Nghiên cứu mức độ nhiễm các loài thuộc chi Aspergillus FR.:FR. và Aflatoxin trên vị thuốc bá tử nhân (Semen platycladi orientalis)

Tuy nhiên, cho đến nay vẫn còn rất ít các đề tài nghiên cứu trong nước về mức độ nhiễm nấm mốc nói chung, chi Aspergillus nói riêng và mycotoxin trên vị thuốc này.. Để góp phần đảm bảo

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI THỊ KIM OANH

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM

CÁC LOÀI THUỘC CHI ASPERGILLUS

FR.: FR VÀ AFLATOXIN TRÊN VỊ THUỐC BÁ TỬ NHÂN

(SEMEN PLATYCLADI ORIENTALIS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM

CÁC LOÀI THUỘC CHI ASPERGILLUS

FR.: FR VÀ AFLATOXIN TRÊN VỊ THUỐC BÁ TỬ NHÂN

(SEMEN PLATYCLADI ORIENTALIS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:

TS Trần Trịnh Công và ThS Lê Thị Thu Hương

Giảng viên bộ môn Vi Sinh-Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, là thầy và

cô đã trực tiếp hướng dẫn, định hướng cho tôi ngay từ ngày đầu làm khóa luận Trong suốt quá trình làm khóa luận, thầy và cô luôn đồng hành, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi có thể thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo và các chị kỹ thuật viên tại bộ môn Vi Sinh-Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Nhân đây, tôi xin trân trọng cám ơn Ban Giám hiệu nhà trường, các phòng ban cùng toàn thể giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị kiến thức cũng như luôn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, các bạn của tôi Đây là những người luôn bên cạnh, khích lệ và cỗ vũ tôi, là nguồn động lực để tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Mai Thị Kim Oanh

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TÊN VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Aspergillus 2

1.1.1 Đặc điểm hình thái của chi Aspergillus 2

1.1.2 Khả năng sinh độc tố của chi Aspergillus 4

1.2 Tổng quan về dược liệu bá tử nhân 6

1.3 Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc hiện nay ở ngoài nước 7

1.4 Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc hiện nay ở trong nước 9

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Đối tượng, trang thiết bị nghiên cứu 11

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.1.2 Môi trường phân lập và phân loại nấm mốc 11

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 12

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 12

2.3.2 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu 13

2.3.3 Phương pháp phân lập nấm mốc 13

2.3.4 Phương pháp phân loại nấm mốc 13

2.3.5 Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm 14

2.3.6 Phương pháp phân tích aflatoxin 14

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17

3.1 Hàm ẩm của các mẫu bá tử nhân nghiên cứu 17

3.2 Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus Fr.:Fr trên vị thuốc bá tử nhân 17 3.2.1 Mức độ nhiễm các loài thuộc chi Aspergillus trên các mẫu bá tử nhân

nghiên cứu 17

3.2.2 Mức độ nhiễm độc tố aflatoxin trên các mẫu bá tử nhân 24

3.3 Một số ý kiến bàn luận 27

3.3.1 Hàm ẩm của dược liệu bá tử nhân 27

3.3.2 Mức độ nhiễm các loài thuộc chi Aspergillus 28

3.3.3 Mức độ nhiễm aflatoxin tự nhiên trên vị thuốc 29

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC TÊN VIẾT TẮT

năng cao

cứu ung thư quốc tế

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 2.1 Các chất chuẩn afltoxin chuẩn được sử dụng……… 14 Bảng 3.1 Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc bá tử nhân nghiên cứu 17

Bảng 3.2 Số lượng các chủng và loài chủ yếu của chi Aspergillus phân lập được từ

10 mẫu bá tử nhân 18

Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc của một số loài phân lập được từ các mẫu bá tử nhân

C, 7 ngày nuôi) 19

Bảng 3.4 Đặc điểm vi học của một số loài phân lập được từ các mẫu bá tử nhân

C, 7 ngày nuôi) 19

Bảng 3.5 Nồng độ chuẩn làm việc… 24 Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra độ thích hợp của hệ thống 24 Bảng 3.7 Kết quả biểu thị sự phụ thuộc giữa diện tích pic (A) và nồng độ aflatoxin

(C) 25

Bảng 3.8 Kết quả xác định hàm lượng aflatoxin trong các mẫu bá tử nhân 26

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Cấu trúc sinh conidi đặc trưng của chi Aspergillus 3

Hình 3.1 Loài A parasiticus nhiễm trên vị thuốc bá tử nhân 20

Hình 3.2 Loài A niger nhiễm trên vị thuốc bá tử nhân 21

Hình 3.3 Loài A flavus nhiễm trên vị thuốc bá tử nhân 22

Hình 3.4 Loài A fumagatus nhiễm trên vị thuốc bá tử nhân 23

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước có nền y học cổ truyền phát triền từ lâu và ngày nay bên cạnh nền y học hiện đại, nền y học cổ truyền của chúng ta vẫn ngày càng phát triển mạnh mẽ vì những tính năng ưu việt của nó Dược liệu nói chung và các sản phẩm có nguồn gốc thực vật nói riêng thường dễ bị nấm mốc xâm nhiễm và phát triển, nhất là trong điều kiện nóng ẩm, nhiệt đới như Việt Nam Khi bị nhiễm nấm mốc, các dược liệu này không chỉ bị ảnh hưởng đến sản lượng, chất lượng làm giảm hoạt chất dẫn đến giảm tác dụng [17] , mà còn thường bị nhiễm các độc tố nấm ( mycotoxins) Độc tố nấm gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người và động vật và được gọi chung là bệnh do độc tố nấm ( mycotoxicosis), với các triệu chứng cấp và mạn tính, có thể dẫn đến quái thai, ung thư, [31],[36] Bá tử nhân (Semen Platycladi orientalis) là vị thuốc thường được sử dụng trong đông y có tác dụng nhuận táo, thông tiện, dưỡng tâm, an thần, cầm mồ hôi Tuy nhiên, cho đến nay vẫn còn rất ít các đề tài nghiên cứu trong nước về mức độ nhiễm nấm mốc nói

chung, chi Aspergillus nói riêng và mycotoxin trên vị thuốc này Để góp phần đảm

bảo chất lượng thuốc và an toàn cho người sử dụng thảo dược nói chung, vị thuốc

bá tử nhân nói riêng, đề tài “ Nghiên cứu mức độ nhiễm các loài thuộc chi

Aspergillus Fr.: Fr và aflatoxin trên vị thuốc bá tử nhân ( Semen platycladi orientalis)” đã được thực hiện với 2 mục tiêu sau:

1 Phân lập, phân loại các loài thuộc chi Aspergillus nhiễm trên vị thuốc bá tử nhân

2 Phân tích mức độ nhiễm aflatoxin trên vị thuốc bá tử nhân

CH ƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Aspergillus

1.1.1 Đặc điểm hình thái của chi Aspergillus

- Khuẩn lạc :thường phát triển nhanh, có thể có màu trắng, vàng, nâu vàng, nâu tới đen hoặc ngả màu xanh lá cây, chủ yếu được cấu tạo bởi các conidiophore thẳng đứng Conidiophore ( thường không phân nhánh) được cấu tạo bởi một cuống (stipe) không phân nhánh

- Hệ sợi nấm: gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, vàng nhạt hoặc trong một số trường hợp trở thành nâu hay màu sẫm ở các vùng khác nhau của khuẩn lạc

- Bộ máy mang bảo tử trần: phát triển từ một tế bào đường kính lớn hơn, thành

tế bào dày hơn các tế bào lân cận của sợi nấm ( tế bào chân-food cell)

- Giá bào tử trần: phát triển từ tế bào chân, như là một nhánh của sợi nấm, gần như thẳng góc với trục của tế bào chân và thường ở trên bề mặt cơ chất Giá bào tử không phân nhánh, không có hoặc có vách ngăn

- Bọng đỉnh giá: là phần phình to ở đỉnh của giá bào tử trần, thường có dạng hình chùy, hình elip, hình gần cầu hay hình cầu, không có vách ngăn Bọng hữu thụ này mang các thể bình

- Thể bình (phyalide) : là tế bào trực tiếp sinh conidi nằm trên các bọng đỉnh giá Các thể bình hoặc song song, hoặc hợp thành cụm ở phần đỉnh bọng, hoặc xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ bề mặt bọng Thể bình hoặc chỉ có một tầng (uniseriate) hoặc hai tầng ( biseriate) Trong các trường hợp hai tầng mỗi thể bình cấp một ( cuống thể bình-metula) mang một cụm gồm 2-3 ( hoặc nhiều hơn) thể bình cấp hai ở phần đỉnh

- Các bào tử trần: được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình, thành chuỗi hướng gốc (bào tử ở miệng bao giờ cũng non nhất, càng xa càng già) không

phân nhánh Bào tử trần không ngăn vách thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết ở mặt ngoài tùy từng loài

- Khối bào tử trần (conidial head): tất cả các chuỗi bào tử trần tạo thành từ các thể bình của bọng đỉnh giá họp thành khối bào tử trần đỉnh bọng Khối bào tử trần hình bọng có thể có hình cột, hình cầu hoặc hình tỏa tròn

Hình 1.1: Cấu trúc sinh khối conidi đặc trưng của chi Aspergillus

- Conidi (conidium):chỉ gồm một tế bào, bề mặt nhẵn hoặc xù xì, có gai, không hoặc có màu Một số có thể sinh tế bào Hulle ( Hulle cell) có thành nhẵn, dày, đơn độc hoặc thành từng chuỗi

- Sự hình thành Conidiphore có thành dày, có phần đỉnh phình to gọi là bọng là đặc trưng của chi Aspergillus Đặc điểm này giúp phân biệt Aspergillus với chi Penicillium và các chi khác cùng nhóm của chi Penicillium

- Phân biệt các loài thuộc chi Aspergillus cơ bản dựa trên cấu trúc khối conidi

(conidial head), có sự hình thành cả cuống thể bình và thể bình, hoặc chỉ hình thành

thể bình, màu sắc conidi Màu sắc khuẩn lạc các loài của chi Aspergillus do màu có

liên quan tới các loài cụ thể

- Không một chi nào trong nhóm nấm Hyphomycetes sinh conidi có sự đa dạng

về màu sắc như chi Aspergillus và các sắc màu này có liên quan với các loài cụ thể

1.1.2 Khả năng sinh độc tố của chi Aspergillus

Mycotoxin là các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp độc được tạo bởi các chi nấm

chủ yếu như Aspergillus, Penicillium, Fusarium và Alternaria Mycotoxin có thể

gây ra nhiều tác động khác nhau như ung thư, độc với hệ thần kinh, gây quái thai,

và làm tổn thương hệ miễn dịch Cho đến nay, có khoảng 400 mycotoxin đã được phát hiện[6] Các tài liệu về mycotoxin rất phong phú, trong phạm vi của khóa luận

này chúng tôi chỉ đề cập tóm tắt về các mycotoxin chủ yếu của chi Aspergillus, đã

được tham khảo tử các tài liệu của các tác giả như Richard & Thurston,1986; Frivad & Samson, 1991; Golinski, 1991; Smith & Henderson, 1991; Pier &

Richard, 1992; Etzel, 2002 Trong số các độc tố do loài Aspergillus sinh ra tạo ra

như aflatoxin, ochratoxin A, citrinin, patulin,… Quan trọng nhất phải nói đến aflatoxin

Aflatoxin là độc tố nguy hiểm nhất của chi Aspergillus, trong gần 20 loại

aflatoxin khác nhau có 4 loại quan trọng là aflatoxin B1, B2, G1, G2 [5],[36] Các

aflatoxin M1 và M2 là các dẫn chất hydroxyl hóa của B1 và B2

Aflatoxin là một loại mycotoxin được phát hiện sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện Aflatoxin được sinh ra chủ yếu bởi các chủng độc

tố A flavus và A parasiticus , phát triển trên nhiều loại thực phẩm, đồ uống và cây thuốc Loài A flavus thường sinh các độc tố nhóm B, trong khi A parasiticus sinh

cả aflatoxin nhóm B & G Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng: Blue (B) và Green (G) [5] Aflatoxin B1 và B2 trong sữa bò được chuyển hóa và gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 ( M viết tắt của Milk) [1], [5] Trong bốn loại aflatoxin trên thì aflatoxin B1 được tìm thấy với nồng độ cao nhất và là độc tố nguy hiểm nhất, tiếp theo là G1, B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp trong tự nhiên [1], [5]

Aflatoxin có thể xuất hiện ở các loài quả, hạt trên đồng ruộng, trang trại trước lúc thu hoạch và sau thu hoạch nếu hàm ẩm của hạt vượt quá mức cho phép Aflatoxin thường được tìm thấy trong các loại hạt có dầu (lạc, đậu tương, hướng dương, bông), ngũ cốc ( ngô,lúa mì, gạo), gia vị ( hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ), hạt cây( hạnh nhân, quả óc chó, ), và thức ăn chăn nuôi [25] Các sản phẩm sữa, trứng, thịt bị nhiễm aflatoxin là do các động vật chăn nuôi ăn phải thức ăn bị nhiễm loài độc tố này Aflatoxin đặc biệt là aflatoxin B1 trong thức ăn đã gây ra tổn thất đáng

kể trong chăn nuôi gia súc Vụ nhiễm độc chết 10 vạn con gà tây ở Anh năm 1960

là một điển hình Hầu hết các loại thuốc dễ bị suy giảm hàm lượng hoạt chất bởi nấm mốc và loại nấm khác trong quá trình chế biến, vận chuyển và bảo quản sau thu hoạch, do đó thiệt hại về kinh tế là rất lớn Những điều kiện thuận lợi như: độ

ẩm cao, nhiệt độ cao và côn trùng phá hoại cây trồng là những nhân tố tác động mạnh giúp cho nấm mốc xâm nhiễm, phát triển và sinh độc tố Song các yếu tố chính xác ảnh hưởng đến quá trình hình thành sinh độc tố vẫn chưa được tìm hiểu chính xác

Aflatoxin rất nguy hiểm, với hàm lượng lớn chúng có thể gây ngộ độc cấp với biểu hiện: nôn, đau bụng, tiêu chảy, dị ứng, mẩn ngứa, ở người Với hàm lượng nhỏ hơn trong ngộ độc trường diễn nó có thể tích lũy trong tế bào gan, có khả năng gây ung thư gan, gan-cơ quan nhạy cảm nhất với độc tố aflatoxin Các nghiên cứu

về độc tính của aflatoxin cho thấy rằng aflatoxin là một chất gây ung thư mạnh, được IARC (tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế) phân loại là chất ung thư ở người nhóm 1 [36], bao gồm nguy cơ ung thư biểu mô tế bào gan đặc biệt là ở các bé gái 6-9 tuổi [36] Theo đó, nguy cơ ung thư do aflatoxin còn liên quan đến độ tuổi, giới tính, chế độ dinh dưỡng và đồng thời kết hợp với nhiều loại bệnh khác như: viêm gan B ( HBV), ký sinh trùng Ngoài độc tính là tác nhân gây ung thư aflatoxin còn

có thể gây quái thai, đột biến và ức chế miến dịch [25], dị tật ống thần kinh,…

Các điều kiện làm tăng nguy cơ về các bệnh liên quan đến aflatoxin cấp tính ở người bao gồm một số các yếu tố sẵn có ở thực phẩm và môi trường Các yếu tố này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm trên các loại hạt và các sản phẩm nông nghiệp khác Ngoài việc thiếu các quy chế, quy định, các hệ thống luật nhằm giám sát và điều chỉnh aflatoxin cũng góp phần làm tăng nguy cơ của bệnh aflatoxin cấp tính

Độc tố này có khả năng gây quái thai, ung thư và cơ quan đầu tiên bị tấn công

là thận Đối với gia cần như gà, vịt nuôi, độc tố này cũng gây tác động tới hệ thần kinh trung ương Với liều thấp ở gia cầm xuất hiện các triệu chứng như giảm tốc độ phát triển, giảm sản lượng trứng, đồng thời cũng gây khả năng tạo kháng thể Ở người orchatoxin A đã từng được cho là căn nguyên của sự phát bệnh thận ở vùng Balkan

Các loài được cho là có khả năng sinh độc tố này là A alliaceus, A melleus,

A ochraceus, A ostianus, A sclerotiorum, A niger, A carbonarius [ 5],[16]

1.2 Tổng quan về dƣợc liệu bá tử nhân

Bá tử nhân là cây nhân quả của cây Trắc bá ( Biota orientalis) thuộc họ Trắc

bá (Cupressaceae), dùng làm thuốc được ghi đầu tiên trong sách Bản kinh với tên

Bá thực Vào đầu mùa đông quả chín thu hái về giã bỏ vỏ lấy nhân phơi khô Khi dùng để nguyên hoặc ép bỏ dầu Cây Trắc bá diệp được trồng khắp nơi ở nước ta để làm cây cảnh và làm thuốc

Bá tử nhân vị ngọt, tính bình, quy kinh Tâm thận đại trường Thành phần có nhiều chất béo và ít tinh dầu Trong tinh dầu có 1-borneol bomyl acetat, camphor,

sesquiterpen alcol, còn có chứa saponosid Về tác dụng: bá tử nhân có tác dụng an thần dưỡng khí, nhuận tràng thông tiện, chủ trị các chứng : huyết hư thất niên, kinh quí chính xung, trường táo tiện bí ( mất ngủ, hồi hộp, tim đập, táo bón,…)

1.3 Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc hiện nay ở ngoài nước

Ước tính khoảng 25-50% thuốc dược phẩm có nguồn gốc từ các nguyên liệu thực vật khác nhau ( Cowan,1999) Khoàng 80% dân số thế giới sử dụng thuốc thảo dược cho một số lĩnh vực của chăm sóc sức khỏe ban đầu và hơn 89% dân số của các nước đang phát triển sử dụng thuốc trị bệnh truyền thống [36] Việc tiêu thụ ngày càng nhiều sản phẩm từ cây thuốc đã khiến cho việc sử dụng chúng trở thành một vấn đề sức khỏe cộng đồng do thiếu sự giám sát về sử dụng, hiệu quả, độc tính

và chất lượng của sản phẩm tự nhiên này Khi nguồn dược thảo được sử dụng tăng cao có thể dẫn đến việc tăng lượng mycotoxin đưa vào cơ thể Bởi vậy, dược thảo nhiễm mycotoxin có thể góp phần tạo ra các vấn đề bất lợi đối với sức khỏe con người, và có thể dẫn đến rủi ro nguy hiểm đến tính mạng Sự xuất hiện tự nhiên của nhiều mycotoxin trong các loại thực vật làm thuốc và các dược thảo truyền thống

đã được ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới như Tây Ban Nha, Trung Quốc, Đức,

Ấn Độ, Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Trung Đông, …[19], [17] Một số nhà nghiên cứu còn nhận xét, nấm mốc và mycotoxin là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây tụt hậu của nền công nghiệp dược thảo Ấn Độ ( một nước có nền y học cổ truyền lâu đời nhất thế giới với dược thảo là nguồn nguyên liệu chính) [26]

Tosun và cộng sự [38] đã nghiên cứu mức độ nhiễm độc tố aflatoxin trên 12 mẫu chè thuốc (herbal tea) đang lưu hành ở các cửa hiệu ở Manisa (Thổ Nhĩ Kỳ) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả cho thấy: Trong số 48 mẫu được phân tích,

có 43 mẫu bị nhiễm aflatoxin Hàm lượng cao nhất của độc tố này (34,18 µg/kg) đã phát hiện thấy trên một mẫu của chè thuốc “Cúc La Mã” (camomile tea) Sự xuất hiện của các aflatoxin B1, B2, G1 và G2 đã được phát hiện trong các mẫu chè

mẫu được phát hiện lần lượt dao động trong các khoảng 0-14,2; 0-12,4; 0-13,5 và 0-28,7 µg/kg Độc tố aflatoxin đã không phát hiện thấy trong 5 mẫu của 3 loại chè thuốc khác

Đánh giá mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên vỏ quế (từ cây quế Cinamomum zeylanicum Blume), 50 mẫu dược liệu này được thu thập từ các hiệu bán lẻ ở khu

vực miền đông của Arập Xeút Tổng số 1.126 chủng nấm thuộc 8 loài của 2 chi

Aspergillus, Penicillium đã được phân lập và nhận diện từ 50 mẫu nghiên cứu Các chủng nấm đã phân lập được từ tất cả các mẫu vỏ, thuộc các loài A terreus, A glaucus, A flavus, A fumagatus, A clavatus, A niger, Penicillium restrectum và Penicillium sp Xác định mycotoxin trên các mẫu vỏ cho thấy: các aflatoxin B1,

B2 và G1 được phát hiện ở nồng độ thấp (không quá 4,67 µg/kg) từ 62% các mẫu nghiên cứu [18]

Khati [29] đã khảo sát mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên 10 mẫu thảo dược

thô của 10 cây thuốc (Emblica officinalis, Terminalia chebula, T belerica, Zingiber officinalis, Piper nigrum, Cinnamomum tamala, Piper longum, Wthania somnifera, Asparagus racemosus và Chlorophytum borivilianum), được bảo quản ở các địa

điểm khác nhau của bang Haridwar, Ấn Độ, kết quả cho thấy: Tất cả các mẫu đã bị

nhiễm một hoặc nhiều các chi nấm Alternaria, Aspergillus, Fusarium,

Rhizoctonia và Verticillium Trong số các chủng nấm phân lập được, loài Aspergillus flavus chiếm tỷ lệ cao nhất (23,6%), tiếp sau là A niger (19,2%) Kết

quả phân tích aflatoxin cho thấy: 2/10 mẫu bị nhiễm aflatoxin B1 Kết quả phân tích nấm và độc tố cho thấy: các thảo dược đã tiềm ẩn rủi ro đối với sức khỏe của người tiêu dùng và cần phải được kiểm tra chặt chẽ trước khi cho phép đưa vào sử dụng trong cộng đồng

Bokhari và cộng sự [20] đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm và độc tố fumonisin trên 47 mẫu của 15 loại chè thuốc được thu thập từ các siêu thị và các

phố chợ ở Jeddah (Arập Xêut) kết quả cho thấy: Hệ vi nấm khá phong phú với 25 loài thuộc 13 chi đã phân lập được từ các mẫu nghiên cứu Trong số đó,

Aspergillus, Penicillium, và Fusarium (các chi có khả năng sinh nhiều độc tố) phân

lập được nhiều nhất Kết quả phân tích fumonisin bằng HPLC cho thấy: lượng độc

đố phát hiện được dao động trong khoảng 0-260 µg/kg Điều này cho thấy sự nhiễm các loài nấm sinh độc tố đưa đến rủi ro nhiễm mycotoxin Trong khi mức độ

sử dụng nguồn dược thảo trên thế giới ngày càng tăng, cho thấy sự cần thiết phải có các qui định về chỉ tiêu nấm mốc và mycotoxin trong các loại thảo dược thô để giảm rủi ro về sức khỏe của người tiêu dùng

1.4 Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc hiện nay ở trong nước

Trong khoảng 10-15 năm trở lại đây, mặc dầu không nhiều nhưng cũng có một số công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược [5], [6], [7] [8], [9], [10] Trong đó, đáng chú ý là công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin của tác giả Trần Trịnh Công và cộng sự [6]

trên 9 vị thuốc gồm: Hạt sen (Semen Nelumbinis): 70 mẫu; Ngũ vị tử (Fructus Kadsurae), Ý dĩ (Semen coicis): mỗi vị 20 mẫu; Nhân sâm (Radix ginseng), Đẳng sâm (Radix Codonopsis), Sa sâm (Launae pinnatifida Cass., rễ nhiều cây khác nhau, họ thực vật khác nhau), Ngưu tất (Radix Achyranthis bidentatae), Bạch truật (Rhizoma Atractylodis macrocephalae, thân rễ phơi hay sấy khô của cây bạch truật)

và Hòang kỳ (Radix Astragali membranacei, rễ phơi hay sấy khô của cây hoàng

kỳ): mỗi vị 15 mẫu, được thu thập từ các hiệu thuốc đông dược thuộc phố Lãn Ông,

Hà Nội; thành phố Hải Dương, tỉnh Hải Dương; thị xã Bắc Ninh, Tỉnh Bắc Ninh, được chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập, phân loại nấm và phân tích độc tố aflatoxin Kết quả cho thấy, các chủng nấm phân

lập được chủ yếu thuộc chi Aspergillus, tiếp sau là Penicillium và nhóm nấm tiếp hợp với các chi Rhizopus, Absidia và Mucor Trong đó, các loài có khả năng sinh

dược dạng quả, hạt: 10/20 mẫu ý dĩ nghiên cứu bị nhiễm 2 loài A flavus và A parasiticus với số lượng chủng phân lập được dao động 4-18 chủng/mẫu (60 hạt); 20/70 mẫu hạt sen nghiên cứu bị nhiễm loài A flavus với tỷ lệ chủng dao động từ

10-60 chủng/mẫu (60 hạt) Kết quả phân tích độc tố bằng HPLC cho thấy: 13/20 bị nhiễm aflatoxin toàn phần (tổng của B1, B2, G1 và G2) dao động trong khoảng 2,2-364,3 ppb; trong đó, có 12 mẫu vượt quá 4ppb (5,3-364,3 ppb) Với vị thuốc ý dĩ: 6/10 mẫu phân tích độc tố bị nhiễm aflatoxin toàn phần dao động từ 3,3-24,1 ppb; trong đó có 5 mẫu vượt qua 4ppb (5,3-24,1) Vị thuốc ngũ vị tử có 5/10 mẫu phân tích độc tố bị nhiễm aflatoxin toàn phần dao động từ 0,1- 0,9 ppb Với kết quả thu được cho thấy nguồn nguyên liệu thảo dược này cần phải được giám sát chặt chẽ trước khi chuyển đến các nhà máy sản xuất thuốc và cộng đồng sử dụng bởi việc sử dụng các dược liệu này là rất thường xuyên và kéo dài

Nối tiếp công trình này đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện trên dược liệu của các tác giả như: Mai Thị Ánh[1], Nguyễn Thị Lý[15] thăm dò sự có mặt của

loài A flavus và khả năng tạo aflatoxin trên dược liệu đã cho thấy tỷ lệ nhiễm A flavus là khá cao Công trình nghiên cứu về hệ vi nấm trên các vị thuốc đông dược

trên địa bản Hà Nội của các tác giả như: Trần Thị Huyền[ 14], Nguyễn Thị Huyền [13], Phạm Thanh Bình [2] và một số nghiên cứu đa dạng loài của tác giả : Đàm

Thu Hiền[12], Nguyễn Thị Hoài Thu [16] cho thấy chi Aspergillus là chi xuất hiện nhiều nhất, trong đó loài xuất hiện phổ biến nhất là A flavus A paraciticus, A niger và A fumigatus

Kết quả của các nghiên cứu đã cung cấp cho chúng ta những bằng chứng cụ thể về mối đe dọa tiềm tàng của các loài thuộc chi này và độc tố aflatoxin, nhất là các vị thuốc có nguồn gốc quả và hạt

CHƯƠNG 2 ĐỐI T ƯỢNG, TRANG THIẾT BỊ VÀ

2.1 Đối tượng, trang thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

10 mẫu của vị thuốc bá tử nhân được thu thập từ các hiệu thuốc đông dược trên địa bàn Hà Nội (phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm) vào tháng 10 của năm 2018, được chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập, phân loại nấm và phân tích mức độ nhiễm aflatoxin

2.1.2 Môi trường phân lập và phân loại nấm mốc

- Môi trường PDA (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Khoai tây gọt vỏ: 200;

- Môi trường xác định 2 loài A flavus và A parasiticus: Aspergillus Differentiation

Medium Base - ADM (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Peptone: 10; Cao nấm men: 20; Ferric amonium citrate: 0,5; Dichloran: 0,002; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 6,3 ± 0,2

- Môi trường Czapek Dox Agar (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Đường kính: 30; NaNO3: 2,0; KCl: 0,5; K2HPO4: 1,0; MgSO4.7H2O: 0,5; FeSO4.7H2O: 0,01;

C): 7,3 ± 0,2

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

- Kính hiển vi Axiostar plus, Carl Zeiss (Đức), gắn máy chụp ảnh kỹ thuật số

Canon (Nhật Bản)

- Tủ cấy vô trùng Aura VF48 (Đức)

- Tủ sấy SEL LAB (Đức)

- Nồi hấp tiệt trùng Hiclave HVE - 25, Hirayama (Nhật Bản)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Quá trình nghiên cứu gồm 6 nội dung chính sau:

- Xác định hàm ẩm, xử lý các mẫu của dược liệu bá tử nhân, đặt lên các đĩa Petri

C trong 5-7 ngày

- Phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu bá tử nhân nghiên cứu

trong 7 ngày

- Nuôi cấy xác định các chủng thuộc 2 loài A flavus và A parasiticus trên môi

trường ADM ( AFPA)

- Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc, vi học, sinh hóa của các chủng nấm và xác định chi hoặc loài

- Phân tích aflatoxin nhiễm trên các mẫu bá tử nhân nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Lấy mẫu là việc lựa chọn, thu thập các mẫu dược liệu cho việc kiểm tra chất lượng Mức độ đại diện của mẫu có ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác và độ đúng của việc kiểm tra Việc lấy mẫu dược liệu để tiến hành phân tích nấm và độc tố được tiến hành dựa trên cơ sở phụ lục 12.1, DĐVN IV: Dược liệu được lấy ở trên, giữa và cuối của mỗi bao gói, với khối lượng 200g Mẫu được trộn đều và san phẳng theo hình vuông; chia mẫu theo 2 đường chéo thành 4 phần bằng nhau Lấy 2 phần đối diện, trộn đều và san phẳng theo hình vuông, chia thành 2 phần bằng nhau theo đường chéo; một phần được dùng để phân tích nấm, phần còn lại được dùng để phân tích độc tố

2.3.2 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu

Hàm ẩm các mẫu dược liệu được xác định bằng phương pháp "Mất khối lượng

do làm khô" (Phụ lục 9.6, DĐVN IV) Cách tiến hành: Dược liệu được nghiền thô, thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm Cân một lượng mẫu thử (m), tiến

C trong vòng 4 giờ với bá tử nhân đến khối lượng không đổi Sau khi sấy, làm nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm rồi cân ngay (m’)

Tính kết quả hàm ẩm theo công thức sau:

2.3.3 Phương pháp phân lập nấm mốc

Phương pháp phân lập nấm mốc trên dược liệu được áp dụng trên cơ sở phương pháp của Samson và cộng sự (phương pháp đặt trực tiếp trên môi trường PDA hoặc DGM) [37]: Các mẫu dược liệu được khử trùng hệ vi nấm bề mặt bằng dung dịch natri hypoclorid (NaOCl) 0,5% mới pha trong 1 phút Sau đó rửa 3 lần bằng nước cất đã khử trùng Để ráo nước, đặt nhanh các hạt bá tử nhân vào các đĩa Petri đã có môi trường PDA (hoặc DGM) bằng kẹp vô trùng (thực hiện trong tủ cấy

vô trùng) Ủ ở nhiệt độ 27°C, sau 5-7 ngày tiến hành phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu dược liệu nghiên cứu

2.3.4 Phương pháp phân loại nấm mốc

- Phân loại các chi nấm theo khóa phân loại của Barnet và Hunter

- Phân loại các chủng nấm đến cấp loài thuộc chi Aspergillus dựa trên mô tả đặc

điểm khuẩn lạc, vi học các loài của Samson và cộng sự 1995 [37], Raper và Fennell

1965 [34], Pitt và Hocking 2009 [33] Nguyên lý của phương pháp là dựa trên sự so sánh đặc điểm khuẩn lạc (đường kính khuẩn lạc, màu sắc mặt trước và sau của khuẩn lạc, các chất tiết trên khuẩn lạc …) và đặc điểm vi học (chủ yếu là cấu trúc sinh conidi, kích thước, màu sắc của cấu trúc sinh conidi và conidi, …) của các

chủng khi được nuôi cấy trên môi trường chuẩn (Czapek agar), trong cùng điều kiện (nhiệt độ, thời gian, …)

- Xác định 2 loài A flavus, A paraciticus theo phương pháp sinh hóa của Pitt và Hocking [33] Nguyên lý của phương pháp là các chủng của 2 loài A flavus, A paraciticus khi nuôi cấy trên môi trường ADM, ủ ở nhiệt độ 25°C sau 42-48 giờ sẽ

xuất hiện màu vàng cam sáng ở mặt trái (mặt sau) khuẩn lạc

2.3.5 Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm

Mức độ nhiễm nấm được đánh giá bằng 2 chỉ số:

- Chỉ số có mặt hay tần suất xuất hiện loài (hoặc chi) trên các mẫu nghiên cứu [27]

2.3.6 Phương pháp phân tích aflatoxin

- Hệ thống phân tích HPLC Shimadzu LC-20AD (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương; cơ sở 2, Tự Liệt, Tam Hiệp, Thanh Trì, Hà Nội)

2.3.6.1 Các aflatoxin chuẩn:

Bảng 2.1: Các chất chuẩn aflatoxin được sử dụng

nhiễm 2 loài A flavus và A parasiticus cao (55 LÔ, 24 LÔ và 51A LÔ) được