Khảo sát khả năng ức chế enzym tyrosinase của dịch nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae (Ahlb.) E.Cohn trong môi trường chứa chè xanh Camellia sinensis (L.) Kuntze

Một số nghiên cứu về tác dụng ức chế tyrosinase của chè xanh và Aspergillus oryzae.... Hiện nay trên thị trường có một số chất được sử dụng làm trắng da có nguồn gốc tổng hợp hóa học như

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỮU ĐỨC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYM TYROSINASE CỦA DỊCH

NUÔI CẤY NẤM MỐC Aspergillus oryzae (Ahlb.) E Cohn TRONG MÔI

TRƯỜNG CHỨA CHÈ XANH

Camellia sinensis (L.) Kuntze

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỮU ĐỨC

MÃ SINH VIÊN: 1401147

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ

ENZYM TYROSINASE CỦA DỊCH

NUÔI CẤY NẤM MỐC Aspergillus

oryzae (Ahlb.) E Cohn TRONG MÔI

TRƯỜNG CHỨA CHÈ XANH

Camellia sinensis (L.) Kuntze

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới PGS.TS Đàm Thanh Xuân – người thầy đã truyền dạy cho tôi những bài học quý báu cũng như lòng yêu khoa học từ những ngày đầu nghiên cứu tới nay, đã hết lòng hướng dẫn, tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo và các anh, chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược, đặc biệt là tổ Công nghệ Sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ tôi giải quyết khó khăn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, các phòng ban cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, tạo môi trường tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu tại trường trong suốt 5 năm

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ở bên, tiếp cho tôi động lực, giúp đỡ tôi trên quãng đường học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019

Sinh viên Nguyễn Hữu Đức

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Aspergillus oryzae 2

1.1.1 Chi Aspergillus 2

1.1.2 Loài Aspergillus oryzae 3

1.2 Enzym tyrosinase 5

1.2.1 Định nghĩa 5

1.2.2 Vai trò 6

1.2.3 Một số chất ức chế tyrosinase, cơ chế và ứng dụng 8

1.3 Chè xanh 11

1.3.1 Vài nét về chè xanh 11

1.3.2 Các catechin chè xanh 12

1.4 Một số nghiên cứu về tác dụng ức chế tyrosinase của chè xanh và Aspergillus oryzae 14

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Nguyên vật liệu 16

2.1.2 Thiết bị sử dụng 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.2.1 Khảo sát khả năng sinh trưởng của Aspergillus oryzae trong dịch chiết lá chè xanh 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp giữ giống 20

2.3.2 Phương pháp lên men 20

2.3.3 Phương pháp định tính acid kojic từ dịch lên men [10] 21

2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase [33] 21

2.3.5 Phương pháp Schoorl - Regenbogen định lượng đường khử [5] 22

2.3.6 Phương pháp định lượng đường saccharose [9] 23

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Khảo sát khả năng sinh trưởng của Aspergillus oryzae trên môi trường có chứa dịch chiết chè 24

3.1.1 Định lượng đường tiêu thụ của Aspergillus oryzae từ dịch sau lên men 24

3.1.2 Khảo sát khối lượng sinh khối khô thu được 27

3.1.3 Định tính và kết tinh acid kojic trong dịch lên men sau khi kết thúc của các môi trường 29

3.2 Thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của dịch nuôi cấy 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ECDG Epicatechin digallate

ECG Epicatechin gallate

EGC Epigallocatechin

EGCDG Epigallocatechin digallate

EGCG Epigallocatechin gallate

GC Môi trường lên men sử dụng glucose 10% và dịch chiết nước

chè xanh

GC Gallocatechin

GCG Gallo catechin gallate

GN Môi trường lên men sử dụng glucose 10% và nước RO

RO Reverse Osmosis – Thẩm thấu ngược

S10C Môi trường lên men sử dụng saccharose 10% và dịch chiết

nước chè xanh

S20C Môi trường lên men sử dụng saccharose 20% và dịch chiết

nước chè xanh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Độc tố của một số chủng giống nấm mốc thuộc chi Aspergillus 3

Bảng 1.2 Thành phần polyphenol nguyên liệu chè theo vùng và vụ thu hái 12

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong đề tài 16

Bảng 2.2 Các môi trường sử dụng trong đề tài 17

Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng 19

Bảng 3.1 Các môi trường lên men Aspergillus oryzae 24

Bảng 3.2 Hàm lượng đường glucose (GN, GC) và saccharose (S10C, S20C) trong môi trường trước và sau khi lên men 25

Bảng 3.3 Kết quả khối lượng sinh khối khô thu được 28

Bảng 3.4 Kết quả kết tinh sản phẩm từ dịch lên men sau khi kết thúc của các môi trường nuôi cấy 31

Bảng 3.5 Kết quả % ức chế tyrosinase của dịch nuôi cấy trong các môi trường khác nhau tại nồng độ thử 100 µg/ml 33

Bảng 3.6 Kết quả % ức chế tyrosinase của dịch nuôi cấy trong các môi trường khác nhau tại nồng độ thử 500 µg/ml 33

Bảng 3.7 Kết quả % ức chế tyrosinase của chất đối chứng hydroquinone 33

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi quang học (a), (b) và dưới kính

hiển vi điện tử (c) 4

Hình 1.2 Con đường phản ứng trong tổng hợp sắc tố melanin từ tyrosin 7

Hình 1.3 Công thức tổng quát của catechin 13

Hình 1.4 Một số cấu trúc catechin chè xanh điển hình 13

Hình 3.1 Khối lượng đường tiêu thụ trong quá trình lên men 26

Hình 3.2 Khối lượng trung bình sinh khối khô của Aspergillus oryzae khi nuôi cấy trong các môi trường 28

Hình 3.3 Hình ảnh định tính acid kojic trong dịch sau lên men của môi trường lên men GN (trái) và GC (phải) 30

Hình 3.4 Hình ảnh sản phẩm thu được khi kết tinh dịch sau lên men của môi trường nuôi cấy GN (a) và GC, S10C, S20C (b) 31

Hình 3.5 Biểu đồ biểu thị giá trị % ức chế trung bình của các môi trường lên men đối với enzym tyrosinase 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ xưa đến nay, làm đẹp luôn là vấn đề được đặc biệt chú trọng ở nữ giới cũng như nam giới Trong thời đại công nghiệp phát triển hiện nay, con người ngày càng tiếp xúc nhiều với các hóa chất độc hại, với môi trường bị ô nhiễm bên ngoài khiến làn da nhanh chóng bị tổn hại, ảnh hưởng đến vẻ đẹp bên ngoài Ngoài ra các yếu tố bất lợi này còn là nguyên nhân dẫn đến xuất hiện các bệnh liên quan đến da như tăng cường quá mức hắc tố da, làm da xuất hiện nhiều mảng tối màu bất thường và có thể dẫn đến ung thư da Do đó các chế phẩm chăm sóc da, làm trắng da ngày càng được sử dụng nhiều Hiện nay trên thị trường có một số chất được sử dụng làm trắng da có nguồn gốc tổng hợp hóa học như hydroquinone, hydrogen peroxide…- thuộc nhóm có khả năng ức chế tốt enzym tyrosinase - mặc

dù có tác dụng hiệu quả làm sáng da và chiếm ưu thế nhưng vẫn gây hại cho người

sử dụng [19], các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên ngày càng được ưa chuộng và hiện đang được chú trọng đầu tư nghiên cứu [14]

Trong một nghiên cứu về thành phần làm trắng da chứa dịch chiết lá chè xanh

được nuôi cấy với Aspergillus oryzae của nhóm tác giả CHANG và cs đã cho kết

quả khả quan [16] Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có bài báo nào đề cập nghiên cứu

về vấn đề này Do đó, để góp phần vào nghiên cứu các chất trắng da, đề tài “Khảo

sát khả năng ức chế enzym tyrosinase của dịch nuôi cấy nấm mốc Aspergillus

oryzae (Ahlb.) E Cohn trong môi trường chứa chè xanh Camellia Sinensis (L.) Kuntze” được tiến hành với các mục tiêu sau:

- Khảo sát khả năng phát triển của Aspergillus oryzae trên môi trường có

chứa dịch chiết chè xanh

- Thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của dịch chiết chè xanh được lên

men bởi Aspergillus oryzae

và 50.000 loài được mô tả, tuy nhiên ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài

nấm hiện diện trên trái đất [7] Aspergillus là một trong những chi nổi tiếng nhất

và được nghiên cứu nhiều nhất Giống nấm Aspergillus có thể lên đến 200 loài,

trong đó có khoảng 20 loài gây hại cho con người

Aspergillus có dạng hình sợi, phân nhánh, có vách ngăn, không màu, màu nhạt

hoặc trở nên nâu, nâu nhạt ở một số vùng nhất định trên khuẩn lạc Sợi nấm đa bào, đầu sợi nấm sinh sản phình to ra tạo thành các tế bào hình chai, phía trên mọc các cuống sinh bào tử đính Các bào tử đính xòe ra như những bông hoa cúc Về

màu sắc: Aspergillus niger màu đen, Aspergillus oryzae màu vàng hoa cau,

Aspergillus awamori màu đen, Aspergillus flavus màu vàng xanh, Aspergillus usami màu đen nâu Chúng phân bố chủ yếu trên bề mặt các loại lương thực thực

phẩm trong quá trình bảo quản, trong đất, ở nhiều loại đồ dùng trong gia đình, một số đồ dùng công nghiệp và còn kí sinh trên cả cơ thể sống Nhiều loài đóng vai trò như những vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ, một số loài được dùng trong công nghiệp để tạo ra acid oxalic, acid citric, nhiều loại men, chất kháng sinh…

Ở Việt Nam, Aspergillus oryzae đã được sử dụng từ lâu với mục đích làm tương

và được gọi là mốc vàng, mốc hoa cau [8]

Vào năm 1960, người Anh chịu thiệt hại lớn do một vụ dịch gà tây ăn phải khô lạc mốc nhập từ Braxin với nguyên nhân được phát hiện là do độc tố của

Aspergillus flavus Người ta đã xác định được độc tố này và đặt tên là aflatoxin,

tên chắp từ ba chữ: “A” của chữ “Aspergillus”, “fla” của chữ “flavus” và “toxin”

nghĩa là độc tố Cho đến cuối năm 1973 thì các aflatoxin đã phát hiện tới 16 loại

B1, aflatoxin B2, aflatoxin G1, aflatoxin G2 (có trong Aspergillus flavus,

Aspergillus parasiticus) Ngoài hai loại Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, nhiều loài Aspergillus khác cũng được xác định là sinh ra các độc tố

ít nhiều gây nhiễm độc cơ thể [8]

Bảng 1.1 Độc tố của một số chủng giống nấm mốc thuộc chi Aspergillus [17]

Aspergillus flavus Aflatoxins, Aflatrem, Aspergilic acid, Cydoplazonic acid, β-nitropionic acid, Serigmatocyctin

Aspergillus oryzae Aspergilic acid, Cycopiazonic acid, Maltoryzine

β-nitropropionic acid, Ochtratoxins

Aspergillus parasiticus Aflatoxins, Aspergillic acid, Sterigmatocyctin

Aspergillus toxicarius Aflatoxins

1.1.2 Loài Aspergillus oryzae

Một số chủng nấm mốc thuộc giống Aspergillus được sử dụng trong công nghệ

lên men, sản xuất enzym (amylase, protease, pectinase…) và các acid hữu cơ (acid

citric, acid glucomic…) trong đó có Aspergillus oryzae Loài Aspergillus oryzae

là loài có tính an toàn cao vì đặc tính không sinh độc tố aflatoxin đã được chứng mình qua các nghiên cứu về độ an toàn [11], và được thực tiễn chứng minh do

Aspergillus oryzae đã được sử dụng trong sản xuất thực phẩm lên men trên nhiều

nước hơn nghìn năm qua

Loài Aspergillus oryzae được phân loại thuộc:

Năm 1950, Aspergillus oryzae được phân lập lần đầu bởi Jokichi Takamine –

một nhà khoa học Nhật Bản và được gọi là RIB40 hoặc ATCC 42149 theo

Wikipedia (2014) Năm 2001, bộ gen di truyền của Aspergillus oryzae đã được

phân tích và giải mã Hệ gen gồm 8 nhiễm sắc thể với 12.074 gen và 37 triệu cặp

base (theo Machida và cộng sự, 2005) [29] Đến nay, loài Aspergillus oryzae đang

được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực ở các quốc gia khác nhau, đặc biệt là các nước châu Á

Nấm Aspergillus oryzae có cấu tạo đa bào, sinh sản bằng bào tử, không sinh

độc tố aflatoxin và tạo hương tốt Khi mới phát triển hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển sang màu vàng, khi già thì chuyển hẳn sang màu xanh lục, phân nhánh có vách ngang chia sợi thành nhiều tế bào sợi mảnh, chiều ngang sợi khoảng 5 – 7

µm Từ những sợi nằm ngang hình thành những sợi thẳng đứng gọi là cuống đính

bào tử, ở đầu có cơ quan sinh sản vô tính Cuống đính bào tử của Aspergillus

oryzae thường dài 1,0 – 2,0 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu

cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài gọi là những tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử dính vào nhau, gọi là đính bào tử, có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau (dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia) Đây

chính là đặc trưng ở Aspergillus oryzae [4]

(a) (b) (c)

Hình 1.1 Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi quang học (a), (b) và dưới kính

hiển vi điện tử (c) [22]

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử của Aspergillus oryzae là

45%, nhiệt độ thích hợp trong khoảng 28ºC – 32ºC, độ ẩm không khí 85-95%, pH môi trường từ 5,5 đến 6,0, hoàn toàn hiếu khí Nấm mốc phải trực tiếp sử dụng các chất hữu cơ có sẵn trong môi trường để phát triển và đảm bảo hoạt động bình thường [4]

Aspergillus oryzae có các enzym thủy phân nội bào và ngoại bào như amylase,

glucoamylase, protease, pectinasa, xylanase, hemicellulase Trong đó hệ enzym

amylase tổng hợp từ Aspergillus oryzae có hoạt lực cao hơn so với một số chủng nấm mốc và vi khuẩn khác Ngoài ra Aspergillus oryzae có khả năng tổng hợp cả

ba loại enzym protease (acid, kiềm và trung tính) Khả năng sinh enzym được ứng dụng trong các chế phẩm giúp tăng cường hoạt động của vi khuẩn đường ruột, cung cấp enzym tiêu hóa như sản phẩm N.Zimes P.A Plus, En Clair Smart Enzyme trên thị trường

Chủng Aspergillus oryzae là loại nấm sợi quan trọng trong công nghiệp, cách

đây hàng nghìn năm nó được dùng để lên men rượu sake, pate đậu phộng, nước

tương ở Nhật Người ta nhận ra rằng Aspergillus oryzae lên men tương ngon hơn

so với một số chủng khác vì chúng có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp

thành đường làm tương có vị ngọt [28] Aspergillus oryzae đang được ứng dụng

rộng rãi trong công nghệ lên men truyền thống ở nhiều nước châu Á như Trung

Quốc, Nhật Bản, Philippin, Indonesia và Việt Nam Hiện nay chủng Aspergillus

oryzae đã được đưa vào sử dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất enzym

(α-amylase, glucoamylase) và trong các ngành chế biến thực phẩm

Trong mỹ phẩm, Aspergillus oryzae được sử dụng chủ yếu để sản xuất acid

kojic – chất dùng trong điều trị bệnh tăng sắc tố da, trong mỹ phẩm làm trắng da, điều trị nám – hay thành phần trong kem dưỡng ẩm như Rohto Kouji Hada Cream, HadaLabo Kouji Treatment Night Cream

1.2 Enzym tyrosinase

1.2.1 Định nghĩa

Tyrosinase (monophenol monooxygenase, EC 1.14.18.1) là một enzym chứa đồng được tìm thấy trong nhiều loài động vật và thực vật, có vai trò quan trọng

trong con đường tổng hợp melanin (chuỗi phản ứng sinh học Mason - Raper) trong

các tế bào sắc tố [42]

Tyrosinase ban đầu được tìm thấy trong dịch chiết nấm (Bourquelot and Bertrand, 1895) sử dụng tyrosin làm cơ chất chính Chúng có thể sử dụng các chất giống tyrosin, như cresol, catechol và các dẫn chất tương tự, làm cơ chất và có ít hoặc không có yêu cầu về cofactor (Pugh and Raper, 1927; Wagreich and Nelson, 1936; Mason, 1949; Jimtnez et al., 1984, 1986a) Mặt khác, các tyrosinase trên động vật có vú chỉ sử dụng dạng L-tyrosin, L-dopa làm cơ chất và yêu cầu L-dopa làm cofactor, và chúng tập trung chủ yếu trong tế bào đặc biệt, tế bào sắc tố [42]

1.2.2 Vai trò

Tyrosinase xúc tác cho ba phản ứng khác nhau trong con đường sinh tổng hợp melanin: 1) phản ứng hydroxyl hóa tyrosin thành 3,4-dihydroxyphenylalanine (dopa); 2) phản ứng oxy hóa dopa thành dopaquinone; 3) phản ứng oxy hóa 5,6-dihydroxyindole thành indole 5,6-quinone Trong đó, hai phản ứng đầu tiên là đặc biệt cẩn thiết bởi sau khi chúng được hoàn thành thì melanin có thể được tổng hợp

tự phát trong ống nghiệm [26]

Hình 1.2 Con đường phản ứng trong tổng hợp sắc tố melanin từ tyrosin [41]

Trong phản ứng khởi đầu chuỗi, chuyển từ tyrosin thành dopa, hoạt tính xúc tác của tyrosinase tương tự như tyrosin hydroxylase (EC 1.14.16.2, được tìm thấy

ở tế bào thần kinh) Tuy nhiên chúng có vài đặc điểm khác biệt cơ bản Thứ nhất, chúng đều có thể dễ dàng phân biệt dựa trên yêu cầu chất làm cofactor của riêng chúng Trong đó tyrosinase yêu cầu dopa, còn tyrosin hydroxylase yêu cầu tetrahydroterin làm cofactor Khác biệt thứ hai là tyrosinase là một enzym chứa đồng và tyrosin hydroxylase là một enzym chứa sắt Do đó chúng có thể được phân biệt dựa trên chất ức chế đặc hiệu của một trong hai kim loại đó Cuối cùng, khác biệt cơ bản là tyrosin hydroxylase chỉ xúc tác cho một phản ứng duy nhất Trong các tế bào thần kinh cũng có enzym dopa decarboxylase (EC 4.1.1.26) sử dụng dopa làm cơ chất với sản phẩm là hydroxytyramine, sau đó đi vào con đường tổng hợp catecholamin/adrenalin Mặt khác, tyrosinase xúc tác cho phản ứng oxy hóa dopa thành dopaquinone Vài nghiên cứu chỉ ra rằng tyrosinase có chứa các

trung tâm hoạt động khác nhau cho mỗi phản ứng xúc tác của chúng và có thể còn bao gồm thêm cả một trung tâm gắn dopa làm cofactor [41] Có thể thấy vai trò đặc biệt quan trọng của enzym tyrosinase trong con đường tổng hợp sắc tố

và có thể thay đổi sự hình thành melanosome, do đó gây tổn hại có chọn lọc cho

các tế bào sắc tố [40]

- Hydroquinone đã được sử dụng trong nhiều thập kỉ với tác dụng là một chất làm trắng da Do các mối lo ngại về các tác dụng trung hạn như gây mảng trắng trên da, đặc biệt là trên mặt (confetti depigmentation) và các mảng tối màu trên

da (exogenous ochronosis) Ảnh hưởng lâu dài cũng có thể xay ra, ưng thư là dễ xảy ra nhất Do đó việc sử dụng chúng trong mỹ phẩm đã bị cấm từ tháng 1 năm

2001 [25] Và hiện nay trong sản phẩm trắng da chỉ sử dụng với nống độ không lớn hơn 2%, việc sử dụng hydroquinone phải thông qua các đơn thuốc được bác

sĩ chỉ định

- Một số sản phẩm chứa hydroquinone trên thị trường: Murad Rapid Age Spot and Pigment Lightening Serum (chứa 2% Hydroquinone), RESIST Triple-Action Dark Spot Eraser 2% BHA Gel

Vì lo ngại về tác dụng phụ của các chất làm trắng nguồn gốc tổng hợp như hydroquinone và xu hướng ưa chuộng các sản phẩm nguồn gốc tự nhiên hiện nay

mà các chất là sản phẩm chuyển hóa sinh học như acid kojic, chiết xuất từ thực vật như arbutin, các vitamin được sử dụng phổ biến hơn:

 Acid kojic

- Là sản phẩm chuyển hóa của một số loài nấm Aspergillus và Penicillium,

được sử dụng như là tác nhân làm trắng da trong các sản phẩm chăm sóc da được bán ở Nhật bản từ năm 1988 Hiệu quả làm trắng da được biết đến nhờ khả năng

ức chế enzym tyrosinase do cấu trúc γ-pyranone có nhóm enolic hydroxyl Nếu nhóm chức này bị khóa thì hoạt tính ức chế của acid kojic sẽ hoàn toàn bị mất Acid kojic ức chế tyrosinase bằng cách tạo phức chelat với nguyên tử đồng ở vị

trí trung tâm hoạt động của enzym [13] Acid kojic thường được sử dụng kết hợp

với hydroquinone trong các công thức làm trắng da để kiểm soát tàn nhan và đồi mồi Tuy nhiên hiện nay hydroquinone đã bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm Do đó, hiện nay việc sử dụng acid kojic trong các chế phẩm làm trắng da đã gia tăng đáng

kể [36] Nồng độ được khuyên dùng của acid kojic trong mỹ phẩm là từ 0,5% đến

1,0% [15]

- Một số sản phẩm trên thị trường có chứa acid kojic như Skin Ceuticals

Phyto+, Skin Linghtening Cream, Pure Kojic Acid Kojic Lightening Body Lotion

- Ngoài ra, Acid kojic cũng hoạt động như chất chống oxy hóa và loại bỏ oxy nguyên tử được giải phóng từ các tế bào hoặc được tạo thành trong mô hoặc máu Phản ứng của acid kojic với muối kim loại nhôm, crom, coban, đồng, vàng, indi, sắt, niken, mangan, palladi, vanadi, và kẽm dẫn đến sự hình thành các phức kim loại kojate ổn định Do khả năng tạo phức chelat với sắt, acid kojic và các dẫn chất đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát bệnh quá tải sắt như β-thalassemia hay anemia Hơn nữa, các tác dụng sinh học khác bao gồm kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống viêm, chống ung thư… đã được nghiên cứu và báo cáo cho acid kojic

 Arbutin

- Là một dẫn chất D-glucopyranoside tự nhiên của hydroquinone, có hiệu quả trong điều trị tại chỗ tăng sắc tố da khác nhau được đặc trưng bởi chức năng của tế bào sắc tố tăng hoạt động quá mức [30] Arbutin bao gồm 2 dạng alpha- và

beta-arbutin trong đó dạng alpha- có hoạt tính mạnh gấp 10 lần so với dạng beta-

trên hiệu quả ức chế enzym tyrosinase [20] Các nghiên cứu về động học và cơ

chế ức chế tyrosinase xác nhận sự ức chế cạnh tranh có thuận nghịch của arbutin trên enzym này Việc sử dụng L-tyrosin và L-dopa như cơ chất đã đề xuất ra cơ chế ức chế liên quan đến sự cạnh tranh vị trí gắn với L-tyrosin tại trung tâm hoạt

động của tyrosinase [31] Một vài nghiên cứu đã chỉ ra hiệu quả tác dụng của

arbutin trên tăng quá mức sắc tố da thấp hơn so với acid kojic [12]

- Trong tự nhiên, Arbutin được tìm thấy trong dịch chiết lá của cây bearberry, quả việt quất, việt quất nam và cây lê; nhưng là ở dạng beta- [39] [38] Dạng alpha- rất khó tìm thấy ở các nguồn chiết xuất tự nhiên, chính vì vậy alpha-arbutin

sử dụng chủ yếu từ nguồn tổng hợp Và hiện nay là thành phần trong các chế phẩn trắng da như Alpha Arbutin 3 Plus+ Collagen Lotion, The Ordinary Alpha Arbutin 2% + Hyaluronic Acid Serum…

 Vitamin C

- Là một chất chống oxy hóa tự nhiên, có khả năng tương tác với ion Đồng tại vị trí hoạt động của enzym tyrosinase Vitamin C hoạt động như một tác nhân khử hóa tại nhiều bước khác nhau trong quá trình tổng hợp melanain, vì vậy ức chế quá trình này [38] Các nghiên cứu chỉ ra rằng tyrosinase bị giảm hoạt tính là

do hoạt tính chống oxy hóa của vitamin C, chứ không phải là do ức chế một cách trực tiếp đến enzym [18]

- Tính an toàn sử dụng của vitamin C đã được kiểm chứng rất kĩ trong nhiều bài báo Tuy nhiên hiệu quả làm trắng da lại không cao, một phần có thể do khả năng thấm thuốc qua da của vitamin C là rất thấp Trên một nghiên cứu được tiến hành trên những phụ nữ Nhật bản đã chỉ ra việc sử dụng thường xuyên sóng siêu

âm kết hợp với gel trắng da (ascorbyl glucoside với niacinamide) đã tăng hiệu quả làm trắng của gel do tăng sự vận chuyển của thuốc qua da [21]

- Vitamin C là một thành phần trong nhiều kem mỹ phẩm: Tatcha Violet-C Brightening Serum, Volition Strawberry-C Serum, SkinCeuticals C E Ferulic…

1.3 Chè xanh

1.3.1 Vài nét về chè xanh

Cây chè, Camellia sinensis (L.) O.Kuntze thuộc chi Chè - Camellia, họ Chè -

Theaceae, thuộc ngành Hạt kín Angiospermatophyta, lớp Ngọc lan (hai lá mầm) Magnoliopsida, phân lớp Sổ Dilleniidae, bộ Chè Theales

Có rất nhiều bảng phân loại chè nhưng bảng phân loại chè được nhiều người công nhận nhất là bảng phân loại của Cohen Stuart (1919) Cơ sở phân loại chè được dựa vào cơ quan sinh dưỡng, cơ quan sinh thực, đặc tính sinh hóa Tác giả chia Camellia sinensis L làm 4 thứ chè chính [3]:

- Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var bohea): phân bố chủ yếu ở

miền đông, đông nam Trung Quốc, Nhật Bản Tại Việt Nam có thể tìm thấy ở Lạng Sơn, Phú Thọ (dưới dạng thí nghiệm, tập đoàn)

- Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var macrophylla): Nguyên sản

của chè Trung Quốc lá to là ở Vân Nam, Tứ Xuyên (Trung Quốc) Ở Việt Nam thì phân bố chủ yếu ở vùng trung du: Phú Thọ, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Bắc Giang… Do được trồng nhiều ở trung du nên còn được gọi là chè Trung du

- Chè Shan (Camellia sinensis var shan): Nguyên sản là Vân Nam (Trung

Quốc), Mianina Ở Việt Nam được trồng nhiều ờ vùng Tây Bắc, vùng Tây Nguyên (Lâm Đồng) Mỗi địa phương có giống khác nhau như Shan Mộc Châu, shan Tham vè, Shan Trấn Ninh… đều cho năng suất khá, từ 7 – 8 tấn/ha

- Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var assamica): được trồng nhiều ở Ấn Độ,

Mianina, Vân Nam và một số vùng khác Ở Việt Nam, chè Ấn Độ được trồng nhiều ở Phú Thọ, Nam Yên Bái, Tuyên Quang, Thái Nguyên

Hiện nay, với xu hướng sử dụng giống lai ở một số nước trồng chè, việc phân biệt giữa các thứ chè này ít có ý nghĩa quan trọng Trên các tài liệu khoa học chính

thức của thế giới, người ta chủ yếu phân biệt hai thứ chè Trung Quốc (C sinensis

var sinensis) và chè Assam (C sinensis var assamica)

Hàng năm, sản lượng chè trên thế giới đạt 2,5 triệu tấn chè, trong đó 80 % có nguồn gốc từ Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Ấn Độ và Srilanka [2]

Thành phần hóa học của nguyên liệu chè bao gồm tannin, caffeine, protein, tinh dầ u, men, sắ c tố, pectin, vitamin, chất khoáng, axít hữu cơ trong đó tannin, caffeine, sắ c tố , dầu thơm, pectin là những thành phần quan trọng quyết định màu sắ c, hương vi ̣của sản phẩm [1] Tannin là tên chung để chỉ hỗn hợp các chất polyphenol mà catechin là thành phần chủ yếu Trong quá trình sản xuất chè xanh, men polyphenol oxidase có tác dụng oxy hóa các polyphenol đã bị bất hoạt bởi nhiệt độ nên toàn bộ hàm lượng polyphenol trong chè xanh không thay đổi so với hàm lượng polyphenol trong lá chè Catechin và các gallate của chúng, các hợp chất phenol tổng số được xem là các chỉ số đánh giá chất lượng và giá trị của chè [37] Vì vậy, phân tích các hợp chất phenol của chè rất quan trọng đối với việc xác định và mô tả tính chất của chè

Chất lượng của chè có sự khác biệt theo vùng và vụ thu hoạch Thường thì vụ thu hoạch là vụ thu sẽ cho chất lượng chề tốt nhất (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Thành phần polyphenol nguyên liệu chè theo vùng và vụ thu hái [2]

Hình 1.3 Công thức tổng quát của catechin

Trong cấu trúc các catechin, khi sắp xếp theo cấu hình tuyệt đối và các nhóm thế có thể xuất hiện tới 24 catechin, tuy nhiên đến nay mới có 12 catechin được phân lập và xác định cấu trúc từ chè xanh

Các catechin đã được phân lập là EC, C, EGC, và GC; catechin gallat gồm có ECG, CG, GCG, EGCG; hai catechin digallat là epicatechin digallat ECDG và epigallocatechin digallat EGCDG cũng được gọi chung là catechin gallat Gần đây (-)-epicatechin-3-(3-O-methylgallate) và (-)-epigallocatechin-3-(3-O-methylgallate) mới được tìm thấy trong thành phần tự nhiên của chè [35]

Hình 1.4 Một số cấu trúc catechin chè xanh điển hình

Các catechin chè xanh được cho là thành phần chính gây ra các tác dụng của chè xanh như hoạt tính chống oxy hóa, chống sinh thành mạch, chống đột biến,

chống ung thư, làm giảm cholesterol, làm trắng da, tác dụng trên bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson… [2], [35], [43]

Những lợi ích chè xanh có được chủ yếu do hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính tiêu diệt các gốc tự do của các catechin Hoạt tính này được tính cho sự hiện diện của các nhóm phenolic hydroxyl trên vòng C ở các catechin (EC và ECG) và trên các vòng C- và D- ở các gallocatechin (EGC và EGCG) (hình 1.3, hình 1.4) [2] Ba nhóm hydroxyl trên vòng C đã được chứng minh là quan trọng trong việc các catechin thể hiện hoạt tính chống oxy hóa và tiêu diệt các gốc tự do Khả năng bắt giữ các kim loại của các catechin có đóng góp quan trọng cho hoạt tính chống oxy hóa Ngoài ra các catechin này còn có khả năng cạnh tranh với L-tyrosin và L-dopa tại vị trí gắn của enzym tyrosinase, gây ức chế hoạt động của enzym làm giảm sự tổng hợp sắc tố melanin và gây hiệu quả trắng da [35]

1.4 Một số nghiên cứu về tác dụng ức chế tyrosinase của chè xanh và

Aspergillus oryzae

 Nghiên cứu ở nước ngoài

Năm 1999, Jae Kyung No và cộng sự đã báo cáo rằng chè xanh đặc biệt là EGCG và GCG có hoạt tính ức chế tyrosinase rất tốt Cụ thể, tại nồng độ 10µM thì GCG ức chế đến khoảng 60% tyrosinase, trong khi đó hydroquinone ức chế khoảng 25%, và EGCG ức chế khoảng hơn 20% tyrosinase gần tương đương với hydroquinone Và tại nồng độ 50µM, EGCG và hydroquinone đều ức chế đến khoảng 90% tyrosinase, EGCG cũng khá khả quan ức chế hơn 60% tyrosinase [35]

Trong một nghiên cứu, Lu và Chen đã báo cáo rằng các catechin trong chè xanh được chuyển hóa sinh học bởi tannase gây tăng cường khả năng loại gốc tự

do, cũng như hoạt tính chống oxy hóa và tạo phức chelat với ion kim loại [27]

Tương tự trên khả năng ức chế tyrosinase, dịch chiết chè xanh được xử lý bởi tannase thể hiện khả năng ức chế cao hơn so với dịch chiết chè thông thường,

tương ứng lần lượt là 58,06% và 35,38% ức chế enzym [23]

Đối với Aspergillus oryzae, khả năng ức chế enzym tyrosinase của chúng đến

oryzae Năm 1994, tác giả Juana Cabanes và cs đã báo cáo acid kojic như là chất

làm trắng với hiệu quả tuyệt vời Nghiên cứu của Te-Sheng Chang và cs (năm 2007) hay Tomoaki Tanaka và cs (năm 1989) cho kết quả cũng khá khả quan

Ở Hàn Quốc, bằng sáng chế của nhóm tác giả Chang và cs được Mỹ công nhận năm 2012 đã đưa ra kết quả về khả năng ức chế tốt của dịch lên men dịch chè, và

tốt hơn so với dịch lên men nước RO cùng được lên men cùng chủng Aspergillus

oryzae [16]

 Nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam nghiên cứu báo cáo về ức chế tyrosinase còn rất ít hoặc chưa báo cáo

Chưa có các nghiên cứu trực tiếp về khả năng ức chế tyrosinase của dịch chiết

chè xanh và dịch lên men với Aspergillus oryzae Tuy nhiên có các nghiên cứu về các chất ức chế tyrosinase có trong chè xanh hay trong dịch nuôi của Aspergillus

oryzae Ví dụ như nghiên cứu chiết xuất các catechin trong chè của dược sĩ Trần

Trọng Biên hay của tác giả Đỗ Thanh Hà (2017) nhằm ứng dụng trong các lĩnh vực Nghiên cứu về khả năng sinh acid kojic của dược sĩ Nguyễn Thị Huyền (năm 2018) và tổng hợp kojic dipalmitat của nhóm tác giả Trương Phương (năm 2013) Ngoài ra, về nghiên cứu chất ức chế tyrosinase nhóm tác giả Bùi Thanh Tùng

và cs tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội báo cáo các phân đoạn chiết từ

ý dĩ có khả năng ức chế tyrosinase

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng giống Aspergillus oryzae do Viện Công nghiệp Thực phẩm cung

cấp

 Nguyên liệu sử dụng trong đề tài:

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong đề tài

Glucose Trung Quốc NaOH Trung Quốc Saccarose Việt Nam CuSO4 Trung Quốc Pepton Merck, Đức KI Trung Quốc Cao nấm men Merck, Đức H2SO4 98% Trung Quốc

KH2PO4 Trung Quốc Na2S2O3 Trung Quốc MgSO4.7H2O Trung Quốc FeCl3 5% Việt Nam Thạch bột Việt Nam Na2CO3 Trung Quốc Nước RO Việt Nam Ethanol 96º Việt Nam

Lá chè xanh Việt Nam L-tyrosin Sigma, Mỹ Enzyme tyrosinase từ nấm Sigma, Mỹ DMSO Merck, Đức Đệm phosphate 0,1M, pH7 phenolphthalein Trung Quốc

 Môi trường sử dụng trong đề tài:

Bảng 2.2 Các môi trường sử dụng trong đề tài

Môi trường giữ giống

Glucose 10,0 Pepton 0,3

KH2PO4 0,1 MgSO4.7H2O 0,05 Thạch bột 2,0 Nước RO Vừa đủ

Thành phần

Môi trường lên men

GN (g/100ml)

GC (g/100ml)

S10C (g/100ml)

S20C (g/100ml)

Glucose 10,0 10,0 0 0

Saccarose 0 0 10,0 20,0 Cao nấm men 0,25 0,25 0,25 0,25

KH2PO4 0,1 0,1 0,1 0,1 MgSO4.7H2O 0,05 0,05 0,05 0,05

pH 6,5 6,5 6,5 6,5 Nước RO Vừa đủ 0 0 0

Nước chè xanh 0 Vừa đủ Vừa đủ Vừa đủ

 Các dung dịch sử dụng được pha theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam V:

1 Dung dịch Fehling A: Hòa tan 34,66 g đồng sulfat trong nước đã acid hóa bằng 2 giọt đến 3 giọt acid sulfuric loãng vừa đủ 500 ml

2 Dung dịch Fehling B: Hòa tan 173 g natri kali tartrat và 50 g natri hydroxyd trong 400 ml nước, làm nguội, thêm nước vừa đủ 500 ml

3 Dung dịch acid sulfuric 25%: Cho từ từ 143 ml acid sulfuric 98% vào 500

ml nước, khuấy liên tục, làm nguội, thêm nước vừa đủ 1000 ml

4 Dung dịch natri thiosulfate 0,1 N: Hòa tan 25,0 g natri thiosulfate và 0,2 g natri carbonat trong nước không có carbon dioxyd vừa đủ 1000 ml

5 Dung dịch hồ tinh bột: Nghiền 1 g tinh bột với 5 ml nước, rồi vừa đổ vừa khuấy vào 100 ml nước sôi Đun sôi cho đến khi thu được chất lỏng chỉ hơi đục, pha trước khi dùng

2.1.2 Thiết bị sử dụng

Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng

Cân kỹ thuật Satorious, Đức

Cân phân tích Satorious, Đức

Nồi hấp ALP, Nhật

Tủ cấy vô trùng Clean Bench, Nhật

Máy lắc ổn nhiệt Bio- Shaker BR- 300LF, Nhật

Thiết bị hút chân không VRL Model 200- 7.0, Mỹ

Bể cách thủy ổn nhiệt WiseBath, Hàn Quốc

Tủ lạnh LG, Hàn Quốc

Tủ sấy Memmert, Đức

Tủ ấm thường Memmert, Đức

Lò vi sóng Sharp, Nhật Bản

Tủ lạnh sâu Haier, Trung Quốc

Máy đông khô Christ Alpha, Đức

Máy đọc ELISA Bio-Rad Laboratories, Mỹ

Máy ủ nhiệt Bio-rad, Mỹ

Phiến 96 giếng SPL Life Sciences, Hàn Quốc

Ống nghiệm, bình nón, đĩa petri, que

cấy, giấy chỉ thị vạn năng, micropipet,

đầu côn,…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát khả năng sinh trưởng của Aspergillus oryzae trong dịch chiết

lá chè xanh

 Chiết xuất lá chè xanh và lên men Aspergillus oryzae trong dịch chiết

 Thu, tách lấy dịch sau lên men

 Định lượng đường tiêu thụ, kết tinh acid kojic, đánh giá sơ bộ khả năng

sinh trưởng và sinh acid kojic của Aspergillus oryzae

2.2.2 Thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của dịch lên men

 Tiền đông dịch lên men

 Thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của dịch lên men

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp giữ giống

Tiến hành cân nguyên liệu, pha môi trường giữ giống (theo công thức ở bảng 2.2) rồi chia vào các ống nghiệm, khoảng 10 ml/ống, vặn nắp ống nghiệm (chú ý không vặn chặt) Hấp tiệt trùng ống nghiệm trong nồi hấp ở điều kiện 0,6 atm trong 20 phút, để nguội khoảng 65 - 70ºC Tiến hành đặt nghiêng ống sao cho chiều cao thạch cao gần 2/3 ống Để yên 1 giờ cho môi trường thạch rắn Sau dựng thẳng ống nghiệm trong 2 giờ để nước đọng lại trên thành ống chảy xuống đáy ống nghiệm

Tiến hành cấy giống: Lấy một vòng que cấy từ khuẩn lạc nấm mốc trong ống giống, cấy thành một đường thẳng lên bề mặt thạch, sao cho đường cấy đều, không đứt quãng Thao tác trong tủ cấy vô trùng Nuôi trong tủ ấm thường ở 30ºC Sau một khoảng thời gian nhất định thu được ống giống cần thiết Bảo quản ống giống trong tủ lạnh 2 - 4ºC

2.3.2 Phương pháp lên men

Chuẩn bị dịch chiết lá chè xanh: 100g lá chè xanh được ngâm trong 1 lít nước

RO, hỗn hợp dung dịch lá chè xanh được chiết xuất nước nóng trong 3 giờ ở nhiệt

độ 80ºC

Tạo môi trường nuôi cấy: Chuẩn bị môi trường lên men (theo công thức ở bảng 2.2) vào bình nón thể tích 250 ml Nút bình nón bằng bông không thấm nước Hấp tiệt trùng ở điều kiện 0,6 atm trong 20 phút, để nguội về nhiệt độ khoảng 30 - 35ºC thì tiến hành đem cấy giống

Tiến hành cấy giống: Lấy một vòng que cấy từ khuẩn lạc trong ống cấy giữ giống đã chuẩn bị từ trước vào môi trường ở trên Thao tác trong tủ cấy vô trùng