

ức chế tín hiệu Wnt dẫn đến suy giảm hình thành xương mới và đồng thờikích hoạt hoạt động của tế bào hủy xương gây tiêu xương [61],[62]

Hình 1.5 Cơ chế DKK1 điều chỉnh sự phát triển và duy trì khối lượng xương

(Nguồn từ NCBI)

Gen DKK1 biểu hiện ở mức độ thấp nhất trong hầu hết các mô củangười bình thường Nó biểu hiện trong các giai đoạn khác nhau của khối utrong ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, đại trực tràng, thực quản, phổi, đa u

tủy xương DKK1 thúc đẩy sự tái hấp thu xương và tạo thuận lợi cho việcchuyển đổi di căn của tế bào tạo xương.

1.3 Tình hình nghiên cứu về mối liên quan giữa gen và loãng xương, gãy xương

Các nghiên cứu về gen liên quan đến loãng xương và gãy xương đã đượctiến hành ở một số nước trên thế giới Nghiên cứu trên toàn bộ gen của KarolEstrad và cộng sự năm 2012 đã xác định 56 loci liên quan với MĐX, 14 lociliên quan đến nguy cơ gãy xương [17] Trong đó, 6 loci có sự liên quan caonhất với (p<5x108) bao gồm: 18p11.21 (C18orf19), 7q21.3 (SLC25A13),11q13.2 (LRP5), 2q16.2 (SPTBN1), 4q22.1 (MEPE) và 10q21.1 (DKK1)[17] Khi sinh thiết xuyên xương chậu và phân tích Karol Estrad và cộng sự

đã nhận thấy biểu hiện của năm gen tương quan với mật độ xương CXĐvà/hoặc CSTL với p<0,001 bao gồm PSME4 (2p16.2), DKK1 (10q21.1),C17orf91 (17p13.3), SOST (17q21.31-1) và DUSP3 (17q21.31-1) Trong số

đó DKK1 là tương quan đáng kể nhất với MĐX CXĐ (P = 1,3 x 10-3) vàMĐX CSTL (P = 3,2 x 10-4) [17]

Theo Jun Jian và cộng sự năm 2015 ở Trung Quốc khi nghiên cứu trên

350 bệnh nhân là phụ nữ mãn kinh loãng xương và 150 người bình thường thìthấy nồng độ huyết thanh DKK1 của nhóm bệnh nhân lớn hơn nhóm chứngvới p< 0,001 Phân tích hồi quy đa biến cho thấy DKK1 tương quan nghịchvới catenin ( =-0,165; P = 0,009) và BMD ( = -0,139; p = 0,027) [64].

Ở Iran năm 2013, Mehrzad Hajialilo và cộng sự nghiên cứu trên 44 phụ

nữ mãn kinh loãng xương và 44 phụ nữ bình thường cho kết quả nồng độDKK1 của nhóm bệnh là (2,91 �1,27) cao hơn đáng kể so với nhóm chứng

rs112910014, rs1569198, rs74711339 và rs2241529 đi đến kết luận không có

sự tương quan giữa 6 biến thể của DKK1 với loãng xương [66]

Tại Trung Quốc khi nghiên cứu trên 192 bệnh nhân bị chứng loạn sảnkhớp hông (DDH) và đối chứng với 191 người bình thường tác giả LiuShengnan và cộng sự đã kết luận DKK1 có liên quan đến sự phát triển củaDDH đặc biệt là các tần số alen A tai rs1569198 [67]

Theo Piters E và cộng sự (2010) nghiên cứu trên 783 nam giới da trắng từ20-29 tuổi, kết quả không tìm thấy mối liên quan giữa DKK1 và BMD nhưng có

sự liên quan giữa rs1569198 với chiều dài trục hông (p = 0,012) [68]

1.4 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong phát hiện đột biến gen

1.4.1 Kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tínhcủa DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNApolymerase Với nguyên liệu là 4 loại nucleotid, enzyme DNA polymerasexúc tác sự tổng hợp một mạch AND mới từ mạch khuôn Phản ứng đòi hỏi sự

có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu củatrình tự AND khuôn

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau mỗi chu kỳ gồm

3 bước:

- Bước 1: Là giai đoạn biến tính Trong một dung dịch phản ứng baogồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ởnhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thường là 940 C-95 0 C trongvòng 30-60 giây

- Bước 2: Là giai đoạn bắt cặp Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồicặp với khuôn, dao động trong khoảng 400C-700C tùy thuộc vào nhiệt độ nóngchảy của các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây

- Bước 3: Là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài Nhiệt độ được tăng lên

720C để DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian phụ thuộcvào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại.

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới được tạo thành sẽ tiếp tục đượcdùng để làm các DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới cho chu kỳ tiếptheo Sản phẩm cuối cùng của phản ứng PCA là đoan DNA chuỗi đôi có chiềudài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sảnphẩm được xác định bằng đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi Số lượngmỗi chu kỳ phản ứng PCA phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA ban đầu,thường không vượt quá 40 chu kỳ Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi lượngmẫu của lần trước Như vậy sau n chu kỳ, từ một DNA đích đã nhân lên đượcthành 2n bản sao Nhờ vậy đủ số lượng DNA để có thể tách ra khi điện di, pháthiện được sau khi nhuộm và để tạo dòng hoặc giải trình tự Trong quá trìnhthực hiện phản ứng PCA, ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng nhưng lượngmồi tự do giảm, enzym hoạt động yếu dần do đó cần tính toán lượng mồi vàenzyme để đảm bảo phản ứng PCR cho kết quả tốt nhất [72]

1.4.2 Kỹ thuật RFLP-PCR

Kỹ thuật RFLP-PCR là phương pháp nghiên cứu tính đa hình chiều dàicủa các phân đoạn AND dựa trên điểm cắt của các enzym giới hạn Nói cáchkhác đây là phương pháp so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắtmẫu bằng một enzyme giới hạn nhằm tìm hiểu xem có hay không đột biếnđiểm hoặc có hay không sự thay đổi một trình tự DNA Nếu trình tự DNA củahai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số lượng và kích thước thì có sựgiống nhau về các băng DNA sau khi chạy điện di Ngược lại nếu có sự xuấthiện đột biến điểm hoặc thay đổi trình tự đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sựkhác nhau về các băng DNA

Quá trình thực hiện kỹ thuật gồm các giai đoạn:

* Phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để khuyếch đại đoạn DNA chứaSNP cần phân tích

* Tiến hành phân cắt đoạn DNA với một enzyme giới hạn thích hợp

* Điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết luận

- Enzym giới hạn: Là một enzyme quan trọng trong vác enzymeendonuclease tác động lên phân tử DNA và có đặc điểm là cắt DNA ở những

vị trí xác định Cho đến nay người ta đã biết trên 500 loại enzyme giới hạnkhác nhau, nhưng chúng đều có cùng chung đặc điểm:

+ Đều được chiết tách từ vi khuẩn và mang tên enzyme mang vi khuẩn.+ Cắt phân tử DNA xoắn kép ở những trình tự base đặc hiệu với từngloại enzyme

+ Vị trí cắt thường có 4-8 nucleotid, đặc trưng quan trọng nhất của trình

tự giới hạn là đoạn DNA gồm 4-8 cặp nucleotide này có trình tự giống nhaukhi đọc theo chiều 3’-5’ và 5’-3’ Vì vậy vị trí cắt của enzyme giống nhau trên

cả hai mạch

+ Sau khi cùng bị cắt với cùng loại enzyme giới hạn, các sợi đơn DNA

có các đầu kết dính với các nucleotide bổ sung cho nhau

- Điện di DNA: Acid nucleotide là các đại phân tử tích điện âm, trongđiện trường có điện thế và cường độ thích hợp, DNA di chuyển từ cực âm đếncực dương của điện trường Để kiểm tra và xác định tính chất của DNA, cầnđiện di DNA trên gel Phân tử DNA càng nhỏ di chuyển càng nhanh Tùy theochiều dài của sản phẩm mà chọn nồng độ gel thích hợp, thường dao độngtrong khoảng 0,8-3% Để quan sát hình ảnh DNA khi điện di, người ta nhuộmDNA bằng Redsafe/Ethidium bromide, dưới ánh sang tử ngoại, DNA gắn vớiRedsafe/Ethidium bromide sẽ phát quang Khi cho chạy điện di DNA nghiêncứu thường có DNA mẫu cùng chạy để so sánh, xác định kích thuwocscuarđoạn DNA [73]

1.4.3 Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp

DNA là cơ sở của gen Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của haimạch đơn được tạo thành từ 4 loại nucleotid A, C, T, G Các nucleotid nàyliên kết với nhau theo một trật tự xác định Giải trình tự của một gen tức làphát hiện thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotid này trên phân tử DNA.

Có nhiều phương pháp giải trình tự gen như: giải trình tự gen bằng phươngpháp hóa học, phương pháp enzyme và bằng máy tự động Trong nghiên cứu nàychúng tôi sử dụng sử dụng phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động ABIPRISM 373xl Genetic Analyzer của Applied Biosystems, USA

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

- Khoa Cơ Xương Khớp Bệnh viện Bạch Mai

- Bộ môn Sinh Lý trường Đại Học Y Hà Nội

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 10/2015 đến tháng 10/2016

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

2.1.3.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

Đối tượng nghiên cứu là phụ nữ từ 40 tuổi trở lên đã mãn kinh (mấtkinh liên tục từ 12 tháng trở lên) Tất cả đối tượng được đo MĐX và chụp

X-Quang CSL, CSTL.

MĐX được đo ở CXĐ bên phải và CSTL từ L1 đến L4 Được chẩn đoánloãng xương nếu có chỉ số T- score ≤ (-2,5) ở CXĐ và CSTL X-Quang chẩnđoán gãy xương cột sống theo chỉ số Genant Dựa vào kết quả đo MĐX vàX-Quang các đối tượng được lựa chọn để nghiên cứu tiếp sẽ được phân thành

3 nhóm:

- Nhóm bệnh nhân loãng xương có gãy xương cột sống

- Nhóm bệnh nhân loãng xương không gãy xương cột sống

- Nhóm bệnh nhân không loãng xương và không gãy xương cột sống

Cả ba nhóm bệnh nhân sẽ được phỏng vấn theo bộ câu hỏi sàng lọc,thăm khám lâm sàng theo một mẫu bệnh án nghiên cứu thống nhất bao gồm:

chiều cao, cân nặng, BMI, các yếu tố nguy cơ loãng xương, tiền sử và cácbệnh kèm theo (phụ lục 1) Các bệnh nhân sẽ được lấy máu làm công thứcmáu, các chỉ số sinh hóa thường quy.

2.1.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân không có đầy đủ các tiêu chuẩn trên

- Bệnh nhân có bệnh mạn tính như bệnh gan, bệnh thận, ung thư, cácbệnh nội tiết và các rối loạn chuyển hóa liên quan đến vitamin D, chuyển hóaxương như đái tháo đường, béo phì, hội chứng kém hấp thu, bệnh cường giáptrạng, hội chứng Cushing

- Bệnh nhân sử dụng các loại thuốc liên quan đến chuyển hóa vitamin D

và calci trong vòng 6 tháng như: corticoid, hormon thay thế, heparin

- Bệnh nhân có tiền sử bất động lớn hơn 1 tháng

- Bệnh nhân bị cắt bỏ tử cung, buồng trứng, đang mang thai , cho con bú

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Sử dụng thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang có đối chứng

2.2.2 Cỡ mẫu

Cỡ mẫu thuận tiện, dự kiến mỗi nhóm lấy 60 bệnh nhân

2.2.3 Quy trình nghiên cứu

2.2.3.1 Quy trình lấy máu

Tất cả các đối tượng thõa mãn nghiên cứu được lấy bệnh phẩm là 2 mlmáu tĩnh mạch ngoại vi, chống đông bằng EDTA Bệnh phẩm lấy buổi sáng,

lúc đói, sau đó 300 microlit máu chống đông được sử dụng để tách chiếtDNA Số còn lại và bệnh phẩm chưa phân tích ngay sẽ được bảo quản trong

3 chùm tia hình dẻ quạt góc rộng, có hệ thống tự động định kích cỡ Mức sai

số 1% Khoảng cách các vùng quét 1mm Thời gian quét 5-7 phút Liều tiathấp 2-4 mrem Nguồn điện sử dụng là 100VAC-5A-60H Bảo quản máy ởnhiệt độ 18-270C

* Vị trí đo và phân tích kết quả: tại CSTL và CXĐ

- Tại CSTL: Đo ở 4 vị trí từ L1 đến L4 Khối lượng xương được đo ởmặt cắt theo chiều trước sau ở vùng tương ứng với vùng đo MĐX Kết quảcuối cùng được tính bằng trung bình cộng của các chỉ số vùng đo MĐX hiểnthị bằng chỉ số T do máy tự động tính theo công thức của WHO

- Tại CXĐ: Đo ở 4 vị trí là CXĐ, tam giác Ward, mấu chuyển lớn, liênmấu chuyển Khối lượng xương được đo ở mặt cắt theo chiều trước sau ởvùng tương ứng với vùng đo MĐX Kết quả cuối cùng được tính bằng trungbình cộng của các chỉ số vùng đo MĐX hiển thị bằng chỉ số T do máy tựđộng tính theo công thức của WHO

Chỉ số T cho nghiên cứu của chúng tôi được tính như sau: Khi có kết quảiMĐX chúng tôi tiến hành tính lại chỉ số T với pMĐX và SD được sử dụngtheo giá trị tham chiếu của người Việt Nam

2.2.3.3 Quy trình chụp XQ và phân loại gãy xương cột sống theo chỉ số Genant

* Thiết bị sử dụng: Máy DR TITAN 2000 Dual CCD - Hàn Quốc

Bệnh nhân sẽ được chụp 2 phim ở tư thế nghiêng 90 độ, một phim cộtsống lưng từ D4-D12, một phim CSTL từ D12-L5

* Phân tích kết quả: Sử dụng phần mềm Image J 1.44 để đo và chẩn đoángãy xương theo Genant

Ở mỗi đối tượng nghiên cứu chúng tôi đo chiều cao của 14 đốt sống (9đốt sống ngực từ D4 đến D12, 5 đốt sống thắt lưng từ L1 đến L5)

Trên X-Quang nghiêng thân đốt sống được chia thành 3 trục: trước, giữa

và sau bằng cách đặt 6 điểm trên phim, 3 điểm ở đĩa cùng trên và tương ứngvới 3 điểm ở đĩa cùng dưới Image J sẽ cho kết quả cụ thể chiều cao thân đốtsống ở bờ trước (Ha), bờ giữa (Hm), bờ sau (Hp)

Nguyên tắc đặt điểm: 2 điểm bên ở tận cùng mép của đĩa cùng, điểmgiữa ở chính giữa

Hình 2.1 Cách xác định gãy xương đốt sống bằng Image J

* Chẩn đoán gãy xương: Đốt sống được xác định là bị lún ép khi chiều

cao bờ trước hoặc bờ giữa nhỏ hơn chiều cao bờ sau của thân đốt sống từ 20%trở lên, hoặc chiều cao của bờ sau thân đốt sống nhỏ hơn từ 20% trở lên sovới chiều cao của thân đốt sống kề cạnh Nếu chỉ giảm chiều cao bờ giữa thânđốt sống gọi là lún ép kiểu lõm 2 mặt, nếu chiều cao cả bờ trước và bờ sauđều giảm so với đốt sống kề cạnh thì gọi là lún xẹp đốt sống

* Phân loại gãy xương:

2.2.4 Kỹ thuật phân tích mẫu nghiên cứu

2.2.4.1 Phương tiện nghiên cứu

* Dụng cụ và máy móc

- Máy ly tâm Kubola 3300

- Máy minispin

- Máy lắc vortex

- Máy đo mật độ quang NanoDrop 1000

- Máy ủ nhiệt Thermomixer comfort

- Máy PCR mastercycle epgradient

- Máy điện di Mulpid Exu

- Đầu côn các loại khử trùng và không có DNAase

- Giá để ống, phiến lạnh để mẫu

- Găng tay, áo choàng, giấy thấm

- Bút dạ, đồng hồ bấm giờ, thùng đựng rác

* Hóa chất và sinh phẩm

- Cell Lysis Solution 28

- Nucleic Lysis Solution

- RNase Solution

- DNA rehydration Solution

- Protein Precipitation Solution

- Ethanol 70% ở nhiệt độ phòng

- Isopropanol tinh sạch (96-100%) ở nhiệt độ phòng

- 10X FastDigest Green Buffer

- PCR Mastes mix 2x

- FastDigest NdeI

- Thang DNA chuẩn

- Dung dịch EDTA

- Đệm điện di Ultrapure TMTBE buffer 0,5X

- Redsafe TM

- Thạch Agarose

- Nước tinh sạch GIBCO UltraPure Distilled Water

- Mẫu bệnh phẩm DNA đã được tách chiết

2.2.4.2 Kỹ thuật phân tích.

* Tách DNA, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng phương pháp

đo mật độ quang bằng máy NanoDrop 1000

Máu tĩnh mạch của đối tượng nghiên cứu được chống đông bằng EDTA.DNA tổng số được tách từ tế bào bạch cầu sử dụng bộ Kit Wizard GenomicDNA Purification, các bước tiến hành như sau:

+ Bước 1: Ly giải tế bào hồng cầu và thu bạch cầu:

- Lấy 300 microlit máu toàn phần vào ống eppendorf 1,5ml

- Thêm 900 microlit dung dịch Cell Lysis Solution

- Đảo ống 5 – 6 lần, sau đó ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm ở 14.000 xg trong 40 giây ở nhiệt độ phòng

- Loại bỏ tối đa dung dịch nổi, không được chạm vào hạt tủa ở đáy ống,còn lại khoảng 20 microlit cặn trong ống

- Lặp lại 2 lần các bước trên

+ Bước 2: Ly giải màng bạch cầu và màng nhân, thuỷ phân RNA.

- Thêm 300 microlit Nucleic Lysis Solution

- Vortex rồi ủ ở 370 C trong 30 phút tới khi cặn tan hoàn toàn Làm mát ởnhiệt độ phòng trong 5 phút

- Thêm 1,5 microlit dung dịch Rnase Solution, đảo đầu ống 5 lần.

- Ủ ở 370C trong 30 phút

+ Bước 3: Loại bỏ protein

- Thêm 130 microlit Protein Precipitation Solution

- Vortex mạnh rồi ly tâm 14.000 xg trong 3 phút ở nhiệt độ phòng, hỗnhợp phân thành lớp: tủa màu nâu ở đáy ống, dung dịch trong suốt chứa DNA

ở trên

+ Bước 4: Thu DNA và bù nước

- Thu lớp trên cùng trong suốt chứa DNA sang một ống Eppendorf khác(không để đầu ống chạm vào kết tủa protein ở đáy ống tránh gây nhiễu chéoDNA với kết tủa)

- Thêm 300 microit Isopropanol Trộn nhẹ dung dịch bằng đảo đầu chotới khi xuất hiện sợi kết tủa DNA trắng có thể nhìn thấy được Ly tâm 14.000

xg trong vòng 1 phút, có thể thấy hạt DNA kết tủa trắng ở đáy ống

- Gạn bỏ dung dịch lớp trên, chú ý không để trôi mất hạt tủa ở đáy ống

- Thêm 300 microlit cồn 70% ethanol ở nhiệt độ phòng Đảo nhẹ ống vàilần để rửa kết tủa Ly tâm 14.000 xg trong 1 phút ở nhiệt độ phòng

- Gạn bỏ dung dịch, chú ý không để trôi mất hạt tủa ở đáy ống

- Đặt ống trên giấy thấm và làm khô ở nhiệt độ phòng qua đêm

- Thêm 100 microlit dung dịch DNA rehydration Solution vào ống Ủqua đêm ở 40 C hoặc ở nhiệt độ phòng Bảo quản ở -200 C hoặc -80 0C

- Lấy 2 microlit sản phẩm DNA tách chiết để kiểm tra độ tinh sạch vànồng độ DNA bằng phương pháp đo mật độ quang bằng máy NanoDrop

1000 Quy trình tiến hành theo hướng dẫn của máy

* Xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP-PCR

Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzym cắt giớihạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen Khi ủ với enzym giớihạn ở dung dịch đệm, Ph, nhiệt độ và thời gian thích hợp, đoạn DNA sẽ bịenzym giới hạn cắt ở vị trí đặc hiệu để tạo ra những phân đoạn DNA với kíchthước khác nhau Dựa vào kích thước các đoạn sau khi cắt để xác định alen vàkiểu gen Trong nghiên cứu này chúng tôi thiết kế mồi và phương phápRFLP-PCR gồm 3 bước sau:

- Dùng phản ứng nhân gen (PCR) để khuếch đại đoạn gen chứa SNP

- Ủ sản phẩm PCR với enzym đặc hiệu

- Nhận định kiểu gen từ sản phẩm

* Phương pháp giải trình tự gen trực tiếp

Kiểm tra và so sánh ngẫu nhiên 03 mẫu với các kiểu gen khác nhau bằngphương pháp giải trình tự gen để kiểm tra độ chính xác của phương phápRFLP-PCR

* Phân tích kết quả

- Sự tồn tại của các alen đột biến hoặc bình thường được khẳng địnhbằng sự xuất hiện của sản phẩm DNA tương ứng độ dài đã biết trước Đốichứng kết quả điện di với thang chuẩn DNA để biết kích thước của các sảnphẩm PCR

- Kết quả được kiểm tra lại bằng giải trình tự gen

- Phân loại các mẫu kết quả theo nhóm

- Kết quả được trình bày ở dạng tỷ lệ phần trăm

2.2.5 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để phân tích thống kê