NGHIÊN cứu đa HÌNH đơn GEN XRCC1 arg399gln TRÊN BỆNH NHÂN LUPUS BAN đỏ hệ THỐNG

ĐẶT VẤN ĐỀLupus ban đỏ hệ thống SLE – Systemic Lupus Erythematosus là bệnh lýcủa mô liên kết có tổn thương nhiều cơ quan do hệ thống miễn dịch của cơ thể bị rốiloạn, đặc trưng bởi sự có

TRẦN TIẾN ĐẠT

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH ĐƠN GEN XRCC1 Arg399Gln

TRÊN BỆNH NHÂN LUPUS BAN ĐỎ HỆ THỐNG

Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số: 60720106

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS TRẦN HUY THỊNH

HÀ NỘI – 2017

TRẦN TIẾN ĐẠT

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH ĐƠN GEN XRCC1 Arg399Gln

TRÊN BỆNH NHÂN LUPUS BAN ĐỎ HỆ THỐNG

Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số: 60720106

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS TRẦN HUY THỊNH

HÀ NỘI – 2017

ACR : American College of Rheumatology

ANA : Antinuclear Antibody (Kháng thể kháng nhân)

Anti-dsDNA : Anti-double stranded DNA (Kháng thể kháng chuỗi kép DNA)

BER : Base excision repair (Sửa chữa cắt bỏ base)

BRCA : Breast Cancer genes

BRCT : BRCA1 carboxy-terminal domain

CI : Confidence Interval (Khoảng tin cậy)

DNA : Deoxyribonucleotid Acid

dNTP : Deoxyribonucleotid-5-triphosphate

OD : Optical density (Độ hấp thụ quang)

OR : Odds ratio (Tỷ suất chênh)

NER : Nucleotide excision repair (Sửa chữa cắt bỏ nucleotide)

PCI : Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol

PCR : Polymerase chain reaction

(Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase)

OGG1 : 8-oxoguanine DNA glycosylase 1

RFLP : Restriction fragment length polymorphism

(Đa hình về chiều dài của các đoạn DNA do enzym giới hạn)

SLE : Systemic Lupus Erythematosus (Lupus ban đỏ hệ thống)

SNP : Single nucleotide polymorphism

(Hiện tượng đa hình thái đơn Nucleotid)

SSB : Single strand break (Đứt gãy sợi đơn)

PARP-1 : Poly(ADP-ribose) polymerase-1

XRCC : X-ray repair cross-complementing

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về bệnh lupus ban đỏ hệ thống 3

1.1.1 Dịch tễ học 3

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ 4

1.1.3 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng 7

1.1.4 Chẩn đoán xác định 8

1.1.5 Các thể lâm sàng và tiên lượng 10

1.1.6 Điều trị 11

1.2 Tổng quan về gen XRCC1 ở người 12

1.2.1 Vị trí và cấu trúc 12

1.2.2 Chức năng 12

1.2.3 Cơ chế sửa chữa cắt bỏ base (con đường BER) 13

1.2.4 Tính đa hình thái đơn nucleotide 15

1.3 Các kỹ thuật SHPT phát hiện tính đa hình thái đơn nucleotide 18

1.3.1 Kỹ thuật PCR 18

1.3.2 Kỹ thuật PCR-RFLP 20

1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng 25

2.3.1 Dụng cụ 25

2.3.2 Trang thiết bị 25

2.3.3 Hóa chất 25

2.4 Quy trình kỹ thuật 27

2.4.1 Quy trình lấy mẫu 27

2.4.4 Quy trình cắt enzym và điện di kiểm tra sản phẩm 31

2.4.5 Quy trình giải trình tự gen 32

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 33

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 Kết quả tách chiết DNA 34

3.2 Kết quả khuếch đại đoạn DNA bằng phản ứng PCR 35

3.3 Kết quả cắt với enzym giới hạn (PCR-RFLP) 35

3.4 Kết quả giải trình tự gen một số mẫu 35

3.5 Kết quả xác định đa hình Arg399Gln của gen XRCC1 trên nhóm bệnh và nhóm chứng 36

3.6 Kết quả xác định mối liên quan giữa đa hình đơn gen XRCC1 Arg399Gln với nguy cơ mắc bệnh lupus ban đỏ hệ thống 36

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 37

4.1 Kết quả tách chiết DNA 37

4.2 Kết quả khuếch đại DNA (PCR) 37

4.3 Kết quả cắt với enzym cắt giới hạn (PCR-RFLP) 37

4.4 Kết quả xác định đa hình Arg399Gln trên nhóm bệnh và nhóm chứng 37

4.5 Kết quả xác định mối liên quan giữa đa hình Arg399Gln với nguy cơ mắc bệnh lupus ban đỏ hệ thống 37

KẾT LUẬN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Hình 1.2 Vị trí gen XRCC1 trên NST số 19 12

Hình 1.3 Các cơ chế tổn thương base (hình A) và các bước sửa chữa cắt bỏ base (con đường BER) (hình B) 14

Hình 1.4 Minh họa hiện tượng đa hình thái đơn (SNP) 15

Hình 1.5 Các miền của protein XRCC1 và cấu trúc gen XRCC1 17

Hình 1.6 Sơ đồ chu trình phản ứng PCR 19

Hình 1.6 Quy trình thực hiện PCR-RFLP 21

Hình 1.7 Giải trình tự gen bằng máy tự động 22

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 24

Hình 2.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 30

Hình 2.3 Minh họa vị trí cắt của enzym NcilI trên đoạn DNA được khuếch đại 31

Hình 2.4 Minh họa kết quả điện di sản phẩm cắt enzym 32

Hình 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng giải trình tự 33

Hình 3.1 Hình ảnh kết quả đo OD mẫu DNA MC1 34

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR một số mẫu 35

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm RFLP một số mẫu bệnh và mẫu chứng 35

Hình 3.4 Hình ảnh kết quả giải trình tự đoạn gen XRCC1 của mẫu… 35

Hình 3.5 Hình ảnh kết quả giải trình tự đoạn gen XRCC1 của mẫu… 35

Hình 3.6 Hình ảnh kết quả giải trình tự đoạn gen XRCC1 của mẫu… 35

Bảng 2.1 Đặc điểm mồi cho phản ứng PCR 26

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 29

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR-RFLP 31

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng giải trình tự gen 32

Bảng 3.1 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA trên nhóm bệnh nhân và nhóm đối chứng 34

Bảng 3.2 Kết quả xác định tính đa hình Arg399Gln của gen XRCC1 36

Bảng 3.3 Tỷ lệ kiểu gen đa hình Arg399Gln trên nhóm bệnh và nhóm chứng 36

Bảng 3.4 Tần số alen đa hình Arg399Gln trên nhóm bệnh và nhóm chứng 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lupus ban đỏ hệ thống (SLE – Systemic Lupus Erythematosus) là bệnh lýcủa mô liên kết có tổn thương nhiều cơ quan do hệ thống miễn dịch của cơ thể bị rốiloạn, đặc trưng bởi sự có mặt của kháng thể kháng nhân và nhiều tự kháng thể khác.Các cơ quan thường bị tổn thương bao gồm khớp, da, thận, tế bào máu, tim, phổi,thần kinh…[1], [2]

Tỷ lệ mắc SLE khác nhau tùy theo nghiên cứu của các tác giả trên thế giới,thay đổi từ 14-172 ca/100.000 dân [3] Bệnh chủ yếu gặp ở nữ giới, đặc biệt độ tuổisinh đẻ, tỷ lệ mắc bệnh của nữ : nam là 9 : 1 [4] Mặc dù sinh bệnh học của SLE đếnnay vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng, nhưng bệnh có liên quan đến các yếu tố di truyền,hormon và môi trường [5]

Có nhiều loại tự kháng thể đối với protein nội bào và acid nucleic tronghuyết thanh của bệnh nhân SLE như kháng thể dsDNA có thể tương quan với mức

độ hoạt động và biểu hiện của bệnh [6] Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự suygiảm của hệ thống sửa chữa DNA ở bệnh nhân SLE đã dẫn đến sự tích tụ các đứtgãy trong DNA [7], [8] Sự tích tụ các đoạn DNA đứt gãy kết hợp với các proteinnhân tế bào có thể hình thành các kháng nguyên miễn dịch, gây sản sinh kháng thể

và đáp ứng tự miễn ở những người nhạy cảm [9], [10]

Sửa chữa cắt bỏ base (BER) và sửa chữa cắt bỏ nucleotide (NER) là hai conđường để sửa chữa hầu hết các DNA bị hư hỏng [11] XRCC1 là một trong nhữngprotein quan trọng nhất có vai trò quan trọng trong con đường BER [12] Proteinnày chịu trách nhiệm cho việc sửa chữa hiệu quả các tổn thương DNA gây ra bởioxy hoạt động, bức xạ ion hóa và các chất alkyl hóa [13] Mặc dù XRCC1 không thểhiện hoạt động enzym, nhưng nó có chức năng tương tác để điều phối hoạt động củacác protein enzym khác trong bộ máy BER, bao gồm: glycosylase, endonuclease(APE1), DNA polymerase β, ligase và Poly (ADP-ribose) Polymerases (PARP1 andPARP2) [13], [14], [15]

Gen XRCC1 có vị trí nằm trên nhiễm sắc thể 19q13.31 và có 17 exon [12] Mặc dù có hơn 300 SNP đã được mô tả trong gen XRCC1, ba SNP thường xuyên

được nghiên cứu là: Arg194Trp, Arg280His và Arg399Gln [16]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên quan giữa SNP

Arg399Gln của gen XRCC1 với nguy cơ mắc lupus ban đỏ hệ thống và một số bệnh

ung thư Tuy nhiên, trên những chủng tộc người khác nhau, các nhà khoa học thuđược kết quả trái chiều [5], [17], [18], [19], [20], [21] Việc xác định đa hình này cóthể giúp tầm soát lupus ban đỏ hệ thống ở những đối tượng có yếu tố nguy cơ, giúpbệnh nhân được chẩn đoán sớm, điều trị kịp thời, giảm các biến chứng cũng như cảithiện tiên lượng bệnh

Tại Việt Nam chúng tôi chưa thấy có nhiều nghiên cứu về gen XRCC1 nói

chung, đa hình Arg399Gln trên bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống nói riêng Do đó,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đa hình đơn gen XRCC1

Arg399Gln trên bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống” với 2 mục tiêu:

1 Xác định đa hình đơn gen XRCC1 Arg399Gln trên bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống.

2 Tìm hiểu mối liên quan giữa đa hình đơn gen XRCC1 Arg399Gln với nguy cơ mắc bệnh lupus ban đỏ hệ thống.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về bệnh lupus ban đỏ hệ thống

1.1.1 Dịch tễ học

Trên toàn thế giới, tỷ lệ mắc SLE là 14-172 ca/100.000 dân, tỷ suất mới mắc

là 1,8-7,6/100.000 dân mỗi năm, thay đổi theo chủng tộc và vùng địa lý [3] Bệnhchủ yếu gặp ở nữ giới, đặc biệt độ tuổi sinh đẻ, tỷ lệ mắc bệnh của nữ : nam là 9 : 1[4], tuổi khởi phát chủ yếu từ 15 đến 44 tuổi [22]

Tại Mỹ, tỷ lệ mắc SLE là 20-150 ca/100.000 dân [23], [24] Do cải thiện việcphát hiện bệnh nhẹ, tỷ suất mới mắc tăng lên gần gấp 3 lần trong 40 năm cuối củathế kỷ 20 [25] Bệnh dường như là phổ biến ở thành thị hơn khu vực nông thôn [24], [26] Xét trên cư dân cùng sống tại Mỹ thì tỷ lệ bệnh cao nhất ở người châu Á,tiếp đến người Mỹ gốc Phi, người Caribe gốc Phi, người Mỹ gốc Địa Trung Hải vàthấp nhất ở người Mỹ gốc châu Âu [23], [24] Phụ nữ da đen ở Anh và Mỹ mắcSLE cao hơn khoảng 4 lần so với phụ nữ da trắng Tuy nhiên, tỷ lệ mắc của phụ nữ

da đen tại châu Phi lại thấp hơn Điều này chứng tỏ vai trò của yếu tố môitrường trong cơ chế bệnh sinh của SLE [27]

Hình 1.1 Phân bố tỷ lệ mắc SLE trên thế giới [28]

Theo nghiên cứu của Rupert W Jakes và cộng sự (2012) cho thấy sự khácbiệt đáng kể về gánh nặng SLE và tỷ lệ sống sót ở các nước Châu Á Thái BìnhDương Tỷ lệ hiện mắc SLE từ 4,3-45,3 ca/100.000 dân, tỷ suất mới mắc dao động

từ 0,9-3,1 ca/100.000 dân mỗi năm Tỷ lệ bệnh nhân có viêm thận lupus ở thời điểmchẩn đoán là 21-65% và lên đến 40-82% theo thời gian Nhiễm trùng và SLE hoạtđộng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong (chiếm 30-80% và 19-95%), tiếp đến là

nguyên nhân tim mạch (6-40%) và sự tham gia của thận (7-36%) Tương quan giữachỉ số phát triển con người và tỷ lệ sống sót 5 năm là 0,83 [29].

Tại Việt Nam, chưa có số liệu thống kê dịch tễ đầy đủ Ở khoa Cơ xươngkhớp bệnh viện Bạch Mai, SLE đứng hàng thứ 5 trong số 15 bệnh xương khớp nộitrú thường gặp nhất [30]

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ

1.1.2.1 Yếu tố di truyền

Tỷ lệ cùng mắc SLE ở trẻ sinh đôi cùng trứng là 24-57%, trong khi trẻ sinhđôi khác trứng là 2-5%; tỷ lệ mắc bệnh giữa anh chị em ruột khi có một người bịbệnh là 20-29%, điều này cho thấy yếu tố di truyền đóng góp vai trò quan trọngtrong bệnh sinh SLE

Vai trò HLA trong cơ chế bệnh sinh của SLE cũng được ghi nhận HLADRB1 alen đã được chứng minh có liên quan chặt chẽ với SLE ở người da trắng, nếungười mang 2 alen trên sẽ có nguy cơ mắc lupus cao gấp 3 lần so với nhóm chứng[31] Các gen DR2, DR3 cũng liên quan đến sự có mặt của một số tự kháng thể như:kháng thể kháng Smith, kháng thể kháng chuỗi kép ds-DNA, kháng thể kháng Ro

và kháng thể kháng La Tuy nhiên, các gen này lại không có liên quan trong cơ chếbệnh sinh chặt chẽ ở các chủng tộc khác không phải người da trắng

Bổ thể có vai trò quan trọng trong sự lắng đọng các phức hợp miễn dịch và

sự chết theo chương trình của tế bào Trong một số bệnh nhân SLE ghi nhận cóthiếu hụt mang tính di truyền của các thành phần bổ thể trong con đường cổ điểnnhư C1q, C2, C4 Thiếu hụt gen C4A gặp chủ yếu ở người mang HLAB8, HLA-DR3, HLA-A1 và đặc biệt các bệnh nhân SLE thiếu hụt gen C4A thường có biểuhiện của viêm cầu thận [32]

Nhiều công bố cho thấy đa số các trường hợp SLE là hậu quả của sự tươngtác đa gen gây nên, một số ít có liên quan đến thiếu hụt một vài gen Các gen liênquan đến các bệnh lý tự miễn khác cũng được tìm thấy trong bệnh nhân SLE nhưPTPN22 trong đái tháo đường hay STAT4 trong viêm khớp dạng thấp

1.1.2.2 Yếu tố nội tiết

SLE chủ yếu gặp ở nữ giới, với tỷ lệ nữ : nam là 9 : 1 Trong đó, đa số bệnhkhởi phát trong độ tuổi sinh đẻ, đặc biệt từ 20-30 tuổi, hiếm khi khởi phát trước tuổidậy thì và sau mãn kinh Bệnh nặng lên khi mang thai, đặc biệt là 3 tháng cuối [4].Các bệnh nhân mắc hội chứng Klinefelter (47, XXY) đặc trưng bởi tình trạng cườngnội tiết nữ và giảm nội tiết tố nam có nguy cơ cao bị SLE và thường nặng hơn [33]

Estrogen có tác dụng kích thích miễn dịch, kích thích tăng sinh tế bàolympho B, tăng sản xuất kháng thể Nghiên cứu trên các đối tượng sử dụng hormonngoại sinh đã cho kết quả khá thú vị là nguy cơ mắc SLE ở nhóm dùng thuốc tránhthai đường uống và nhóm dùng liệu pháp hormon cao gấp 1,54-1,9 và 2,1- 2,8 lần

so với nhóm đối tượng bình thường [34]

Prolactin là hormon thùy trước tuyến yên, có vai trò chủ yếu kích thích vàbài tiết sữa Ngoài ra, nó cũng có vai trò trong duy trì đáp ứng miễn dịch cơ thể.Một số nghiên cứu nhận thấy khoảng 15-33% bệnh nhân SLE có tình trạng tăng

prolactin máu [35] Nồng độ prolactin cao bất thường ở phụ nữ mang thai mắc SLEcũng tương quan với mức độ hoạt động bệnh [36] Tuy nhiên, nguồn gốc và vai tròcủa prolactin trong bệnh sinh của SLE chưa được biết rõ.

Androgen được coi như là đối trọng của estrogen trong vai trò miễn dịch Ởmột số bệnh nhân SLE nam có nồng độ testosteron giảm và estrogen tăng cao hơnbình thường, còn ở bệnh nhân SLE nữ, nồng độ androgen cũng thấp hơn [37], [38]

1.1.2.3 Yếu tố môi trường

Gen và hormon là yếu tố nhạy cảm dưới sự kích thích của môi trường làmxuất hiện bệnh Các yếu tố môi trường gồm: vật lý, hóa học và nhiễm khuẩn

- Tia cực tím (UV): đặc biệt là UV-A1 và UV-B, có thể gây ra các đợt bùng

phát bệnh ở bệnh nhân SLE và kích hoạt sự khởi phát bệnh SLE [39] Hơn nữa, khảnăng của tia cực tím trong việc gây nên đợt bùng phát bệnh SLE hoặc lupus dadường như là liều phụ thuộc [40] Một điều chắc chắn là UV-B gây ra hiện tượng

chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào sừng (keratinocytes) và các tế bào da

khác, và quá trình đã giải phóng một lượng lớn các tự kháng nguyên và cáccytokine tiền viêm vào tuần hoàn, gây ra viêm hệ thống miễn liên quan đến tự miễn[40] Ở liều thấp của tia UV-B, apoptosis phụ thuộc vào dòng thác bình thường gây

ra ở keratinocytes, trong khi ở liều vừa và cao, sự phân mảnh DNA, tăng biểu hiệnIL-1α và hoại tử của keratinocytes đã được quan sát thấy [40] Ngoài ra, nghiên

cứu in vitro cho thấy thay vì sự dịch chuyển các kháng nguyên miễn dịch Ku, Sm và

DNA vào màng tế bào, UV-B liều cao đã được chứng minh là gây ra sự phóng thíchcác tự kháng nguyên này vào trong tế bào chất và ngay cả trên bề mặt khi sự toànvẹn của tế bào bị tổn thương [40] Cùng với nhau, sự tiếp xúc với tia UV-B liềutrung bình và liều cao thúc đẩy quá trình chết theo chương trình và hoại tử, kèmtheo việc giải phóng các kháng nguyên tự nhiên và một số lượng lớn các cytokinetiền viêm, gây ra phản ứng viêm [40], [41]

- Lupus do thuốc (Drug-induced lupus erythematosus – DILE): là một rối

loạn với các đặc điểm lâm sàng, mô học và miễn dịch tương tự lupus ban đỏ hệthống (SLE), do sử dụng lâu dài một số loại thuốc nhất định và các triệu chứng sẽhết sau khi ngừng thuốc Có khoảng hơn 100 loại thuốc đã được báo cáo có thể gây

ra tình trạng này và danh sách còn tiếp tục mở rộng, những thuốc phổ biến nhấtlà: procainamide, hydralazine, quinidine Các cơ chế khác nhau được đề xuất baogồm: giảm methyl hóa DNA bằng cách ức chế trực tiếp DNA methyltransferaseshoặc gián tiếp bằng tín hiệu theo con đường ERK Thuốc đóng vai trò như mộthapten, gắn với protein mô hoặc huyết tương gây đáp ứng miễn dịch Thêm vào đó,

sự chuyển hóa thuốc cục bộ trong bạch cầu hoặc tế bào gan có thể chuyển đổi thuốcthành các hợp chất gây độc tế bào, làm tăng các tế bào hoại tử và kích hoạt đại thựcbào Các thuốc có thể làm tăng hoặc giảm apoptosis [42], [43]

- Nhiễm trùng: nhiễm khuẩn, nhiễm virus cũng được đề cập đến

trong bệnh sinh của SLE như HTLV1, retrovirus, epstein-Barr virus hiệnđang được nghiên cứu thêm Các nghiên cứu cho thấy nhiễm khuẩn chỉ cóvai trò khởi phát, tạo điều kiện thuận lợi cho phát sinh bệnh

1.1.3 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng

1.1.3.1 Lâm sàng [2]

Chủ yếu gặp thể bán cấp

Tỷ lệ mắc bệnh nữ : nam = 9 : 1, chủ yếu ở độ tuổi 20 - 30

Khởi phát: Đa số bắt đầu từ từ, tăng dần với sốt dai dẳng không rõ nguyênnhân, đau khớp hoặc viêm khớp với biểu hiện tương tự trong bệnh viêmkhớp dạng thấp Có một số yếu tố thuận lợi khởi phát bệnh: nhiễm trùng,chấn thương, stress, thuốc…

Toàn phát: tổn thương nhiều cơ quan

o Toàn thân: sốt dai dẳng kéo dài, mệt mỏi, gầy sút

o Cơ xương khớp: đau hoặc viêm các khớp với biểu hiện tương tự trongbệnh viêm khớp dạng thấp song hiếm khi biến dạng khớp; đau cơ.Một số hiếm trường hợp có hoại tử xương (thường gặp hoại tử vômạch đầu trên xương đùi)

o Da niêm mạc: ban đỏ hình cánh bướm ở mặt (rất thường gặp), bandạng đĩa, (gặp trong thể mạn tính), nhạy cảm với ánh sáng (cháy,bỏng, xạm da sau khi tiếp xúc với ánh nắng), loét niêm mạc miệng,niêm mạc mũi, rụng tóc, viêm mao mạch dưới da…

o Máu và cơ quan tạo máu: thiếu máu do viêm, thiếu máu huyết tán,chảy máu dưới da (do giảm tiểu cầu) , lách to, hạch to

o Thần kinh tâm thần: rối loạn tâm thần, động kinh

o Tuần hoàn, hô hấp: thường gặp các triệu chứng tràn dịch màng tim,màng phổi, tăng áp lực động mạch phổi, viêm phổi kẽ Các triệuchứng hiếm gặp: viêm cơ tim, viêm nội tâm mạc , hội chứngRaynaud, viêm tắc động mạch, tĩnh mạch

o Thận: rất thường gặp: protein niệu, tế bào trụ niệu, hội chứng thận hư,viêm cầu thận

o Gan: cổ trướng, rối loạn chức năng gan (hiếm gặp)

o Mắt: giảm tiết nước mắt (Hội chứng Sjogren), viêm giác mạc, viêmkết mạc, viêm võng mạc

1.1.3.2 Cận lâm sàng [2]

Các xét nghiệm không đặc hiệu: tế bào máu ngoại vi (giảm hồng cầu, giảmbạch cầu, giảm tiểu cầu), tốc độ lắng máu tăng, điện di huyết thanh (gammaglobulin tăng), tìm thấy phức hợp miễn dịch trong máu, phản ứng huyếtthanh giang mai BW (+) giả…

Các xét nghiệm đặc hiệu: kháng thể kháng nhân (ANA), kháng thể khángDs-DNA, Kháng thể chống các kháng nguyên hòa tan, kháng thể kháng hồngcầu, kháng Lympho bào, kháng tiểu cầu…, giảm bổ thể, giảm tỷ lệ Lymphobào so với tế bào B

Sinh thiết các cơ quan tổn thương:

o Sinh thiết da: lắng đọng globulin miễn dịch IgM, IgG và bổ thể thành mộtlớp thượng bì và trung bì của da (+70%)

o Thận: viêm cầu thận, dày màng đáy do lắng đọng IgG, IgM và bổ thể

o Màng hoạt dịch khớp: tổn thương gần tương tự viêm khớp dạng thấp

1.1.4 Chẩn đoán xác định

Năm 1982, Hội Thấp khớp học Hoa Kỳ (ACR – American College ofRheumatology) đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán SLE gồm 11 tiêu chuẩn và đến năm

1997 được sửa đổi và áp dụng phổ biến đến ngày nay [44]

Gần đây, năm 2012, các trung tâm cộng tác quốc tế về lupus hệ thống(Systemic Lupus International Collaborating Clinics - SLICC) đã đưa ra tiêu chuẩnmới gồm 11 tiêu chuẩn lâm sàng và 6 tiêu chuẩn miễn dịch [2]

Theo nghiên cứu của Peri M và cộng sự (2012), tiêu chuẩn ACR 1997 cho

độ nhạy 86% và độ đặc hiệu 93%, còn tiêu chuẩn SLICC 2012 cho độ nhạy 94% và

độ đặc hiệu 92% [44]

1.1.4.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán SLE của ACR năm 1997

Chẩn đoán xác định SLE khi có ít nhất 4 trên 11 tiêu chuẩn sau [45]:

1 Ban đỏ hình cánh bướm ở mặt

2 Ban đỏ dạng đĩa ở mặt và thân

3 Nhạy cảm với ánh nắng

4 Loét miệng hoặc mũi họng

5 Viêm nhiều khớp không có hình bào mòn trên phim chụp X quang

6 Viêm màng phổi hoặc màng tim

7 Tổn thương thận: Protein niệu > 500mg/24h hoặc tế bào niệu (có thể là hồng cầu, hemoglobin, trụ hạt, tế bào ống thận hoặc hỗn hợp).

8 Tổn thương thần kinh: Cơn động kinh hoặc loạn thần đã loại trừ các nguyên

nhân khác

9 Rối loạn công thức máu :

- Thiếu máu huyết tán có tăng hồng cầu lưới

- hoặc giảm tổng số bạch cầu < 4G/l trong ≥ 2 lần

- hoặc giảm lympho bào < 1,5G/l trong ≥ 2 lần

- hoặc giảm tiểu cầu < 100 G/l khi không có sai lầm trong dùng thuốc

10 Rối loạn miễn dịch:

- Kháng thể kháng chuỗi kép (anti-dsDNA)

- hoặc kháng thể kháng Smith (anti-Sm)

- hoặc tìm thấy kháng thể anti-phospholipid dựa trên:

o có kháng thể anticardiolipin loại IgG hoặc IgM

o hoặc các yếu tố chống đông lupus

o hoặc test huyết thanh với giang mai dương tính giả trên 6 tháng, được xác nhận bằng test cố định xoắn khuẩn hoặc hấp thụ kháng thể xoắn khuẩn bằng miễn dịch huỳnh quang.

11 Kháng thể kháng nhân (ANA): Hiệu giá bất thường của kháng thể kháng nhân được xác định bằng miễn dịch huỳnh quang hoặc các thử nghiệm tương đương, không do sử dụng các thuốc có thể gây “lupus do thuốc”.

Tiêu chuẩn lâm sàng Tiêu chuẩn miễn dịch

3 Loét miệng hay mũi 3 Anti-Sm

4 Rụng tóc không sẹo 4 KT Antiphospholipid

6 Viêm thanh mạc 6 Test Coombs trực tiếp

(Không được tính khi có sự tồn tại củathiếu máu tan huyết)

7 Thận

8 Thần kinh

9 Thiếu máu tan huyết

10 Giảm bạch cầu

11 Giảm tiểu cầu (<100G/l)

Chẩn đoán SLE khi có ≥ 4 tiêu chuẩn (có ít nhất 1 tiêu chuẩn lâm sàng và 1

tiêu chuẩn miễn dịch) hoặc bệnh nhân phải có sinh thiết thận chứng minh

bệnh thận lupus kèm theo ANA ( + ) hoặc anti-dsDNA ( + )

1.1.4.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán SLICC 2012 [2]

1.1.5 Các thể lâm sàng và tiên lượng [30]

Tiên lượng phụ thuộc vào các thể lâm sàng:

Thể cấp tính: biểu hiện tổn thương nhiều phủ tạng Tiến triển nhanh, tử

vong sau vài tháng do tổn thương ở thận, thần kinh, tim, phổi, nhiễm khuẩn

Thể bán cấp: tiến triển từng đợt, nặng dần Sống sót sau 5 – 10 năm Bệnh

nặng thêm trong thời kỳ thai nghén, nhiễm khuẩn, chấn thương, phẫu thuật.Thường tử vong do biến chứng thận, thần kinh, nhiễm khuẩn

Thể mạn tính: ít tổn thương nội tạng, diễn biến chậm Biểu hiện ngoài da

nhẹ, tiên lượng tốt

1.1.6 Điều trị [2]

1.1.6.1 Nguyên tắc chung

- Đánh giá mức độ nặng của bệnh, các bệnh kèm theo

- Điều trị bao gồm: giai đoạn tấn công, củng cố và duy trì

- Cần cân nhắc giữa tác dụng mong muốn và tác dụng phụ của mỗi loại thuốc

1.1.6.2 Các nhóm thuốc được sử dụng

- Thuốc kháng viêm không steroid: trong các trường hợp lupus kèm viêm

đau khớp, sốt và viêm nhẹ các màng tự nhiên nhưng không kèm tổn thươngcác cơ quan lớn Nên tránh dùng ở các bệnh nhân viêm thận đang hoạt động

- Hydroxychloroquine: đáp ứng tốt với các trường hợp có ban, nhạy cảm ánh

sáng, đau hoặc viêm khớp Cần theo dõi biến chứng mắt, khám 1 lần/năm

- Liệu pháp glucocorticoid đường toàn thân: Chỉ định với SLE có đe dọa

tính mạng như có tổn thương thần kinh, giảm tiểu cầu, thiếu máu huyết tánhoặc SLE không đáp ứng với các biện pháp điều trị bảo tồn

- Liệu pháp dùng các thuốc ức chế miễn dịch khác: Chỉ định với SLE thể

nặng có khả năng đe dọa tính mạng như: viêm cầu thận cấp nặng, có tổnthương thần kinh, giảm tiểu cầu và thiếu máu huyết tán hoặc SLE không đápứng với corticoid hoặc xuất hiện tác dụng phụ nặng của corticoid Các loạithuốc có thể sử dụng đơn độc hoặc phối hợp với nhau, hoặc với corticoid:

o Cyclophosphamide: phối hợp với mesna để dự phòng biến chứngbàng quang.

o Azathioprine, mycophenolate mofetil là nhóm thuốc đang được ưachuộng vì ít tác dụng phụ, hiệu quả cao, thích hợp với phụ nữ còn độtuổi sinh đẻ, tuy nhiên giá thành tương đối cao

- Điều trị không dùng thuốc: Chủ yếu là đối với thể nhẹ, bao gồm: nghỉ ngơi,

tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng, dự phòng nhiễm khuẩn, giáo dục bệnhnhân hiểu rõ về bệnh Một số trường hợp tổn thương suy thận nặng có thểphải lọc máu hoặc ghép thận

1.2 Tổng quan về gen XRCC1 ở người

1.2.1 Vị trí và cấu trúc

Gen XRCC1 có vị trí 19q13.31 (NST 19, cánh dài, vùng 1, băng 3, băng phụ

3, băng dưới phụ 1), bắt đầu từ cặp base 43.543.040 và kết thúc ở cặp base43.580.473 Gen gồm 37.434 cặp base và có 17 exon [12]

Hình 1.2 Vị trí gen XRCC1 trên NST số 19 (Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov )

1.2.2 Chức năng

XRCC1 mã hóa cho protein XRCC1 chứa 633 acid amin, khối lượng phân tử

69.477 Da XRCC1 là một trong những protein đóng vai trò quan trọng trong cơ chếcắt bỏ sửa chữa base (BER) Protein này chịu trách nhiệm cho việc sửa chữa có hiệuquả các tổn thương DNA gây ra bởi các tác động oxy hóa, bức xạ ion hóa và alkyl

hóa [5] Đây là thành viên XRCC được nghiên cứu nhiều nhất trên SLE [16].

Cùng thuộc gia đình XRCC thì XRCC3 được đề xuất đóng vai trò then chốt trong sự phát triển của ung thư, XRCC4 đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định

hệ gene [46] Mặc dù chức năng của chúng rất quan trọng trong sự ổn định DNA,các gen này chưa được nghiên cứu về rối loạn tự miễn, đặc biệt là SLE [16]

Mặc dù XRCC1 không thể hiện hoạt động enzym, nhưng nó có chức năngtương tác để điều phối hoạt động của các protein enzym khác trong bộ máy BER,

bao gồm: glycosylase, endonuclease (APE1), DNA polymerase β, ligase và Poly(ADP-ribose) Polymerases (PARP1 and PARP2) [13], [14], [15]

1.2.3 Cơ chế sửa chữa cắt bỏ base (con đường BER)

Sự thoái hóa base của DNA xảy ra tự phát thông qua thủy phân cũng như qua

sự tương tác với các phân tử hoạt động Các chất alkylating nội sinh như

S-Adenosyl methionine và các tác nhân ngoại sinh (như các chất hóa học dùng trongtrị liệu và các chất chuyển hóa khói thuốc lá) sẽ thêm các nhóm methyl vào cácnitrogens và oxygens của purine và pyrimidines (Hình 1.3 A) Các nhóm oxy hoạtđộng (ROS) được tạo ra do chuỗi vận chuyển điện tử trong ty thể, hoặc do sự ionhóa và tia cực tím, thường thêm các nhóm hydroxyl vào nguyên tử carbon có liênkết đôi trong các purine và pyrimidin, cũng như gây đứt gãy mạch khung đườngphosphate của DNA (Hình 1.3 A) [47]

Sự mất base và tổn thương base làm thay đổi tính chất ghép cặp base củaDNA có khả năng gây nên đột biến, cùng với sự thủy phân tự phát của các basetrong DNA ước tính xảy ra hơn 18.000 lần mỗi tế bào mỗi ngày [48] Mặc dù sốlượng DNA tổn thương này cao, tỷ lệ đột biến soma ở người đã được ước tính là 10-

6 trên mỗi tế bào trong 1 lần phân chia [49]

Phần lớn các base bị hư hại được loại bỏ và thay thế bằng BER Mặc dù BERbao gồm một số con đường phụ, nhưng nó có thể được tổng kết dưới dạng 5 bướccùng enzym tương ứng (Hình 1.3 B)

Bước 1: Liên kết N-glycosidic của base bị hư hại bị cắt bởi DNA glycosylase

để lại một vị trí abasic trong DNA (vị trí khuyết không có base purine haybase pyrimidin)

Bước 2: Đường deoxyribose phosphate tại vị trí abasic được cắt bởi mộtglycosylase hai chức năng và/hoặc một AP-endonuclease Nếu cần thiết, đầutận 3’ của sợi trục bị đứt gãy được chuyển thành hydroxyl cho phép DNApolymerase gắn lại các base mới

Bước 3: Tổng hợp của một bazơ được gọi là miếng vá ngắn (SP – shortpatch) BER và tổng hợp của một số bazơ được gọi là miếng vá dài (LP –long patch) BER

Bước 4: Đầu tận 5' của sợi đơn đứt gãy (SSB - Single strand break) bị tách

rời sau đó sẽ được xử lý để cho phép gắn DNA ligase III

Bước 5: Gắn sợi đơn đứt gãy nhờ DNA ligase III

Hình 1.3 Các cơ chế tổn thương base (hình A) và các bước sửa chữa cắt bỏ

base (con đường BER) (hình B) [47].

Bên cạnh sửa chữa các base bị hư hại, con đường BER cũng tham gia vàoviệc sửa chữa các vị trí abasic và sợi đơn đứt gãy (SSB) được tạo ra độc lập với cácglycosylases và/hoặc AP-endonucleases, chẳng hạn như: sự đứt gãy phân tách

đường deoxyribose phosphate gây ra bởi ROS hoặc sự thủy phân tự phát liên kết

N-glycosidic

1.2.4 Tính đa hình thái đơn nucleotide

1.2.4.1 Đa hình thái đơn là gì?

Hiện tượng đa hình thái đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism –SNP) là những biến thể trình tự DNA xảy ra khi một nucleotide đơn A, T, G, C ởtrong bộ gen bị thay đổi so với bộ gen chung của loài Một biến thể được coi là mộtSNP thì nó phải xảy ra ở ít nhất 1% dân số [50]

Hình 1.4 Minh họa hiện tượng đa hình thái đơn (SNP)

(Nguồn: https://www.natera.com )

SNP là một hiện tượng tương đối phổ biến diễn ra trong suốt chiều dài DNAcủa một người, trung bình xảy ra một lần sau mỗi 300 nucleotide nghĩa là bộ genngười có khoảng 3 tỷ bp sẽ có khoảng 10 triệu SNP [51] Sự phân bố SNP là khôngđồng nhất, nó có thể xảy ra ở bất kỳ vị trí nào trên hệ gen, ở vùng mã hóa haykhông mã hóa, tuy nhiên người ta thường tìm thấy SNP với tần suất cao ở các đoạnDNA nằm giữa các gen [52]

SNP trong vùng mã hóa có 2 loại: đồng nghĩa và không đồng nghĩa SNPđồng nghĩa không ảnh hưởng đến các chuỗi protein trong khi SNP không đồngnghĩa thay đổi trình tự axit amin của protein Các SNP không đồng nghĩa lại đượcchia thành sai nghĩa và vô nghĩa

SNP không nằm trong vùng mã hóa protein có thể vẫn ảnh hưởng đến sự liênkết gen, sự gắn kết yếu tố phiên mã, sự thoái hoá của mRNA, hoặc trình tự RNAkhông mã hóa

Mặc dù hơn 99% trình tự DNA của con người là giống nhau, nhưng chỉ một

sự thay đổi nhỏ trong hệ gen cũng có thể tác động lớn đến tính nhạy cảm của mỗi cáthể khác nhau với bệnh tật, sự đáp ứng với các liệu pháp điều trị cũng như khả năngthích nghi với các yếu tố từ môi trường như: chất độc, vi khuẩn, virus… Điều nàylàm cho SNP có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực y sinh học [53]

Những biến thể này được xem như là các dấu ấn sinh học Các nhà nghiêncứu sẽ tiến hành so sánh trình tự gen của các nhóm người khác nhau (giữa nhómngười bị bệnh và không bị bệnh) để từ đó xác định mối liên quan giữa các SNP vớikhả năng mắc bệnh, tìm ra các yếu tố nguy cơ cũng như phương pháp chữa trị.

1.2.4.2 Tính đa hình thái đơn nucleotide của gen XRCC1

Mặc dù có hơn 300 SNP đã được mô tả trong gen XRCC1, chỉ có ba SNP

thường xuyên được nghiên cứu [16]:

Bảng 1.1 Một số đa hình đơn của gen XRCC1

SNP Vị trí trên gen

XRCC1 Biến đổi nucleotide

Acid amin

Đa hình Arg399Gln (rs25487, G > A) là đa hình được nghiên cứu trong đề tàinày Tính đa hình của Arg399Gln nằm ở trung tâm của miền XRCC1 BRCT1, liênquan đến chức năng của PARP1, PARP2 và APE1 [54], [31] Monaco và cộng sự(2007) cho thấy việc thay thế Arg399Gln XRCC1 tạo ra sự thay đổi đáng kể về cấuhình ở một số vị trí khác trong miền BRCT1 Những thay đổi này có thể là rất quantrọng trong sự tương tác protein-protein và sau đó có thể giảm khả năng tạo ra các

bộ máy BER [55]

Hình 1.5 Các miền của protein XRCC1 và cấu trúc gen XRCC1 [56]

A: Sơ đồ mạch cho thấy các vùng tương tác giữa các protein trong BERB: Sơ đồ vị trí của các SNP phổ biến nhất và được nghiên cứu nhiều nhất

Sự giảm khả năng của protein XRCC1 399Gln trong quá trình sửa chữaDNA gần đây đã được chứng minh Li Y và cộng sự (2009) nghiên cứu cho thấycác “tế bào lymphoblast bất tử” (immortalized lymphoblasts) lấy từ những người

công nhân vinyl chloride mang kiểu gen XRCC1 399Arg/Arg, đã phơi nhiễm với

chloroethylene oxide (CEO) và tiếp xúc với etheno-adenosine có hiệu quả sửa chữatrung bình là 82% Ngược lại, các “tế bào lymphoblast bất tử” ở những người công

nhân có kiểu gen XRCC1 399 Gln/Gln và cùng phơi nhiễm như trên thì hiệu quảsửa chữa trung bình là 32% [57].

Việc sửa chữa DNA bị suy giảm có thể gây phản ứng tự miễn dịch ở nhữngngười dễ bị tổn thương với biến thể protein XRCC1 đã bị phơi nhiễm với các yếu tốphá hủy DNA [10], [9], [58], [59], [60]

Một nghiên cứu phân tích cộng gộp gần đây (2012) bao gồm các dân tộc Đài

Loan Trung Quốc, Ba Lan và Brazil cho thấy kiểu gen XRCC1 399 Gln/Gln hoặc

Gln/Arg và alen Gln có liên quan đến tỷ lệ mắc SLE Tỷ suất chênh OR cho gen

399 Gln/Gln hoặc Gln/Arg so với Arg/Arg là 1,440 (p = 0,0019) và OR cho alen Gln là 1,27 (p = 0,0051) [5]

Tuy nhiên, nghiên cứu ở Đông Nam Iran (2014) lại cho thấy nguy cơ SLEthấp hơn ở các cá thể có gen 399 Gln/Gln và Gln/Arg so với những người có kiểu

gen Arg/Arg với tương ứng OR = 0,73 (p = 0,063) và OR = 0,44 (p = 0,001) Ngoài

ra, tần số của alen Gln thấp hơn đáng kể ở bệnh nhân SLE OR = 0,7 (p = 0,02) [17].

Đa hình Arg399Gln (rs25487, G > A) được nghiên cứu không chỉ trong SLE

mà còn trong nhiều bệnh ung thư khác nhau Sự có mặt của alen A (tương ứng kiểugen 399 Gln/Gln hoặc 399 Gln/Arg) được coi là yếu tố nguy cơ xuất hiện các loạiung thư như: ung thư tụy ở người châu Á [18] và là yếu tố tiên lượng xấu làm giảmđáp ứng điều trị đối với ung thư phổi [19], ung thư dạ dày và đại trực tràng ở ngườichâu Á [20], ung thư vú (xạ trị và hóa trị) [21] Tuy nhiên đa hình này được cho làkhông liên quan tới ung thư biểu mô tế bào gan [61], ung thư vú ở người Ả RậpSaudi [62], ung thư bàng quang ở người châu Á [63] Ngoài ra đa hình Arg399Glncũng có thể đóng góp trong bệnh tâm thần phân liệt [64], bệnh xơ vữa động mạchvành [65]…

Tại Việt Nam chúng tôi chưa thấy có nhiều nghiên cứu về gen XRCC1 nói

chung, đa hình Arg399Gln trên bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống nói riêng

1.3 Các kỹ thuật SHPT phát hiện tính đa hình thái đơn nucleotide

1.3.1 Kỹ thuật PCR

1.3.1.1 Khái niệm

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) là một kỹthuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) củamột đoạn DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt [66]

1.3.1.2 Thành phần và các bước tiến hành

 Các thành phần tham gia trong phản ứng PCR

DNA khuôn: Là DNA cần khuếch đại, có thể là mạch thẳng, mạch vòng,DNA plasmid, cDNA hay RNA đều được

Cặp mồi đặc hiệu: Gồm mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) Nó gắn chặt vớiDNA khuôn ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA polymerasenối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi DNA mới

DNA polymerase: Là enzym xúc tác quá trình lắp ráp các nucleotide A, T, G,

C vào mạch DNA mới tổng hợp Thường gặp là Taq polymerase.

Các dNTP: Gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu tham gia tạonên mạch DNA mới

MgCl2 và dung dịch đệm (Buffer): Thành phần dung dịch của phản ứng PCRthường phụ thuộc vào loại enzym DNA polymerase sử dụng trong PCR, quantrọng nhất là ion Mg2+ Mg2+ cần thiết cho quá trình liên kết các dNTP, xúc

tác cho Taq polymerase làm tăng Tm của DNA mạch kép Mg2+ còn là

Co-factor của Taq polymerase.

 Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại Mỗi chu kỳ gồm có 3 giai đoạnđược điều hòa bởi nhiệt độ:

Giai đoạn biến tính (92 – 95oC): Chuỗi xoắn kép DNA bị biến tính, táchthành 2 sợi đơn

Giai đoạn gắn mồi (50 – 52oC): Đoạn DNA mồi được lai ghép với sợi đơncủa DNA ban đầu

Giai đoạn tổng hợp (70 – 72oC): DNA polymerase điều khiển sự gắn tiếp cácdNTP vào đoạn DNA mồi dựa trên DNA khuôn ban đầu

Hình 1.6 Sơ đồ chu trình phản ứng PCR (Nguồn: https://en.wikipedia.org )

1.3.2 Kỹ thuật PCR-RFLP

1.3.2.1 Khái niệm

PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment LengthPolymorphism) là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc một đoạn DNA