BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA TỪNG YẾU TỐ HÌNH THÁI ĐẾN KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN...44 Ảnh hưởng của số lượng phôi bào đến kết quả di truyền...44 Ảnh hưởng của tỷ lệ phân mảnh bào tương đ
Trang 1NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ
ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHÔI NGÀY 3 VỚI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM
DI TRUYỀN TRONG KỸ THUẬT SÀNG LỌC
DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ
Hà Nội, năm 2018
Trang 2NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ
ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHÔI NGÀY 3 VỚI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM
DI TRUYỀN TRONG KỸ THUẬT SÀNG LỌC
DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ
Chủ nhiệm đề tài
BS.CKII Phạm Thúy Nga
Nhóm nghiên cứu:
CN Nguyễn Thu Huyền
KS Đinh T Phương Thảo
CN Ngô Tuấn Khanh
HS Lê Thị Hương
Hà Nội, năm 2018
Trang 3a-CGH : Array Comparative Genomic Hybridization
(lai so sánh bộ gen)FISH : Fluorescent In Situ Hybridization
(lai huỳnh quang tại chỗ)hCG : Human Chorionic Gonadotropin
ICSI : IntraCytoplasmic Sperm Injection
(tiêm tinh trùng vào bào tương noãn)IVF : In-Vitro Fertiliztion (thụ tinh trong ống nghiệm)
LBNST : Lệch bội nhiễm sắc thể
NGS : Next Generation Sequencing (giải trình tự gene thế hệ mới)
PGD : Preimplantation genetic diagnosis
(Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ)PGS : Preimplantation genetic screening
(Sàng lọc di truyền tiền làm tổ)TTTON : Thụ tinh trong ống nghiệm
Trang 4ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 3
TỔNG QUAN 3
1.1 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI TTTON VÀ TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI PHÔI ĐANG PHÂN CHIA 3
1.1.1 Giai đoạn tiền nhân 3
1.1.2 Giai đoạn phân chia (Cleavage) 3
1.1.3 Giai đoạn phôi dâu (morula) 4
1.1.4 Giai đoạn phôi nang (blastocyst) 4
1.1.5 Các yếu tố hình thái của phôi ngày 3 6
1.2 SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ 8
1.2.1 Khái niệm, chỉ định 8
1.2.2 Quy trình sàng lọc di truyền tiền làm tổ 8
1.3 BỘ NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI VÀ BẤT THƯỜNG NST 12
1.3.1 Bộ nhiễm sắc thể người 12
1.3.2 Bất thường số lượng nhiễm sắc thể 13
1.3.3 Bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể 14
1.3.4 Một số hội chứng ở người do bất thường NST gây ra 15
1.4 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ 16 1.4.1.Nghiên cứu về kết quả xét nghiệm di truyền 16
1.4.2 Nghiên cứu về ảnh hưởng của hình thái phôi đến két quả xét nghiệm 17
CHƯƠNG 2 19
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 19
Trang 52.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ 19
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả hồi cứu và tiến cứu 19
2.3.2 Cỡ mẫu 19
2.3.3 Kỹ thuật thu thập số liệu 20
2.3.4 Các bước tiến hành 20
2.3 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ PHÔI NGÀY 3 TRONG NGHIÊN CỨU .23
2.4 CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU 25
2.4.1 Các biến số về đặc điểm mẫu nghiên cứu 25
2.4.2 Các biến số về kết quả xét nghiệm di truyền 25
2.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ SAI SỐ 25
2.6 KHÍA CẠNH ĐẠO ĐỨC CỦA ĐỀ TÀI 26
CHƯƠNG 3 27
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27
3.1 ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27
3.1.1 Đặc điểm về hình thái phôi 27
3.1.2 Đặc điểm về kết quả xét nghiệm di truyền của phôi 28
3.2 LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHÔI VỚI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN 28
3.2.1 Liên quan giữa hình thái phôi ngày 3 với kết quả xét nghiệm 28 3.2.2 Liên quan giữa từng yếu tố của phôi ngày 3 với kết quả xét nghiệm 30
3.2.3 Liên quan giữa các yếu tố của phôi ngày 3 với kết quả xét nghiệm qua phân tích kết hợp các yếu tố hình thái 33
Trang 64.1 BÀN LUẬN VỀ ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39
4.2 BÀN LUẬN VỀ TƯƠNG QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHÔI NGÀY 3 VỚI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN 41
4.3 BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA TỪNG YẾU TỐ HÌNH THÁI ĐẾN KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN 44
Ảnh hưởng của số lượng phôi bào đến kết quả di truyền 44
Ảnh hưởng của tỷ lệ phân mảnh bào tương đến kết quả di truyền 45
Ảnh hưởng của độ đồng đều tế bào đến kết quả di truyền 46
4.4 BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG KẾT HỢP CỦA CÁC YẾU TỐ HÌNH THÁI ĐẾN KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN 48
Ảnh hưởng của hai yếu tố hình thái đến kết quả xét nghiệm 48
Ảnh hưởng kết hợp của ba yếu tố hình thái đến kết quả xét nghiệm 49
KẾT LUẬN 51
KIẾN NGHỊ 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO 25
Trang 7Bảng 3.1: Đặc điểm về hình thái của phôi sinh thiết 27
Bảng 3.2: Kết quả giải trình tự gen 23cặp nhiễm sắc thể của phôi ngày 3 28
Bảng 3.3: Liên quan giữa hình thái phôi với kết quả xét nghiệm 28
Bảng 3.4: Liên quan giữa hình thái phôi với loại bất thường NST 29
Bảng 3.5: Liên quan giữa số lượng tế bào với kết quả di truyền 30
Bảng 3.6: Liên quan giữa tỷ lệ phân mảnh bào tương với kết quả di truyền 31
Bảng 3.7: Liên quan giữa độ đồng đều tế bào với kết quả di truyền 32
G 32 Bảng 3.8: Liên quan giữa số lượng tế bào, độ đồng đều tế bào 33
với kết quả xét nghiệm di truyền 33
Bảng 3.9: Liên quan giữa số lượng tế bào, độ phân mảnh bào tương 34
với kết quả xét nghiệm di truyền 34
Bảng 3.10: Liên quan giữa độ đồng đều của tế bào, độ phân mảnh bào tương với kết quả xét nghiệm di truyền 35
Bảng 3.11: Liên quan giữa số lượng tế bào, độ đồng đều tế bào và tỷ lệ phân mảnh bào tương với kết quả xét nghiệm di truyền 37
Trang 8Hình 1.1: Sự phát triển của phôi ngày 2, ngày 3 (2, 4, 6, và 8 tế bào)[23] 4
Hình 1.2 : Phôi dâu ngày 4 (từ lúc bắt đầu kết khối đến khi hoàn tất thành một khối đặc không thấy ranh giới tế bào)[23] 4
Hình 1.3: Phôi nang (từ lúc mới xuất hiện xoang phôi nang đến khi hình thành phôi nang hoàn chỉnh) [23] 5
Hình 1.4: Đánh giá độ đồng đều của phôi 7
Hình 1.5: Quy trình sàng lọc di truyền tiền làm tổ 8
Hình 1.6: Sinh thiết tế bào ở phôi ngày 3 (8 tế bào) 9
Hình 1.7: Sinh thiết phôi nang 10
Hình 1.8: Bộ nhiễm sắc thể đặc trưng của người 13
Hình 1.9: Cơ chế tạo thể lệch bội trong nguyên phân và giảm phân 14
Hình 1.10: Cơ chế hình thành bất thường cấu trúc NST 15
Hình 2.1: Kỹ thuật sinh thiết tế bào ngày 3 21
Hình 2.2: Kỹ thuật rửa tế bào sau sinh thiết 21
Hình 2.3: Quy trình phân tích mẫu (bộ kit VeriSeq PGS – Illumina) 22
Hình 2.4: Phần mềm phân tích kết quả trong kỹ thuật NGS 22
Hình 2.5: Phôi có kích thước các tế bào tương đối đồng đều 24
Hình 2.6: Phôi có kích thước tế bào không đồng đều 24
Hình 2.7: Mức độ phân mảnh bào tương của phôi 24
Trang 9ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát triển và ngày càng hoàn thiện của các kĩ thuật thụ tinh trongống nghiệm tạo phôi đã giúp bệnh nhân tạo được nhiều phôi hơn trong mỗichu kì IVF, nhờ vậy càng có nhiều cơ hội để lựa chọn phôi chuyển vào buồng
tử cung Việc lựa chọn được phôi “chất lượng tốt” để chuyển vào buồng tửcung là bước quan trọng đầu tiên giúp tăng tỷ lệ có thai và cho ra đời những
em bé khỏe mạnh, không bị dị tật Hiện nay, ở các trung tâm thụ tinh trongống nghiệm, việc lựa chọn phôi thường chỉ dựa trên những tiêu chuẩn về hìnhthái như: kích thước, số lượng tế bào và tỷ lệ các mảnh vụn bào tương củaphôi…không phản ánh đầy đủ chất lượng thực của phôi [1] Rất nhiều kĩ thuậtmới ra đời giúp lựa chọn được những phôi có tiềm năng để chuyển vào buồng
tử cung nhằm tăng cơ hội có thai Kỹ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ(Preimplantation genetic screening – Sàng lọc di truyền tiền làm tổ - PGS) làmột trong những kỹ thuật đó với cơ sở khoa học rằng: nguyên nhân chính gâythất bại làm tổ hoặc sẩy thai nhiều lần là do phôi bị bất thường về nhiễm sắcthể Kỹ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ giúp sàng lọc bất thường của phôi
ở giai đoạn sớm trước khi làm tổ nhằm phát hiện những phôi bất thường, chọnnhững phôi bình thường có tiềm năng làm tổ cao nhất để chuyển vào buồng tửcung cho bệnh nhân giúp cải thiện tỷ lệ có thai và giảm tỷ lệ thai dị tật cũngnhư tăng cơ hội sinh ra những em bé khỏe mạnh [4]
Sau một thời gian chuẩn bị kĩ lưỡng về trang thiết bị, nhân lực, kĩ thuật,tháng 10/2015, khoa Hỗ trợ sinh sản – Bệnh viện Phụ sản Hà Nội bắt đầutriển khai kĩ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ và đã thu được một số kết quảđáng khích lệ Tuy nhiên, chi phí cho một chu kì PGS tương đối cao đối vớiphần lớn các cặp vợ chồng hiếm muộn “Làm sao để giúp các cặp vợ chồngkhông có điều kiện làm PGS có thể lựa chọn được những phôi có tiềm năng
Trang 10cao và tỷ lệ bất thường NST thấp” luôn là trăn trở của chúng tôi Nhiềunghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy mối liên quan giữa hình thái phôingày 3 và kết quả xét nghiệm di truyền Đây là động lực để nhóm tác giảchúng tôi, dựa vào kết quả của những chu kỳ PGS, quyết định thực hiện đề
tài: “Đánh giá mối liên quan giữa hình thái phôi ngày 3 với kết quả xét
nghiệm di truyền bằng kỹ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ” với hai
Trang 11CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI TTTON VÀ TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI PHÔI ĐANG PHÂN CHIA
Giai đoạn phát triển phôi sớm ở người kéo dài khoảng 5-6 ngày bắt đầu
từ khi noãn thụ tinh đến khi hoàn tất giai đoạn phôi nang (blastoyst), sẵn sàngcho quá trình làm tổ Sự phát triển của phôi trước khi làm tổ được chia làm 4giai đoạn: giai đoạn tiền nhân, giai đoạn phân chia (cleavage); giai đoạn phôidâu (morula); giai đoạn phôi nang (blastocyst)
1.1.1 Giai đoạn tiền nhân
Sự hợp nhất của tinh trùng với noãn kèm theo giải cô đặc nhiễm sắc thểthường xảy ra trong tế bào chất của noãn trưởng thành Noãn thụ tinh có hìnhthành 2 tiền nhân quan sát được vào thời điểm 16-20 giờ sau ICSI Tiền nhân
có nguồn gốc từ tinh trùng thường ở trung tâm, tiền nhân có nguồn gốc từnoãn ở gần thể cực Hai tiền nhân thường nằm sát nhau thành hình số 8 vàphần tiếp xúc sát nhau tạo thành một mặt phẳng Mỗi tiền nhân có 1 đến 9 hạtnhân Những đặc điểm của 2 tiền nhân như kích thước và vị trí 2 tiền nhântrong bào tương noãn, số lượng và sự phân bố của hạt nhân có giá trị tiênlượng chất lượng phôi [11]
1.1.2 Giai đoạn phân chia (Cleavage)
Giai đoạn phân chia của phôi bắt đầu từ giai đoạn phôi 2 tế bào đến kiphôi bắt đầu nén Sự phân chia của hợp tử giai đoạn này không kèm theo sựtăng kích thước của hợp tử Từ hợp tử lớn ban đầu tạo ra nhiều tế bào con(blastomeres) và vẫn được bao ngoài bởi màng trong suốt Các tế bào đềuhình cầu, có tính đồng nhất về mặt hình thái, sinh hóa và có “tính toàn năng”,tức là đều có tiềm năng phát triển thành bất kỳ loại mô nào của cơ thể
Trang 12Hình 1.1: Sự phát triển của phôi ngày 2, ngày 3 (2, 4, 6, và 8 tế bào)[23]
1.1.3 Giai đoạn phôi dâu (morula)
Khoảng giai đoạn 8 tế bào, các tế bào biến đổi hình dạng từ hình cầusang hình dẹt, có cạnh và tựa lên nhau, tiếp xúc khăng khít với nhau, giảmkhoảng gian bào và đường viền quanh tế bào cũng mờ đi Quá trình này gọi làgiai đoạn kết khối (compaction) Phôi dâu hình thành cuối giai đoạn này,thường vào khoảng giữa ngày 3 và ngày 4, có dạng một khối tế bào đặc hìnhcầu khoảng 16-32 tế bào
Phôi giai đoạn 16 tế bào mà không có các dấu hiệu của sự kết khối sẽ bịgiảm tiềm năng và sẽ khó đạt đến giai đoạn phôi nang [2]
Hình 1.2 : Phôi dâu ngày 4 (từ lúc bắt đầu kết khối đến khi hoàn tất thành
một khối đặc không thấy ranh giới tế bào)[23]
1.1.4 Giai đoạn phôi nang (blastocyst)
Sau ngày thứ 4 của sự phát triển, phôi lúc này khoảng 30 tế bào, bắtđầu có sự hình thành xoang chứa dịch gọi là khoang phôi nang (blastocystcavity) ở trong phôi Khoảng ngày 5 sau thụ tinh, phôi nang có khoảng 100 tếbào, và biệt hóa thành 2 dòng tế bào khác biệt: tế bào bên ngoài là tế bào dẹt,lớn, gọi là “lá nuôi” (trophectoderm - TE) giúp hỗ trợ quá trình làm tổ của
Trang 13phôi, hình thành nhau thai và các phần phụ, trao đổi chất; khối tế bào bêntrong (ICM, inner cell mass) tiếp tục phân chia và co lại tạo thành một khối ở
vị trí lệch tâm chịu trách nhiệm tạo nên toàn bộ cơ thể của thai nhi sau này
Sự hình thành và phát triển của phôi nang phụ thuộc vào nhiều yếu tốliên quan như: chất lượng tinh trùng, tuổi người phụ nữ, số noãn chọc hútđược, số noãn thụ tinh, chất lượng phôi ngày 3
Hình 1.3: Phôi nang (từ lúc mới xuất hiện xoang phôi nang đến khi hình
thành phôi nang hoàn chỉnh) [23]
Chất lượng phôi nang được đánh giá dựa trên 3 tiêu chuẩn là: sự tạonang và độ nở rộng của phôi; khối tế bào bên trong (ICM) và lớp tế bào lánuôi (TE) Một phôi ngày 5 đánh giá vào thời điểm 116 ± 2h sau ICSI đượcxem là có chất lượng tốt khi có độ nở rộng tối đa, hay đã phát triển đến giaiđoạn thoát màng; có khối ICM nổi bật, thấy rõ giới hạn, bên trong có chứanhiều tế bào liên kết chặt chẽ với nhau; các tế bào TE có nhiều, ép dẹt vàomàng trong suốt và dính liền với nhau [12]
Trang 141.1.5 Các yếu tố hình thái của phôi ngày 3
Phôi giai đoạn đang phân chia được đánh giá dựa vào 3 tiêu chuẩn:
số lượng tế bào, độ đồng đều về kích thước giữa các tế bào và độ phânmảnh bào tương
Đánh giá số lượng tế bào
Số lượng tế bào là đặc điẻm chính có giá trị tiên lượng cao nhất trongđánh giá chất lượng phôi Số lượng tế bào đại diện cho tốc độ phát triển củaphôi Phôi ngày 3 (68h±1) thường có 7-9 tế bào Những phôi có tốc độ phânchia chậm hơn mong đợi có khả năng làm tổ thấp trong khi những phôi có tốc
độ phân chia nhanh hơn mong đợi có thể mang bất thường di truyền và làmgiảm tỷ lệ làm tổ [2]
Đánh giá độ đồng đều của các tế bào
Theo lý thuyết, quá trình phân cắt sẽ tạo ra 2 tế bào kích thước bằngnhau Khi quá trình phân chia diễn ra bất thường, một tế bào nhận được ít tếbào chất hơn tế bào còn lại Tế bào này sẽ tiếp tục phân chia và tạo ra nhữngdòng tế bào kích thước nhỏ hơn và nhiều khiếm khuyết hơn
Kích thước tế bào được đánh giá ở 3 mức độ: lớn, trung bình, nhỏ Phôi
có kích thước đồng đều khi kích thước của mỗi tế bào tương đối bằng nhau.Phôi có kích thước không đồng đều khi đường kính giữa tế bào lớn nhất và tếbào nhỏ nhất khác biệt từ 20% trở lên Những phôi có kích thước tế bàokhông đồng đều thường có tỷ lệ lệch bội và đa nhân cao hơn cũng như khảnăng phát triển và làm tổ kém hơn [12]
Kích thước tế bào của phôi dựa vào số lần phân chia và độ đồng đềucủa mỗi lần phân chia Thông thường những phôi có số tế bào chẵn (2, 4,hoặc 8) có kích thước tế bào tương đối đồng đều Các phôi có số tế bào lẻ nên
có kích thước không đồng đều do sự phân chia không đồng đều của 1 hoặcnhiều tế bào [2]
Trang 15Hình 1.4: Đánh giá độ đồng đều của phôi
Đánh giá độ phân mảnh của bào tương
Mảnh vỡ bào tương là những khối bào tương có màng bao, không cónhân nằm ngoài tế bào, có kích thước < 45µm đối với phôi ngày 2 và < 40µmđối với phôi ngày 3 [2] Đây là một hiện tượng thường gặp ở phôi trong ốngnghiệm Kích thước và sự phân bố mảnh vỡ bào tương thường khác nhau giữacác phôi Lượng mảnh vỡ bào tương thường được sử dụng để dự đoán khảnăng làm tổ và mức độ lệch bội của phôi [12] Mức độ phân mảnh bào tươngđược chia thành 3 cấp độ: nhẹ (< 10%), vừa (10 – 19%) và nặng (>20%).Nhiều mảnh vỡ bào tương ngăn cản và làm giảm sự tiếp xúc giữa các tế bàovới nhau, gây ảnh hưởng tới quá trình phân chia của phôi, đặc biệt là quá trìnhnén cũng như hình thành phôi nang Những phôi tốt, có khả năng phát triển vàlàm tổ cao được ghi nhận là những phôi không có hoặc ít phân mảnh Phânmảnh lớn, xuất hiện sớm sau chu kì phân bào đầu tiên ảnh hưởng nhiều đến
sự phát triển của phôi Ngược lại, những mảnh vỡ nhỏ, xuất hiện muộn ít ảnhhưởng đến sự phát triển của phôi [12]
Trang 161.2 SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ
1.2.1 Khái niệm, chỉ định
Kỹ thuật sinh thiết phôi để sàng lọc di truyền tiền làm tổ được báo cáođầu tiên năm 1989 bởi Handyside và cs Sàng lọc di truyền tiền làm tổ (PGS:Preimplantation genetic screening) là kĩ thuật áp dụng cho bệnh nhân TTTONnhằm xác định những phôi bất thường (nguyên nhân chính gây thất bại làm tổhay sảy thai nhiều lần sau chuyển phôi), chọn những phôi bình thường cótiềm năng làm tổ cao nhất để chuyển vào buồng tử cung cho bệnh nhân do đócải thiện trực tiếp tỷ lệ có thai [5]
PGS được chỉ định cho các trường hợp TTTON tiên lượng kém như: phụ
nữ lớn tuổi, tiền căn sẩy thai liên tiếp nhiều lần (trên 2 lần), thất bại làm tổnhiều lần (trên 3 lần) Trong các trường hợp này đều tìm thấy sự liên quan đếncác bất thường NST: 70% noãn bất thường phát hiện ở phụ nữ >40 tuổi, 50-90% sảy thai tự nhiên và 41,3% thất bại làm tổ [22]
1.2.2 Quy trình sàng lọc di truyền tiền làm tổ
Như vậy một chu kì PGD/PGS gồm các giai đoạn: kích thích buồngtrứng làm TTON, sinh thiết phôi, xét nghiệm di truyền và chuyển phôi So vớimột chu kỳ IVF thông thường, chu kì PGS có thêm hai giai đoạn nữa là sinhthiết phôi và xét nghiệm di truyền
Hình 1.5: Quy trình sàng lọc di truyền tiền làm tổ
Trang 171.2.2.1 Sinh thiết phôi
Đây là giai đoạn quan trọng nhằm thu nhận tế bào để phục vụ cho quátrình xét nghiệm 3 nguồn vật liệu cung cấp cho sinh thiết là tế bào thể cực ởnoãn trưởng thành, tế bào ở giai đoạn phôi đang phân chia và tế bào lá nuôi ởgiai đoạn phôi nang Mỗi thời điểm sinh thiết đều có ưu, nhược điểm khácnhau trong đó sinh thiết tế bào giai đoạn đang phân chia và giai đoạn phôinang được thực hiện rộng rãi nhất
Sinh thiết tế bào ở giai đoạn phôi đang phân chia (cleavage-embryo biopsy)
1-2 tế bào sẽ được sinh thiết vào sáng ngày thứ 3 sau thụ tinh (giai đoạn 6-8
tế bào) để làm xét nghiệm di truyền mà không gây ảnh hưởng đến khả năng sống
và phát triển tiếp của phôi Phôi sau sinh thiết sẽ tiếp tục được nuôi, chờ kếtquả xét nghiệm di truyền (khoảng 24h – 36h) và được chọn lựa để chuyển vàobuồng tử cung [8], [10]
Ở thời điểm sinh thiết phôi ngày 3 sau thụ tinh, liên kết giữa các tế bàobắt đầu chặt chẽ có thể gặp khó khăn trong quá trình sinh thiết Ngoài ra, khảnăng tự tái sắp xếp cấu trúc của phôi ngày 3 cũng như hiện tượng khảm(mosaicism) vẫn có thể xảy ra gây ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm Việc sửdụng hai tế bào để sàng lọc, chẩn đoán được đề xuất cho kết quả chính xáchơn Tuy nhiên, sinh thiết 2 tế bào được ghi nhận ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinhcũng như giảm tỷ lệ phôi làm tổ hơn so với sinh thiết 1 tế bào [9]
Hình 1.6: Sinh thiết tế bào ở phôi ngày 3 (8 tế bào)
Trang 18 Sinh thiết tế bào ở giai đoạn phôi nang (blastocyst biopsy)
Phôi sẽ được nuôi cấy đến ngày thứ 5 sau khi thụ tinh và sinh thiết 5-10 tếbào thuộc lớp tế bào lá nuôi (trophectoderm – TE) để làm xét nghiệm [8] Phôisau sinh thiết được đông lại và chuyển vào chu kì sau Phôi sinh thiết ở giaiđoạn này thường có sức sống cao hơn so với phôi giai đoạn đang phân chia
Do khối tế bào nội phôi (inner cell mas - ICM) vẫn được bảo tồn nên sự pháttriển tiếp theo của phôi không bị ảnh hưởng Kỹ thuật này giúp thu đượcnhiều tế bào hơn, có thể khắc phục được nhược điểm về hiện tượng thể khảm
và tái sắp xếp cấu trúc di truyền của phôi ngày 3 nên kết quả đáng tin cậy.Tuy nhiên, sinh thiết phôi nang tương đối khó thao tác, ít phôi phát triểnđến giai đoạn phôi nang và phải đông phôi lại để chuyển ở chu kỳ sau nhằmtránh hiện tượng thoát màng [6]
Hình 1.7: Sinh thiết phôi nang 1.2.2.2 Các kỹ thuật xét nghiệm di truyền trong PGS
Kỹ thuật FISH ( Fluorescent insitu hybridization)
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescent insitu hybridization - FISH)
là kỹ thuật sử dụng một đoạn dò đặc hiệu (probe) có bản chất nucleid acid đượcgắn tín hiệu huỳnh quang, lai với nhiễm sắc thể (NST) hoặc vùng NST ở kỳgiữa, hoặc nhân tế bào ở kỳ trung gian của quá trình phân bào Mẫu dò đặc hiệu
có thể là những trình tự ADN đặc hiệu cho các bệnh di truyền cần phát hiện, sẽgắn với những trình tự tương đồng trong gen đích để phát hiện bất thường Quan
Trang 19sát vị trí gắn kết của mẫu dò bằng kính hiển vi huỳnh quang Như vậy, FISHgiúp xác định bất thường về số lượng và bất thường chuyển đoạn NST
Kể từ lần đầu tiên được đưa vào xét nghiệm phôi người năm 1992 đến nay,
kỹ thuật FISH đã được cải tiến nhiều để có thể khảo sát được nhiều NST hơn.Các đầu dò sử dụng tập trung vào các NST có ý nghĩa về mặt lâm sàng như:
X, Y, 13, 18, 21, 14, 15, 16 và 22 [18]
Kỹ thuật CGH-microarray (lai so sánh bộ gen)
Kỹ thuật lai so sánh bộ gen cho phép đánh giá đồng thời tất cả 24NSTtrong một tế bào đơn lẻ ở bất kỳ giai đoạn phân chia nào mà không cần cốđịnh tế bào Trong kỹ thuật này, ADN cần xét nghiệm được đánh dấu huỳnhquang màu xanh lai so sánh với ADN bình thường đánh dấu huỳnh quangmàu đỏ Tỷ lệ giữa phần huỳnh quang màu xanh/ phần huỳnh quang màu đỏdọc theo nhiễm sắc thể sẽ thể hiện số lượng nhiễm sắc thể của mẫu thử vớimẫu chứng Nếu màu huỳnh quang xanh đặc hiệu cho ADN đang xét nghiệmtăng hơn chứng tỏ có sự tăng nhiễm sắc thể, ngược lại nếu màu huỳnh quang
đỏ tăng hơn là biểu hiện của thiếu nhiễm sắc thể [19]
Phương pháp này lần đầu tiên được sử dụng để tầm soát phôi người vàonăm 1996 và đã phát hiện chính xác, đầy đủ rối loạn của phôi dị bội, làm tăng
sự chính xác trong việc lựa chọn phôi để chuyển vào buồng tử cung Tuynhiên, đây là một kĩ thuật khó, cần người thực hiện phải được đào tạo chuyênsâu và thời gian trả lời kết quả cũng tương đối lâu
Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing)
Kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi ở châu Âu và Mỹ để phân tíchnhiễm sắc thể của phôi nang Nguyên lý của kỹ thuật này là chia nhỏ bộ genthành hàng trăm nghìn đoạn nhỏ; các đoạn nhỏ này sẽ được đọc trình tự songsong và nhiều lần Cuối cùng, chúng được ghép lại với nhau và được so sánh
Trang 20với một bộ gen chuẩn Kỹ thuật này không chỉ phát hiện bất thường về sốlượng nhiễm sắc thể mà còn giúp phát hiện đột biến có độ lớn >20Mb [5]
Ưu, nhược điểm của mỗi kỹ thuật được thể hiện trong bảng tổng hợp sau:
FISH BOB Microarray NGS Công
Đoạn dò gắn
bead
Công nghệdựa vào tínhiệu hình ảnh
Đoạn dò gắntrên bản lamkính
Công nghệ dựavào số liệu vềtrình tự ADN
3000 đầu dò 3000 đầu dò đọc
đi đọc lại hàngnghìn lần
Trang 21trùng có sự kết hợp và tái tổ hợp nên phôi mang bộ NST lưỡng bội đặc trưngcủa loài
Các bất thường nhiễm sắc thể bao gồm 2 loại: bất thường về sốlượng và bất thường về cấu trúc Những bất thường này gặp với tỉ lệ 1/150trẻ sinh sống và là nguyên nhân hàng đầu của các trường hợp chậm pháttriển trí tuệ và sẩy thai Bất thường số lượng NST xảy ra gây nhiều hậu quảnghiêm trọng: gây sẩy thai sớm, dị tật thai nhi Bất thường cấu trúc NSTthường ít gây chết thai nhưng có thể gây ra nhiều hội chứng bệnh lý chonhững đứa trẻ được sinh ra
Hình 1.8: Bộ nhiễm sắc thể đặc trưng của người
1.3.2 Bất thường số lượng nhiễm sắc thể
Bất thường số lượng nhiễm sắc thể bao gồm đa bội và lệch bội Đa bội
là hiện tượng số lượng NST của bộ NST đa bội là bội số của n và lớn hơn 2n
Đa bội hiếm gặp ở người
Lệch bội là hiện tượng bất thường số lượng của một hoặc một số NSTtrong bộ NST của tế bào Sự mất cân bằng này có thể dẫn đến tình trạng phôingừng phát triển trước khi làm tổ, sẩy thai hoặc thai chết lưu Tuy nhiên, vẫn
có phôi lệch bội nhiễm sắc thể có thể sống nhưng phát triển thành thai bấtthường như hội chứng Down hoặc hội chứng Klinefelter
Trường hợp tăng thêm một NST gọi là thể tam nhiễm (trisomy), trườnghợp mất một NST được gọi là thể đơn nhiễm (monosomy) Thể đơn nhiễm của
Trang 22NST gặp rất ít ở trẻ sinh sống do đa số không sống được tới khi sinh Thể tamnhiễm được gặp ở trẻ sinh sống với tần số cao hơn do cơ thể có thể dung nạptình trạng thừa vật liệu di truyền tốt hơn trường hợp thiếu vật liệu di truyền.
Bất thường lệch bội xảy ra do rối loạn phân ly của các NST trong quátrình nguyên phân hoặc giảm phân Sự không phân ly của một cặp NST nào
đó trong quá trình giảm phân có thể xảy ra ở lần phân bào thứ nhất hoặc thứhai của giảm phân và tạo ra các hậu quả khác nhau
Hình 1.9: Cơ chế tạo thể lệch bội trong nguyên phân và giảm phân
1.3.3 Bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể
Bất thường cấu trúc NST có thể ảnh hưởng đến 1, 2 NST hoặc nhiềuhơn Các bất thường này xảy ra do bất thường quá trình tiếp hợp và trao đổichéo giữa các NST tương đồng trong quá trình giảm phân hoặc do đứt gãyxảy ra trên NST trong nguyên phân hoặc giảm phân Bình thường nhữngđứt gãy này được sửa chữa tuy nhiên trong một số trường hợp những tổn
Trang 23thương không thể sửa chữa, làm thay đổi cấu trúc của NST và truyền chothế hệ sau Bất thường mất đoạn và thêm đoạn là hai dạng bất thường gâyhậu quả lớn nhất.
Mất đoạn: Một đoạn NST bị mất, có thể ở một đầu cùng hoặc nằm
trong một nhánh của NST (không bao gồm tâm động) Đôi khi mất đoạn xảy
ra ở cả hai đầu cùng của NST dẫn đến tạo NST hình nhẫn (ring chromosome).Đột biến mất đoạn làm giảm số lượng gen trên NST nên thường làm giảm sứcsống hoặc gây chết Ví dụ: ở người mất đoạn NST21 gây ung thư máu, mấtđoạn nhỏ ở NST 5 gây hội chứng tiếng mèo kêu
Thêm đoạn: Một đoạn gen được thêm vào NST Đoạn gen này có thể là
từ NST khác bị đứt gãy hoặc từ những chuyển đoạn giữa các NST Kết quả là
làm tăng số lượng gen trên NST Chuyển đoạn tương hỗ (reciprocal trans.) khi có sự trao đổi đoạn giữa 2 NST không tương đồng Chuyển đoạn
Robertson (Robertsonian trans.) còn gọi là chuyển đoạn hòa hợp tâm
(centrifusion trans.) là chuyển đoạn xảy ra giữa 2 nhánh dài của 2 NST tâm
đầu, phần vệ tinh bị mất.
Hình 1.10: Cơ chế hình thành bất thường cấu trúc NST
1.3.4 Một số hội chứng ở người do bất thường NST gây ra
Trang 24vô sinh (đa số)Trisomy
13
HC Patau: nhiều di tật: nhiều ngón, dị tật tim, thận, thầnkinh, bộ mặt bất thường, sứt môi, hở hàm ếch…95%thai trisomy 13 bị sẩy ngẫu nhiên trong thai kỳ 90% trẻchết trong năm đầu sau sinh
Trisomy
21
HC Down: mặt dẹt, mắt xếch, tai nhỏ, rãnh khỉ, lưỡi dầy
và dài và khuôn mặt đặc trưng, dễ nhận biết Trẻ sơ sinhnhược cơ gây khó khăn trong bú, ăn, táo bón Trẻ lớnchậm phát triển ngôn ngữ và nhận thức; dị tật tim, thínhgiác, thị giác, rối loạn tuyến giáp, bất thường về tiêuhóa, động kinh, các vấn đề về hô hấp, béo phì, dễ bịnhiễm trùng và ung thư bạch huyết
1.4 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ 1.4.1.Nghiên cứu về kết quả xét nghiệm di truyền
Năm 2012 Al-Asma và cs dùng phương pháp FISH 9 đầu dò (13, 15,
16, 17, 18, 21, 22, XY) đánh giá 393 phôi ngày 3 của 70 bệnh nhân (tuổi trung
Trang 25bình 34,6), có tiền sử sẩy thai cho thấy tỷ lệ lệch bội NST là 67,8% [1] Rubio
và cs năm 2013 sử dụng phương pháp FISH 9 đầu dò (13, 15, 16, 17, 18, 21, 22,XY) nghiên cứu 265 phôi ngày 3 của 91 phụ nữ có phôi thất bại làm tổ liên tiếp(tuổi trung bình 35,2), và 485 phôi của 93 phụ nữ lớn tuổi (41-44 với tuổi trungbình là 41,8), tỷ lệ lệch bội tương ứng là 57,3% và 69,2% [20]
Rubio và cs năm 2013 sử dụng phương pháp a-CGH kiểm tra phôi của
556 bệnh nhân có tiền sử sảy thai liên tiếp, phôi thất bại làm tổ nhiều lần, vôsinh nam và phụ nữ lớn tuổi thì thấy tỷ lệ lệch bội là 73,5% [21]
Ở Việt Nam, nghiên cứu sơ bộ, Nguyễn Viết Tiến và cs năm 2014 sửdụng phương pháp FISH đánh giá 5 NST 13, 18, 21, XY đã công bố tỷ lệ lệchbội NST của 37 phôi ngày 3 là 45,9% [18]
Năm 2015, Phan Thị Khánh Vy đã sử dụng phương pháp a-CGH đểđánh giá 23 cặp NST đã công bố tỷ lệ lệch bội NST của 1257 phôi ngày 3 là62,3% [19]
Năm 2017, nghiên cứu bước đầu của nhóm chúng tôi thực hiện sử dụngphương pháp giải trình tự gen thế hệ mới đánh giá 577 phôi sinh thiết ngày 3cho tỷ lệ bất thường NST là 66%
1.4.2 Nghiên cứu về ảnh hưởng của hình thái phôi đến két quả xét nghiệm
Finn và cộng sự (2010) tìm thấy phôi bình thường về số lượng nhiễmsắc thể gặp nhiều nhất ở phôi có 7-8 tế bào ở thời điểm 64h sau thụ tinh khi sovới phôi có ≤6 tế bào hay phôi có ≥ 9 tế bào [7] Magli và cộng sự trongnghiên cứu của mình phát hiện phôi ngày 3 có 7-8 tế bào ở thời điểm 62 giờsau thụ tinh có tỷ lệ bất thường NST thấp nhất [13] Campbell và cộng sự(2014), sử dụng phương pháp theo dõi phôi liên tục (time-lapseimaging) cũngkhẳng định rằng phôi lệch bội nhiễm sắc thể phát triển chậm hơn phôi bìnhthường [3] Trong nghiên cứu của Phan Thị Khánh Vy (2015), tác giả nhậnthấy tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể cao nhất ở những phôi phát triển chậm (≤ 6
Trang 26tế bào) gấp gần 1,5 lần so với phôi phát triển bình thường (7-9 tế bào) Yếu tốphát triển chậm được xem như là một cảnh báo nguy cơ cao trong dự đoánphôi lệch bội nhiễm sắc thể Nghiên cứu này còn thấy rằng phôi có kích thướccác tế bào không đồng đều tương ứng với tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể cao hơngần 2 lần so với phôi có kích thước các tế bào đồng đều [19].
Trong nghiên cứu của Magli và cs (2001), tỷ lệ phôi lệch bội NST tăng
từ 50-60% ở phôi không có phân mảnh bào tương lên 70-90% ở phôi có tỷ lệphân mảnh bào tương >35% Những phôi mà bào tương có vùng tế bào chấttập trung có tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể cao hơn những phôi có bào tươngbình thường (86% so với 63%) [13] Munne (2007) cũng nhận thấy phôi cókích thước tế bào không đồng đều có khả năng làm tổ kém hơn và tỷ lệ bấtthường di truyền cao hơn phôi có kích thước tế bào đồng đều [16]
Trang 27CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành tại khoa Hỗ trợ sinh sản, bệnh viện Phụ sản
Phôi ngày 3 (66-68h sau ICSI), từ 4 tế bào trở lên
Tỷ lệ phân mành bào tương không quá 30%
Phôi tạo từ tinh trùng có khả năng di động
Bệnh nhân thực hiện xét nghiệm sàng lọc bằng phương pháp giải trình
tự gen thế hệ mới
2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ
Phôi không đủ tiêu chuẩn
Phôi trữ lạnh
Phôi tạo ra từ tinh trùng phẫu thuật (TESE, PESA )
Bệnh nhân thực hiện xét nghiệm sàng lọc bằng phương pháp khác
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả hồi cứu và tiến cứu
2.3.2 Cỡ mẫu
Nghiên cứu theo phương pháp mô tả hồi cứu và tiến cứu nên cỡ mẫu được tính theo công thức sau:
Z²1-α/2 p qN= -
Trang 28(p Є)²Trong đó:
N = cỡ mẫu tối thiểu
Z²1-α/2 : biểu thị độ tin cậy; độ tin cậy của nghiên cứu là 95%, tươngứng với α= 5% thì Z² 1-α/2 = 1,96
Є = 0,05 là độ sai lệch của nghiên cứu so với thực tế Độ sai lệch Єchỉ nằm trong khoảng 0,1% đến 10%
p = 0,605 (tỷ lệ phôi bất thường NST trong nghiên cứu cấp cơ sởnăm 2016 của nhóm chúng tôi)
q = 1-p biểu thị tỷ lệ bình thường
Thay vào N= 1006
2.3.3 Kỹ thuật thu thập số liệu
Số liệu được thu thập từ 3 nguồn: phiếu thu thập số liệu, thông tin từ hồ
sơ bệnh án và thông tin do bệnh nhân cung cấp (trực tiếp hoặc qua điện thoại)
2.3.4 Các bước tiến hành
Bước 1: Kích thích buồng trứng, chọc hút noãn và tạo phôi
• Kích thích buồng trứng, chọc hút để thu nhận noãn: Noãn được chọchút qua đường âm đạo dưới hướng dẫn của siêu âm 36 – 38h sau tiêm hCG vàđược nuôi cấy trong môi trường G-IVF plus (Vitrolife, Thụy Điển) trong tủcấy CO2 6,0 %, 370C
• Thu nhận và lọc rửa tinh trùng
• Tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn (ICSI): tách bớt lớp tế bào
vỏ và tế bào hạt của khối cumulus, bộc lộ noãn bào, noãn trưởng thành đượcthụ tinh bằng phương pháp ICSI với tinh trùng của chồng hoặc người hiến
• Đánh giá thụ tinh: Khoảng 16-18h sau ICSI, noãn được đánh giá thụtinh Noãn thụ tinh có xuất hiện 2 tiền nhân và 2 cực cầu
Trang 29• Đánh giá phôi: Phôi được đánh giá ở thời điểm 66 - 68h sau ICSItheo tiêu chuẩn đánh giá của VINAGOFPA
Bước 2: Sinh thiết phôi ngày 3
Phôi ngày 3 để sinh thiết sẽ được ngâm trong môi trường có bổ sung
Mg2+ và Ca2+ từ 3-5 phút để làm cho liên kết giữa các tế bào lỏng lẻo hơn Sửdụng laser để mở lỗ ở màng trong suốt Khi màng trong suốt đã được mở,dùng kim sinh thiết có đường kính 30-35mm hút nhẹ nhàng 1 tế bào Tế bàonày phải nhìn rõ nhân
Hình 2.1: Kỹ thuật sinh thiết tế bào ngày 3
Tế bào thu được sau sinh thiết sẽ được rửa qua các giọt môi trường vàcuối cùng bảo quản trong dung dịch đệm PBS 1% + 10% PVB trong ống PCR0,2ml Các ống PCR này sẽ được vận chuyển đến khu vực xét nghiệm ditruyền Phôi sau sinh thiết tiếp tục được nuôi cấy và chờ kết quả xét nghiệm
Hình 2.2: Kỹ thuật rửa tế bào sau sinh thiết
Bước 3: X ét nghiệm di truyền bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới
Trang 30Phương pháp xét nghiệm di truyền chúng tôi đang sử dụng là giải trình
tự gen thế hệ mới sử dụng bộ kit VeriSeq PGS – Illumina Kỹ thuật này có thểphát hiện được các đột biến số lượng nhiễm sắc thể (đột biến thêm hoặc bớtnhiễm sắc thể) và đoạn đột biến có kích thước >20Mb
Hình 2.3: Quy trình phân tích mẫu (bộ kit VeriSeq PGS – Illumina)
Hình 2.4: Phần mềm phân tích kết quả trong kỹ thuật NGS
Bước 4: Ghi nhận kết quả
Đánh giá mối liên quan giữa hình thái phôi ngày 3 với kết quả xétnghiệm di truyền
Trang 312.3 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ PHÔI NGÀY 3 TRONG NGHIÊN CỨU
Tiêu chuẩn đánh giá hình thái phôi ngày 3: đồng thuận đánh giá noãn,phôi của VINAGOPA [12]
Phân loại Số lượng tế bào Độ đồng đều Tỉ lệ mảnh vỡ
bào tương
Tốt
8 tế bào Đều hoặc tương đối
đều (lệch nhau <20%)Đơn nhân
Tiêu chuẩn đánh giá độ đồng đều của các tế bào phôi:
Số tế bào của phôi Phôi đều/tương đối đều
4 tế bào 4 tế bào kích thước đều/tương đối đều
8 tế bào 8 tế bào kích thước đều/tương đối đều
Trang 32Hình 2.5: Phôi có kích thước các tế bào tương đối đồng đều
Hình 2.6: Phôi có kích thước tế bào không đồng đều
Trang 332.4 CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU
2.4.1 Các biến số về đặc điểm mẫu nghiên cứu
Tổng số phôi sinh thiết, số phôi tốt, số phôi trung bình, số phôi xấu
Số phôi có số lượng tế bào: 4 - 6, 7 - 9, > 9
Số phôi có tỷ lệ phân mảnh bào tương: ≤ 10%, 11 – 19%, ≥ 20%
Số phôi có độ đồng đều của tế bào: số phôi đều, số phôi không đều
2.4.2 Các biến số về kết quả xét nghiệm di truyền
Tỷ lệ phôi bình thường NST, tỷ lệ phôi bất thường NST, tỷ lệ phôi không có kết quả xét nghiệm di truyền
Tỷ lệ phôi không nhân được ADN, tỷ lệ phôi nhiễu
Tỷ lệ bất thường số lượng NST
Tỷ lệ bất thường cấu trúc NST
Tỷ lệ phôi bất thường số lượng + cấu trúc
2.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ SAI SỐ
Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS và các phương pháp thống kê
Sai số trong nghiên cứu và khắc phục:
Nghiên cứu của chúng tôi cũng có 3 loại sai số như sau:
- Sai số ngẫu nhiên: Trong nghiên cứu này, yếu tố độ phân mảnh bàotương là yếu tố chịu sai số ngẫu nhiên nhiều nhất vì phụ thuộc vàođánh giá cá nhân của người sinh thiết qua kính hiển vi đảo ngược.Thêm nữa, tỷ lệ phân mảnh bào tương được đánh giá theo thangkhoảng 0% (cho 0-2%), 5% (3-7%), 10% (8-12%), 15% (13-17%),20% (18-22%), 25%(23-27%), 30% (28-32%) tương đối rộng vàkhó chính xác Để khắc phục sai số này, chúng tôi đã tiến hành đàotạo lại nhân viên sinh thiết để đánh giá các yếu tố hình thái gần vớinhau và gần với chuẩn thực tế hơn
Trang 34- Sai số kỹ thuật: xuất hiện do các yếu tố kỹ thuật gây ra một cáchkhách quan, không do năng lực cảm nhận chủ quan của người quansát Cụ thể trong nghiên cứu này, sai số của phương tiện kỹ thuậttrong quá trình sinh thiết như hệ thống kính hiển vi đảo ngược vàcamera theo dõi kết nối màn hình máy tính hoặc trong quá trình xétnghiệm như máy nhân gen PCR, máy giải trình tự gen, máy phântích kết quả Đây là sai số không thể khắc phục.
- Sai số hệ thống: do cách chọn mẫu Trong nghiên cứu này, vì lý dokinh tế cho bệnh nhân, chúng tôi chỉ sinh thiết những phôi đủ điềukiện: phôi ngày 3 từ 4 tế bào trở lên, tỷ lệ phân mảnh bào tươngkhông quá 30% vì thế mẫu ghi nhận được không đại diện được chotoàn bộ phôi ngày 3 thu được trong các chù kì IVF tại khoa Hỗ trợsinh sản, bệnh viện Phụ sản Hà Nội
2.6 KHÍA CẠNH ĐẠO ĐỨC CỦA ĐỀ TÀI
Nghiên cứu này không can thiệp và gây ảnh hưởng đến quy trìnhIVF/PGS thường quy của khoa Hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội,
do đó không ảnh hưởng đến đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu được thựchiện với mục tiêu đưa ra được mối liên quan giữa hình thái phôi ngày 3 vớikết quả xét nghiệm di truyền, từ đó đưa ra những gợi ý trong lựa chọn phôisinh thiết cũng như thời điểm sinh thiết cho các nhà phôi học nhằm giảm tối
đa chi phí xét nghiệm cho bệnh nhân
Các thông tin cá nhân của đối tượng nghiên cứu được đảm bảo bí mật.Bệnh nhân tự nguyện tham gia chu kì PGS và được nhận vào nghiêncứu sau khi đã hoàn tất hồ sơ và kí “Bản cam kết tham gia sàng lọc di truyềntiền làm tổ (PGS)”
Trang 35CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
3.1.1 Đặc điểm về hình thái phôi
Tổng cộng có 1006 phôi ngày 3 từ 221 bệnh nhân trong nghiên cứu:
Bảng 3.1: Đặc điểm về hình thái của phôi sinh thiết
Đánh giá về số lượng tế bào của các phôi trong nghiên cứu, đa số phôiphát triển đúng tốc độ đạt số lượng 7-9 tế bào ở thời điểm sinh thiết (71,5%);
tỷ lệ phôi phát triển chậm và phát triển nhanh chiếm tương ứng là 17,3% và11,1%
Đa số các phôi ở thời điểm sinh thiết có kích thước các tế bào khôngđồng đều (70,4%)