Sàng lọc tìm kiếm hợp chất tự nhiên ức chế acetylcholinesterase có tác dụng đa đích ứng dụng trong điều trị bệnh alzheimer

Sàng lọc các chất ức chế kép đồng thời khóa cả vị trí xúc tác và ngoại vi AChE là một trong những hướng đi tiềm năng trong phát triển thuốc đa đích và đồng thời cũng là trọng tâm trong n

ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn:

Lời cảm ơn

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn

chân thành nhất đến TS Phạm Thế Hải - Giảng viên bộ môn Hóa dược, Đại học Dược Hà Nội, cô TS Lê Thị Thu Hường – Giảng viên khoa Y Dược, Đại học Quốc

Gia Hà Nội, những người thầy, cô đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu còn bỡ ngỡ khi bước vào con đường nghiên cứu khoa học, luôn ở bên chỉ bảo, động viên giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Bộ môn Hóa dược, các anh chị, các bạn và các em trong nhóm nghiên cứu đã tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp cho tôi hoàn thành khóa luận này

Xin được cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên, động viên, ủng

hộ giúp em trong suốt quá trình tiến hành nghiên cứu

Hà Nội, Ngày 20 tháng 5 năm 2019 Sinh Viên

Võ Nguyên Thành

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG 7

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 8

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về bệnh Alzheimer và các thuốc điều trị đa đích 2

1.1.1 Bệnh Alzheimer 2

1.1.2 Thuốc điều trị Alzheimer 3

1.2 Tổng quan về enzym acetylcholinesterase 4

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu in silico 6

1.3.1 Dự đoán ADMET và các thông số hóa lý 6

1.3.2 Sàng lọc ảo dựa trên docking và thuộc tính giống thuốc (drug-likeness) 7

1.3.3 Mô phỏng động lực học phân tử 9

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 12

2.1.1 Nguyên liệu 12

2.1.2 Thiết bị 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp 12

2.3.1 Sàng lọc Drugs likeness 12

2.3.2 Mô phỏng docking 13

2.3.3 Molecular Dynamic 15

2.3.4 Dự đoán ADMET và các thông số hóa lý 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Sàng lọc drug-likeness 18

3.2 Mô phỏng protein docking 18

3.2.1 Re-dock galanthamin 18

3.2.2 Sàng lọc ảo 810 hợp chất 20

3.3 Mô phỏng động lực học phân tử 24

3.3.1 Độ lệch trung bình bình phương gốc (RMSD) 24

3.3.2 Kết quả của biến động bình phương trung bình (RMSF) 26

3.3.3 Phân tích liên kết hydro giữa ligand và protein 27

3.4 Dự đoán ADMET và các thông số hóa lý 28

3.4.1 Thông số hóa lý 28

3.4.2 Dự đoán đặc tính dược động học 29

3.5 Bàn luận 31

3.5.1 Về các hợp chất mang khung lignan 31

3.5.2 Về ưu điểm của phương pháp 31

3.5.3 Về nhược điểm của phương pháp nghiên cứu 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Å Angstrom (Đơn vị đo khoảng cách, chiều dài liên kết)

Asp Aspartic Acid

P-gly Kênh vận chuyển P-glycoprotein

BBB Hàng rào máu - não

HIA Hấp thu qua đường ruột ở người

FDA Food and Drug Administration (Cơ Quan Quản lý Thực phẩm và

LogP Hệ số phân bố Octanol – nước

ADMET Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ, độc tính

AChE Enzym Acetylcholinsterase

AChE Chất ức chế enzyme Acetylcholinsterase

AD Bệnh Alzheimer

Aβ amyloid-β

NMDA N-methyl-D-aspartate

PAF Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu

MAO Monoamine oxidase

RO5 Quy tắc 5 điểm của Lipiski

MW Khối lượng phân tử

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả re-dock galanthamin 19

Bảng 3.2 24 ligand tương tác với các residue thuộc bộ ba xúc tác 20

Bảng 3.3 Điểm số docking và các tương tác giữa phối tử với đích 23

Bảng 3.4 Số lượng liên kết hydro trung bình 27

Bảng 3.5 Tính chất hóa lý của các hợp chất 29

Bảng 3.6 Đặc tính hấp thu, phân bố và thải trừ 29

Bảng 3.7 Đặc tính chuyển hóa với các enzym gan 30

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Trung tâm hoạt động của acetylcholinesterase 5

Hình 2.1 Cấu trúc các chất được vẽ bằng ChemDraw 13

Hình 2.2 Xây dựng hộp nước bằng tiện ích mở rộng Add Solvation Box 15

Hình 3.1 Tương tác của Galanthamin trong tinh thể 1dx6 18

Hình 3.2 Cấu dạng galanthamin re-dock được phân tích bằng phần mềm Discover studio 19

Hình 3.3 Kết quả sàng lọc docking 20

Hình 3.3 Tương tác các của 9 ligand với đích được phân tính bằng MOE 22

Hình 3.4 RMSD của galanthamin và 9 hợp chất theo thời gian mô phỏng 25

Hình 3.5 RMSF theo từng residue của galanthamin và 9 hợp chất 26

Hình 3.6 Số liên kết hydro của galanthamin và 9 hợp chất với đích theo thời gian 28

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Alzheimer (AD) là dạng sa sút trí tuệ phổ biến nhất, đóng góp tới 60-70% những ca lâm sàng đã ghi nhận Theo tổ chức quốc tế về bệnh Azheimer, hiện nay ước tính

có khoảng 50 triệu người trên toàn thế giới mắc bệnh, con số này sẽ tăng gấp đôi sau mỗi

20 năm, đạt 75 triệu vào năm 2030 và 131,5 triệu vào năm 2050 Cũng theo đó, tổng chi phí y tế cho AD ước tính trên toàn thế giới trong năm 2018 là 1 nghìn tỷ đô la Mỹ Con số

này sẽ tăng lên 2 nghìn tỷ đô la vào năm 2030 [32]

Cho đến nay các chất ức chế acetylcholinsterase (AChEI) đã trở thành loại thuốc được kê đơn nhiều nhất để điều trị triệu chứng của AD nhẹ đến trung bình Các thuốc này mặc dù có lợi trong việc cải thiện nhận thức và hành vi, song chúng không trì hoãn hoặc ngăn ngừa sự thoái hóa thần kinh Do vậy, hiện nay mô hình thuốc điều trị Alzheimer đơn mục tiêu truyền thống đang dần chuyển hướng sang các thuốc hướng đa đích Sàng lọc các chất ức chế kép đồng thời khóa cả vị trí xúc tác và ngoại vi AChE là một trong những hướng

đi tiềm năng trong phát triển thuốc đa đích và đồng thời cũng là trọng tâm trong nghiên cứu

“Sàng lọc tìm kiếm hợp chất tự nhiên ức chế acetylcholinsterase có tác dụng đa đích ứng dụng trong điều trị bệnh Alzheimer” Cơ sở dữ liệu của nghiên cứu hiện có 1600 hợp chất

có nguồn gốc dược liệu Việt Nam và vẫn đang tiếp tục được cập nhật [1] Với số lượng lớn hợp chất như vậy, phương pháp in silico được áp dụng để giảm thiểu thời gian nghiên cứu

và tiết kiệm ngân sách Phương pháp tiến hành với 3 mục tiêu chính:

1 Sàng lọc docking tìm kiếm các hợp chất tự nhiên tương tác mạnh với 2 vùng xúc tác

và ngoại biên của AChE

2 Mô phỏng động lực học phân tử để nghiên cứu sự ổn định của phức hợp các Protein thu được từ docking

ligand-3 Nghiên cứu đặc điểm dược động học và hóa lý của các chất nhờ các công cụ in silico

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh Alzheimer và các thuốc điều trị đa đích

1.1.1 Bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer (AD) được đặc trưng bởi sự suy giảm về khả năng nhận thức AD tăng đáng kể ở những người từ 65 tuổi trở lên, với sự suy giảm dần về trí nhớ, suy nghĩ, ngôn ngữ và khả năng học tập Bệnh thường bắt đầu với các triệu chứng nhẹ và kết thúc bằng tổn thương não nghiêm trọng

Bệnh Alzheimer lần đầu tiên được mô tả bởi bác sĩ Alois Alzheimer vào ngày 3 tháng 11 năm 1906 tại cuộc họp lần thứ 37 của Hội tâm thần học Tây Nam Đức ở Tubingen Ông mô tả một phụ nữ 50 tuổi ở Tây Nam Đức mắc chứng hoang tưởng, rối loạn trí nhớ, thường xuyên gây hấn và bối rối cho đến khi bà tử vong Báo cáo của ông ghi nhận các mảng đặc biệt và đám xơ rối trong mô não bệnh nhân Năm 1910, tái bản lần 8 quyển “Tâm thần học” của Kraepelin được phát hành và trong đó tác giả đề nghị đặt tên căn bệnh mới được tìm ra là Alzheimer Tới năm 1909, Alois Alzheimer công bố thêm 3 trường hợp khác tương tự với tình trạng của Auguste D, và một bệnh nhân mới (Josef F) chỉ có các mảng bám trong não mà không có rối loạn sợi thần kinh Từ trường hợp của Auguste D và Josef

F, Alzheimer đã chỉ ra mảng bám và đám xơ rối là các giai đoạn khác nhau của một bệnh

lý [16]

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu sâu rộng được tiến hành, tuy nhiên cơ chế gây bệnh của AD vẫn chưa được làm sáng tỏ Điều này gây cản trở việc phòng ngừa và điều trị bệnh Trong số các giả thuyết về cơ chế bệnh sinh, phải kể đến giả thuyết amyloid-β oligome (AβO) đã được công bố vào năm 1998 [6] Nó đề xuất rằng tổn thương não dẫn đến bệnh Alzheimer được kích thích bởi các AβO hòa tan, giống như ligand Trong khi đó, giả thiết Amyloid (Amyloid cascade hypothesis) đề xuất rằng sự lắng đọng của Aβ là sự kiện khởi phát bệnh lý AD dẫn đến sự hình thành các mảng bám và sau đó đến các đám rối thần kinh, chết tế bào thần kinh và cuối cùng là mất trí nhớ [33] Sự tích tụ các mảng Aβ cũng khiến cho nồng độ acetylcholin ở người mắc AD bị suy giảm đáng kể Mặt khác, acetylcholin là chất dẫn truyền thần kinh tại khe synapse, có vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thần kinh và nồng độ acetylcholin được duy trì ổn định bởi enzym acetylcholinsterase Do vậy,

thiết kế các thuốc ức chế acetylcholinsterase đóng vai trò quan trọng trong việc làm chậm tiến triển của bệnh AD

1.1.2 Thuốc điều trị Alzheimer

Cho đến nay vẫn chưa có phương pháp nào thực sự điều trị cho bệnh Alzheimer Điều trị hỗ trợ và chăm sóc bệnh nhân là những biện pháp chủ yếu Đối với các bệnh nhân mắc AD triệu chứng từ nhẹ đến trung bình, các chất ức chế acetylcholinsterase (AChEI) được kê đơn nhiều nhất Tuy nhiên, chiến lược sử dụng chất ức chế đơn đích truyền thống

là không đủ và không phù hợp để mang lại hiệu quả điều trị mong muốn vì nhiều yếu tố như sự lắng cặn amyloid-β (Aβ), viêm thần kinh, stress oxy hóa và giảm mức độ acetylcholin (ACh) đã được cho là đóng vai trò quan trọng trong bệnh học AD [48]

Mô hình phát triển thuốc AD theo hướng mới giải quyết vấn đề này bằng cách tập trung vào các chất ức chế đa đích dựa trên AChEI Có thể kể đến một số ví dụ điển hình như: Các chất ức chế kép AChEI, các AChEI ức chế NMDA, các AChEI đối kháng thụ thể PAF, các AChEI ức chế MAO-B [48]

1.1.2.1 Các chất ức chế kép AChE

Các chất này có khả năng ức chế đồng thời vị trí xúc tác lẫn ngoại vi, vì vậy không chỉ làm giảm triệu chứng suy giảm nhận thức của bệnh nhân AD bằng cách tăng số lượng ACh trong khe synap mà còn đóng vai trò là tác nhân làm chậm tiến trình của bệnh, làm trì hoãn sự hình thành mảng bám amyloid Một trong các thuốc điển hình của hướng nghiên cứu này thiết kế dẫn xuất của galanthamin - hợp chất đã được FDA công nhận sử dụng là thuốc điều trị Azheimer [42] I Doytchinova và các cộng sự đã thiết kế và tổng hợp 15 hợp chất dựa trên khung galanthamin, kết quả nghiên cứu chỉ ra các hợp chất này đều có IC50 lớn hơn galanthamin từ 10 đến 100 lần và đều có khả năng khóa khu vực xúc tác lẫn ngoại biên của AChE [10]

1.1.2.2 Các AChEI ức chế NMDA

Bệnh lý AD biểu hiện tổn thương tế bào thần kinh trên các hệ thống truyền đa thần kinh, bao gồm cholinergic, glutamatergic, dopaminergic, serotoninergic, v.v Các hợp chất nhắm mục tiêu vào các thụ thể tương ứng sẽ làm giảm độc tính synap và có lợi cho điều trị

AD Trong số các thụ thể này, thụ thể NMDA, liên quan đến tính linh hoạt synap, đã được chứng minh là có liên quan đến rối loạn chức năng glutamatergic trong bệnh lý AD [8] và

trở thành mục tiêu điều trị AD đầy hứa hẹn Trong 1 báo cáo năm 2010, Yvonne Rook và cộng sự đã chỉ ra rằng một số β-carbolines hóa trị 2 được phát hiện có khả năng ức chế thụ thể NMDA cùng hoạt tính ức chế AChE/BuChE [35]

1.1.2.4 Các AChEI đối kháng thụ thể PAF

Viêm dây thần kinh có mối tương qua với lắng đọng Aβ và rối loạn sợi thần kinh Phản ứng viêm thần kinh nghiêm trọng thúc đẩy thêm quá trình thoái hóa thần kinh [26]

Là một chất trung gian gây viêm mạnh, PAF cho thấy mức độ tăng cao trong não AD Do

đó, các thuốc ức chế cả PAF và AChE được mong chờ sẽ có hiệu lực điều trị AD tốt hơn

1.2 Tổng quan về enzym acetylcholinesterase

Acetylcholinsterase (kí hiệu: EC 3.1.1.7) là một trong hai loại enzym cholinesterase,

nó tập trung tại các khớp thần kinh cholinergic trên khắp hệ thống thần kinh trung ương và tại các khớp thần kinh cơ Tại đây, AChE nhanh chóng thủy phân acetylcholin thành cholin

và acetat [9] Việc thủy phân acetycholine giúp tái lập kích thích thần kinh và cho phép dẫn truyền xung động thần kinh mới

Trung tâm hoạt động

Cấu trúc của AChE được mô tả lần đầu tiên vào năm 1991 bởi J Sussman, người đã kết tinh thành công enzym từ cơ quan điện của loài cá đuối điện, Torpedo californiaica (TcAChE) TcAChE bao gồm 537 acid amin và được bao quanh bởi 14 chuỗi xoắn ốc [44]

Trong cấu trúc AChE, hai vùng gắn kết quan trọng cần được quan tâm là vùng xúc tác và vùng ngoại biên

Phản ứng thủy phân AChE diễn ra ở vị trí xúc tác là đáy của một khoang tác động sâu 20 Å, rộng 5 Å Vị trí này có bộ ba xúc tác là các residue Ser200, His440 và Glu327 Hoạt tính xúc tác có liên quan đến việc chuyển nhóm acetyl từ acetylcholin sang Ser200

Ngoài ra, vùng xúc tác còn có các thành phần khác như: Túi “oxyanion” với các amino acid Gly118, Gly119 và Ala201, đóng vai trò đây là nơi ổn định phức hợp trung gian được tạo thành trong phản ứng xúc tác của enzym Túi acyl với các amino acid Phe288 và Phe290, có vai trò ổn định nhóm methyl của phần acetate trong quá trình xúc tác và trong việc chọn lọc cơ chất cho enzym Một thành phần khác của vùng xúc tác là vị trí anion AChE, bao gồm Trp84, Tyr130, Phe330 và Phe331, chịu trách nhiệm liên kết nhóm amoni bậc bốn cơ chất với các tương tác cation-π [2]

Vùng ngoại biên (PAS) nằm ở lối vào của khoang tác động bao gồm các amino acid Tyr70, Asp72, Tyr121, Trp279 và Tyr334 trong đó Trp279 là thành phần quan trọng nhất Vùng này liên quan đến vai trò thúc đẩy sự kết tập các mảng β amyloid đồng thời biến đổi chức năng synap của các tế bào thần kinh hải mã [2]

Nghiên cứu từ Inestrosa và cộng sự cho thấy sự tương tác của peptide Aβ với PAS

góp phần hình thành các mảng amyloid bằng cách đẩy nhanh quá trình Oligome hóa Aβ [17] Các chất ức chế PAS có thể ngăn chặn ACh đi vào vào lõi xúc tác bằng hoạt tính ức chế không cạnh tranh cũng như ức chế sự oligome hóa do PAS gây ra Do đó, PAS đã nổi lên như một hướng đi mới đầy triển vọng cho điều trị AD [2]

Hình 1.1 Trung tâm hoạt động của acetylcholinesterase [2]

Sự thay đổi sinh hóa đáng chú ý nhất ở bệnh nhân AD là giảm nồng độ acetylcholine (ACh) ở vùng đồi thị và vỏ não [18] Do vậy, các thuốc ức chế AChE nhằm duy trì nồng

độ acetylcholine đóng vai trò tăng cường sự dẫn truyền thần kinh, giúp cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ trong việc ngăn chặn sự tiến triển của bệnh Alzheimer

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu in silico

Thuật ngữ in silico có nguồn gốc từ tiếng Latin, dùng để diễn đạt các công việc được

thực hiện trên máy tính thông qua các chương trình giả lập Vào năm 1989, thuật ngữ này lần đầu tiên được sử dụng bởi Pedro Miramontes trong hội thảo "Cellular Automata: Theory and Application" ở Los Alamos, New Mexico [28]

Ban đầu in silico dùng để chỉ các mô phỏng máy tính dùng để mô hình hóa các quá

trình tự nhiên và không đề cập đến các tính toán được thực hiện bởi máy tính nói chung Sau đó, các nhà khoa học đã nhanh chóng mở rộng và ứng dụng phương pháp này để dự đoán khả năng phát triển một hợp chất cho mục đích y học cũng như tác dụng phụ của

chúng trên con người [36] Theo tính toán của PricewaterhouseCooper, việc ứng dụng in

silico được kì vọng giúp đẩy nhanh tốc độ nghiên cứu phát triển thuốc và cắt giảm tới một

nửa chi phí [49]

Nghiên cứu in silico trong y học được cho là có khả năng tăng tốc độ tìm kiếm các

hợp chất làm thuốc Một trong những cách để đạt được mục tiêu này là sàng lọc tìm kiếm các chất ứng cử viên làm thuốc có tiềm năng Năm 2007, các nhà nghiên cứu đã sử dụng

phương pháp in silico để hỗ trợ phát hiện thuốc điều trị lao, phương pháp này cho phép các

thí nghiệm chỉ mất vài phút thay vì thực nghiệm tiêu tốn thời gian vài tháng [43] Năm

2010, bằng cách sử dụng thuật toán lắp ghép protein, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy các chất ức chế tiềm năng đối với một loại enzym liên quan đến hoạt động ung thư Một nửa

trong số các phân tử sau đó đã được chứng minh là có hoạt tính ức chế in vitro [34]

1.3.1 Dự đoán ADMET và các thông số hóa lý

1.3.1.1 Dự đoán ADMET

Các đặc tính liên quan đến sự hấp thụ, phân phối, trao đổi chất, bài tiết và độc tính (ADMET) đã trở thành một trong những vấn đề quan trọng nhất để đánh giá khả năng trở thành thuốc của một chất Phát triển một thuốc mới đòi hỏi rất nhiều chi phí và công sức Tuy nhiên, số lượng thuốc được đưa ra thị trường chiếm tỷ lệ rất nhỏ so với các thuốc đưa

chất ứng cử viên là quá trình không đơn giản Vì vậy, cùng với sự ra đời của kĩ thuật in

silico, các công cụ đến tính toán ADMET đã ra đời

AdmetSAR là một trong số những công cụ dự đoán ADMET mạnh mẽ Công cụ này tích hợp hơn 210.000 dữ liệu lưu trữ thuộc tính hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ của

96.000 hợp chất Cùng với đó là 22 mô hình dự đoán định tính với đầu ra xác suất và 5 mô hình hồi quy định lượng với đầu ra số thực tế đã được phát triển và triển khai để dự đoán các thuộc tính ADMET [5]

1.3.1.2 Dự đoán thông số hóa lý

Các thông số hóa lý là yếu tố vô cùng quan trọng trong việc cân nhắc một chất có thể trở thành thuốc được hay không Cùng với sự ra đời của các nguồn dữ liệu khổng lồ như PubChem việc tính toán các thông số hóa lý không còn là việc đơn giản Vì vậy, các công cụ hóa tin học đã ra đời để hỗ trợ quá trình tính toán

Một trong số các công cụ tiêu biểu có thể kể đến là phần mềm Datawarrior, phần mềm được phát triển bởi tiến sĩ Thomas Sander và các cộng sự nhằm mục đích giảm bớt gánh nặng trong công việc tính toán Sử dụng Datawarrior cho phép tính toán được các thông số từ cấc trúc hóa học như TPSA (Topological polar surface area – Diện tích bề mặt phân cực), logP (hệ số phân bố Octanol – nước), logS (hệ số tan) [38]…

1.3.2 Sàng lọc ảo dựa trên docking và thuộc tính giống thuốc (drug-likeness)

1.3.2.1 Sàng lọc drug-likeness dựa theo quy tắc của Lipinski

Lipinski chỉ định các hợp chất giống thuốc là những chất có các đặc tính ADMET (hấp thu, phân phối, chuyển hóa, thải trừ) đủ để vượt qua các thử nghiệm lâm sàng pha I [25] Ông cũng đưa ra bộ quy tắc 5 điểm (RO5) cung cấp một hướng dẫn để xác định đặc điểm giống thuốc Các thuộc tính như sinh khả dụng đường uống hoặc tính thấm của màng thường có mối tương quan với log P, trọng lượng phân tử (MW), số lượng liên kết hydro

cho và số lương liên kết hydro nhận trong một phân tử Quy tắc RO5 nói rằng các phân tử thể hiện sự hấp thụ hoặc thẩm thấu tốt khi logP < 5, MW < 500, số liên kết hydro cho (n OHNH) ≤ 5, số liên kết hydro nhận (n ON) ≤ 10 Nếu một hợp chất không vượt qua quy tắc RO5, nó sẽ có nguy cơ gặp vấn đề khi sử dụng đường uống Tuy nhiên một chất đáp ứng RO5 không đảm bảo nó sẽ trở thành thuốc, vì RO5 không bàn về đặc điểm cấu trúc hóa học

1.3.2.2 Mô phỏng docking

Docking là phương pháp dựa đoán chế độ liên kết thích hợp của một phân tử với phân tử thứ hai sao cho sau khi liên kết chúng tạo thành phức hợp ổn định [23] Docking phân tử là một trong những phương pháp được sử dụng thường xuyên nhất trong thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, do khả năng dự đoán cấu trúc liên kết của các phối tử phân tử nhỏ đến vị trí gắn kết đích thích hợp

Để hoàn thành mục tiêu tìm cấu dạng phù hợp nhất, kết quả docking cần liên hệ cấu hình không gian với các trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất (ligand) lên protein [19]. Các trị số đánh giá khả năng gắn kết được định lượng thông qua hàm tính điểm, nhờ đó xếp hạng khả năng liên kết mạnh hay yếu của ligand với receptor

Thực chất, quá trình docking tìm kiếm vị trí và cấu hình phù hợp nhất mà ligand có thể gắn với protein và dự đoán chính xác hoạt động của phối tử để năng lượng tự do của phức hợp mục tiêu phân tử - phối tử là nhỏ nhất [22]

Năng lượng này được cho bởi hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔG) Trong đó xét đến các tương tác như Van der Waals, liên kết kị nước, liên kết Hydro, liên kết cộng hóa trị, liên kết tĩnh điện [30]

Phân loại docking [12]

(a) Docking cứng nhắc, trong đó cả thụ thể và phân tử nhỏ được coi là cứng nhắc, chỉ quan tâm đến chuyển động tự do và chuyển động tịnh tiến của phối tử

(b) Doking phối tử linh hoạt/thụ thể cứng, đây là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong thiết kế thuốc do tính chính xác cao vào tốc độ nhanh

(c) Docking linh hoạt hoàn toàn, trong đó cả thụ thể và phối tử đều có tính linh hoạt Tuy nhiên khi thực hiện phải lưu ý giới hạn tính linh động ở những chuỗi bên đặc trưng của

Mô phỏng docking

Trước khi tiến hành mô phỏng docking cần khoanh vùng tìm kiếm cho thuật toán Vùng tìm kiếm tùy thuộc vào tưng nghiên cứu, tuy nhiên không nên quá nên tránh gây mất thời gian, cũng không nên quá nhỏ vì số cấu hình thu được sẽ giảm Khi tiến hành docking, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm trả về những cấu hình phù hợp chất của phối tử cùng với điểm số docking đi kèm Việc phân tích tương tác của các cấu hình thu được có thể thực hiện trên phần mềm như MOE, Discovery studio

1.3.3 Mô phỏng động lực học phân tử

Tính linh hoạt của vị trí liên kết mục tiêu là một khía cạnh thiết yếu nhưng thường

bị bỏ qua để được xem xét trong lắp ghép phân tử Phối tử và thụ thể có thể trải qua những thay đổi về hình dạng trong quá trình nhận dạng phân tử [24] Trong một số trường hợp, sự sắp xếp lại cấu trúc này là nhỏ và phối tử phù hợp với một vị trí gắn kết với ít sự di động Mặt khác, một số protein thực hiện các thay đổi về hình dạng đáng kể, có thể liên quan đến các yếu tố cấu trúc bậc hai và bậc ba Các vấn đề linh hoạt như vậy có thể được xử lý bằng cách sử dụng các kỹ thuật như mô phỏng động lực học phân tử (MD) [37]

MD dự đoán sự di chuyển của các nguyên tử, phân tử trong một theo thời gian dựa trên các phương trình động học như định luật chuyển động của Newton [21] Những mô phỏng này cho biết các quá trình phân tử sinh học quan trọng, bao gồm sự thay đổi về hình dạng, liên kết phối tử và protein, cho biết vị trí của tất cả các nguyên tử ở cấp độ femtosecond Nhờ đó, MD có thể dự đoán các phân tử sinh học sẽ phản ứng thế nào ở mức

độ nguyên tử

Mô phỏng MD còn được sử dụng để kiểm tra độ chính xác của cấu trúc mô hình nhiễu xạ tia X hoặc thậm chí để tinh chỉnh nó Đôi khi người ta loại bỏ ligand ràng buộc khỏi cấu trúc protein và sau đó mô phỏng MD để xem việc loại bỏ phối tử ảnh hưởng đến cấu trúc protein như thế nào [11] Trong một số trường hợp, một hay nhiều acid amin trong protein sẽ bị đột biến rồi sau đó sử dụng MD để giải thích, dự đoán ảnh hưởng của đột biến đến hệ [7] Mô phỏng MD đặc biệt có giá trị trong thiết kế thuốc, sau khi sàng lọc ảo, các phức hợp của các ligand tiềm năng với protein được mô phỏng MD để nghiên cứu sự ổn định của hệ [46]

Trường lực trong mô phỏng động lực học phân tử

Trường lực là một biểu thức toán học mô tả sự phụ thuộc năng lượng của một hệ vào tọa độ của các hạt của nó Nó là một dạng phân tích của năng lượng tiềm năng của các tương tác và một tập hợp các tham số tham chiếu Một trường lực lý tưởng phải đủ đơn giản để được đánh giá nhanh chóng, nhưng đủ chi tiết để tái tạo các thuộc tính quan trọng của hệ thống được nghiên cứu [14] Trong động lực phân tử, trường lực là một tập hợp các phương trình và hằng số liên quan được thiết kế để tái tạo hình học phân tử và các thuộc tính được chọn của các cấu trúc được thử nghiệm Nó dùng để mô tả sự biến đổi theo thời gian của độ dài liên kết, góc và độ xoắn của liên kết, cũng tương tác van der Waals, tương tác tĩnh điện…

4 bước trong mô phỏng MD [14]

Bước 1: Thiết lập hệ thống Giai đoạn này phải tạo ra một cấu hình hợp lý của hệ thống cần mô phỏng, chọn trường lực hợp lệ cho hệ thống này, chọn phương pháp xử lý các tương tác tĩnh điện nếu hệ thống chứa mang điện tích, chọn điều kiện định biên định kì (thiết lập hộp mô phỏng)

11

Bước 2: Cực tiểu hóa Thông thường cấu hình ban đầu của hệ sẽ không đại diện cho các điều kiện chúng ta muốn mô phỏng Ví dụ: nếu xuất phát từ mô phỏng MD trước đó, chúng ta có thể muốn mô phỏng hệ thống ở nhiệt độ khác Nếu các vị trí ban đầu được xác định ngẫu nhiên, chúng ta có thể có một số nguyên tử quá gần gây ra xung đột cho cấu trúc

hệ Quá trình cân bằng sẽ tìm kiếm một trạng thái có năng lượng thấp nhất và loại bỏ năng lượng dư thừa khỏi hệ thống để ngăn chặn mô phỏng thất bại do xuất hiện một lực quá lớn

Bước 3: Mô phỏng Sau khi cực tiểu hóa ở nhiệt độ và áp suất mong muốn, chúng

ta có thể thực hiện quá trình mô phỏng, trong điều kiện NVP hoặc NPT Một điều cần lưu

ý là thời gian mô phỏng phải đủ dài để cho phép các đại phân tử khám phá tất cả các cấu

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Cơ sở dữ liệu VNPD gồm cấu trúc của 1424 hợp chất có nguồn gốc dược liệu Việt Nam và các thông tin như nguồn dược liệu, tác dụng dược lý đã nghiên cứu được lưu trữ trong file excel

Cấu trúc tinh thể tia X của Acetylcholin esterase (1dx6) được tải về từ ngân hàng dữ liệu protein (Protein data bank)

2.1.2 Thiết bị

Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng bao gồm:

Chemdraw Professional 15.0 Microsoft Excell 2016

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Sàng lọc các hợp chất tự nhiên và xác định cấu dạng khi chúng ức chế enzym Acetylcholin Esterase thông qua mô phỏng docking và phương pháp drug-likeness

2 Xác định độ ổn định của hệ protein-ligand thông qua mô phỏng động lực học phân

bộ công cụ ChemOffice2015 Sau khi nạp dữ liệu đầu vào, DruLiTo sẽ dự đoán các

Trong phức hợp TcAChE (pdb: 1DX6) chứa sẵn ligand đồng kết tinh là galantamine

Do đó, Re-dock Galathamin là cách để thẩm định quy trình dock Nếu sự sai lệch của Galathamin trong tinh thể và sau khi Re-dock là không đáng kể thì có thể kết luận quy trình dock là phù hợp Các bước Re-dock gồm;

Chuẩn bị ligand: Quá trình này được tiến hành với 3 cấu dạng ligand

(1) Tách ligand đồng kết tinh TcAChE trong tinh thể 1dx6

(2) Tách ligand đồng kết tinh và chuẩn bị lại trong phần mềm ICM-Pro

(3) Vẽ ligand hoàn toàn mới bằng Chemdraw và chuẩn bị lại trong ICM-Pro 3.8-6 Chuẩn bị protein: Cấu trúc tinh thể của TcAChE đồng kết tinh với Galanthmin (PDB: 1dx6, độ phân giải 2,3Å) được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein (Protein data bank), loại nước, các cấu tử (ligand) ra khỏi cấu trúc của protein, thêm hydro, tối ưu hóa các hydro phân cực và gắn trường lực MMFF Tất cả các bước này đều được tiến hành trong phần mềm ICM-Pro

Mô phỏng docking: Tiến hành docking bằng phần mềm ICM với các tùy chọn Nỗ lực (effort = 1,0); số cấu hình (N comformation = 30); Score version 2005; kích thước hộp tìm kiếm 22x22x33 Å Phân tích các kết quả bằng phần mềm Discovery studio và MOE Đánh giá kết quả:

Kết quả docking được đánh giá thông qua 3 tiêu chí là RMSD (Root mean square deviation),khả năng tương tác và điểm số docking

RMSD: đo độ lệch trung bình của các nguyên tử giữa 2 cấu dạng Công thức tính RMSD cho 2 cấu dạng a, b như sau:

2 )

,

Trong đó n là tổng số nguyên tử; ix, iy, iz là toạ độ không gian của nguyên tử thứ i RMSD càng lớn thì mức độ sai lệch của hai cấu dạng càng lớn Thông thường RMSD ≤ 1,5Å thì có thể xem sự sai lệch là không đáng kể [15]

Khả năng tương tác: sử dụng phần mềm MOE để phân tích các tương tác (hydro,

-, ion, tương tác cation--, Van der Waals) giữa galanthamin re-dock với protein, các tương tác này được so sánh với tương tác của galanthamin ban đầu

Điểm số docking (score): Trong mô phỏng docking, năng lượng liên kết thấp hơn được cho là gần với trạng thái tự nhiên của phức hợp Hàm tính điểm của thuật toán docking

là phương trình là tập hợp giá trị các tham số đi kèm với hệ số theo một lý thuyết áp đặt nhất định Mỗi loại tương tác, đều được gán cho 1 miền giá trị, kết quả cuối phản ánh khả năng tương tác mạnh hay yếu của phối tử với receptor

2.3.2.2 Sàng lọc ảo 1424 hợp chất

Sau khi được thẩm định bởi kết quả re-dock, quy trình docking này được dùng để sàng lọc ảo cơ sở dữ liệu VNPD 1424 chất Các hợp chất tiềm năng được đưa vào ICM dưới dạng công thức cấu tạo trong file sdf ICM sẽ áp dụng trường lực MMFF, cực tiểu hóa năng lượng, điều chỉnh điện tích ở pH7 cho các hợp chất

Kết quả protein docking sẽ chọn ra với 3 tiêu chí:

1) Điểm số docking tốt hơn galanthamin re-dock

2) Tạo liên kết với bộ ba xúc tác trong vùng thủy phân cơ chất

3) Tạo liên kết với vùng ngoại biên

15

2.3.3 Molecular Dynamic

2.3.3.1 Thiết lập hệ thống

Thu thập tọa độ Protein

Để bắt đầu mô phỏng MD trước tiên cần file tọa độ cấu trúc của cả đích (protein) và phối tử (ligand) ở dạng file PDB Với protein sử dụng định dạng PDB được tải xuống từ ngân hàng dữ liệu cấu trúc của protein (địa chỉ domain: http://www.rcsb.org) File PDB của ligand được lấy từ kết quả docking Sau đó sử dụng công cụ online Charmmgui (http://www.charmm-gui.org) để áp dụng trường lực Charm36 cho cả protein và ligand

Thiết lập điều kiện định biên (thiết lập hộp nước)

Điều kiện biên định biên được áp dụng cho mô phỏng động lực học phân tử để theo dõi chuyển động của tất cả các hạt và để tránh / giảm thiểu hiệu ứng cạnh trên các nguyên

tử bề mặt Hộp nước được thiết lập bởi phần mềm VMD sao cho khoảng cách từ bề mặt protein tới cạnh hộp là 10 Å Sau đó thực hiện solvat hóa hệ thống bằng nước nhờ tiện ích

mở rộng Add Solvation Box (hình 2.2) trong VMD để bắt chước môi trường sinh lý của một protein Đây là bước cần thiết để mô phỏng MD với điều kiện định biên

Hình 2.2 Xây dựng hộp nước bằng tiện ích mở rộng Add Solvation Box 3