PHÁT HIỆN đột BIẾN GEN LDL RECEPTOR gây BỆNH TĂNG CHOLESTEROL máu có TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH

Mảng vữa xơ gây nên triệu chứng thiếu máu cơ tim cục bộ hoặc có thể nứt vỡ tạo nên huyết khối gây tắc mạch dẫn tới NMCT cấp với tỷ lệ tử vong cao.Trong quá trình hình thành, phát triển v

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung

HÀ NỘI – 2015

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial hypercholesterolemia FH) 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình .3 1.1.2 Cơ chế gây bệnh 4

1.1.3 Một số đặc trưng của FH và tiêu chuẩn chẩn đoán 6

1.1.4 Đột biến ở LDL-receptor gây FH 8

1.1.5 Vai trò của tăng lipid máu trong bệnh mạch vành: 12

1.2 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong phát hiện đột biến gen .15 1.2.1 Kỹ thuật PCR 16

1.2.2 Kỹ thuật RFLP- PCR: 16

1.2.3 Kỹ thuật giải trình tự gen 18

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 20

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 20

2.1.3 Quy trình tuyển chọn đối tượng nghiên cứu và lấy máu 20

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4 Cỡ mẫu 21

2.5 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 22

2.6 Phương tiện nghiên cứu 23

2.7.1 Tách DNA, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng phương

pháp đo mật độ quang bằng máy NanoDrop 1000 ( Thermo) 24

2.7.2 Xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP- PCR 26

2.7.3 Xét nghiệm sinh hóa máu 27

2.8 Phương pháp xử lý số liệu 27

2.9 Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài 27

CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 28

3.1.1 Đặc điểm về tuổi, giới 28

3.1.2 Đặc điểm chung về một số triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng 28

3.2 Tỷ lệ các loại đột biến 28

3.3 Mối tương quan giữa loại đột biến và kiểu hình 29

CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 30

4.1 Tỷ lệ các đột biến LDLreceptor 30

4.2 Mối liên quan giữa loại đột biến và một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng 30

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 31

DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 3.1 Đặc điểm về tuổi, giới 28Bảng 3.2 Đặc điểm chung về một số triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng 28Bảng 3.3 Tỷ lệ các loại đột biến 28Bảng 3.4 Mối tương quan giữa loại đột biến và kiểu hình 29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh mạch vành là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong 10 năm trởlại đây [1] Ước tính tử vong do bệnh mạch vành trên toàn cầu năm 2002 là7,1 triệu người và sẽ tăng lên 11,1 triệu người vào năm 2020 [2] Ở Mỹ cứ 40giây lại có một người tử vong do bệnh tim mạch, quá nửa trong số đó là dobệnh mạch vành Bệnh đang có xu hướng gia tăng ở các nước đang phát triển[3] Tại Việt Nam, tỷ lệ bệnh mạch vành ngày càng tăng: năm 1994: 3,4%,năm 2003: 11,2%, và năm 2007 lên đến 24% [4]

Nguyên nhân gây bệnh là do các mảng vữa xơ gây hẹp lòng động mạchlàm giảm cung cấp máu và oxy cho tim (National center for BiotechnologyInformation, 2010) Mảng vữa xơ gây nên triệu chứng thiếu máu cơ tim cục

bộ hoặc có thể nứt vỡ tạo nên huyết khối gây tắc mạch dẫn tới NMCT cấp với

tỷ lệ tử vong cao.Trong quá trình hình thành, phát triển và nứt vỡ của mảngvữa xơ, tăng cholesterol máu đóng một vai trò chìa khóa Tăng cholesterolmáu thường được quy cho là do chế độ ăn giàu cholesterol, ít vận động, hậuquả của một số bệnh rối loạn chuyển hóa Tuy nhiên với sự phát triển củacông nghệ di truyền và công nghệ gen đã cho thấy rằng một nguyên nhânquan trọng gây tăng cholesterol máu là do gen trong đó có bệnh tăngcholesterol máu có tính chất gia đình (Familial hypercholesterolemia FH)

FH là bệnh rối loạn chuyển hóa do di truyền phổ biến nhất Tỷ lệ mắcước tính toàn cầu là 1:500 đến 1:300 ở một vài quần thể tỷ lệ còn cao hơn.Đây là một bệnh di truyền đơn gen, nguyên nhân là do đột biến ở: LDLreceptor, apoB, PCSK9, LDLRAP1, trong đó đa số là đột biến ở LDL-R(chiếm trên 80%)[5] Người bị bệnh FH liên quan với nồng độ cao LDL-C

từ khi mới sinh nên tác động của nó nên hệ tim mạch đặc biệt nguy hiểm hơn

so với người tăng cholesterol máu mắc phải Trung bình bệnh nhân FH không

điều trị có nguy cơ bị bệnh mạch vành cao gấp 20 lần so với nhóm chứng[6].Bệnh nhân FH không được điều trị xuất hiện triệu chứng bệnh mạch vành từrất sớm, trung bình là từ khi 20-60 tuổi tùy thể bệnh[7],[8] Ngược lại nếuđược chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời tình trạng này hoàn toàn có thể ngănngừa được hay ít nhất là có thể trì hoãn Chẩn đoán về gen đóng vai trò quantrọng giúp chẩn đoán chính xác, nhất là ở giai đoạn sớm khi bệnh nhân chưa

có triệu chứng lâm sàng nhờ đó bệnh nhân có cơ hội điều trị sớm để dự phòngcác biến chứng tim mạch một cách có hiệu quả

Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về chẩn đoán sớm FH dựa trên phân tíchgen, vì vậy còn nhiều bệnh nhân trẻ xuất hiện bệnh mạch vành thậm chí đột tử

do bệnh mạch vành mà không tìm thấy nguyên nhân.Xuất phát từ thực tế đó

chúng tôi tiến hành đề tài:“phát hiện đột biến gen ldl receptor gây bệnh tăng

cholesterol máu có tính chất gia đình” với 2 mục tiêu:

1 Xác định đột biến gen ở những bệnh nhân FH.

2 Tìm hiểu mối liên quan giữa kiểu gen với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial hypercholesterolemia FH)

1.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

Vào năm 1938, nhà khoa học Norwegian Dr Carl Muller nhận ra sự liên

hệ giữa tăng nồng độ cholesterol huyết thanh, u vàng ở gân và vữa xơ độngmạch ở các thành viên của một nhóm gia đình và đưa ra giả thuyết đây là mộtbệnh di truyền đơn gen Vào năm 1960, Khachadurian khi nghiên cứu trênmột dòng họ ở Libăng đã mô tả sự khác biệt về kiểu hình giữa dạng đồng hợp

tử và dị hợp tử và khẳng định rằng cấu trúc phả hệ phù hợp với di truyền trộiđơn gen Cụ thể ông chỉ ra rằng dựa vào nồng độ cholesterol huyết thanh cóthể chia các cá nhân trong dòng họ này thành 3 nhóm: nhóm đồng hợp tử cónồng độ cholesterol cao gấp 4 lần bình thường, nhóm dị hợp tử cao gấp 2 lầnbình thường và nhóm không bị ảnh hưởng có nồng độ cholesterol bình thường[9].Vào năm 1964, FH được xác định như là một bệnh di truyền trội trên NSTthường (ADH), và mô tả sự khác biệt về lâm sàng giữa dạng đồng hợp tử và

dị hợp tử [10] Cùng thời điểm này Fredrickson và cộng sự đã đưa ra giảthuyết kiểu hình của FH có liên quan với rối loạn chuyển hóa LDL-C Năm

1970 với sự phối hợp làm việc của Ott và cộng sự, Elston và cộng sự, Berg vàHeiberg đã chỉ ra gen liên quan với kiểu hình FH nằm trên NST 19 [7].Brown và Goldstein thấy rằng receptor trên bề mặt tế bào có liên quan vớiviệc thu nhận những mảnh còn lại của LDL lưu hành trong máu[11] Vào năm

1986, họ khám phá ra sai sót về phân tử gây FH là do đột biến chức năng ởgen mã hóa LDLR [12] Giải thưởng Nobel này đã cung cấp nền tảng cơ sởcho công tác dự phòng và điều trị hiện tại để làm giảm LDL-C Tiếp bước

những thành công này nhiều nghiên cứu đã được tiến hành tại nhiều quốc giatrên thế giới Và người ta thấy rằng FH là một trong những bệnh di truyền phổbiến nhất Tỷ lệ mắc ước tính toàn cầu là 1:300 đến 1:500 (0,2%) ở một vàiquần thể tỷ lệ còn cao hơn như: quần thể người Libăng theo đạo Cơ đốc giáo

là 1:85, người Nam Phi gốc Âu: 1:72 tới 1:100, người Tuynidi 1:165, ngườiPháp gốc Canada là 1:270 [7] Tỷ lệ ước tính này tương ứng với khoảng 13triệu người khắp thế giới và khoảng 600.000 người Mỹ mắc FH Phần lớnnhững trường hợp mắc là dị hợp tử (được di truyền một đột biến gây bệnh).Một số nhỏ bệnh nhân là dị hợp tử phức tạp (được di truyền một bản sao củatừng cặp hai đột biến khác nhau), trong khi đó những bệnh nhân đồng hợp tử

FH được di truyền hai đột biến gây bệnh giống nhau Các đột biến gen trộigây FH đã được tìm thấy trên gen LDLR, ApoB và PCSK9 Trong đó đột biến

ở LDL-R chiếm trên 80% còn các đột biến gen ApoB và PCSK9 chỉ chiếmtương ứng khoảng 5,5% và 1,5% các trường hợp FH [5]

Ngoài ra đã phát hiện đột biến lặn gây FH(ARH là dạng đồng hợp tử vềđột biến gen mã hóa cho LDLR adaptor protein 1 (LDLRAP1) [10] Và một

số dạng hiếm khác của di truyền lặn gây tăng cholesterol máu gồmsitosterolemia do ATP gắn cassette subfamily G member 5 (ABCG5) hoặcthiếu hụt ABCG8, và thiếu cholesterol 7 alpha hydroxylase (CYP7A1) làenzym của bước đầu tiên tổng hợp acid mật dẫn tới nồng độ cholesterol caotrong tế bào gan và giảm sự hiện diện bề mặt của LDLreceptor [13]

1.1.2 Cơ chế gây bệnh

LDL trong máu có ApoB-100 trên bề mặt LDL-Repceptor là mộtglycoprotein có trên bề mặt tế bào gan và gắn ApoB-100 của LDL-C Phứchợp LDL-C và LDL receptor (tạo túi clathrin) được hình thành, cả thụ thể vàchất gắn LDL-C đều được đưa vào trong thể nội bào (endosome) cùng vớinhững protein khác thông qua tương tác liên quan đến protein chuyển đổi

LDLR (LDLR adaptor protein 1: LDLRAP1) Sau khi phức hợp chất gắn –thụ thể phân ly, LDLR được tái sử dụng trên màng tế bào, trong khicholesterol tự do được sử dụng bên trong tế bào PCSK9 có vai trò như mộtchất ức chế LDLR sau phiên mã Nó được tiết ra ngoài tế bào và ức chếLDLR thông qua các tương tác trên bề mặt tế bào Các bằng chứng cũng chothấy một con đường nội bào của ức chế LDLR thông qua PCSK9, tuy nhiên

cơ chế cụ thể vẫn chưa được làm sáng tỏ [12] Điều hòa của nhân đối với sảnxuất LDLR bao gồm 2 con đường Con đường thứ nhất, việc gắn của proteingắn yếu tố đáp ứng steroid (steroid response element binding protein:SREBP) với một yếu tố đáp ứng steroid (steroid response element) trên DNA

sẽ kích thích sự phiên mã của LDLR nhằm đáp ứng với sự giảm nồng độcholesterol nội bào [12] Con đường này được hoạt hóa trong quá trình điềutrị bằng các chất ức chế HMG-CoA Reductase Con đường thứ hai trong điềuhòa LDLR là một thụ thể của nhân qua trung gian sterol khác (LXR), đượccho thấy làm giảm phiên mã của chất thoái giáng cảm ứng của LDLR(inducible degrader of the LDLR: IDOL) IDOL kích hoạt sự ubiquitin hóacủa LDLR giúp thoái giáng phân tử này.Con đường này giúp hấp thu LDL-Ctrong máu Bất kỳ thiếu hụt nào trong con đường này cũng tạo ra sai sót trongquá trình hấp thu và LDL-C tăng cao trong máu, gây nên các triệu chứng lâmsàng của FH

1.1.3 Một số đặc trưng của FH và tiêu chuẩn chẩn đoán

Nồng độ Cholesterol toàn phần và LDL-C ở bệnh nhân FH dị hợp tửtrong khoảng 9-14mmol/L và 5-10mmol/L còn ở bệnh nhân đồng hợp tửkhoảng 17-26mmol/L và LDL-C trên 15mmol/L

LDL lắng đọng ở mô gây ra những biểu hiện lâm sàng của FH như: uvàng ở gân và dây chằng hay gặp nhất là ở khuỷu tay, gân achille, bàn tay.Lipid có thể lắng đọng quanh mắt và có thể xuất hiện ở cả giác mạc dẫn tớilão hóa giác mạc hình vòng cung [10] Tuy nhiên đặc điểm này ít gặp ở quần

thể người châu Á hơn so với các nơi khác trên thế giới [14] Quan trọng hơn,lắng đọng LDL-C ở động mạch khi sinh ra là nguyên nhân dẫn tới bệnh timmạch từ khi còn trẻ và nhất là bệnh mạch vành trẻ (coronary heart diseaseCHD) ở bệnh nhân FH Trung bình bệnh nhân FH không điều trị có nguy cơCHD gấp 20 lần so với nhóm chứng [6] Với bệnh nhân FH dị hợp tử nếukhông được điều trị hơn 50% bệnh nhân nam đến tuổi 50 tuổi và ít nhất 30%bệnh nhân nữ đến tuổi 60 tuổi xuất hiện triệu chứng của bệnh mạch vành Cònvới bệnh nhân FH đồng hợp tử thì sớm hơn trung bình là 20 tuổi [7],[8].

Việc chẩn đoán lâm sàng FH dựa vào sự kết hợp: tiền sử gia đình, dấuhiệu lâm sàng (đặc biệt là u vàng ở gân) và nồng độ cholesterol máu Hiệnnay được sử dụng phổ biến trên thế giới là MEDPED của Mỹ (make earlydiagnosis to prevent early death) của Anh (Simon Broome), Dutch lipid cliniccủa Hà Lan [5] Trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng tiêu chuẩn chẩnđoán của Mỹ MEDPED cụ thể như sau:

Tuổi Quan hệ bậc 1 Quan hệ bậc 2 Quan hệ bậc 3 Cộng đồng

< 18 5,7 ( 4,0) 6,0 (4,3) 6,2 (4,4) 7,0 (5,2)

20 6,2 (4,4) 6,5 (4,7) 6,7 (4,8) 7,5 (5,7)

30 7,0 (4,9) 7,3 (5,2) 7,5 (5,4) 8,8 (6,2)40+ 7,5 (5,3) 7,8 (5,6) 8,0 (5,8) 9,3 (6,7)

Cholesterol ( và LDL-C ) mmol/L

Độ nhạy 87%, độ đặc hiệu 98%

Chẩn đoán FH chính xác nhất là phối hợp giữa tiêu chuẩn lâm sàng vàxét nghiệm DNA vì xét nghiệm DNA đối với FH hiện nay không nhạy 100%bởi bệnh có thể bị gây ra bởi một đột biến vẫn chưa được đánh giá Do đó,không phát hiện thấy đột biến không loại trừ được chẩn đoán FH [15] Nghiêncứu cho thấy khoảng 15% bệnh nhân FH không có đột biến gen LDLR, ApoBhay PCSK9 (ước tính thay đổi từ 12% đến 48%) [16] Ngược lại, dù sàng lọcđột biến đối với FH có độ đặc hiệu cao, vẫn có thể cho kết quả dương tính giả

do một vài thay đổi trình tự phát hiện được có thể không gây bệnh [5],[17].Trường hợp này có thể loại trừ dựa vào tiêu chuẩn lâm sàng.

1.1.4 Đột biến ở LDL-receptor gây FH

1.1.4.1 Phân loại:

Gen mã hóa LDL receptor nằm trên nhánh ngắn của NST 19 vùng 13.2(19p13.2) dài 45kb gồm 18 exon và 17 intron Chứa 11.089.361 đến11.133.829 đôi base Mã hóa cho mARN dài 5,3kb [13] Đột biến ở gen mãhóa LDLR là nguyên nhân phổ biến nhất gây FH (chiếm khoảng 80%) Hiệnnay, trên 1700 đột biến ở gen LDL-R đã được phát hiện Ban đầu một số thiếuhụt đầu tiên ở LDLR có đặc trưng là các mất đoạn lớn được xác định bằngSouthern blooting Sau đó với sự ra đời của các phương pháp mới và đơn giảnhơn trong việc chỉ ra những thay đổi nhỏ (thay đổi ở 1 base của gen) như:PCR định lượng (MLDPA), giải trình tự tự động trực tiếp các sản phẩm PCR,DGGE-PCR(denaturing gradient gel electrophoresis) hoặc SSCP (singlestrand conformational polymorphism) ngày càng nhiều đột biến ở LDLRđược chỉ ra Bao gồm: sắp xếp lại đoạn lớn, codon kết thúc sớm, thay thế 1a.a,đột biến ở vùng promotor tác động đến sự sao chép gen, đột biến ảnh hưởngđến sự kéo dài của pre-mARN Điều thú vị là các đột biến của LDLR mà ảnhhưởng đến chức năng của nó trải dài suốt chiều dài của gen và hầu hết mỗithay thế amino acid đơn mà đã được tìm thấy đều có tác động có hại lên chứcnăng của receptor [9] Đột biến ở LDLR chia làm 5 loại chính:

-Loại 1: đột biến gen LDLR dẫn tới không tổng hợp được receptor LDL.Người dị hợp tử chỉ sản xuất được một nửa số receptor LDL

-Loại 2: vẫn tổng hợp được receptor LDL nhưng những receptor nàykhông thể rời khỏi lưới nội sinh chất để tới bộ Golgi để thể hiện trên bề mặt

tế bào và sẽ bị giáng cấp

-Loại 3: đột biến dẫn tới sản xuất LDL bất thường: có thể di chuyển tới

bề mặt tế bào nhưng không thể gắn với LDL

-Loại 4: hiếm, LDLR tổng hợp được nhưng không tới được lõm áo ở bềmặt màng tế bào do đó không vận chuyển được LDL vào trong tế bào

-Loại 5: LDLR khi vào trong tế bào không tách được LDLR do đó khôngthể quay trở lại màng tế bào và bị giáng cấp [9],[13]

1.1.4.2 Cơ chế bệnh sinh:

Những tế bào của người bình thường thu nhận cholesterol từ quá trìnhtổng hợp cholesterol nội sinh trong tế bào và thu nhận cholesterol từ ngoài vàotrong chế độ ăn Ở người bình thường nồng độ cholesterol trong tế bào đủ sẽtác động ức chế (feedback repression) tổng hợp LDLR và giảm tổng hợpcholesterol nội sinhl LDL-C vào trong tế bào phải được receptor LDL tiếpnhận LDLR là một glycoprotein có trên bề mặt tế bào gan và gắn ApoB-100của LDL-C Phức hợp LDL-C và LDL receptor (tạo túi clathrin) được hìnhthành, cả thụ thể và chất gắn LDL-C đều được đưa vào trong thể nội bào(endosome) cùng với những protein khác thông qua tương tác liên quan đếnprotein chuyển đổi LDLR (LDLR adaptor protein 1: LDLRAP1) Sau khi phứchợp chất gắn – thụ thể phân ly, LDLR được tái sử dụng trên màng tế bào, trongkhi cholesterol tự do được sử dụng bên trong tế bào Sai sót trong cấu trúc củaLDLR dẫn tới giảm vận chuyển LDL-C vào trong tế bào làm tăng nồng độLDL-C trong huyết thanh và gây nên các triệu chứng lâm sàng của FH

1.1.4.3 Ảnh hưởng của loại đột biến lên kiểu hình:

Kiểu hình lâm sàng của FH rất thay đổi và ban đầu giả thiết rằng sựthay đổi này phụ thuộc vào mức độ hoạt động còn lại của hoạt động củaLDLR có liên quan với mỗi phần của allen đột biến Mặc dù bệnh nhân FHđồng hợp tử với vài chức năng của LDLR vẫn còn thì ít ảnh hưởng trầm trọnglên lâm sàng hơn là những người không thể phát hiện hoạt động của LDLR,

khi đủ số lượng bệnh nhân để nghiên cứu mối liên quan này dường như khôngđúng với bệnh nhân dị hợp tử trưởng thành, bất chấp nhiều nỗ lực để chứngminh [18] Trẻ con FH dị hợp với kiểu gen null tuy nhiên lại có nồng độLDL-C cao hơn, lớp áo trong của động mạch cảnh dày hơn những trẻ đột biếnthiếu hụt receptor, nó chỉ ra rằng chúng có thể hưởng lợi từ việc điều trị tíchcực hơn bắt đầu từ thời thơ ấu[19].Hơn nữa kiểu hình lâm sàng của nhữngngười mang đột biến apoB Arg3500Gln cũng rất khác nhau bất chấp sự cómặt của cùng alen đột biến Đột biến mất đoạn của PCSK9 dẫn tới rất nhiềunồng độ LDL-C khác nhau ở những cá thể bị ảnh hưởng từ nhẹ đến nặng Hầuhết những cá thể bị ảnh hưởng nặng là những cá thể mang đột biến Asp374Tyr[20].

Chỉ 1 hoặc 2 đột biến LDLR có thể được xem là nhẹ (tất cả những ngườimang đột biến có cholesterol máu tăng nhẹ hơn hầu hết những bệnh nhân FH)[18] Với tất cả những bệnh nhân FH khác gây ra bởi sự thiếu hụt LDLR, môitrường, hoặc yếu tố di truyền khác dường như quan trọng hơn loại đột biếnđược xác định là kiểu hình trầm trọng [21] Chúng thường là những yếu tốtương tự mà dẫn đến CHD ở quần thể chung (thuốc lá, nồng độ HDL-C thấp,giới tính nam, tuổi cao)

Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để chỉ ra rằng sự thay đổi ở các locusgen khác nhau có thể ảnh hưởng đến kiểu hình lâm sàng FH ở bệnh nhân độtbiến LDLR, nhưng hầu hết trong số này chưa kết luận được vì mới một sốnhỏ bệnh nhân được nghiên cứu Mặc dù tồn tại nhiều đột biến, có thể lànhiều trong số này sẽ là các allen hiếm mà có thể có ảnh hưởng rõ lên mộtdòng họ nhưng có thể không nhanh chóng có thể phát hiện được trong nhómbệnh nhân FH do tính đa hình ở một nucleotid đơn liên quan với nghiên cứu.Tất nhiên, cũng có thể có những allen tương tác với yếu tố môi trườngđể ảnhhưởng lên kiểu hình, nhưng ví dụ thì vẫn chưa tìm thấy

25% (2% đbở nhóm chứng)5%

18 exon của gen LDLR 22 BN có đột biến

Exon 3 ( D69N) Exon 4 ( R94H) Exon 5

Exon 6 Exon 7 Exon 8 Exon 9 Exon10 Exon14

37 bệnh nhân FH dị hợp

tử Nhật Bản

Exon2 Exon3 Exon4 Exon5

1.1.5 Vai trò của tăng lipid máu trong bệnh mạch vành:

Vai trò của rối loạn lipid máu trong bệnh lý xơ vữa động mạch đã đượcchứng minh qua nhiều nghiên cứu Rối loạn lipid máu là một trong những yếu

tố khởi đầu cho quá trình hình thành và phát triển của xơ vữa động mạch gâynên bệnh mạch vành, hơn nữa tình trạng tăng LDL-C làm cho mảng xơ vữa

dễ gây biến chứng hơn (nứt, loét, vỡ, đông máu gây tắc mạch) và hậu quả lâmsàng là hội chứng vành cấp và tử vong

1.1.5.1.Vai trò của tăng lipid với sự hình thành mảng vữa xơ:

Cholesterol đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành mảngvữa xơ Bước đầu tiên của bệnh học vữa xơ là sự bẫy của LDL huyết thanh,VLDL, và VLDL tàn dư vào lớp áo động mạch Những mảnh này rời dòngmáu và đi qua lớp nội mạc của động mạch tích tụ ở lớp áo trong của độngmạch [9] Khi những mảnh này bị bẫy, chúng bị biến đổi bởi enzym thành cácmảnh tiền viêm Những mảnh tiền viêm này khởi đầu một đáp ứng viêm [10],chemokine được tiết bởi cơ trơn, tiểu cầu, và mô mỡ làm tế bào mono,lympho,tế bào mast và bạch cầu đa nhân trung tính tới thành động mạch.Cùng lúc, tế bào cơ trơn tiết collagen và xơ elastic vào chất nền ngoại bào[9].Khi trong thành động mạch, tế bào mono được chuyển dạng thành đại thựcbào [11] LDL tồn tại lâu trong huyết tương, thời gian bán hủy của chúng kéodài, chúng bị biến đổi (oxy hóa, acetyl hóa, glycosyl hóa ) và được nhận biếtbởi một loại receptor đặc hiệu ở đại thực bào Đai thực bào bị ứ đọngcholesterolester sẽ trở thành “tế bào bọt” [12] Những sự thay đổi này là vi thể

và có thể đảo ngược và vẫn chưa được xem là vữa xơ Sự tiếp tục tích lũy của

tế bào bọt, từ vi thể thành những thay đổi có thể nhìn thấy rõ, dẫn đến sự hìnhthành những vệt chất béo, mà được xem là giai đoạn đầu của vữa xơ

Trong giai đoạn 2 của vữa xơ, tế bào bọt tiếp tục tích lũy bằng cáchhoạt hóa các tế bào viêm khác Lipid bên ngoài tế bào kết hợp vào gây ra hoại

tử tế bào [9] Thậm chí, những lõi giàu lipid này phát triển đến khi chúngchiếm giữ 30-50% đường kính thành động mạch Tiếp theo, mô xơ được thêmvào phía trên lõi giàu lipid, phía dưới nội mạc, làm hình thành 1 cái mũ xơ

Giai đoạn thứ 3 và là giai đoạn cuối cùng của vữa xơ là tổn thươngphát triển hoàn thiện Trong giai đoạn này, một cái mũ xơ mỏng phát triển và

có thể vỡ Cái mũ xơ trở nên mỏng và yếu hơn khi hoạt động của enzymelàm cho mô xơ phân hủy Nếu nó phân hủy, khởi động quá trình đông máu tạo

ra huyết khối gây bít tắc có khả năng đe dọa tính mạng Tuy nhiên, nhiềumảnh vỡ im lặng về lâm sàng Chúng được làm lành bằng cách hình thành mô

xơ kết dính các tế bào, sợi collagen, và không gian ngoại bào Nhưng chúng

có thể vỡ lại gây ra vòng vỡ-đông-lành Mỗi bước này kết quả là lắng đọngcalci Sự tăng kích thước của mảng có thể dẫn tới hẹp nghiêm trọng đủ để gây

ra thiếu máu gây chết do sự hạn chế của dòng máu [11]

1.1.5.2 Vai trò của tăng lipid với tính ổn định của mảng vữa xơ:

Sự tích tụ lipid trong hệ tuần hoàn không chỉ làm hình thành mảng vữa

xơ mà nó còn đóng vai trò quan trọng gây nên tính không ổn định của mảngvữa xơ hay tạo nên nguy cơ vỡ mảng xơ vữa Người ta thấy rằng nguy cơ vỡmảng xơ vữa phụ thuộc vào kiểu mảng xơ vữa hơn là phụ thuộc vào kíchthước Các mảng xơ vữa mềm và giàu lớp lipid dễ bị tổn thương và nhạy cảmvới sự vỡ hơn so với mảng xơ vữa cứng giàu collagen

Các nghiên cứu giải phẫu bệnh đã xác định có 3 yếu tố chính của khảnăng dễ bị vỡ của mảng xơ vữa:

-Kích thước của lõi giàu lipid

-Tình trạng viêm làm phá hủy mảng xơ vữa

-Thiếu các tế bào cơ trơn làm lành các chỗ vỡ

Sự tích tụ lipid, thâm nhiễm đại thực bào và thiếu các tế bào cơ trơnlàm giảm tính bền vững của mảng xơ vữa, làm cho nó dễ bị vỡ Ngược lại, sựlành qua trung gian các tế bào cơ trơn và tiến trình sửa chữa làm ổn định cácmảng xơ vữa, bảo vệ mảng xơ vữa, chống lại sự vỡ.

Lõi của mảng xơ vữa là thành phần không có mạch máu, nghèo tế bào,giàu lipid, mềm nhão và hoàn toàn không có collagen nâng đỡ Kích thướccủa lõi mềm này quyết định tính ổn định của mảng xơ vữa Các nghiên cứumiễn dịch đã chỉ ra rằng, các lipid và những thành phần tế bào khác đượcphóng thích từ các tế bào bọt chết có thể góp phần làm tăng trưởng lõi vữa.Trong lúc sinh thiết tử thi, Gertz và Roberts thấy lõi vữa của những mảng xơvữa bị vỡ lớn hơn so với các mảng không vỡ Davies và cộng sự cũng tìmthấy mối tương quan chặt chẽ giữa kích thước lõi vữa và tình trạng vỡ mảng

xơ vữa ở động mạch chủ [13],[14]

1.2 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong phát hiện đột biến gen

Với sự phát triển của sinh học phân tử, hiện nay có rất nhiều kỹ thuật

để xác định kiểu gen Một số kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong nghiêncứu như kỹ thuật RFLP- PCR (Restriction fragment length polymorphisms-PCR: kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn ADN do enzyme giới hạn tạo nên),ASP-PCR (Allen specific- PCR: phản ứng khuếch đại chuỗi đặc hiệu allen),Taqman, Real-Time multiplex PCR, giải trình tự gen trực tiếp (Sequencing).Trong đó RFLP-PCR là phương pháp có độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản vàgiá thành rẻ, được áp dụng rộng rãi trong các labo sinh học phân tử ở ViệtNam Bởi vậy, trong phạm vi của đề tài tôi xin trình bày những nét chính của

kỹ thuật RFLP-PCR, là kỹ thuật liên quan đến việc xác định kiểu gen LDLreceptor trong nghiên cứu này Sau đó kiểm tra lại bằng phương pháp giảitrình tự gen Kỹ thuật PCR-RFLP được tiến hành dựa trên cơ sở khuếch đạiđoạn gen nghi ngờ mang đột biến bằng kỹ thuật PCR