ỨNG DỤNG kĩ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN THẾ hệ mới TRONG xác ĐỊNH KIỂU GEN một số CHỦNG VIRUS VIÊM GAN c tại BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT đới TRUNG ƯƠNG năm 2015

LÊ THỊ DUYÊNỨNG DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG XÁC ĐỊNH KIỂU GEN MỘT SỐ CHỦNG VIRUS VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG NĂM 2015 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC

LÊ THỊ DUYÊN

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN

THẾ HỆ MỚI TRONG XÁC ĐỊNH KIỂU GEN MỘT SỐ CHỦNG VIRUS VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG NĂM 2015

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2017

LÊ THỊ DUYÊN

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN

THẾ HỆ MỚI TRONG XÁC ĐỊNH KIỂU GEN MỘT SỐ CHỦNG VIRUS VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG NĂM 2015

Chuyên ngành: Vi sinh y học

Mã số: 60720115

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS LÊ THỊ HỘI

HÀ NỘI – 2017

NAT (Nucleic acid amplification) : thử nghiệm khuếch đại acid

nucleicWHO (World Health Organrination) : Tổ chức Y tế thế giới

DAAs (Direct acting Antivirals) : thuốc kháng virus trực tiếp

LVP (Lipo – viro – particles) : hạt lipoprotein – virus

ORF (Open reading frame) : khung đọc mở

UTRs (Untranslated regions) : vùng không dịch mã

NS (Non structural) : gen không cấu trúc

RDRP (RNA – dependent RNA

polymerase)

: polymerarase RNA phụ thuộcRNA

DNA : Deoxyribonucleic acid

RNA : Ribonucleic acid

NGS (Next Generation Sequencing) : giải trình tự gen thế hệ mới

RT PCR (Reverse Transcription

Primer Chain Reaction)

: PCR phiên mã ngược

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình bệnh viêm gan virus C 3

1.2 Virus viêm gan C 6

1.2.1 Cấu trúc hạt virus viêm gan C 6

1.2.2 Cấu trúc bộ gen virus viêm gan C 7

1.2.3 Các kiểu gen virus viêm gan C 8

1.3 Vai trò xác định kiểu gen HCV trong điều trị 10

1.4 Các phương pháp xác định kiểu gen HCV 11

1.4.1 Phương pháp lai đầu dò (Line Probe Assay – LiPA) 11

1.4.2 Realtime PCR (Realtime Primer Chain Reaction) 12

1.4.3 Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger 12

1.4.4 Giải trình tự gen thế hệ mới NGS (Next Generation Sequencing) 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3 Quy trình nghiên cứu 17

2.4 Thiết kế nghiên cứu 18

CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 20

3.1 Đặc điểm chung của bệnh nhân nghiên cứu 20

3.2 Tỷ lệ kiểu gen và kiểu gen phụ HCV dựa trên phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới NGS 21

3.2.1 Kết quả phân tích kiểu gen HCV bằng phương pháp NGS 22

3.2.2 Tỷ lệ kiểu gen HCV 21

3.3.2 Tỷ lệ kiểu gen phụ HCV 23

3.4 So sánh giải trình tự gen HCV bằng 2 phương pháp NGS và Sanger 23

CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 24

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 24

DỰ KIẾN KHUYẾN NGHỊ 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 2.1 Nội kiểm quy trình xét nghiệm…………….………… 18

Bảng 3.1 Kết quả phân tích kiểu gen HCV bằng phương pháp NGS 21

Bảng 3.2 Tỷ lệ kiểu gen HCV 21

Bảng 3.3 Tỷ lệ kiểu gen phụ HCV 22

Bảng 3.4 Tỷ lệ kiểu gen HCV 21

Bảng 3.5 Tỷ lệ kiểu gen phụ HCV 22

Bảng 3.6 Kết quả kiểu gen HCV dựa trên phương pháp NGS và Sanger 21

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh theo các nhóm tuổi 20

Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh theo giới 20

Hình 1.2 Cấu trúc HCV 6

Hình 1.3 Cấu trúc bộ gen HCV 7

Hình 1.4 Cây phát sinh chủng loại HCV 8

Hình 1.5 Sự phân bố genotype HCV trên toàn thế giới 9

Hình 1.6 Đích tác dụng của thuốc DAAs 11

Hình 1.7 Quy trình giải trình tự gen bằng NGS 15

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu 17

Hình 2.2 Thiết kế nghiên cứu 18

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh viêm gan virus C là bệnh truyền nhiễm do virus viêm gan C(HCV) gây ra Mặc dù biểu hiện lâm sàng của nhiễm HCV cấp thường nhẹhoặc không có triệu chứng nhưng HCV có thể gây viêm gan cấp, viêm ganmạn, tiến triển thành xơ gan, thậm chí ung thư tế bào gan (HCC) dẫn đến tửvong [1],[2] Theo ước tính của nghiên cứu về Gánh nặng bệnh tật toàn cầucủa Tổ chức Y tế thế giới (Global Burden of Disease), số ca tử vong do viêmgan C là 333.000 vào năm 1990, 499.000 vào năm 2010 và 704.000 vào năm

2013 [3],[4] Năm 2015, tổng kết số người nhiễm HCV mạn tính lên tới 71triệu người, tương đương với số bệnh nhân viêm gan virus C cần điều trị, làmột gánh nặng bệnh tật cho cả toàn xã hội [5]

Sự ra đời của các thuốc điều trị viêm gan virus C, đặc biệt là các thuốctác động trực tiếp tới virus DAAs (Direct Acting Antivirals) đã giúp cải thiệnđáng kể tình trạng bệnh, giảm tỷ lệ biến chứng và tử vong cũng như giảm chiphí điều trị Tuy nhiên, việc lựa chọn phác đồ điều trị HCV liên quan mậtthiết tới kiểu gen của HCV, đặc biệt một số phác đồ đòi hỏi phải xác định tớikiểu gen phụ của virus [2] Do tầm quan trọng trong việc xác định kiểu genHCV trước khi lựa chọn phác đồ điều trị, nhiều phương pháp xác định kiểugen HCV đã ra đời chỉ ngay sau khi phát hiện ra virus viêm gan C một vàinăm Một số phương pháp thường được sử dụng là lai đầu dò, Realtime PCR,giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger, phương pháp Sanger được xemnhư tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán và xác định kiểu gen HCV Tuy nhiên,nhược điểm của phương pháp này là cần nhiều mẫu cho một lần chạy, chi phícao, thời gian để có kết quả dài hơn so với các phương pháp khác [6] Bêncạnh đó, dịch tễ của các bệnh nhân bị nhiễm HCV hiện nay tập trung chủ yếuvào nhóm nguy cơ cao, bao gồm các bệnh nhân chạy thận nhân tạo, tiêm

chích ma túy, truyền máu [7] Những đối tượng này rất dễ bị nhiễm nhiềuhơn một kiểu gen HCV Đây là vấn đề mà phương pháp Sanger không thểgiải quyết được Trong những năm gần đây, một số phương pháp giải trình tựgen mới đã ra đời, gọi là phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NextGeneration Sequencing – NGS), giúp khắc phục một số nhược điểm củaphương pháp Sanger NGS có khả năng tạo ra khối lượng dữ liệu khổng lồ,cũng như khả năng cung cấp thông tin về bộ gen chính xác, nhanh chóng, đặcbiệt còn cho phép xác định đa nhiễm nhiều kiểu gen hay kiểu gen phụ HCVtrên cùng một bệnh nhân [7] Để tìm hiểu về khả năng ứng dụng của NGStrong giải trình tự gen HCV, chúng tôi tiến hành nghiên “Ứng dụng kỹ thuậtgiải trình tự gen thế hệ mới trong xác định kiểu gen của một số chủng virusviêm gan C tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương năm 2015” với 2 mụctiêu:

1 Xác định tỷ lệ genotype và subtype HCV dựa trên phương pháp

giải trình tự gen thế hệ mới NGS.

2 So sánh giải trình tự gen HCV bằng 2 phương pháp NGS và

Sanger.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1. Tình hình bệnh viêm gan virus C

Bệnh viêm gan virus C là bệnh truyền nhiễm do virus viêm gan C(HCV) gây ra HCV có thể gây viêm gan cấp, viêm gan mạn, tiến triển thành

xơ gan, ung thư tế bào gan (HCC) HCV là một trong những căn nguyên hàngđầu gây bệnh gan mạn tính Bệnh lây nhiễm qua đường máu, tình dục, mẹtruyền sang con [1],[2]

Phần lớn bệnh không có triệu chứng lâm sàng cho đến khi có biểu hiện

xơ gan, đôi khi có mệt mỏi, chán ăn, đầy bụng, đau nhẹ hạ sườn phải, rối loạntiêu hóa, đau cơ [1],[2] 15 – 45% số người mắc HCV cấp tính sẽ tự khỏitrong vòng 6 tháng 55 – 85% sẽ mắc HCV trong suốt phần đời còn lại haycòn gọi là nhiễm HCV mãn tính nếu không điều trị Các kháng thể chống lạiHCV xuất hiện từ giai đoạn cấp tính và tồn tại suốt đời Ở những người cókháng thể HCV, cần phải kiểm tra nồng độ acid nucleic (NAT) đối với HCVRNA, phát hiện sự hiện diện của virus để phục vụ cho chẩn đoán và điều trị[8],[9] Trong số những người bị nhiễm HCV mãn tính, nguy cơ xơ gan là 15– 30% trong vòng 20 năm [10],[11],[12] Nguy cơ ung thư tế bào gan ở người

bị xơ gan xấp xỉ 2 – 4% mỗi năm [13]

Trước đây, số ca tử vong mỗi năm do các bệnh liên quan đến HCV ngàymột gia tăng Theo ước tính của nghiên cứu về Gánh nặng bệnh tật toàn cầucủa Tổ chức Y tế thế giới (Global Burden of Disease), số ca tử vong do viêmgan C là 333.000 vào năm 1990, 499.000 vào năm 2010 và 704.000 vào năm

2013 [3],[4] Một số lượng lớn những người nhiễm HCV từ 30 – 60 năm trướcđang chết vì xơ gan và ung thư tế bào gan vì những biến chứng này thường tiếntriển kéo dài tới hàng thập kỷ Sự gia tăng số người chết được dự kiến sẽ tiếp tụctrong nhiều thập kỷ nữa trừ khi điều trị được tăng lên đáng kể [14]

Các phân tích gần đây về tỷ lệ hiện nhiễm HCV toàn cầu cho thấy có thể

có ít người nhiễm HCV hơn so với trước đây Năm 2013, một tổng kết hệthống đã kết luận rằng có 184 triệu người có tiền sử nhiễm HCV (có khángthể kháng HCV) Trong số đó, khoảng 130 – 150 triệu người có thể bị nhiễmbệnh mạn tính [15] Một nghiên cứu khác vào năm 2014 có tính hệ thốnghơn, ước tính rằng 115 triệu người có kháng thể kháng HCV dương tính và

80 triệu người bị nhiễm HCV mạn tính [16] Gần đây nhất vào năm 2015, sốngười nhiễm HCV mạn tính được ước tính giảm xuống còn 71 triệu người

Số ca tử vong cũng giảm còn trung bình khoảng 399.000 ca/ năm Ước tính

Hình 1.1 Diễn biến tự nhiên của nhiễm HCV [2]

thấp hơn này có thể được giải thích bởi sự giảm tỷ lệ số ca nhiễm cũng như

sự cải thiện các xét nghiệm chẩn đoán HCV giúp giảm tỷ lệ dương tính giả và

sự ra đời của các thuốc điều trị HCV mới [5].Theo báo cáo của Tổ chức Y tếThế giới, các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HCV cao nằm ở Châu Phi và Châu Ánhư Ai Cập (14,7%), Pakistan (4,95%), Thái Lan (3,2 – 5,6%) và Việt Nam(2 – 9%) [15] Tại Việt Nam, tỷ lệ hiện nhiễm HCV thay đổi tùy theo vị tríđịa lý và tùy từng đối tượng, từ 1 – 2,9% trong dân số nói chung [18] đến 46– 87% ở những người tiêm chích ma tuý [19]

Mặc dù tỷ lệ mắc có giảm nhưng số người cần được điều trị HCV hiệnnay vẫn còn cao Việc nắm được tỷ lệ những người bị xơ hóa giai đoạn cuốirất quan trọng trong việc lên kế hoạch cho các dịch vụ điều trị HCV Đây lànhững cá nhân cần được ưu tiên điều trị HCV vì họ có nguy cơ cao bị xơ ganmất bù và ung thư tế bào gan [20] Năm 1989, sau khi virus HCV được khámphá ra, thuốc điều trị HCV đầu tiên dựa trên Interferon-alpha, một cytokineđược giải phóng bởi các tế bào chủ ra đời Thuốc được tiêm dưới da, ức chế

sự nhân lên của HCV và điều chỉnh đáp ứng miễn dịch đối với các tế bào gannhiễm HCV Sự ra đời của Ribavirin, một chất ức chế nucleoside đã làm tăng

tỷ lệ chữa khỏi bệnh Tuy nhiên, các phác đồ Interferon / Ribavirin đượcdung nạp kém, liên quan đến nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng và tỷ lệ chữakhỏi từ 40 – 65%, tùy thuộc vào kiểu gen của bệnh nhân, tình trạng xơ gan,HIV và kinh nghiệm điều trị trước đây Một cải tiến đáng kể trong điều trịHCV là việc sử dụng các thuốc uống ức chế trực tiếp chu kỳ nhân lên củaHCV Các thuốc này được gọi là Direct – Acting Antiviral (DAA), nhắm mụctiêu đến ba vùng quan trọng trong bộ gen của HCV: NS3/ 4A protease,polymerase NS5A và NS5B, dẫn đến đáp ứng virus dài hơn, thời gian điều trịngắn hơn, được dùng đường uống và có ít tác dụng phụ hơn [21] Sự ra đờicủa DAAs đã giúp tăng hiệu quả điều trị lên đáng kể, tỷ lệ đáp ứng virus đối

với genotype 1 từ 40% lên tới 90%, giúp giảm tỷ lệ biến chứng, tử vong doHCV trong những năm gần đây [2].

1.2. Virus viêm gan C

1.2.1 Cấu trúc hạt virus viêm gan C

Virus viêm gan C thuộc họ Flaviviridae, chi Hepacivirus HCV có dạng

hình cầu, đường kính 40 – 80 nm trong cơ thể vật chủ [22] hoặc 60 – 75 nmtrong tế bào nuôi cấy [23] Cấu tạo hạt HCV bao gồm lớp vỏ envelope ởngoài cùng có các glycoprotein E1 và E2, một capsid gồm 20 mặt bao bọcquanh một sợi RNA mạch đơn [23]

Hình 1.2 Cấu trúc HCV [24]

Trong máu, HCV tồn tại dưới nhiều dạng khác nhau: dạng liên kếtLipoprotein (LVP) bao gồm Lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) và Lipoprotein

tỷ trọng rất thấp (VLDL), dạng liên kết với kháng thể và dạng tự do [25],[26].Vai trò chính xác của việc hình thành LVP vẫn còn chưa rõ ràng, nhưngdường như chúng giúp virus xâm nhập vào tế bào chủ (vì các hạt HCV sử

dụng thụ thể liên quan đến sự hấp thu lipid) và có khả năng giúp virus trốntránh hệ thống miễn dịch của vật chủ (Lipoprotein bao quanh bảo vệ viruskhỏi sự nhận dạng của kháng thể) [27].

1.2.2 Cấu trúc bộ gen virus viêm gan C

HCV có bộ gen là một sợi RNA dương tính bao gồm một khung đọc mởdài 9,6 kb (ORF) được bắt đầu và kết thúc bởi các vùng không dịch mã 5’ và3’ (UTRs) Vùng 5’ UTR được bảo toàn cao, 3’ UTR có một chuỗi biến đổingắn poly U và một phần tử được bảo toàn cao

Hình 1.3 Cấu trúc bộ gen HCV [28]

Core, p7, E1, E2 là các gen protein cấu trúc mã hóa cho các proteinnucleocapsid, protein xuyên màng , gp35 và gp72 Trong quá trình nhân lên,ORF HCV được chuyển thành một polyprotein mạch đơn (khoảng 3.000 axitamin), sau đó được cắt bởi protease tế bào chủ và protease virus được mã hoábởi các gen không cấu trúc NS2, NS3 và NS4A Gen NS3 còn mã hoá chomột helicase đóng vai trò trong quá trình nhân lên của virus NS5A là mộtphosphoprotein đa chức năng Nó là thành phần quan trọng của phức hợpnhân bản và liên kết với các thành phần khác của phức hợp, bao gồm RDRP,RNA, và cyclophilin A – một protein cần thiết cho sự nhân lên của RNAHCV NS5A còn đóng vai trò trong việc lắp ráp hạt virus NS5B là RNA

polymerase phụ thuộc RNA (RDRP) thiếu hoạt tính sửa chữa, dẫn đến có tỷ

lệ đột biến cao trong quá trình nhân lên và hình thành nên các biến loài [28]

1.2.3 Các kiểu gen virus viêm gan C

Kể từ khi HCV được phát hiện vào cuối những năm 1980, 6 genotypechính đã được công nhận, genotype 1 đến 6 Các kiểu gen 1, 2, 3, 4 và 6 lạiđược chia nhỏ thành nhiều loại kiểu gen phụ Các kiểu gen khác nhau ≥ 30%

số nucleotide, trong khi các kiểu gen phụ trong cùng một kiểu gen có sự khácbiệt thường từ 15% đến 25% [29],[30] Gần đây, một kiểu gen mới có bộ genkhác với 6 kiểu gen trước đây đã được phát hiện và được đặt tên là kiểu gen

7, đồng thời cũng được phân loại là kiểu gen phụ 7a Tổng kết lại tới nayHCV đã được phân ra làm 7 kiểu gen và 67 kiểu gen phụ khác nhau [30]

Hình 1.4 Cây phát sinh chủng loại HCV [30]

Sự phân bố toàn cầu các kiểu gen của HCV rất đa dạng, phản ánh sựkhác biệt về dịch tễ học, bao gồm cả thời gian, phương thức lây truyền vàchủng tộc Các kiểu gen HCV 1, 2 và 3 phân bố khá rộng, trong khi kiểu gen

4, 5 và 6 chỉ tập trung ở một số vùng địa lý cụ thể [31],[32] Kiểu gen 1 cóphân bố địa lý rộng nhất, nó là kiểu gen phổ biến nhất ở hầu hết các nước Bắc

Mỹ [33], Bắc và Tây Âu [34],[35], Nam Mỹ, Châu Á và Australia [36] Trướcnhững năm 1990, ở Đông và Nam Âu, kiểu gen 1b và 2 là nổi bật [37],[38],[39], nhưng dữ liệu trong thập kỷ qua cho thấy đã có sự biến chuyển Cácnghiên cứu từ Ba Lan [37], Estonia [38] và Hy Lạp [39] báo cáo tăng tỷ lệkiểu gen 3a, giảm kiểu gen 1b và/ hoặc kiểu gen 2 theo thời gian Sự phân bốkiểu gen 4, 5, 6 hạn chế hơn Kiểu gen 4 được tìm thấy chủ yếu ở Châu Phi[40] và Trung Đông [41],[42] Kiểu gen 5 hầu như chỉ được tìm thấy ở NamPhi [43] Kiểu gen 6 tập trung chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á , trong đó cóViệt Nam [44] và cũng phổ biến ở Hồng Kông [45], Nam Trung Quốc [46] Tại Việt Nam, các kiểu gen phổ biến là 1, 2 và 6 Trong một nghiên cứu

về dịch tễ học kiểu gen của HCV tại Việt Nam, tỷ lệ các kiểu gen 1, 2 và 6chiếm hầu hết các trường hợp và lần lượt là 58,4%; 13,1%; 23,9% [47]

Hình 1.5 Sự phân bố kiểu gen HCV trên toàn thế giới [48]

1.3. Vai trò xác định kiểu gen HCV trong điều trị

Hiện nay lựa chọn đầu tay trong điều trị viêm gan virus C là các thuốcDAAs, nhắm mục tiêu trực tiếp vào các protein không cấu trúc liên quanđến sự nhân lên của virus ( NS3 – 4A, NS5A, NS5B) Tuy nhiên, khả năngđáp ứng của các kiểu gen HCV khác nhau với DAAs cũng có thể khácnhau Ví dụ: tỷ lệ đáp ứng virus bền vững sau khi sử dụng Sofosbuvir/Ribavirin với kiểu gen 2 lớn hơn với kiểu gen 3 ít nhất 30% trên các bệnhnhân xơ gan và bệnh nhân thất bại điều trị với Interferon α/ Ribavirin [49].Với kiểu gen 1, việc xác định kiểu gen phụ 1a và 1b cũng rất quan trọngtrong việc lựa chọn DAAs để điều trị Đáp ứng điều trị với các thuốc ức chếprotease (Simeprevir, Paritaprevir,…) có thể phụ thuộc vào từng loại kiểu genphụ này, cụ thể tỷ lệ đáp ứng virus bền vững đối với các thuốc ức chếprotease trên 1b cao hơn 15% so với trên 1a Bên cạnh đó, các cá nhân bịnhiễm kiểu gen phụ 1a có thể chứa các virus đột biến có khả năng chống lạicác thuốc ức chế protease, đặc biệt là đột biến điểm trong NS3 dẫn đến sựthay đổi glutamine – tolysine ở axit amin 80, hoặc trong Q80K, làm cho virus

có khả năng đề kháng với Simeprevir Bởi vậy, với các bệnh nhân mang kiểugen phụ 1a, khuyến cáo thử nghiệm thêm cho Q80K để lựa chọn phác đồthuốc điều trị phù hợp cho bệnh nhân [50], [51] Ngoài ra, việc xác định kiểugen của HCV rất quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị bằng thuốc

và tiên lượng về khả năng đáp ứng điều trị đối với Interferon/ Ribavirin, cácthuốc lựa chọn thứ 2 sau DAAs [50]

Hình 1.6 Đích tác dụng của thuốc DAAs [52]

1.4. Các phương pháp xác định kiểu gen HCV

Hiện nay có nhiều phương pháp để xác định kiểu gen và kiểu gen phụcủa HCV Các xét nghiệm dựa trên trình tự 5’UTR thường được chấp nhậnđối với việc xác định kiểu gen nhưng xác định kiểu gen phụ lại thường dựavào phân tích các gen NS5B, Core, và/ hoặc Core – E1 để đạt độ chính xáccao hơn

1.4.1 Phương pháp lai đầu dò (Line Probe Assay – LiPA)

Kỹ thuật lai đầu dò hướng đến gen đích là 5’ – UTR HCV Sau khi genđược khuếch đại bằng các mồi đặc hiệu, sản phẩm được lai với một màng cócác đầu dò đặc hiệu gen và được phát hiện bằng máy dò màu hoặc quan sátbằng mắt

Mặc dù gen 5’ – UTR có độ bảo tồn cao, việc xác định kiểu gen HCVdựa trên 5’ – UTR là chính xác cho hầu hết các kiểu gen nhưng đã có nghiêncứu lưu ý rằng các phương pháp dựa trên việc sử dụng 5’ – UTR xác định sai

các kiểu gen phụ 6c đến 6l [28] Một tỷ lệ đáng kể các kiểu gen phụ 1a phânlập được bởi LiPA dưới dạng 1b Phân tích trình tự cho thấy sự khác biệt duynhất trong đoạn gen 5’UTR ở các kiểu gen phụ 1a với 1b được phân loại sai

là một nucleotide (A / G) ở vị trí 99 của bộ gen HCV [52] Phương pháp nàychưa đủ độ tin cậy cho phân loại kiểu gen phụ

1.4.2 Realtime PCR

Phương pháp này sử dụng Realtime PCR và nhiều đầu dò thủy phântrong ba phản ứng khác nhau để phát hiện tất cả các HCV, phân biệt các kiểugen và kiểu gen phụ Phản ứng dựa vào các gen đích 5’ – UTR hoặc Core đểphân biệt kiểu gen và NS5B để phân biệt kiểu gen phụ [53] Với phươngpháp này, có thể xác định được đa nhiễm nhiều kiểu gen Tỷ lệ không xácđịnh là khoảng 2% với hầu hết các vấn đề phát sinh từ việc xác định kiểu gen

3 Không thể phân biệt được các kiểu gen phụ của kiểu gen 1 trong khoảng5% các trường hợp [54]

1.4.3 Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger

Năm 1977, Frederick Sanger phát triển công nghệ giải trình tự DNA dựatrên phương pháp chấm dứt chuỗi (còn gọi là giải trình tự Sanger) Do hiệuquả cao và tính phóng xạ thấp nên giải trình tự Sanger đã được công nhận làcông nghệ chính trong "giải trình tự gen thế hệ thứ nhất" ứng dụng trong cảphòng thí nghiệm và các kit thương mại [55]

Các kiểu gen của HCV được xác định dựa trên phân tích trình tự genNS5B RNA của virus sau khi được tách chiết sẽ được chuyển sang dạngcDNA nhờ phản ứng sao chép ngược (Reverse Transcription PCR– RT PCR).Các cDNA sau đó được dùng làm khuôn để nhân đoạn NS5B bằng cặp mồiSc2 và Ac2 Sản phẩm PCR vòng một (sử dụng cặp mồi Sc2, Ac2) được tiếp tụcdùng làm khuôn cho phản ứng Nested PCR với cặp mồi S7, A5 Sản phẩm NestedPCR có kích thước bé hơn sản phẩm PCR vòng 1 và được tinh sạch, dùng làm

khuôn cho phản ứng PCR sequencing và giải trình tự gen trên máy giải trình tự.Trong phản ứng sequencing, quá trình sao chép sợi DNA được tổng hợp

từ đầu 3’, vì có một nhóm OH tại vị trí cacbon số 3 được dùng để nối cácnucleotide tiếp theo thông qua liên kết với nhóm phosphat ở vị trí cacbon số

5 Các nucleotide bị khuyết nhóm OH tại vị trí các bon số 3 được gọi làdideoxy nucleotide (ddDNA), và những nucleotide này đóng vai trò kết thúc

sự kéo dài của sợi DNA mỗi khi chúng được gắn vào Mỗi dideoxy nucleotide(ddCTP, ddATP, ddTTP, ddGTP) đều được gắn một loại dye huỳnh quang cómàu khác nhau nhằm mục đích để phân biệt khi chúng phát quang Khi bốnloại ddNTP đã gắn dye huỳnh quang này tiếp xúc với tia UV laser, chúng sẽhấp phụ tại các bước sóng khác nhau, sau đó được phát hiện và ghi lại bởi mộtsensor đặt trên máy DNA sequencer

Trong mỗi ống PCR, thành phần phản ứng bao gồm: (1) Bigdye (cóchứa Taq DNA polymerase, dNTPs thông thường, ddNTPs đã được đánh dấuhuỳnh quang và khuyết nhóm OH, (2) một đoạn mồi, (3) DNA khuôn (sảnphẩm PCR đã tinh sạch), và (4) nước Thông thường, nồng độ của dNTPstrong ống phản ứng phải cao hơn nồng độ ddNTPs Nếu bổ sung 100%ddNTPs, Taq polymerase sẽ gắn một ddNTP vào phía trước đoạn mồi và khi

đó phản ứng kéo dài sợi ADN sẽ dừng lại Mặt khác, khi bổ sung 100%dNTPs, sợi ADN sẽ được tổng hợp liên tục mà không có cơ hội để gắn cácddNTP vào sợi ADN Do vậy, Big Dye có chứa hỗn hợp dNTPs và ddNTPsvới tỷ lệ tối ưu là 100:1, và với tỷ lệ này, mỗi khi polymerase gắn mộtnucleotide vào sợi DNA, cũng sẽ là cơ hội để gắn một ddNTP Việc lặp lạinhiều chu kỳ PCR sẽ tạo ra nhiều sợi DNA có chiều dài dao động từ vị trí mồicộng thêm một nucleotide tới vị trí mồi cộng tất cả các nucleotide Do sảnphẩm DNA tổng hợp đã được đánh dấu bằng các loại dye huỳnh quang khácnhau, trình tự sợi DNA tính từ đầu 3’ được xác định bằng cách phân tách cácđoạn sản phẩm trên gel acrylamide và quét trên máy đọc huỳnh quang để phát

hiện các ddNTP gắn huỳnh quang trên sợi DNA Trình tự DNA sau đó được

xử lý và đưa lên trên hệ thống dữ liệu HCV để tìm ra kiểu gen tương đồngnhất với mẫu HCV đích

Phương pháp này là tiêu chuẩn vàng để định type HCV, có thể xác địnhchính xác kiểu gen và kiểu gen phụ của HCV, kể cả các kiểu gen hiếm gặp (chiếm

tỷ lệ < 10%) Tuy nhiên, chúng yêu cầu cần có các thiết bị chuyên dụng, phầnmềm phân tích, chi phí cao, thời gian để có kết quả dài hơn so với các phươngpháp khác, và hạn chế khi có đồng nhiễm hay đa nhiễm nhiều kiểu gen HCV [28]

1.4.4 Giải trình tự gen thế hệ mới NGS (Next Generation Sequencing)

Phương pháp Sanger tự động ra đời đã mang đến nhiều thành tựu lớn.Tuy nhiên, những hạn chế của phương pháp cho thấy cần phải có công nghệmới và cải tiến hơn để sắp xếp một số lượng lớn bộ gen của người và các bộgen khác Vào cuối những năm 20 và đầu thế kỷ 21, đã có những nỗ lực nhằmphát triển các phương pháp mới để thay thế cho phương pháp Sanger, cácphương pháp mới hơn được gọi là NGS (Next Generation Sequencing) Sựtiến bộ lớn của NGS là khả năng tạo ra khối lượng dữ liệu khổng lồ, cũng nhưkhả năng cung cấp thông tin về bộ gen chính xác, nhanh chóng và không tốnkém [57]

1.4.4.1 Nguyên lý

NGS sử dụng nguyên lý khác với phương pháp cổ điển của Sanger Mộttrong những công nghệ hiện nay hay dùng là Illumina với nguyên lý tổng hợpnucleotid (Sequencing By Synthesis  –  SBS), theo dõi việc bổ sung cácnucleotide đã được gắn nhãn một cách song song, ồ ạt Một lần chạy có thểcung cấp dữ liệu đầu ra từ 300 kilobase lên đến 1 terabase, tùy thuộc vào loạidụng cụ và cấu hình máy

Đầu tiên, các phân tử DNA sẽ được tinh sạch rồi cắt thành các đoạn ngắnngẫu nhiên, gắn adapter vào hai đầu, sau đó gắn lên bề mặt của tế bào dòngchảy (flow cell), tạo thành các cầu và được khuếch đại lên nhiều lần thành các

cụm DNA Các cầu sẽ được cắt thành mạch thẳng và biến tính tạo mạch đơn.

Từ mạch đơn các nucleotid tự do đã được đánh dấu huỳnh quang sẽ gắn vàotheo nguyên tắc bổ sung, và tín hiệu huỳnh quang từ các nucleotis sẽ đượcmáy ghi nhận lại Sau khi một hình ảnh được hoàn thành, các tế bào dòngchảy di chuyển vào vị trí kế tiếp Quá trình này được lặp lại cho mỗi chu trìnhsắp xếp Khi quá trình chạy hoàn tất, dữ liệu được tự động phân tích phầnmềm và kết nối với máy tính để thực hiện phân tích

Hình 1.7 Quy trình giải trình tự gen bằng NGS 1.4.4.2 Ứng dụng NGS trong giải trình tự gen HCV

Các đoạn gen đích hay được ứng dụng để xác định kiểu gen HCV là5’UTR, Core và NS5B Tuy nhiên, 5’UTR chỉ cho phép xác định đến kiểugen mà không cho ra được kết quả kiểu gen phụ chính xác Core và NS5B là

2 vùng hay được ứng dụng nhất để xác định kiểu gen HCV Giải trình tự Corehay NS5B được xem như tiêu chuẩn vàng trong xác định kiểu gen HCV do cóthể cho kết quả chính xác đến kiểu gen phụ [58] Trong đó vùng NS5B làvùng thiếu khả năng sửa chữa, do đó hay xuất hiện các đột biến tạo ra nhữngbiến loài hay type mới hơn [28]

Kỹ thuật NGS đã được ứng dụng thành công trong giải trình tự gen