NGHIÊN cứu QUY TRÌNH sản XUẤT mẫu HUYẾT THANH sử DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG xét NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA

xuất mẫu huyết thanh sử dụng trong kiểm tra chất lượng xétnghiệm DNA- HBV” – Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xétnghiệm - đại học Y Hà Nội tài trợ.Hà nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Nguyễn

NGUYỄN THỊ THÙY

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU

HUYẾT THANH SỬ DỤNG TRONG

CHƯƠNG TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG HBV- DNA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ

KHÓA 39

HÀ NỘI – 2017

NGUYỄN THỊ THÙY

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU

HUYẾT THANH SỬ DỤNG TRONG

CHƯƠNG TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG HBV- DNA

Chuyên ngành : Hóa sinh

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

GS.TS Tạ Thành Văn và PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung,

những người đã luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thứccũng như kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập.Thầy và Cô đã luôn tận tâm hướng dẫn, đóng góp, sửa chữa

và động viên tôi hoàn thành tốt luận văn này

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các Thầy, Cô vàcán bộ trong bộ môn Hóa sinh, đã luôn tận tình dạy dỗ, truyềnđạt cho tôi những kiến thức chuyên ngành và những kinhnghiệm quý giá

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc và lãnh đạoTrung tâm kiểm chuẩn Đại học Y Hà Nội, đã giúp đã và luôntạo điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia đề tài và triển khaithực hiện nghiên cứu tại trung tâm

Xin cảm ơn các anh chị trong khoa xét nghiệm - Bệnhviện Đại học Y, Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xétnghiệmvà Trung tâm nghiên cứu Gen-protein - đại học Y HàNội đã giúp đỡ tôi có được mọi điều kiện cơ sở vật chất, kinhnghiệm để có thể thực hiện nghiên cứu

Xin bày tỏ lòng kính yêu sâu sắc đến gia đình, Nhữngngười thân, người thương, bạn bè đã luôn ở bên hỗ trợ, cổ vũ,động viên tôi hoàn thành được khóa luận này

xuất mẫu huyết thanh sử dụng trong kiểm tra chất lượng xétnghiệm DNA- HBV” – Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xétnghiệm - đại học Y Hà Nội tài trợ.

Hà nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017

Nguyễn Thị Thùy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả và số liệu trong bản luậnvăn tốt nghiệp Bác sĩ Nội trú này hoàn toàn trung thực và dobản thân tôi thu được trong quá trình nghiên cứu, không saochép của bất kỳ ai

Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn với độ xác thực củaluận văn này

Hà Nội, ngày 19 tháng 9 năm

2017

Tác giả

Nguyễn Thị Thùy

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Virus viêm gan B 3

1.1.1 Hình thái virus 3

1.1.2 Cấu trúc bộ gen virus 4

1.1.3 Chu kỳ nhân lên của virus 5

1.1.4 Kiểu gen của HBV và vai trò sinh bệnh học 6

1.1.5 Dịch tễ học 6

1.1.6 Diến tiến của nhiễm HBV 8

1.1.7 Phòng ngừa HBV 9

1.2 Xét nghiệm định lượng HBV-DNA trong phòng xét nghiệm 10 1.2.1 Ý nghĩa lâm sàng định lượng HBV- DNA 10

1.2.2 Kĩ thuật định lượng HBV- DNA 11

1.2.3 Kỹ thuật Real-time PCR 12

1.3 Đảm bảo chất lượng xét nghiệm 15

1.3.1 Yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm 16

1.3.2 Các sai số trong phòng thí nghiệm 17

1.3.3 Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm 18

1.3.4 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm 19

1.3.5 Mẫu kiểm tra chất lượng và yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng mẫu 23

1.4 Tiêu chuẩn về mẫu chuẩn 24

1.4.1 Tiêu chuẩn quốc tế về mẫu chuẩn 24

1.4.2 Tiêu chuẩn cơ sở 26

1.5 Xét nghiệm định lượng HBV-DNA tại Việt Nam 28

1.6 Quy trình sản xuất mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng

dạng đông khô HBV-DNA .28

1.6.1 Về phương pháp điều chế 28

1.6.2 Quy trình chuẩn bị huyết tương đông khô theo hướng dẫn của WHO 29

1.7 Phương pháp đánh giá độ ổn định ngắn hạn 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu nghiên cứu 32

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 32

2.1.2 Tiêu chuẩn chấp nhận 32

2.1.3 Tiêu chuẩn loại bỏ 32

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

32 2.3 Phương pháp nghiên cứu 33

2.3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 33

2.3.2 Xây dựng bộ mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA 33

2.3.3 Xác định đặc tính của mẫu kiểm tra chất lượng 34

2.3.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở 36

2.4 Sơ đồ nghiên cứu 37

2.5 Quy trình nghiên cứu 38

2.6 Đánh giá chất lượng mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA 39

2.6.1 Đánh giá độ đồng nhất 39

2.6.2 Đánh giá độ ổn định 40

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43

3.1 Kết quả xây dựng quy trình sản xuất mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA 43

3.1.1 Phương trình đường chuẩn định lượng HBV-DNA 43

3.1.2 Kết quả phân tích đặc điểm bộ mẫu kiểm tra chất lượng 45

3.2 Kết quả đánh giá chất lượng bộ mẫu 46

3.2.1 Chất lượng mẫu huyết tương kiểm tra HBV- DNA dạng đông khô 46

3.3 Độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu huyết tương kiểm tra dạng đông khô HBV- DNA 49

3.3.1 Độ đồng nhất của mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA 49

3.3.2 Độ ổn định dài hạn của mẫu huyết tương kiểm tra chất lượng dạng đông khô HBV-DNA 53

3.3.3 Kết quả so sánh chất lượng mẫu huyết tương kiểm tra với tiêu chuẩn Iso 13528 56

3.3.4 Độ ổn định ngắn hạn của mẫu kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng HBV- DNA 56

3.4 Kết quả thử nghiệm ngoại kiểm xét nghiệm định lượng HBV-DNA 57

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 60

4.1 Quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm dạng đông khô 60

4.1.1 Thu thập và xử lý mẫu huyết tương 60

4.1.2 Chia và đông khô mẫu kiểm tra chất lượng 63

4.1.3 Trọng lượng khô của vật liệu nghiên cứu 64

4.1.4 Đánh giá chất lượng thiết bị phân tích mẫu 64

4.1.6 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn HBV-DNA 66

4.1.7 Độ ổn định ngắn hạn của mẫu huyết tương kiểm tra dạng đông khô sử dụng trong xét nghiệm định lượng HBV- DNA 69

4.2 Đánh giá kết quả thử nghiệm ngoại kiểm 69

4.3 Tiêu chuẩn cơ sở 70

KẾT LUẬN 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

: Polymerase chain reaction: External quality assessment: Quality assurance

: Quality Control: Internal Quality Control: International Organization forStandardization

: World Health Organization

Hình 1.1: Cấu trúc HBV 3

Hình 1.2: Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào gan 5

Hình 1.3: Nguyên lý kỹ thuật Realtime PCR 13

Hình 1.4: Biểu đồ biểu diễn sự khuếch đại mẫu 14

Hình 1.5: Đường biểu diễn kết quả của các nồng độ 15

Hình 1.6: Tính xác thực của xét nghiệm 18

Hình 1.7: Vai trò của các đơn vị tham gia ngoại kiểm 20

Hình 3.1: Đường tín hiệu của các mẫu chuẩn HBV-DNA 43

Hình 3.2: Bộ mẫu chuẩn sau khi chia 46

Hình 3.3: Mẫu đông khô bị loại bỏ 47

Hình 3.4: Trước và sau hoàn nguyên của mẫu đông khô 47

Hình 3.5: Kết quả đồng nhất mẫu nồng độ thấp và nồng độ cao 51

Hình 3.6: Kết quả chạy độ ổn định tháng 9 54

Hình 3.7: Thời gian bộ mẫu vận chuyển đến các đơn vị và quay trở lại Trung tâm kiểm chuẩn Đại Học Y Hà Nội 56

Bảng 2.1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao 32

Bảng 2.2: Máy móc và thiết bị sử dụng 33

Bảng 2.3: Mồi sử dụng trong định lượng HBV 34

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng realtime-PCR 35

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng realtime-PCR 35

Bảng 3.1: Các nồng độ xây dựng đường chuẩn 43

Bảng 3.2: Nồng độ các mẫu huyết tương ngoại kiểm HBV- DNA với các mức nồng độ trước đông khô .45

Bảng 3.3: Kết quả đông khô mẫu kiểm tra nồng độ cao sau đông khô 48

Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu mẫu nồng độ thấp 49

Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu đồng nhất mẫu nồng độ cao 50 Bảng 3.6: Kết quả nghiên cứu mẫu âm tính 52

Bảng 3.7: Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu nồng độ thấp .53

Bảng 3.8: Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu nồng độ cao 55 Bảng 3.9: Kết quả kiểm tra độ ổn định ngắn hạn 57

Bảng 3.10: Kết quả các bệnh viện 58

Bảng 3.11: Kết quả các bệnh viện 59

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Biểu đồ mẫu HBV-DNA 44

Biểu đồ 3.3: Đánh giá thử nghiệm trên hệ thống RT-PCR tự

động 59

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh viêm gan do virus B hiện đang là một vấn đề sứckhỏe toàn cầu Theo Tổ chức Y tế Thế giới, năm 2013 cókhoảng 2 tỉ người nhiễm virus viêm gan B (HBV) trong đó cótới 240 triệu người nhiễm mạn tính [1] Bệnh diễn biến dẫnđến các biến chứng nguy hiểm như: xơ gan, suy gan mất bù

và ung thư biểu mô tế bào gan [2-5], ước tính có đến 686 000nghìn người tử vong hàng năm do các biến chứng trên [1].Việc chẩn đoán nhiễm virus viêm gan B chủ yếu dựa trên

sự phát hiện kháng nguyên HBsAg [6] Tuy nhiên, kết quả củaxét nghiệm này không phản ánh được chính xác lượng virustrong huyết thanh hay hoạt động của virus viêm gan B cũngnhư hiệu quả của điều trị thuốc kháng virus, do đó định lượngHBV-DNA là một xét nghiệm đáng tin cậy và có giá trị caotrong: theo dõi tốc độ nhân lên của virus từ đó xác định thờiđiểm điều trị thuốc kháng virus, đánh giá sự đáp ứng và nguy

cơ tiến triển dẫn tới xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan ởnhững bệnh nhân bị bệnh viêm gan B mạn tính [7-11]

Trong những năm gần đây xét nghiệm định lượng DNA bằng phương pháp Realtime PCR đã sử dụng ở nhiềunơi do có độ nhạy và đặc hiệu cao [12] Tuy nhiên chấtlượng xét nghiệm vẫn còn phụ thuộc vào phương pháp vàkinh nghiệm của kĩ thuật viên Do đó kiểm tra nội chuẩn vàngoại chuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảotính chính xác của kết quả xét nghiệm [13], [14] Mặc dù có

HBV-vai trò quan trọng như vậy nhưng chỉ có một số phòng xétnghiệm tham gia công tác ngoại kiểm vì các mẫu này đềuchưa được sản xuất trong nước mà phải nhập từ nước ngoàivới giá thành cao, và nguồn cung không ổn định do đó sẽlàm tăng gánh nặng chi phí cho bệnh nhân Xuất phát từ

vấn đề, chúng tôi xin tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết thanh sử dụng trong chương trình kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng HBV- DNA", với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng quy trình sản xuất mẫu huyết thanh dùng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng HBV- DNA.

2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho mẫu huyết thanh đông khô được sản xuất sử dụng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng HBV-DNA.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Virus viêm gan B (HBV)

1.1.1 Hình thái virus

HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có cấu trúc DNA xoắn kép

[15], [16] Trong huyết thanh của người nhiễm HBV, virus tồntại dưới 2 dạng [17]

- Hạt Dane: được phát hiện vào thập niên 70 [18] Là mộtvirion hoàn chỉnh hình cầu, đường kính 42 nm, bên ngoài có

vỏ bọc cấu tạo từ kháng nguyên bề mặt (HBsAg) với 3 loạiprotein S, M, L [19] Bên trong là nucleocapside, đường kính

34 nm, cấu tạo từ kháng nguyên lõi (HBcAg), DNA và cácenzyme như DNA polymerase, protein kinase

Hình 1.1: Cấu trúc HBV [20]

- Các hạt HBs: có dạng hình cầu hoặc hình ống, có kíchthước thay đổi Đây là các protein HBs được tạo ra dư thừa

trong bào tương của tế bào gan sau đó được phóng thích vàomáu và không chứa DNA của virus do đó không gây nhiễm

[21], [22].

1.1.2 Cấu trúc bộ gen virus

HBV có bộ gen là phân tử DNA dạng vòng, chiều dàikhoảng 3200 bases, gồm 2 chuỗi có chiều dài khác nhau.Chuỗi dài (sợi âm) nằm phía ngoài, có chiều dài cố định là

3200 bases và gần như khép kín, mã hóa cho các thông tin ditruyền của virus.Chuỗi ngắn (sợi dương), nằm ở trong, chiềudài thay đổi và chỉ bằng 50-80% chiều dài sợi âm

Trên sợi DNA âm, có 4 đoạn gen tương tứng với 4 khungđọc mở (opening reading frame) là các vùng mã hóa cho sựtổng hợp các protein bề mặt (HBsAg), protein lõi (HBeAg,HBcAg), polymerase và protein X [23].

Các gen đó gồm:

- Gen S: bao gồm vùng S, Pre-S1, Pre-S2 mã hóa cho sựtổng hợp kháng nguyên bề mặt HBsAg Đoạn gen S tổng hợpnên Protein S, đoạn gen S và pre-S2 tổng hợp nên protein M(Medium) có chiều dài 108 acid amin Vùng Pre-S2 giúp chovirus bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ liênkết với một loại albumin được trùng hợp trong huyết thanhcủa người Đoạn S, Pre-S1, Pre-S2 tổng hợp nên Protein L(Large) Vùng Pre-S1 là vùng chủ yếu mà virus sẽ gắn lên cácthụ thể trên bề mặt của tế bào gan, giúp virus xâm nhập vàobên trong tế bào [24]

- Gen C: gồm vùng C (Core) và pre-C (Pre-core), mã hóacho sự tổng hợp protein của nucleocapsid Các nucleotide đầu

tiên của vùng Pre-core mã hóa cho việc tạo nên một đoạnpeptide tín hiệu có vai trò giúp cho kháng nguyên HBeAgđược bài tiết qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, hòatan vào huyết thanh Sự hiện diện của HBeAg phản ánh tìnhtrạng nhân lên của virus ở bên trong tế bào gan và có liênquan đến tính lây nhiễm Nếu quá trình đọc mã đi hết đoạngen C sẽ tổng hợp nên kháng nguyên HBcAg Vì khángnguyên HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu nên khôngđược bài tiết ra ngoài tế bào gan do đó không được tìm thấytrong huyết thanh [24].

- Gen X: mã hóa cho sự tổng hợp protein HBx Chức năngđầy đủ của protein HBx chưa được biết rõ Protein HBx có vaitrò chuyển hoạt hóa trong quá trình sao chép của virus Do

đó, protein HBx có vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ungthư ở các tế bào gan bị nhiễm

- Gen P (Polymerase): là gen lớn nhất chiếm 80% chiềudài bộ gen mã hóa cho DNA-polymerase, có liên quan đến cơchế sao chép ngược của virus và đồng thời tham gia một phầnvào việc tạo ra capside bao bọc bên ngoài cấu trúc của tiềngenom [25], [26]

1.1.3 Chu kỳ nhân lên của virus

Hình 1.2: Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào gan [23]

Khi virus nhân lên, DNA không sao chép trực tiếp thànhDNA của virus mới mà qua bước trung gian là tạo ra 2 sợimRNA nhờ RNA của tế bào ký chủ Hai sợi mRNA này được gọi

là tiền genome, chứa toàn bộ thông tin di truyền của virus Từ

2 sợi mRNA này sẽ tổng hợp các thành phần của virion DNAcủa virion sẽ sao chép từ mRNA thành DNA của virus Nhưvậy, DNA polymerase hoạt động như một men sao chépngược Khi sợi DNA dài (L) được hình thành thì sợi mRNA cũng

tự phá hủy

Phần lõi của virus được lắp ghép thêm phần vỏ bọc xungquanh rồi được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào tương đểphóng thích ra khỏi tế bào gan dưới dạng một virion hoàn

chỉnh hoặc phần lõi này sẽ trở lại nhân tế bào gan để vào lạimột chu trình sao chép mới [27], [28].

1.1.4 Kiểu gen của HBV và vai trò sinh bệnh học

Okamoto là tác giả đầu tiên đưa ra phân loại kiểu gen củaHBV vào năm 1988 Bằng phương pháp so sánh từng cặp vàphân loại sinh học dựa trên giải trình tự gen toàn bộ phân tửHBV-DNA, tác giả và cộng sự đã phân loại được 4 kiểu gencủa HBV kí hiệu là: A, B, C, D Các kiểu gen này có tỷ lệ khácbiệt nucleotid trên toàn bộ phân tử HBV-DNA lớn hơn 8%, hay

tỷ lệ đồng đạng nucleotid nhỏ hơn 92%

Sau đó Norder và cộng sự xác định thêm được 4 kiểu gennữa là: E, F, G,H Các kiểu gen của HBV có sự phân bố khácnhau giữa các vùng địa lý, trong đó kiểu gen A, B, C gặp chủyếu ở châu Á và đông Nam Á Nghiên cứu về kiểu gen củaHBV ở trong nước của Đông Thị Hoài An tại Thành phố Hồ ChíMinh cho thấy kiểu gen B chiếm 76,8%, kiểu gen C chiếm20%, kiểu gen A chiếm 1,1% [29], [30]

1.1.5 Dịch tễ học

1.1.5.1 Các đường lây nhiễm

Lây nhiễm theo đường dọc

Đa số các trường hợp lây nhiễm từ mẹ sang con xảy ratrong thời kỳ chu sinh hay những tháng đầu sau sinh, khônglây nhiễm qua nhau thai Ở những vùng có tỷ lệ lưu hànhHBsAg cao, đường lây nhiễm này là quan trọng nhất, thườnggặp ở những nước vùng châu Á Mức độ lây nhiễm từ mẹ sangcon phụ thuộc vào nồng độ HBV- DNA trong máu và tình trạngHBeAg của bà mẹ vào 3 tháng cuối thai kỳ Ở những bà mẹ cóHBeAg (+), trẻ sơ sinh có nguy cơ bị nhiễm rất cao (95%) nếu

không được điều trị dự phòng Ở những bà mẹ có HBeAg (-),

tỷ lệ lây nhiễm cho con thấp hơn (32%) Tỷ lệ lây nhiễm chocon tăng lên từ 0% nếu HBV-DNA của mẹ thấp hơn 105 copies/

ml tăng đến 50% nếu HBV- DNA của mẹ từ 109 -1010 copies/ml trở lên

Nếu trẻ em nhiễm HBV do lây truyền từ mẹ thì 90%những trẻ em này sẽ trở thành người nhiễm HBV mạn tínhsuốt đời và 40% trong số này có nguy cơ sẽ chết vì bệnh xơgan và ung thư gan [31], [32]

Lây nhiễm theo đường ngang

Lây nhiễm qua đường tình dục bao gồm quan hệ tình dụcđồng tính nam hoặc khác giới với người nhiễm HBV Lâynhiễm thông qua tiếp xúc với máu, các chế phẩm của máuhay dịch tiết của người bị nhiễm HBV Ngoài ra, nguy cơ lâynhiễm còn xảy ra khi dùng chung bàn chải đánh răng, daocạo râu, kìm cắt móng tay với người bị nhiễm HBV, sử dụngkim tiêm, xăm mình hay xỏ lỗ tai không đảm bảo vô trùng,nhân viên y tế bị tai nạn chạm phải kim tiêm nhiễm HBV[33] Ở đối tượng tiêm chích ma túy, việc dùng chung kimtiêm có nhiễm HBV là nguy cơ lây nhiễm chính [34]

1.1.5.2 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới ước tính có khoảng hơn 2 tỉ người

bị nhiễm HBV Trong số này có khoảng 240 triệu người mangHBV mạn tính (HBV carier) [1] Ở Mỹ tuy có tần suất thấp hơn

so với Châu Phi và Châu Á nhưng mỗi năm có khoảng 5000người tử vong liên quan đến nhiễm HBV HBV có khả năng lâynhiễm nhiều gấp 100 lần so với HIV [35] HBV là yếu tố gây

ung thư đứng hàng thứ 2 sau thuốc lá và là nguyên nhân gây

ra 60-80% trường hợp ung thư gan nguyên phát và 50%trường hợp xơ gan Nhìn chung tình hình nhiễm HBV thay đổitheo từng vùng địa lý và tùy thuộc vào điều kiện kinh tế, vệsinh môi trường, tập quán sinh sống [12] Có 75% các trườnghợp nhiễm HBV mạn tính trên thế giới là người châu Á và châuPhi Ở một số nước châu Á như Trung Quốc, Thái Lan, ĐàiLoan, tỷ lệ nhiễm HBV rất cao ở trẻ nhỏ và trong thời kỳ thơ

ấu với tỷ lệ HBsAg (+) đến 25% Dựa vào tỷ lệ nhiễm HBVtrong dân số, người ta chia ra các vùng dịch tễ HBV trên thếgiới như sau:

- Vùng lưu hành dịch cao là vùng có tỷ lệ người mangHBsAg (+) >8%, gồm châu Á, châu Phi và hầu hết các nướcTrung Đông, vùng lưu vực sông Amazon

- Vùng lưu hành trung bình là vùng có tỷ lệ người mangHBsAg (+) từ 2-7% gồm có Ấn Độ, một phần Trung Đông,Nhật Bản, Đông Âu và hầu hết các nước Nam Mỹ, Trung Mỹ

- Vùng lưu hành dịch thấp là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg (+) < 2% gồm có Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc…và tỷ lệ người từng phơi nhiễm với HBV < 20% [36]

1.1.5.3 Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam

Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới khu vực Tây TháiBình Dương, thì Việt Nam hiện có khoảng 8.6 triệu ngườinhiễm virus viêm gan B Trong đó có khoảng 8.8% ở phụ nữ

và 12.3% ở nam giới [37] Ứớc tính tử vong liên quan tới viêmgan B ở Việt Nam khoảng 42000 người [38]

1.1.6 Diến tiến của nhiễm HBV

1.1.6.1 Nhiễm HBV ở người lớn

Nhiễm HBV ở người lớn là những lây nhiễm theo đườngngang, thường

diễn tiến qua 2 giai đoạn:

Giai đoạn virus tăng sinh, gây tổn thương, hoại tử tế bàogan tiến triển, biểu hiện bằng tăng men gan, nồng độ HBVDNA trong máu tăng và HBeAg(+) Sau giai đoạn tăng sinh,dưới áp lực miễn dịch của ký chủ, sự tăng sinh của virus giảmdần, bệnh gan thuyên giảm đặc trưng bởi sự biến mất củaHBeAg và HBV- DNA, men gan bình thường và xuất hiệnAntiHBe Một số bệnh nhân có thể có giai đoạn tái kích hoạt(HBV tăng sinh trở lại) sau một thời gian [39], [40]

1.1.6.2 Nhiễm HBV ở trẻ em

Nhiễm HBV ở trẻ em chủ yếu theo đường dọc Diễn tiến qua

4 giai đoạn:

Giai đoạn dung nạp miễn dịch (Immune-Tolerant phase):

có sự tăng sinh mạnh của HBV với HBeAg (+) và nồng độ HBVDNA trong huyết thanh rất cao nhưng không có bằng chứngcủa viêm gan hoạt động

Giai đoạn phản ứng miễn dịch (Immune-reactive phase):HBV vẫn tăng sinh nhưng có sự đáp ứng miễn dịch của cơ thểđối với HBV

Giai đoạn không tăng sinh (Nonreplicative phase): bệnhnhân có HBeAg(-), anti HBe (+), nồng độ HBV- DNA tronghuyết thanh thấp hay không phát hiện được, không có biểuhiện lâm sàng

Giai đoạn tái kích hoạt (Reactivation phase): sau mộtthời gian nhất định, một số bệnh nhân đi vào giai đoạn táikích hoạt do virus bị đột biến tự nhiên pre-core và corepromoter ảnh hưởng lên khả năng tổng hợp HBeAg của virus[41].

- Tiêm vắc xin viêm gan virus B

- Tiêm vắc xin viêm gan vi rút B cho các đối tượng chưa bịnhiễm HBV

- Tiêm vắc xin viêm gan vi rút B cho nhân viên y tế

Phòng lây truyền từ mẹ sang con:

- Nếu mẹ mang thai có HBsAg (+): Tiêm vắc xin viêm gan

vi rút B liều sau sinh cho trẻ theo chương trình tiêm chủng mởrộng và phối hợp với tiêm kháng thể kháng HBV cho trẻ [42].[43].[44]

1.2 Xét nghiệm định lượng HBV-DNA trong phòng xét nghiệm

1.2.1 Ý nghĩa lâm sàng định lượng HBV- DNA

Trong hướng dẫn thực hành điều trị viêm gan B của hộigan mật Mỹ (AASLD) năm 2009 và những năm gần đây đều sửdụng chỉ số HBV-DNA để làm tiêu chuẩn chẩn đoán các thểbệnh Để chẩn đoán viêm gan B mạn tính thì một trong cáctiêu chẩn là HBV-DNA > 105 copies/mL, người mang HbsAgkhông hoạt động là HBV-DNA < 2000 IU/mL, viêm gan B hồiphục là HBV-DNA dưới ngưỡng phát hiện [45]

Cũng theo Hội gan mật Mỹ, định lượng HBV-DNA có vai tròquan trọng trong việc quản lý bệnh nhân để có chỉ định điềutrị kịp thời Mặc dù nồng độ HBV-DNA > 105 copies/ml đượclựa chọn như là một tiêu chuẩn điều trị viêm gan B mạn tính.Tuy nhiên viêm gan B mạn tính, xơ gan và ung thư biểu mô tếbào gan đã gặp ở các bệnh nhân có nồng độ HBV-DNA thấphơn Do đó, kiểm tra nồng độ HBV-DNA liên tục có vai tròquan trọng

Nồng độ DNA phản ánh sự nhân lên của vi rút DNA thay đổi tùy theo từng giai đoạn trong quá rình diễn biến

HBV-tự nhiên của viêm gan B mạn tính Theo nghiên cứu của T.Nguyen và J Jaroszewics thấy nồng độ HBV-DNA cao nhất ởgiai đoạn dung nạp miễn dịch, tiếp theo là giai đoạn thải loạimiễn dịch và giai đoạn tái hoạt động, thấp nhất ở giai đoạnkhông hoạt động [46] Định lượng HBV-DNA có ý nghĩa rất lớntrong tiên lượng tiến triển của bệnh Nồng độ HBV-DNA caothì nguy cơ dẫn đến xơ gan ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính.Nồng độ HBV-DNA > 104 copies/mL dự báo khả năng tiến triển

xơ gan Và trên nền xơ gan thì nồng độ HBV-DNA càng caonguy cơ biến chứng càng nhiều [47-50].

Nồng độ HBV-DNA là tiêu chuẩn quyết định điều trị thuốckháng vi rút Theo khuyến cáo của các Hội gan mật Mỹ, Châu

Âu và Châu Á Thái Bình Dương thì trong trường hợp viêm gan

B có HbeAg (+), men gan ALT tăng > 40 U/L, HBV-DNA > 105

copies/mL là chỉ định điều trị thuốc kháng vi rút

Nồng độ HBV-DNA giúp theo dõi sự kháng thuốc Nếu saumột thời gian điều trị đặc hiệu mà lượng vi rút không giảmquá 100 lần hoặc trong quá trình điều trị xét nghiệm thấyHBV- DNA từ âm tính thành dương tính trở lại thì bác sĩ điềutrị cần nghĩ đến khả năng kháng thuốc của vi rút

HBV-DNA tiên lượng đáp ứng trong điều trị Dấu ấn đểđánh giá hiệu quả trực tiếp của thuốc kháng vi rút là HBV-DNA Nếu nồng độ HBV-DNA giảm theo thời gian điều trị vàtiếp tục duy trì dưới ngưỡng phát hiện, hoặc < 104 copies/mL

là dấu hiệu đáp ứng tốt Thông thường phác đồ điều trị hiệnnay được khuyến cáo là kéo dài ít nhất 2 năm đối với cácthuốc nhóm nucleotide, 1 năm với thuốc nhóm Interferon Sauthời gian điều trị phải kiểm tra HBV-DNA 3-6 tháng/ lần

HBV-DNA giúp đánh giá khả năng lây truyền của vi rút Sựlây truyền HBV qua nhau thai liên quan đến nồng độ HBV-DNA

và HbeAg (+) Nếu nồng độ HBV-DNA cao thì khả năng lâytruyền mạnh hơn [51] Do đó các bà mẹ khi sinh con mà cóHbeAg (+) và nồng độ HBV-DNA cao thì nên tiêm Globulinmiễn dịch cho con hoặc Lavumidine cho mẹ vào 3 tháng cuốithai kỳ

1.2.2 Kĩ thuật định lượng HBV- DNA

Để đánh giá mức độ nhân lên của HBV, chúng ta có thểlàm các xét nghiệm định lượng HBV- DNA bằng một sốphương pháp như: Direct hybrization, phương pháp chuỗinhánh (b-DNA) và phương pháp PCR

Phương pháp Direct hybrization là kỹ thuật lai ghép trênmàng lọc hoặc trong môi trường lỏng, hạn chế về độ nhạy, chỉphát hiện được HBV-DNA từ 105 copies/mL Hiện nay kỹ thuậtnày ít được thực hiện

Phương pháp phân nhánh (b-DNA) là kỹ thuật lai ghépchuyên biệt nhờ sự khuếch đại tín hiệu lai ghép Kỹ thuật nàycho phép định lượng HBV-DNA nhạy gấp 10-20 lần so vớiphương pháp lai ghép trực tiếp, khả năng định lượng đượcHBV-DNA từ 103 copies/mL, ngày nay phương pháp này cũng

ít được sử dụng

Với sự ra đời của kỹ thuật Real-time PCR có độ nhạy cao

và có khả năng định lượng được nồng độ HBV-DNA từ 102

copies/mL đến 108 copies/mL, kỹ thuật này ngày nay được sửdụng nhiều nhất

1.2.3 Kỹ thuật Real-time PCR

Khái niệm Real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đạiDNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phảnứng [52], [53]

Nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR trong định lượng HBV

Cặp mồi (primer) được thiết kế trong vùng gen S của bộgen HBV để nhân bản một trình tự mục tiêu có kích thước 98cặp base Trong khi chạy PCR, một khi có sản phẩm khuếchđại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR thì taqman probe đặchiệu với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và

sẽ bị thủy giải bởi men taq polymerase (nhờ hoạt tính 5’-3’exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn kéo dài Sựthủy phân taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnhquang (fluorophore) ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang(quencher) ở đầu 3’ của probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ pháthuỳnh quang khi bị chiếu ánh sáng kích thích và sự pháthuỳnh quang này sẽ được ghi nhận bộ phận cảm biến quangcủa máy

Hình 1.3: Nguyên lý kỹ thuật Realtime PCR

Phân tích kết quả:

Sau khi phản ứng kết thúc, ta sẽ thu được đường biểudiễn khuếch đại của các phản ứng.

Cường độ huỳnh quang nền: thiết bị Realtime-PCR sẽghi nhận cường độ tín hiệu huỳnh quang xuất hiện ở một sốchu kỳ đầu, gọi là chu kỳ nền, lấy trung bình cộng các cường

độ huỳnh quang này sẽ tạo ra cường độ huỳnh quang nền.Đường cắt ngang qua cường độ huỳnh quang nền được gọi làđường nền

Chu kỳ ngưỡng (Ct): là chu kỳ nhiệt mà tại thời điểm đóthiết bị Realtime ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra

từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quangnền Được xác định bằng số chu kỳ mà đường nền cắt đườngbiểu diền khuếch đại, do vậy Ct thường là các số lẻ Mẫu cóDNA gốc càng nhiều thì Ct càng nhỏ và ngược lại DNA gốccàng ít thì Ct càng lớn

Hình 1.4: Biểu đồ biểu diễn sự khuếch đại mẫu

Từ các nồng độ DNA-HBV chuẩn đã biết trước ta sẽ dụngđược một đường thẳng biểu hiện mối quan hệ giữa nồng độDNA-HBV với Ct được gọi là đường biểu diễn chuẩn, với trụctung là Ct và trục hoành là nồng độ DNA đích chuẩn Từphương trình tuyến tính đó sẽ tính ra được lượng DNA mẫubệnh nhân, thông qua Ct của từng phản ứng

Mẫu HBV- DNA âm tính khi đường biểu diễn PCR thấp hơn đường nền

Realtime-Mẫu HBV-DNA dương tính khi đường biểu diễn PCR vượt cao hơn đường nền

realtime-Phản ứng realtime- PCR có sử dụng mẫu đối chứng âmhoặc đối chứng dương chạy cùng bệnh phẩm để loại trừ khảnăng nhiễm ngoại lai, và đảm bảo quy trình PCR đạt yêu cầu

Hình 1.5: Đường biểu diễn kết quả của các nồng độ

1.3 Đảm bảo chất lượng xét nghiệm.

Đảm bảo chất lượng (QA- Quality Asurance) là một hệthống bao hàm toàn bộ các chính sách, pháp quy, kế hoạch

về đào tạo con người, trang thiết bị máy móc, lựa chọnphương pháp kỹ thuật và thuốc thử để xét nghiệm đạt được

độ tin cậy, giúp bác sỹ lâm sàng trong việc chẩn đoán và điềutrị bệnh Đảm bảo chất lượng hạn chế đến mức thấp nhấtnhững sai sót có thể xảy ra trong 3 giai đoạn của quá trìnhxét nghiệm: trước, trong và sau xét nghiệm

Kiểm tra chất lượng xét nghiệm (QC- Quality Control) baogồm nội kiểm tra (Internal Quality Control - IQC) và ngoạikiểm tra (External quality assurance - EQA), là một khâunhằm phát hiện sai số, tìm nguyên nhân gây sai số từ đó đề

ra các biện pháp phòng ngừa và khắc phục

- Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm (External Quality

Assessment- EQA): Còn được gọi là ngoại kiểm tra bao gồm

ba phương thức triển khai là thử nghiệm thành thạo, kiểm traphân tích lại và đánh giá tại chỗ Trong đó thử nghiệm thànhthạo là phương thức được sử dụng phổ biến nhất [54], [55]

- Nội kiểm tra chất lượng (Internal Quality Control – IQC),

gọi tắt là nội kiểm tra, là công cụ kiểm tra chất lượng hàngngày trong nội bộ PXN, được thực hiện bởi nhân viên y tếnhằm đánh giá liên tục các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượngxét nghiệm, từ đó đi đến quyết định rằng kết quả XN có đủ tincậy trước khi trả cho bác sĩ lâm sàng hay người bệnh [56].[57]

1.3.1 Yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm

1.3.1.1 Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn trước xét nghiệm

Đây là giai đoạn chuẩn bị cho việc làm xét nghiệm, chuẩn

bị bệnh nhân, lấy mẫu bệnh phẩm, chuẩn bị thuốc thử, chuẩnhóa thiết bị xét nghiệm Trong giai đoạn này các cán bộ cầnđảm bảo lấy và bảo quản bệnh phẩm đúng quy cách (dụng cụđảm bảo vô trùng, dùng chất chống đông thích hợp, ghi đúngtên bệnh nhân trên ống máu, bảo quản đùng và gửi kịp thờiđến phòng thí nghiệm…) Ngoài ra đối với một số xét nghiệmviệc biến động sinh lý, biến động giữa các cá thể như ditruyền, tuổi tác, giới tính hay biến động trong bản thân cáthể như chế độ ăn uống, vận động, nhịp độ sinh học hay tưthế bệnh nhân , biến động do tình trạng bệnh, biến động dolấy mẫu như vị trí lấy mẫu, thời gian lấy, điều kiện bảo quản,vận chuyển cũng đều ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm[58-60]

1.3.1.2 Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn xét nghiệm

Trong giai đoạn này việc biến động về kỹ thuật phân tích

sẽ ảnh hưởng nhiều đến kết quả xét nghiệm Đó là những sai

số trong phòng thí nghiệm hoặc trình độ tay nghề của cán bộ.Những sai sót trong giai đoạn xét nghiệm thường xảy ra khicác đơn vị không có quy trình chuẩn hoặc có nhưng khôngtuân thủ cũng như các trang thiết bị không được hiệu chỉnhđịnh kỳ Bên cạnh đó việc đảm bảo chất lượng xét nghiệm cầnđược thực hiện thông qua việc sử dụng các mẫu nội kiểm tra

và tham gia các chương trình ngoại kiểm tra và định kỳ hiệuchỉnh các trang thiết bị [49], [58], [60]

1.3.1.3 Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn sau xét nghiệm

Sau khi đã hoàn thành xét nghiệm, việc đánh giá và ghinhận kết quả, gửi trả kết quả đến nơi yêu cầu xét nghiệm làrất quan trọng Việc vào hồ sơ xét nghiệm và trả kết quảcần tránh sai sót và chậm trễ, gây tổn hại đến uy tín củaphòng thí nghiệm Trả lời kết quả xét nghiệm cần đảm bảo

đủ thông tin và được lưu trữ ở phòng xét nghiệm để tiệntham khảo hoặc tra cứu khi cần thiết [58-60]

1.3.2 Các sai số trong phòng thí nghiệm

Trong quá trình tiến hành xét nghiệm không tránh khỏinhững sai số ảnh

hưởng đến kết quả xét nghiệm có thể chia thành các loại sai

số sau:

Sai số thô bạo: thường do lỗi của nhân viên làm xétnghiệm trong quá trình xử lý mẫu, sử dụng pipet, pha hoáchất thuốc thử, không tuân thủ đúng qui trình thao tác, nhầmlẫn dung dịch thuốc thử, tính toán sai…

Sai số ngẫu nhiên: khi ta tiến hành làm một xét nghiệmtrong điều kiện như nhau và lặp lại nhiều lần thì kết quả xétnghiệm không thể cho giá trị như nhau mà có sự phân tánnhiều hoặc ít Sai số này thường do yếu tố con người, máymóc thiếu bảo dưỡng và nhiễm bẩn Muốn hạn chế sai số nàycần trang bị máy có độ chính xác cao và hoá chất có chấtlượng tốt, chú ý bảo dưỡng kiểm tra máy móc,thuốc thử

Sai số hệ thống: là các sai số lặp li lặp lại trong cách lầnthực hiện Nguyên nhân gây ra sai số hệ thống có thể do máymóc, dụng cụ, hóa chất chưa chuẩn, đôi khi do tật của ngườithực hiện dẫn đến kết quả có xu hướng luôn thấp hơn hoặc

luôn cao hơn so với trị số mong muốn Các sai số trên đặc biệt

là sai số ngẫu nhiên và sai số hệ thống liên quan chặt chẽ đến

độ chính xác (độ lặp lại) và độ xác thực (độ giá trị) [60]

1.3.3 Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm [61]

Do nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệmnên việc kiểm tra chất lượng xét nghiệm là công việc rất cầnthiết Việc kiểm tra này nhằm mục đích:

-Đánh giá những kết quả xét nghiệm thực hiện ở mỗiphòng xét nghiệm

-Đảm bảo tính tin cậy của kết quả xét nghiệm

-Giúp cho mỗi phòng xét nghiệm tự đánh giá giá trị của

kỹ thuật xét nghiệm và sự hoạt động hiệu quả của phòng xétnghiệm của mình

-Đánh giá tay nghề của mỗi cán bộ làm xét nghiệm.Sosánh kết quả xét

nghiệm của phòng mình với kết quả xét nghiệm của phòngkhác áp dụng cũng loại kỹ thuật

Chương trình nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm baogồm:

Kiểm tra độ chính xác (Precision)

Kiểm tra độ xác thực (Accuracy)

Các tình huống trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm cóthể gặp giống như bia bắn

Độ xác thực: Xấu Tốt Tối ưu

Độ chính xác: Tốt Xấu Tối ưu

Hình 1.6: Tính xác thực của xét nghiệm

1.3.4 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm (External Quality Assessment - EQA)

1.3.4.1 Khái quát chung về chương trình ngoại kiểm

Những tiêu chuẩn về phòng thí nghiệm được công nhận ởmức độ quốc tế, quốc gia, địa phương hay từ một tổ chức banhành sẽ làm cơ sở để đánh giá phòng thí nghiệm bằng nhiềucách khác nhau trong những trường hợp cụ thể khác nhau.Các tiêu chuẩn quốc tế ISO là rất rõ ràng về các yêu cầu củađánh giá và thường sử dụng thuật ngữ “kiểm tra - Audit” thaycho từ “đánh giá - Assessment”, những thuật ngữ này có thểđược thay thế cho nhau Đánh giá hay kiểm tra cho phépphòng thí nghiệm hiểu rõ được cách thức thực hiện khi sosánh với một tiêu chuẩn nào đó Việc kiểm tra đánh giá giúpphát hiện các thiếu sót hoặc sự không tuân thủ các chínhsách, quy trình mà phòng thí nghiệm đưa ra

Ngoại kiểm tra chính là một hình thức đánh giá baogồm cả đánh giá với mục đích khẳng định sự tin tưởng phục

vụ cho việc cấp chứng nhận hoặc cấp phép

Đánh giá chất lượng từ bên ngoài (External QualityAssessment-EQA) được sử dụng để mô tả một phương phápcho phép so sánh kết quả xét nghiệm của một phòng thínghiệm đối với các phòng thí nghiệm khác, đánh giá chấtlượng từ bên ngoài thuộc phạm trù ngoại kiểm tra nhưngtrọng tâm chủ yếu là đánh giá về kết quả xét nghiệm củaphòng thí nghiệm này so với các phòng thí nghiệm khác, xét

nghiệm cùng một mẫu xét nghiệm với cùng kỹ thuật xétnghiệm Chương trình ngoại kiểm tra thông thường được tổchức bởi một phòng thí nghiệm chuẩn thức, đơn vị này, phânphối mẫu xét nghiệm cho các phòng thí nghiệm thành viêncùng tham gia vào chương trình ngoại kiểm tra để làm xétnghiệm, sau đó thu thập các kết quả xét nghiệm để so sánh

và đánh giá kết quả của các phòng thí nghiệm thành viên Kếtquả sai ở các phòng thí nghiệm sẽ được nhà quản lý điều tratìm hiểu các điểm không phù hợp và hỗ trợ khắc phục đểnâng cao chất lượng Bên cạnh đó cũng khuyến cáo các cơ sở

sử dụng sinh phẩm phù hợp với các yêu cầu về chất lượng,điều kiện (Hình 1.7) Nhằm nâng cao chất lượng xét nghiệm,WHO đã đưa ra những hướng dẫn kỹ thuật để triển khaichương trình kiểm tra chất lượng cho các phòng thí nghiệmnói chung và đặc biệt là các phòng thí nghiệm HBV-DNA nóiriêng từ nhiều năm nay [62], [63]

Hình 1.7: Vai trò của các đơn vị tham gia ngoại kiểm

Ở Việt Nam, ngày nay do yêu cầu ngày càng cao về chấtlượng xét nghiệm ngoại kiểm đã trở thành một hoạt độngthiết yếu và là nhu cầu thực tế và cần thiết của các phòng thínghiệm ở mọi lĩnh vực: thử nghiệm, đo lường, hiệu chuẩn vàgiám định Tham gia vào các chương trình ngoại kiểm cũng làmột trong những yêu cầu bắt buộc đối với bất cứ phòng thínghiệm nào, điều này được thể hiện rõ trong các văn bản quyphạm pháp luật của Bộ Y tế.

1.3.4.2 Các phương thức ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm

Có ba phương thức được sử dụng trong ngoại kiểm tra,bao gồm: thử nghiệm thành thạo (Proficiency testing - PT),kiểm tra lại/ phân tích lại (Rechecking/ Retesting), đánh giátại chỗ (on-site evaluation)

- Thử nghiệm thành thạo: Đơn vị triển khai ngoại kiểm

sẽ phân phối mẫu ngoại kiểm cho các phòng xét nghiệmtham gia Các phòng xét nghiệm phân tích mẫu và gửi kếtquả về đơn vị triển khai ngoại kiểm để được phân tích thống

kê, đánh giá kết quả thực hiện Sau đó, phòng xét nghiệmnhận bản phân tích kết quả ngoại kiểm từ đơn vị triển khaingoại kiểm để xem xét và khắc phục sai số nếu có [64]

- Kiểm tra lại/ phân tích lại: Phòng xét nghiệm lựa chọn

mẫu bệnh phẩm xét nghiệm ngẫu nhiên gửi đến phòng xétnghiệm tham chiếu hoặc đơn vị kiểm chuẩn để phân tích vàđánh giá lại các kết quả mà phòng xét nghiệm đã thực hiện

- Đánh giá tại chỗ: Đoàn đánh giá được thành lập bới cơ

quan có thẩm quyền (Bộ Y tế, Sở Y tế…) hoặc các tổ chứcđược công nhận của quốc gia đánh giá phòng xét nghiệm căn

cứ vào bảng kiểm, những tiêu chí đã được phê duyệt [64]

1.3.4.3 Mô hình chương trình ngoại kiểm

Chương trình đánh giá chất lượng phòng thí nghiệm từbên ngoài (External qualiy assessment schemes – EQAS) haycòn gọi là chương trình ngoại kiểm là chương trình đánh giáchất lượng các phòng thí nghiệm một các định kỳ và thườngxuyên

Tổ chức bên ngoài thường là phòng thí nghiệm chuẩn thức

có uy tín cung cấp mẫu tới nhiều phòng thí nghiệm để thựchiện xét nghiệm và phân tích, so sánh đánh giá và báo cáokết quả tới các phòng thí nghiệm đã tham gia EQAS là hệthống kiểm tra khách quan năng lực kỹ thuật của phòng thínghiệm do tổ chức bên ngoài thực hiện Tất cả các phòng thínghiệm tham gia EQA cho tất cả các chỉ tiêu xét nghiệm đãthực hiện EQA [65]

Phòng thí nghiệm kể cả các đơn vị đã được công nhận bởicác tổ chức cũng cần tham gia vào các chương trình ngoạikiểm, việc tham gia này nhằm mục đích giúp phòng thínghiệm so sánh năng lực của mình với phòng thí nghiệm khác

và kiểm soát để đảm bảo chất lượng quá trình thử nghiệm.Nếu những xét nghiệm nào không có sẵn trong chương trìnhngoại kiểm trong nước, phòng thí nghiệm có thể tham gia vàocác chương trình của Quốc tế hoặc thực hiện so sánh liênphòng thí nghiệm với các phòng thí nghiệm khác Các kết quảđánh giá từ bên ngoài cần phải được lãnh đạo phòng thínghiệm xem xét và lưu hồ sơ, đây là cơ sở để cải thiện chất

lượng của đơn vị [64].

1.3.4.4 Các chương trình ngoại kiểm HBV-DNA trên thế giới

và Việt Nam.

- Trên thế giới:

Các nước tiên tiến đã coi đảm bảo chất lượng là mộttrong những tiêu chí hàng đầu của chất lượng phòng thínghiệm Chính vì vậy hệ thống các tiêu chuẩn quốc tế vềquản lý phòng thí nghiệm ra đời như ISO 15189, 17025 Việctham gia ngoại kiểm là một tiêu chí bắt buộc để duy trì cáctiêu chuẩn ISO cho phòng thí nghiệm cũng như duy trì chấtlượng của phòng thí nghiệm

Nhận thức được tầm quan trọng của chất lượng xétnghiệm định lượng HBV-DNA, WHO đã đưa ra các hướng dẫn

và khuyến cáo xây dựng chương trình ngoại kiểm cho cácnước trên thế giới [13], [14], [65].

Hiện nay các chương trình ngoại kiểm tra cho xétnghiệm định lượng HBV-DNA được một số công ty nướcngoài cung cấp như: AcroMetrix, Bio-Rad

- Tại Việt Nam

Hiện nay Việt Nam đã có một số trung tâm thử nghiệmsản xuất mẫu ngoại kiểm xét nghiệm như: HIV, HbsAg, nhómmáu [66], tuy nhiên chương trình ngoại kiểm về xét nghiệmđịnh lượng HBV- DNA hiện nay chúng ta vẫn phải nhập từnước ngoài với chi phí cao và không chủ động về nguồn cung