NGHIÊN cứu QUY TRÌNH sản XUẤT mẫu HUYẾT TƯƠNG sử DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG xét NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI****** BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU HUYẾT TƯƠNG SỬ DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH KIỂM TRA

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

******

BÁO CÁO KẾT QUẢ

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU

HUYẾT TƯƠNG SỬ DỤNG TRONG

CHƯƠNG TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG HBV- DNA

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Trần Phương

Đặng Quang Huy

HÀ NỘI – 2017

CÁC CÁN BỘ THAM GIA NGHIÊN CỨU

1.Nguyễn Thị Thùy- BSNT Hóa Sinh khóa 39 2.Lê Ngọc Thúy sinh viên kỹ thuật y học

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Virus viêm gan B 3

1.1.1 Hình thái virus 3

1.1.2 Cấu trúc bộ gen virus 4

1.1.3 Chu kỳ nhân lên của virus 5

1.1.4 Kiểu gen của HBV và vai trò sinh bệnh học 6

1.1.5 Dịch tễ học 7

1.2 Xét nghiệm định lượng HBV-DNA trong phòng xét nghiệm 8 1.2.1 Ý nghĩa lâm sàng định lượng HBV- DNA 8

1.2.2 Kĩ thuật định lượng HBV- DNA 9

1.2.3 Kỹ thuật Real-time PCR 10

1.3 Đảm bảo chất lượng xét nghiệm 13

1.3.1 Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm 14

1.3.2 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm 15

1.4 Tiêu chuẩn về mẫu chuẩn 19

1.4.1 Tiêu chuẩn quốc tế về mẫu chuẩn 19

1.4.2 Tiêu chuẩn cơ sở 20 1.5 Xét nghiệm định lượng HBV-DNA tại Việt Nam 22

1.5.1 Hệ thống các phòng xét nghiệm định lượng HBV-DNA tại Việt Nam 22

1.5.2 Các phương pháp sản xuất mẫu kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng HBV-DNA 23

1.6 Quy trình sản xuất mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng

dạng đông khô HBV-DNA 23

1.6.1 Về phương pháp điều chế 23

1.6.2 Quy trình chuẩn bị huyết tương đông khô theo hướng dẫn của WHO 24

1.7 Phương pháp đánh giá độ ổn định ngắn hạn 24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu nghiên cứu 27

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 27

2.1.2 Tiêu chuẩn chấp nhận 27

2.1.3 Tiêu chuẩn loại bỏ 27

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

27 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28

2.3.2 Xây dựng bộ mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA 28

2.3.3 Xác định đặc tính của mẫu kiểm tra chất lượng 29

2.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở 32

2.4.1 Yêu cầu kỹ thuật 32

2.4.2 Đánh giá chất lượng mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA .33

2.5 Phương pháp thử nghiệm đánh giá ngoại kiểm xét nghiệm định lượng HBV-DNA 35

2.6 Sơ đồ nghiên cứu 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38

3.1 Kết quả xây dựng quy trình sản xuất mẫu huyết tương

kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA 38

3.1.1 Phương trình đường chuẩn định lượng HBV-DNA 38

3.1.2 Kết quả phân tích đặc điểm bộ mẫu kiểm tra chất lượng 40

3.2 Kết quả đánh giá chất lượng bộ mẫu 41

3.2.1 Chất lượng mẫu huyết tương kiểm tra HBV- DNA dạng đông khô 41

3.3 Độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu huyết tương kiểm tra dạng đông khô HBV- DNA 44

3.3.1 Độ đồng nhất của mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA 44

3.3.2 Độ ổn định dài hạn của mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA 48

3.3.3 Kết quả so sánh chất lượng mẫu huyết tương kiểm tra với tiêu chuẩn Iso 13528 51

3.3.4 Độ ổn định ngắn hạn của mẫu kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng HBV- DNA 51

3.4 Kết quả thử nghiệm ngoại kiểm xét nghiệm định lượng HBV-DNA 52

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 55

4.1 Quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm dạng đông khô 55

4.1.1 Thu thập và xử lý mẫu huyết tương 55

4.1.2 Chia và đông khô mẫu kiểm tra chất lượng 58

4.1.3 Trọng lượng khô của vật liệu nghiên cứu 59

4.1.4 Đánh giá chất lượng thiết bị phân tích mẫu 59

4.1.5 Đánh giá độ đồng nhất của bộ mẫu chuẩn HBV-DNA60

4.1.6 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn HBV-DNA 614.1.7 Độ ổn định ngắn hạn của mẫu huyết tương kiểm tradạng đông khô sử dụng trong xét nghiệm định lượng HBV-DNA 64

4.2 Đánh giá kết quả thử nghiệm ngoại kiểm 644.3 Tiêu chuẩn cơ sở 65

KẾT LUẬN 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO

: Polymerase chain reaction: External quality assessment: Quality assurance

: Quality Control: Internal Quality Control: International Organization forStandardization

: World Health Organization

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cấu trúc HBV 3

Hình 1.2: Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào gan 5

Hình 1.3: Nguyên lý kỹ thuật Realtime PCR 11

Hình 1.4: Biểu đồ biểu diễn sự khuếch đại mẫu 12

Hình 1.5: Đường biểu diễn kết quả của các nồng độ 13

Hình 1.6: Tính xác thực của xét nghiệm 15

Hình 1.7: Vai trò của các đơn vị tham gia ngoại kiểm 16

Hình 3.1: Đường tín hiệu của các mẫu chuẩn HBV-DNA 38

Hình 3.2: Bộ mẫu chuẩn sau khi chia 41

Hình 3.3: Mẫu đông khô bị loại bỏ 42

Hình 3.4: Trước và sau hoàn nguyên của mẫu đông khô 42

Hình 3.5: Kết quả đồng nhất mẫu nồng độ thấp và nồng độ cao 46

Hình 3.6: Kết quả chạy độ ổn định tháng 9 49 Hình 3.7: Thời gian bộ mẫu vận chuyển đến các đơn vị và

quay trở lại Trung tâm kiểm chuẩn Đại Học Y Hà Nội 51

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao 27

Bảng 2.2: Máy móc và thiết bị sử dụng 28

Bảng 2.3: Mồi sử dụng trong định lượng HBV 29

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng realtime-PCR 30

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng realtime-PCR 30

Bảng 3.1: Các nồng độ xây dựng đường chuẩn 38

Bảng 3.2: Nồng độ các mẫu huyết tương ngoại kiểm HBV- DNA với các mức nồng độ trước đông khô 40

Bảng 3.3: Kết quả đông khô mẫu kiểm tra nồng độ cao sau đông khô 43

Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu mẫu nồng độ thấp 44

Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu đồng nhất mẫu nồng độ cao 45 Bảng 3.6: Kết quả nghiên cứu mẫu âm tính 47

Bảng 3.7: Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu nồng độ thấp

48 Bảng 3.8: Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu nồng độ cao 50 Bảng 3.9: Kết quả kiểm tra độ ổn định ngắn hạn 52

Bảng 3.10: Kết quả các bệnh viện 53

Bảng 3.11: Kết quả các bệnh viện 54

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Biểu đồ mẫu HBV-DNA 39Biểu đồ 3.2: Kết quả đánh giá thử nghiệm trên hệ thống RT-PCR

bán tự động 53Biểu đồ 3.3: Đánh giá thử nghiệm trên hệ thống RT-PCR tự

động 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh viêm gan do virus B hiện đang là một vấn đề sứckhỏe toàn cầu Theo Tổ chức Y tế Thế giới, năm 2013 cókhoảng 2 tỉ người nhiễm virus viêm gan B (HBV) trong đó cótới 240 triệu người nhiễm mạn tính [1] Bệnh diễn biến dẫnđến các biến chứng nguy hiểm như: xơ gan, suy gan mất bù

và ung thư biểu mô tế bào gan [2-5], ước tính có đến 686 000nghìn người tử vong hàng năm do các biến chứng trên [1].Việc chẩn đoán nhiễm virus viêm gan B chủ yếu dựa trên

sự phát hiện kháng nguyên HBsAg [6] Tuy nhiên, kết quả củaxét nghiệm này không phản ánh được chính xác lượng virustrong huyết thanh hay hoạt động của virus viêm gan B cũngnhư hiệu quả của điều trị thuốc kháng virus, do đó định lượngHBV-DNA là một xét nghiệm đáng tin cậy và có giá trị caotrong: theo dõi tốc độ nhân lên của virus từ đó xác định thờiđiểm điều trị thuốc kháng virus, đánh giá sự đáp ứng và nguy

cơ tiến triển dẫn tới xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan ởnhững bệnh nhân bị bệnh viêm gan B mạn tính [7-11]

Trong những năm gần đây xét nghiệm định lượng DNA bằng phương pháp Realtime PCR đã sử dụng ở nhiềunơi do có độ nhạy và đặc hiệu cao [12] Tuy nhiên chấtlượng xét nghiệm vẫn còn phụ thuộc vào phương pháp vàkinh nghiệm của kĩ thuật viên Do đó kiểm tra nội chuẩn vàngoại chuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảotính chính xác của kết quả xét nghiệm [13], [14] Mặc dù có

HBV-vai trò quan trọng như vậy nhưng chỉ có một số phòng xétnghiệm tham gia công tác ngoại kiểm vì các mẫu này đềuchưa được sản xuất trong nước mà phải nhập từ nước ngoàivới giá thành cao, và nguồn cung không ổn định do đó sẽlàm tăng gánh nặng chi phí cho bệnh nhân Xuất phát từ

vấn đề, chúng tôi xin tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết tương sử dụng trong chương trình kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng HBV- DNA", với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng quy trình sản xuất mẫu huyết tương dùng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng HBV- DNA.

2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho mẫu huyết tương đông khô được sản xuất sử dụng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng HBV-DNA.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Virus viêm gan B (HBV)

1.1.1 Hình thái virus

HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có cấu trúc DNA xoắn kép

[15], [16] Trong huyết thanh của người nhiễm HBV, virus tồntại dưới 2 dạng [17]

- Hạt Dane: được phát hiện vào thập niên 70 [18] Là mộtvirion hoàn chỉnh hình cầu, đường kính 42 nm, bên ngoài có

vỏ bọc cấu tạo từ kháng nguyên bề mặt (HBsAg) với 3 loạiprotein S, M, L [19] Bên trong là nucleocapside, đường kính

34 nm, cấu tạo từ kháng nguyên lõi (HBcAg), DNA và cácenzyme như DNA polymerase, protein kinase

Hình 1.1: Cấu trúc HBV [20]

- Các hạt HBs: có dạng hình cầu hoặc hình ống, có kíchthước thay đổi Đây là các protein HBs được tạo ra dư thừa

trong bào tương của tế bào gan sau đó được phóng thích vàomáu và không chứa DNA của virus do đó không gây nhiễm

[21], [22].

1.1.2 Cấu trúc bộ gen virus

HBV có bộ gen là phân tử DNA dạng vòng, chiều dàikhoảng 3200 bases, gồm 2 chuỗi có chiều dài khác nhau.Chuỗi dài (sợi âm) nằm phía ngoài, có chiều dài cố định là

3200 bases và gần như khép kín, mã hóa cho các thông tin ditruyền của virus.Chuỗi ngắn (sợi dương), nằm ở trong, chiềudài thay đổi và chỉ bằng 50-80% chiều dài sợi âm

Trên sợi DNA âm, có 4 đoạn gen tương tứng với 4 khungđọc mở (opening reading frame) là các vùng mã hóa cho sựtổng hợp các protein bề mặt (HBsAg), protein lõi (HBeAg,HBcAg), polymerase và protein X [23].

Các gen đó gồm:

- Gen S: bao gồm vùng S, Pre-S1, Pre-S2 mã hóa cho sựtổng hợp kháng nguyên bề mặt HBsAg Đoạn gen S tổng hợpnên Protein S, đoạn gen S và pre-S2 tổng hợp nên protein M(Medium) có chiều dài 108 acid amin Vùng Pre-S2 giúp chovirus bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ liênkết với một loại albumin được trùng hợp trong huyết thanhcủa người Đoạn S, Pre-S1, Pre-S2 tổng hợp nên Protein L(Large) Vùng Pre-S1 là vùng chủ yếu mà virus sẽ gắn lên cácthụ thể trên bề mặt của tế bào gan, giúp virus xâm nhập vàobên trong tế bào [24]

- Gen C: gồm vùng C (Core) và pre-C (Pre-core), mã hóacho sự tổng hợp protein của nucleocapsid Các nucleotide đầutiên của vùng Pre-core mã hóa cho việc tạo nên một đoạnpeptide tín hiệu có vai trò giúp cho kháng nguyên HBeAg

được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, hòatan vào huyết thanh Sự hiện diện của HBeAg phản ánh tìnhtrạng nhân lên của virus ở bên trong tế bào gan và có liênquan đến tính lây nhiễm Nếu quá trình đọc mã đi hết đoạngen C sẽ tổng hợp nên kháng nguyên HBcAg Vì khángnguyên HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu nên khôngđược bài tiết ra ngoài tế bào gan do đó không được tìm thấytrong huyết thanh [24].

- Gen X: mã hóa cho sự tổng hợp protein HBx Chức năngđầy đủ của protein HBx chưa được biết rõ Protein HBx có vaitrò chuyển hoạt hóa trong quá trình sao chép của virus Do

đó, protein HBx có vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ungthư ở các tế bào gan bị nhiễm

- Gen P (Polymerase): là gen lớn nhất chiếm 80% chiềudài bộ gen mã hóa cho DNA-polymerase, có liên quan đến cơchế sao chép ngược của virus và đồng thời tham gia một phầnvào việc tạo ra capside bao bọc bên ngoài cấu trúc của tiềngenom [25], [26]

1.1.3 Chu kỳ nhân lên của virus

Hình 1.2: Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào gan [23]

Khi virus nhân lên, DNA không sao chép trực tiếp thànhDNA của virus mới mà qua bước trung gian là tạo ra 2 sợimRNA nhờ RNA của tế bào ký chủ Hai sợi mRNA này được gọi

là tiền genome, chứa toàn bộ thông tin di truyền của virus Từ

2 sợi mRNA này sẽ tổng hợp các thành phần của virion DNAcủa virion sẽ sao chép từ mRNA thành DNA của virus Nhưvậy, DNA polymerase hoạt động như một men sao chépngược Khi sợi DNA dài (L) được hình thành thì sợi mRNA cũng

tự phá hủy

Phần lõi của virus được lắp ghép thêm phần vỏ bọc xungquanh rồi được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào tương đểphóng thích ra khỏi tế bào gan dưới dạng một virion hoàn

chỉnh hoặc phần lõi này sẽ trở lại nhân tế bào gan để vào lạimột chu trình sao chép mới [27], [28].

1.1.4 Kiểu gen của HBV và vai trò sinh bệnh học

Okamoto là tác giả đầu tiên đưa ra phân loại kiểu gen củaHBV vào năm 1988 Bằng phương pháp so sánh từng cặp vàphân loại sinh học dựa trên giải trình tự gen toàn bộ phân tửHBV-DNA, tác giả và cộng sự đã phân loại được 4 kiểu gencủa HBV kí hiệu là: A, B, C, D Các kiểu gen này có tỷ lệ khácbiệt nucleotid trên toàn bộ phân tử HBV-DNA lớn hơn 8%, hay

tỷ lệ đồng đạng nucleotid nhỏ hơn 92%

Sau đó Norder và cộng sự xác định thêm được 4 kiểu gennữa là: E, F, G,H Các kiểu gen của HBV có sự phân bố khácnhau giữa các vùng địa lý, trong đó kiểu gen A, B, C gặp chủyếu ở châu Á và đông Nam Á Nghiên cứu về kiểu gen củaHBV ở trong nước của Đông Thị Hoài An tại Thành phố Hồ ChíMinh cho thấy kiểu gen B chiếm 76,8%, kiểu gen C chiếm20%, kiểu gen A chiếm 1,1% [29], [30]

1.1.5 Dịch tễ học

1.1.5.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới ước tính có khoảng hơn 2 tỉ người

bị nhiễm HBV Trong số này có khoảng 240 triệu người mangHBV mạn tính (HBV carier) [1] Ở Mỹ tuy có tần suất thấp hơn

so với Châu Phi và Châu Á nhưng mỗi năm có khoảng 5000người tử vong liên quan đến nhiễm HBV HBV có khả năng lâynhiễm nhiều gấp 100 lần so với HIV [31] HBV là yếu tố gâyung thư đứng hàng thứ 2 sau thuốc lá và là nguyên nhân gây

ra 60-80% trường hợp ung thư gan nguyên phát và 50%trường hợp xơ gan Nhìn chung tình hình nhiễm HBV thay đổitheo từng vùng địa lý và tùy thuộc vào điều kiện kinh tế, vệsinh môi trường, tập quán sinh sống [12] Có 75% các trườnghợp nhiễm HBV mạn tính trên thế giới là người châu Á và châuPhi Ở một số nước châu Á như Trung Quốc, Thái Lan, ĐàiLoan, tỷ lệ nhiễm HBV rất cao ở trẻ nhỏ và trong thời kỳ thơ

ấu với tỷ lệ HBsAg (+) đến 25% Dựa vào tỷ lệ nhiễm HBVtrong dân số, người ta chia ra các vùng dịch tễ HBV trên thếgiới như sau:

- Vùng lưu hành dịch cao là vùng có tỷ lệ người mangHBsAg (+) >8%, gồm châu Á, châu Phi và hầu hết các nướcTrung Đông, vùng lưu vực sông Amazon

- Vùng lưu hành trung bình là vùng có tỷ lệ người mangHBsAg (+) từ 2-7% gồm có Ấn Độ, một phần Trung Đông,Nhật Bản, Đông Âu và hầu hết các nước Nam Mỹ, Trung Mỹ

- Vùng lưu hành dịch thấp là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg (+) < 2% gồm có Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc…và tỷ lệ người từng phơi nhiễm với HBV < 20% [32].

1.1.5.2 Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam

Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới khu vực Tây TháiBình Dương, thì Việt Nam hiện có khoảng 8.6 triệu ngườinhiễm virus viêm gan B Trong đó có khoảng 8.8% ở phụ nữ

và 12.3% ở nam giới [33] Ứớc tính tử vong liên quan tới viêmgan B ở Việt Nam khoảng 42000 người [34]

1.2 Xét nghiệm định lượng HBV-DNA trong phòng xét nghiệm

1.2.1 Ý nghĩa lâm sàng định lượng HBV- DNA

Trong hướng dẫn thực hành điều trị viêm gan B của hộigan mật Mỹ (AASLD) năm 2009 và những năm gần đây đều sửdụng chỉ số HBV-DNA để làm tiêu chuẩn chẩn đoán các thểbệnh Để chẩn đoán viêm gan B mạn tính thì một trong cáctiêu chẩn là HBV-DNA > 105 copies/mL, người mang HbsAgkhông hoạt động là HBV-DNA < 2000 IU/mL, viêm gan B hồiphục là HBV-DNA dưới ngưỡng phát hiện [35]

Cũng theo Hội gan mật Mỹ, định lượng HBV-DNA có vai tròquan trọng trong việc quản lý bệnh nhân để có chỉ định điềutrị kịp thời Mặc dù nồng độ HBV-DNA > 105 copies/ml đượclựa chọn như là một tiêu chuẩn điều trị viêm gan B mạn tính.Tuy nhiên viêm gan B mạn tính, xơ gan và ung thư biểu mô tếbào gan đã gặp ở các bệnh nhân có nồng độ HBV-DNA thấphơn Do đó, kiểm tra nồng độ HBV-DNA liên tục có vai tròquan trọng

Nồng độ DNA phản ánh sự nhân lên của vi rút DNA thay đổi tùy theo từng giai đoạn trong quá rình diễn biến

HBV-tự nhiên của viêm gan B mạn tính Theo nghiên cứu của T.Nguyen và J Jaroszewics thấy nồng độ HBV-DNA cao nhất ởgiai đoạn dung nạp miễn dịch, tiếp theo là giai đoạn thải loạimiễn dịch và giai đoạn tái hoạt động, thấp nhất ở giai đoạnkhông hoạt động [36] Định lượng HBV-DNA có ý nghĩa rất lớntrong tiên lượng tiến triển của bệnh Nồng độ HBV-DNA caothì nguy cơ dẫn đến xơ gan ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính.Nồng độ HBV-DNA > 104 copies/mL dự báo khả năng tiến triển

xơ gan Và trên nền xơ gan thì nồng độ HBV-DNA càng caonguy cơ biến chứng càng nhiều [37-40]

Nồng độ HBV-DNA là tiêu chuẩn quyết định điều trị thuốckháng vi rút Theo khuyến cáo của các Hội gan mật Mỹ, Châu

Âu và Châu Á Thái Bình Dương thì trong trường hợp viêm gan

B có HbeAg (+), men gan ALT tăng > 40 U/L, HBV-DNA > 105copies/mL là chỉ định điều trị thuốc kháng vi rút

Nồng độ HBV-DNA giúp theo dõi sự kháng thuốc Nếu saumột thời gian điều trị đặc hiệu mà lượng vi rút không giảmquá 100 lần hoặc trong quá trình điều trị xét nghiệm thấyHBV- DNA từ âm tính thành dương tính trở lại thì bác sĩ điềutrị cần nghĩ đến khả năng kháng thuốc của vi rút

HBV-DNA tiên lượng đáp ứng trong điều trị Dấu ấn đểđánh giá hiệu quả trực tiếp của thuốc kháng vi rút là HBV-DNA Nếu nồng độ HBV-DNA giảm theo thời gian điều trị vàtiếp tục duy trì dưới ngưỡng phát hiện, hoặc < 104 copies/mL

là dấu hiệu đáp ứng tốt Thông thường phác đồ điều trị hiệnnay được khuyến cáo là kéo dài ít nhất 2 năm đối với các

thuốc nhóm nucleotide, 1 năm với thuốc nhóm Interferon Sauthời gian điều trị phải kiểm tra HBV-DNA 3-6 tháng/ lần.

HBV-DNA giúp đánh giá khả năng lây truyền của vi rút Sựlây truyền HBV qua nhau thai liên quan đến nồng độ HBV-DNA

và HbeAg (+) Nếu nồng độ HBV-DNA cao thì khả năng lâytruyền mạnh hơn [41] Do đó các bà mẹ khi sinh con mà cóHbeAg (+) và nồng độ HBV-DNA cao thì nên tiêm Globulinmiễn dịch cho con hoặc Lavumidine cho mẹ vào 3 tháng cuốithai kỳ

1.2.2 Kĩ thuật định lượng HBV- DNA

Để đánh giá mức độ nhân lên của HBV, chúng ta có thểlàm các xét nghiệm định lượng HBV- DNA bằng một sốphương pháp như: Direct hybrization, phương pháp chuỗinhánh ( b-DNA) và phương pháp PCR

Phương pháp Direct hybrization là kỹ thuật lai ghép trênmàng lọc hoặc trong môi trường lỏng, hạn chế về độ nhạy, chỉphát hiện được HBV-DNA từ 105 copies/mL Hiện nay kỹ thuậtnày ít được thực hiện

Phương pháp phân nhánh (b-DNA) là kỹ thuật lai ghépchuyên biệt nhờ sự khuếch đại tín hiệu lai ghép Kỹ thuật nàycho phép định lượng HBV-DNA nhạy gấp 10-20 lần so vớiphương pháp lai ghép trực tiếp, khả năng định lượng đượcHBV-DNA từ 103 copies/mL, ngày nay phương pháp này cũng

ít được sử dụng

Với sự ra đời của kỹ thuật Real-time PCR có độ nhạy cao

và có khả năng định lượng được nồng độ HBV-DNA từ 102

copies/mL đến 108 copies/mL, kỹ thuật này ngày nay được sửdụng nhiều nhất.

1.2.3 Kỹ thuật Real-time PCR

Khái niệm Real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đạiDNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phảnứng [42], [43]

Nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR trong định lượng HBV

Cặp mồi (primer) được thiết kế trong vùng gen S của bộgen HBV để nhân bản một trình tự mục tiêu có kích thước 98cặp base Trong khi chạy PCR, một khi có sản phẩm khuếchđại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR thì taqman probe đặchiệu với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và

sẽ bị thủy giải bởi men taq polymerase (nhờ hoạt tính 5’-3’exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn kéo dài Sựthủy phân taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnhquang (fluorophore) ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang(quencher) ở đầu 3’ của probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ pháthuỳnh quang khi bị chiếu ánh sáng kích thích và sự pháthuỳnh quang này sẽ được ghi nhận bộ phận cảm biến quangcủa máy

Hình 1.3: Nguyên lý kỹ thuật Realtime PCR

độ huỳnh quang này sẽ tạo ra cường độ huỳnh quang nền.Đường cắt ngang qua cường độ huỳnh quang nền được gọi làđường nền

Chu kỳ ngưỡng (Ct): là chu kỳ nhiệt mà tại thời điểm đóthiết bị Realtime ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra

từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quangnền Được xác định bằng số chu kỳ mà đường nền cắt đườngbiểu diền khuếch đại, do vậy Ct thường là các số lẻ Mẫu có

DNA gốc càng nhiều thì Ct càng nhỏ và ngược lại DNA gốccàng ít thì Ct càng lớn.

Hình 1.4: Biểu đồ biểu diễn sự khuếch đại mẫu

Từ các nồng độ DNA-HBV chuẩn đã biết trước ta sẽ dụngđược một đường thẳng biểu hiện mối quan hệ giữa nồng độDNA-HBV với Ct được gọi là đường biểu diễn chuẩn, với trụctung là Ct và trục hoành là nồng độ DNA đích chuẩn Từphương trình tuyến tính đó sẽ tính ra được lượng DNA mẫubệnh nhân, thông qua Ct của từng phản ứng

Mẫu HBV- DNA âm tính khi đường biểu diễn PCR thấp hơn đường nền

Realtime-Mẫu HBV-DNA dương tính khi đường biểu diễn PCR vượt cao hơn đường nền

realtime-Phản ứng realtime- PCR có sử dụng mẫu đối chứng âmhoặc đối chứng dương chạy cùng bệnh phẩm để loại trừ khảnăng nhiễm ngoại lai, và đảm bảo quy trình PCR đạt yêu cầu.

Hình 1.5: Đường biểu diễn kết quả của các nồng độ

1.3 Đảm bảo chất lượng xét nghiệm.

Đảm bảo chất lượng (QA- Quality Asurance) là một hệthống bao hàm toàn bộ các chính sách, pháp quy, kế hoạch

về đào tạo con người, trang thiết bị máy móc, lựa chọnphương pháp kỹ thuật và thuốc thử để xét nghiệm đạt được

độ tin cậy, giúp bác sỹ lâm sàng trong việc chẩn đoán và điềutrị bệnh Đảm bảo chất lượng hạn chế đến mức thấp nhấtnhững sai sót có thể xảy ra trong 3 giai đoạn của quá trìnhxét nghiệm: trước, trong và sau xét nghiệm

Kiểm tra chất lượng xét nghiệm (QC- Quality Control) baogồm nội kiểm tra (Internal Quality Control - IQC) và ngoạikiểm tra (External quality assurance - EQA), là một khâu

nhằm phát hiện sai số, tìm nguyên nhân gây sai số từ đó đề

ra các biện pháp phòng ngừa và khắc phục

- Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm (External Quality

Assessment- EQA): Còn được gọi là ngoại kiểm tra bao gồm

ba phương thức triển khai là thử nghiệm thành thạo, kiểm traphân tích lại và đánh giá tại chỗ Trong đó thử nghiệm thànhthạo là phương thức được sử dụng phổ biến nhất [44], [45]

- Nội kiểm tra chất lượng (Internal Quality Control – IQC),

gọi tắt là nội kiểm tra, là công cụ kiểm tra chất lượng hàngngày trong nội bộ PXN, được thực hiện bởi nhân viên y tếnhằm đánh giá liên tục các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượngxét nghiệm, từ đó đi đến quyết định rằng kết quả XN có đủ tincậy trước khi trả cho bác sĩ lâm sàng hay người bệnh [46] [47]

1.3.1 Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm [48]

Do nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm nên việc kiểm tra chất lượng xét nghiệm là công việc rất cần thiết Việc kiểm tra này nhằm mục đích:

-Đánh giá những kết quả xét nghiệm thực hiện ở mỗiphòng xét nghiệm

-Đảm bảo tính tin cậy của kết quả xét nghiệm

-Giúp cho mỗi phòng xét nghiệm tự đánh giá giá trị của

kỹ thuật xét nghiệm và sự hoạt động hiệu quả của phòng xétnghiệm của mình

-Đánh giá tay nghề của mỗi cán bộ làm xét nghiệm.Sosánh kết quả xét

nghiệm của phòng mình với kết quả xét nghiệm của phòngkhác áp dụng cũng loại kỹ thuật

Chương trình nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm baogồm:

Kiểm tra độ chính xác ( Precision)

Kiểm tra độ xác thực (Accuracy)

Các tình huống trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm cóthể gặp giống như bia bắn

Độ xác thực: Xấu Tốt Tối ưu

Độ chính xác: Tốt Xấu Tối ưu

Hình 1.6: Tính xác thực của xét nghiệm 1.3.2 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm (External Quality Assessment - EQA)

1.3.2.1 Khái quát chung về chương trình ngoại kiểm

Những tiêu chuẩn về phòng thí nghiệm được công nhận ởmức độ quốc tế, quốc gia, địa phương hay từ một tổ chức banhành sẽ làm cơ sở để đánh giá phòng thí nghiệm bằng nhiềucách khác nhau trong những trường hợp cụ thể khác nhau.Các tiêu chuẩn quốc tế ISO là rất rõ ràng về các yêu cầu củađánh giá và thường sử dụng thuật ngữ “kiểm tra - Audit” thaycho từ “đánh giá - Assessment”, những thuật ngữ này có thể

được thay thế cho nhau Đánh giá hay kiểm tra cho phépphòng thí nghiệm hiểu rõ được cách thức thực hiện khi sosánh với một tiêu chuẩn nào đó Việc kiểm tra đánh giá giúpphát hiện các thiếu sót hoặc sự không tuân thủ các chínhsách, quy trình mà phòng thí nghiệm đưa ra.

Ngoại kiểm tra chính là một hình thức đánh giá bao gồm

cả đánh giá với mục đích khẳng định sự tin tưởng phục vụcho việc cấp chứng nhận hoặc cấp phép

Đánh giá chất lượng từ bên ngoài (External QualityAssessment-EQA) được sử dụng để mô tả một phương phápcho phép so sánh kết quả xét nghiệm của một phòng thínghiệm đối với các phòng thí nghiệm khác, đánh giá chấtlượng từ bên ngoài thuộc phạm trù ngoại kiểm tra nhưngtrọng tâm chủ yếu là đánh giá về kết quả xét nghiệm củaphòng thí nghiệm này so với các phòng thí nghiệm khác, xétnghiệm cùng một mẫu xét nghiệm với cùng kỹ thuật xétnghiệm Chương trình ngoại kiểm tra thông thường được tổchức bởi một phòng thí nghiệm chuẩn thức, đơn vị này, phânphối mẫu xét nghiệm cho các phòng thí nghiệm thành viêncùng tham gia vào chương trình ngoại kiểm tra để làm xétnghiệm, sau đó thu thập các kết quả xét nghiệm để so sánh

và đánh giá kết quả của các phòng thí nghiệm thành viên Kếtquả sai ở các phòng thí nghiệm sẽ được nhà quản lý điều tratìm hiểu các điểm không phù hợp và hỗ trợ khắc phục đểnâng cao chất lượng Bên cạnh đó cũng khuyến cáo các cơ sở

sử dụng sinh phẩm phù hợp với các yêu cầu về chất lượng,điều kiện (Hình 1.7) Nhằm nâng cao chất lượng xét nghiệm,

WHO đã đưa ra những hướng dẫn kỹ thuật để triển khaichương trình kiểm tra chất lượng cho các phòng thí nghiệmnói chung và đặc biệt là các phòng thí nghiệm HBV-DNA nóiriêng từ nhiều năm nay [49], [50].

Hình 1.7: Vai trò của các đơn vị tham gia ngoại kiểm

Ở Việt Nam, ngày nay do yêu cầu ngày càng cao về chấtlượng xét nghiệm ngoại kiểm đã trở thành một hoạt độngthiết yếu và là nhu cầu thực tế và cần thiết của các phòng thínghiệm ở mọi lĩnh vực: thử nghiệm, đo lường, hiệu chuẩn vàgiám định Tham gia vào các chương trình ngoại kiểm cũng làmột trong những yêu cầu bắt buộc đối với bất cứ phòng thínghiệm nào, điều này được thể hiện rõ trong các văn bản quyphạm pháp luật của Bộ Y tế

1.3.2.2 Các phương thức ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm

Có ba phương thức được sử dụng trong ngoại kiểm tra,bao gồm: thử nghiệm thành thạo (Proficiency testing - PT),kiểm tra lại/ phân tích lại (Rechecking/ Retesting), đánh giá

tại chỗ (on-site evaluation).

- Thử nghiệm thành thạo: Đơn vị triển khai ngoại kiểm

sẽ phân phối mẫu ngoại kiểm cho các phòng xét nghiệmtham gia Các phòng xét nghiệm phân tích mẫu và gửi kếtquả về đơn vị triển khai ngoại kiểm để được phân tích thống

kê, đánh giá kết quả thực hiện Sau đó, phòng xét nghiệmnhận bản phân tích kết quả ngoại kiểm từ đơn vị triển khaingoại kiểm để xem xét và khắc phục sai số nếu có [51]

- Kiểm tra lại/ phân tích lại: Phòng xét nghiệm lựa chọn

mẫu bệnh phẩm xét nghiệm ngẫu nhiên gửi đến phòng xétnghiệm tham chiếu hoặc đơn vị kiểm chuẩn để phân tích vàđánh giá lại các kết quả mà phòng xét nghiệm đã thực hiện

- Đánh giá tại chỗ : Đoàn đánh giá được thành lập bới cơ

quan có thẩm quyền (Bộ Y tế, Sở Y tế…) hoặc các tổ chứcđược công nhận của quốc gia đánh giá phòng xét nghiệm căn

cứ vào bảng kiểm, những tiêu chí đã được phê duyệt [51]

1.3.2.3 Mô hình chương trình ngoại kiểm

Chương trình đánh giá chất lượng phòng thí nghiệm từbên ngoài (External qualiy assessment schemes –EQAS) haycòn gọi là chương trình ngoại kiểm là chương trình đánh giáchất lượng các phòng thí nghiệm một các định kỳ và thườngxuyên

Tổ chức bên ngoài thường là phòng thí nghiệm chuẩn thức

có uy tín cung cấp mẫu tới nhiều phòng thí nghiệm để thựchiện xét nghiệm và phân tích, so sánh đánh giá và báo cáokết quả tới các phòng thí nghiệm đã tham gia EQAS là hệthống kiểm tra khách quan năng lực kỹ thuật của phòng thí

nghiệm do tổ chức bên ngoài thực hiện Tất cả các phòng thínghiệm tham gia EQA cho tất cả các chỉ tiêu xét nghiệm đãthực hiện EQA [52].

Phòng thí nghiệm kể cả các đơn vị đã được công nhận bởicác tổ chức cũng cần tham gia vào các chương trình ngoạikiểm, việc tham gia này nhằm mục đích giúp phòng thínghiệm so sánh năng lực của mình với phòng thí nghiệm khác

và kiểm soát để đảm bảo chất lượng quá trình thử nghiệm.Nếu những xét nghiệm nào không có sẵn trong chương trìnhngoại kiểm trong nước, phòng thí nghiệm có thể tham gia vàocác chương trình của Quốc tế hoặc thực hiện so sánh liênphòng thí nghiệm với các phòng thí nghiệm khác Các kết quảđánh giá từ bên ngoài cần phải được lãnh đạo phòng thínghiệm xem xét và lưu hồ sơ, đây là cơ sở để cải thiện chấtlượng của đơn vị [51]

1.3.2.4 Các chương trình ngoại kiểm HBV-DNA trên thế giới

và Việt Nam.

- Trên thế giới:

Các nước tiên tiến đã coi đảm bảo chất lượng là mộttrong những tiêu chí hàng đầu của chất lượng phòng thínghiệm Chính vì vậy hệ thống các tiêu chuẩn quốc tế vềquản lý phòng thí nghiệm ra đời như ISO 15189, 17025 Việctham gia ngoại kiểm là một tiêu chí bắt buộc để duy trì cáctiêu chuẩn ISO cho phòng thí nghiệm cũng như duy trì chấtlượng của phòng thí nghiệm

Nhận thức được tầm quan trọng của chất lượng xétnghiệm định lượng HBV-DNA, WHO đã đưa ra các hướng dẫn

và khuyến cáo xây dựng chương trình ngoại kiểm cho các

nước trên thế giới [13], [14], [52].

Hiện nay các chương trình ngoại kiểm tra cho xétnghiệm định lượng HBV-DNA được một số công ty nướcngoài cung cấp như: AcroMetrix, Bio-Rad

- Tại Việt Nam

Hiện nay Việt Nam đã có một số trung tâm thử nghiệmsản xuất mẫu ngoại kiểm xét nghiệm như: HIV, HbsAg, nhómmáu [53], tuy nhiên chương trình ngoại kiểm về xét nghiệmđịnh lượng HBV- DNA hiện nay chúng ta vẫn phải nhập từnước ngoài với chi phí cao và không chủ động về nguồn cung

1.4 Tiêu chuẩn về mẫu chuẩn

1.4.1 Tiêu chuẩn quốc tế về mẫu chuẩn.

ILCA (International Laboratory AccreditationCooperation) đã tổng hợp những tiêu chuẩn để đánh giá độđồng nhất và độ ổn định được trình bày trong ISO 13528(2015) [51]

- Tiêu chuẩn đánh giá độ đồng nhất của mẫu chuẩn

+ Phân tích ngẫu nhiên g mẫu (g ≥ 10), mỗi mẫu lặp 2lần

+Tính các giá trị trung bình X ̅

+ Xác độ độ lệch chuẩn trung bình của mẫu

Sx = (x t  x) / (2 g1)+ Xác định độ lệch chuẩn trong các mẫu Sw

Sw = w / (2 )2t g

+ Xác định độ lệch chuẩn giữa các mẫu Ss

Ss = s2x (s2w / 2)+ Xác định độ lệch chuẩn của đánh giá thành thạo σpt

2 2

1 2 0,3 pt 2 ( ) 1 ( ) 2

Trong đó u : độ không đảm bảo đo của xét nghiệm

1.4.2 Tiêu chuẩn cơ sở

Theo Thông tư 21/2007/TT-BKHCN ngày 28/9/2007 của

Bộ trưởng Bộ Khoa học và Công nghệ hướng dẫn xây dựng và

+ Tiêu chuẩn cơ sở là tiêu chuẩn do tổ chức kinh tế, tổ

chức xã hội - nghề nghiệp, cơ quan nhà nước, đơn vị sựnghiệp và các cơ quan, tổ chức khác công bố để áp dụngtrong các hoạt động của tổ chức đó

+ Áp dụng tiêu chuẩn: là sử dụng tiêu chuẩn trong hoạt

động quản lý, sản xuất, kinh doanh sản phẩm, hàng hoá, dịch

vụ, quá trình, môi trường và trong các hoạt động kinh tế - xãhội khác

+ Công bố tiêu chuẩn cơ sở là việc tổ chức, cá nhân sản

xuất, kinh doanh thông báo về tiêu chuẩn áp dụng hoặc cácđặc tính cơ bản của sản phẩm, hàng hóa, dịch vụ, quá trình,môi trường của mình

- Yêu cầu đối với tiêu chuẩn cơ sở

+ Tiêu chuẩn cơ sở không được trái với quy chuẩn kỹthuật và quy định của pháp luật hiện hành

+ Tiêu chuẩn cơ sở cần được xây dựng phù hợp với trình

độ tiến bộ khoa học và công nghệ, đáp ứng được yêu cầu

quản lý, sản xuất kinh doanh của cơ sở.

- Căn cứ xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

+ Tiêu chuẩn cơ sở được xây dựng dựa trên các kết quảnghiên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ kỹ thuật, kinhnghiệm, nhu cầu và khả năng thực tiễn của cơ sở Các tiêuchuẩn quốc gia, tiêu chuẩn quốc tế, khu vực hoặc nước ngoàitương ứng được khuyến khích sử dụng để xây dựng hoặc chấpnhận thành tiêu chuẩn cơ sở

- Loại tiêu chuẩn cơ sở

Tiêu chuẩn cơ sở có thể gồm các loại sau:

+ Tiêu chuẩn yêu cầu kỹ thuật;

+ Tiêu chuẩn phương pháp thử, phương pháp đo vàhiệu chuẩn;

+ Tiêu chuẩn ghi nhãn, bao gói, vận chuyển, bảoquản;

+ Tiêu chuẩn quá trình;

+ Tiêu chuẩn dịch vụ;

+ Tiêu chuẩn môi trường

Tùy theo loại hình, quy mô hoạt động, mục đích, yêucầu quản lý nội bộ, các cơ sở có thể vận dụng cách thứcphân loại trên hoặc bổ sung loại tiêu chuẩn mới để quy định

về phân loại tiêu chuẩn một cách thích hợp cho cơ sở mình

- Phương thức xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

Tiêu chuẩn cơ sở có thể được xây dựng theo nhữngphương thức cơ bản sau:

+ Chấp nhận tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn quốc tế,

tiêu chuẩn khu vực hoặc tiêu chuẩn nước ngoài tương ứngthành tiêu chuẩn cơ sở;

+ Xây dựng mới tiêu chuẩn cơ sở trên cơ sở sử dụng cáckết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, các kết quả thửnghiệm, đánh giá, phân tích và thực nghiệm;

+ Sửa đổi, bổ sung tiêu chuẩn cơ sở hiện hành

Hiện nay chưa có tiêu chuẩn cơ sở về mẫu huyết tươngkiểm tra HBV-DNA

1.5 Xét nghiệm định lượng HBV-DNA tại Việt Nam

1.5.1 Hệ thống các phòng xét nghiệm định lượng DNA tại Việt Nam

Cho đến nay, hệ thống phòng xét nghiệm định lượng DNA ở miền Bắc đã được thiết lập với hơn 30 phòng, trong đó

HBV-có khoảng 15 phòng thí nghiệm sử dụng bộ mix của hãng Việt

Á trên máy bán tự động, khoảng 10 phòng thí nghiệm sử dụng

bộ mix Roche trên máy tự động hoàn toàn, phần còn lại sửdụng hóa chất từ Nam Khoa…

Công tác quản lý đảm bảo chất lượng xét nghiệm cũng đãđược quan tâm triển khai và thực hiện ở tất cả các cơ sở xétnghiệm chuyên sâu, tuy nhiên phần lớn phụ thuộc vào chươngtrình ngoại kiểm của các nước trên thế giới, giá thành cao nên

có rất ít phòng xét nghiệm tham gia vào chương trình ngoạikiểm

1.5.2 Các phương pháp sản xuất mẫu kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng HBV-DNA

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp sản xuấtmẫu kiểm tra chất lượng HBV-DNA khác nhau như mẫu chuẩn

sản xuất theo phương pháp mẫu huyết tương đông khô, mẫuhuyết tương đông lạnh và tùy thuộc vào tình hình thực tế củamỗi quốc gia và chiến lược của nhà cung cấp.Với mẫu huyếttương khô sẽ hạn chế được việc ảnh hưởng bởi nhiệt độ trongquá trình vận chuyển cũng như việc tiết kiệm được chi phí sảnxuất cũng như lượng mẫu sử dụng cho sản xuất [55].

1.6 Quy trình sản xuất mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA.

1.6.1 Về phương pháp điều chế

Quá trình đông khô:

Mẫu chuẩn có thể được sản xuất dưới dạng dung dịch,đông lạnh hoặc đông khô Tuy nhiên mẫu dạng đông khô chothấy độ ổn định và tuổi thọ cao hơn rất nhiều so với dạng

dung dịch thông thường [56-58].

Mặt khác dạng đông khô dễ vận chuyển hơn dạng dungdịch và đông lạnh do yêu cầu về đảm bảo nhiệt độ lạnh đơngiản hơn Chính vậy hiện nay các nhà sản xuất đều ưu tiênsản xuất mẫu chuẩn ở dạng đông khô

Nguyên lý: Sự thăng hoa phần nước ở trạng thái rắn sanghơi hầu như không gây hại cho sự sống cũng như các hệthống enzym và tế bào khi quá trình xảy ra nhanh ở nhiệt độthấp và trong môi trường chân không Ngoài ra đông khôkhông làm vỡ tế bào, ở điều kiện chân không và đã loại gầnhết oxy nên chủng giống hoặc tế bào vi sinh vật không thểphát triển trong thời gian dài bảo quản sau đó

1.6.2 Quy trình chuẩn bị huyết tương đông khô theo hướng dẫn của WHO [56]