KẾT QUẢ KHOA học CÔNG NGHỆ đề tài NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG một số kỹ THUẬT CHẨN đoán xác ĐỊNH CHỦNG nấm MALASSEZIA gây BỆNH LANG BEN tại KHU vực hà nội

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP THÀNH PHỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆY TẾ - BẢO HỘ LAO ĐỘNG - VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM MÃ SỐ: BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP THÀNH PHỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

Y TẾ - BẢO HỘ LAO ĐỘNG - VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM

MÃ SỐ:

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH CHỦNG NẤM MALASSEZIA GÂY BỆNH LANG BEN

TẠI KHU VỰC HÀ NỘI

Mã số: 011-08/04-2016-2

Cơ quan chủ trì đề tài: Bệnh viện Da liễu Trung Ương

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Hữu Sáu

HÀ NỘI – 2017

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HÀ NỘI BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH CHỦNG NẤM MALASSEZIA GÂY BỆNH LANG BEN

TẠI KHU VỰC HÀ NỘI

Mã số: 011-08/04-2016-2 Chủ nhiệm đề tài

(ký tên)

Cơ quan chủ trì đề tài (ký tên)

Ban chủ nhiệm chương trình

(ký tên)

Sở khoa học và công nghệ Hà Nội (ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)

HÀ NỘI – 2017

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Nấm Malassezia 3

1.1.1 Vài nét lịch sử 3

1.1.2 Đặc điểm nấm Malassezia 3

1.1.3 Cơ chế gây bệnh 4

1.1.4 Một số yếu tố thuận lợi 5

1.1.5 Lang ben và một số bệnh lý khác do Malassezia 6

1.2 Bệnh lang ben 9

1.2.1 Dịch tễ 9

1.2.2 Căn nguyên 11

1.2.3 Đặc điểm lâm sàng 12

1.2.4 Cận lâm sàng 15

1.2.5 Chẩn đoán xác định 15

1.2.6 Chẩn đoán phân biệt 16

1.2.7 Điều trị 17

1.3 Các phương pháp chẩn đoán Malassezia trong bệnh lang ben 19

1.3.1 Phương pháp xét nghiệm trực tiếp 19

1.3.2 Nuôi cấy định danh 25

1.3.3 Sinh học phân tử 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Xác định các chủng Malassezia gây bệnh lang ben tại một số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội 33

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 33

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.1.4 Quy trình nghiên cứu 36

2.2 Nghiên cứu xác định các chủng Malassezia trên người khoẻ mạnh 36

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 36

2.2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 36

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 36

2.2.4 Quy trình nghiên cứu 38

2.3 Nghiên cứu đánh giá hiệu quả kỹ thuật lấy bệnh phẩm tìm Malassezia bằng băng dính 38

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 38

2.3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 38

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu 38

2.3.4 Quy trình nghiên cứu 40

2.4 Nghiên cứu đánh giá hiệu quả kỹ thuật soi trực tiếp tìm Malassezia bằng NaOH kết hợp ParkerTM blue black ink 40

2.4.1 Đối tượng nghiên cứu 40

2.4.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 40

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu 40

2.4.4 Quy trình nghiên cứu 42

2.5 Xây dựng tiêu chuẩn và một số quy trình xét nghiệm soi trực tiếp tìm Malassezia spp trong chẩn đoán bệnh lang ben 42

2.5.1 Đối tượng nghiên cứu 42

2.5.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 42

2.5.3 Phương pháp nghiên cứu 43

2.6 Xây dựng quy trình và tiêu chuẩn xét nghiệm chẩn đoán nguyên nhân bệnh lang ben 44

2.6.1 Quy trình soi trực tiếp bằng phương pháp băng dính và NaOH kết hợp ParkerTM blue black ink 44

2.7 Quản lý và phân tích số liệu 51

2.7.1 Quản lý số liệu 51

2.7.2 Phân tích số liệu 52

2.8 Đạo đức trong nghiên cứu 52

2.9 Hạn chế của đề tài 52

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53

3.1 Xác định các chủng Malassezia gây bệnh lang ben tại một số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội 53

3.1.1 Xác định Malassezia trong bệnh lang ben bằng nuôi cấy và PCR sequencing 53

3.1.2 Xác định Malassezia trên người khoẻ mạnh 67

3.1.3 Đánh giá hiệu quả kỹ thuật lấy bệnh phẩm bằng băng dính 70

3.1.4 Đánh giá hiệu quả kỹ thuật soi trực tiếp tìm Malassezia bằng NaOH kết hợp ParkerTM blue black ink 75

3.2 Xây dựng tiêu chuẩn xét nghiệm soi trực tiếp tìm Malassezia trong chẩn đoán bệnh lang ben 80

3.2.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 80

3.2.2 Kết quả soi trực tiếp của nhóm bệnh 81

3.2.3 Kết quả soi trực tiếp của nhóm chứng 84

3.2.4 So sánh kết quả soi trực tiếp của nhóm bệnh và nhóm chứng 86

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 87

4.1 Xác định các chủng Malassezia gây bệnh lang ben tại một số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội 87

4.1.1 Xác định Malassezia trong bệnh lang ben bằng nuôi cấy và PCR sequencing 87

4.1.2 Xác định Malassezia trên người khoẻ mạnh 102

4.1.3 Đánh giá hiệu quả kỹ thuật lấy bệnh phẩm bằng băng dính 103

4.1.4 Đánh giá hiệu quả kỹ thuật soi trực tiếp tìm Malassezia bằng NaOH kết hợp ParkerTM blue black ink 109

4.2 Xây dựng tiêu chuẩn xét nghiệm soi trực tiếp tìm Malassezia trong chẩn đoán bệnh lang ben 111

4.2.1 Kết quả soi trực tiếp của nhóm bệnh 111

4.2.2 Kết quả soi trực tiếp của nhóm chứng 113

4.2.3 So sánh kết quả soi trực tiếp của nhóm bệnh và nhóm chứng 114

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 1.1 So sánh tính hiệu quả giữa 2 kỹ thuật lấy bệnh phẩm bằng băng

dính và dao cùn trong xét nghiệm trực tiếp tìm nấm 22

Bảng 1.2 So sánh soi trực tiếp tìm Malassezia bằng NaOH+BI và KOH 24

Bảng 1.3 Đặc điểm các môi trường thường dùng trong nuôi cấy Malassezia 26

Bảng 1.4 Đặc điểm kiểu hình của 14 loài Malassezia dựa trên đặc tính sinh lý và sinh hóa 27

Bảng 1.5 Đặc tính các loài Malassezia trên CHROM agar Malassezia 29

Bảng 1.6 Các phương pháp định danh Malassezia bằng sinh học phân tử và PCR 31

YBảng 3.1 Phân bố đặc trưng cá nhân của bệnh nhân 53

Bảng 3.2 Phân bố bệnh theo địa dư và nghề nghiệp 54

Bảng 3.3 Kết quả nuôi cấy từ vảy da bệnh nhân lang ben 55

Bảng 3.4 Kết quả định danh các loài Malassezia bằng nuôi cấy 55

Bảng 3.5 Kết quả PCR từ vảy da bệnh nhân lang ben 56

Bảng 3.6 Kết quả Malassezia định danh theo PCR sequencing 56

Bảng 3.7 Độ nhạy, độ đặc hiệu của PCR theo nuôi cấy 57

Bảng 3.8 Độ nhạy, độ đặc hiệu của loài M globosa với kỹ thuật PCR sequencing theo nuôi cấy 58

Bảng 3.9 Phân bố các loài Malassezia gây bệnh lang ben theo nhóm tuổi 59

Bảng 3.10 Phân bố loài Malasssezia gây bệnh lang ben theo giới 60

Bảng 3.11 Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo địa dư 61

Bảng 3.12 Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo thời gian bị bệnh 62

Bảng 3.13 Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo tính chất bệnh 63

Bảng 3.14 Phân bố đặc trưng cá nhân của nhóm người khỏe mạnh tình nguyện 67

Bảng 3.15 Kết quả định danh các loài Malassezia bằng nuôi cấy của người khỏe mạnh tình nguyện 68

Bảng 3.16 Kết quả Malassezia định danh theo PCR sequencing của người khỏe mạnh tình nguyện 69

Bảng 3.17 Phân bố bệnh theo tuổi 70

Bảng 3.18 Phân bố bệnh theo giới 71

Bảng 3.19 Phân bố bệnh theo địa dư 71

Bảng 3.20 Thời gian trả kết quả xét nghiệm của phương pháp băng dính và dao cùn 72

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của phương pháp băng dính và dao cùn theo vị trí 72

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của phương pháp băng dính và dao cùn theo đối tượng 73

Bảng 3.23 Kết quả soi trực tiếp của phương pháp băng dính và dao cùn 73

Bảng 3.24 Ảnh hưởng khi nhận định hình thái trên KHV của phương pháp băng dính và dao cùn 74

Bảng 3.25 Kết quả nhận định tế bào nấm men bằng phương pháp băng dính và dao cùn 74

Bảng 3.26 Ảnh hưởng của phương pháp băng dính và dao cùn theo thương tổn vảy da 75

Bảng 3.27 Phân bố bệnh theo tuổi 76

Bảng 3.28 Phân bố bệnh theo giới 76

Bảng 3.29 Phân bố bệnh theo địa dư 77

Bảng 3.32 Ảnh hưởng khi nhận định hình thái trên kính hiển vi của phương

pháp NaOH+BI và KOH 78

Bảng 3.33 Kết quả nhận định tế bào nấm men bằng phương pháp NaOH+BI và KOH 79

Bảng 3.34 Độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp NaOH+BI theo nuôi cấy79 Bảng 3.35 Độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp KOH theo nuôi cấy 80

Bảng 3.36 Đặc điểm nhóm nghiên cứu theo tuổi 80

Bảng 3.37 Đặc điểm nhóm nghiên cứu theo giới 81

Bảng 3.38 Kết quả nuôi cấy định danh từ vảy da 81

Bảng 3.39 Kết quả định lượng tế bào nấm men 82

Bảng 3.40 Độ nhạy, độ đặc hiệu của kết quả định lượng tế bào nấm men theo nuôi cấy ở nhóm bệnh 83

Bảng 3.41 Kết quả nuôi cấy định danh từ vảy da 84

Bảng 3.42 Kết quả định lượng tế bào nấm men 84

Bảng 3.43 Độ nhạy, độ đặc hiệu của kết quả định lượng tế bào nấm men theo nuôi cấy ở nhóm bệnh 85

Bảng 3.44 So sánh số lượng vi nấm 20TB/VT ở người bệnh và người lành 86 Bảng 4.1 Xác định Malassezia theo nuôi cấy đinh danh ở các nghiên cứu 92

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Phân bố các loài Malassezia gây bệnh lang ben theo màu sắc dát 64 Biểu đồ 3.2 Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo vị trí thương tổn 65 Biểu đồ 3.3 Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo kết quả soi trực tiếp

từ vảy da 66Biểu đồ 3.4 Kết quả nuôi cấy từ vảy da người khỏe mạnh tình nguyện 68Biểu đồ 3.5 Kết quả PCR từ vảy da của người khỏe mạnh tình nguyện 69

Hình 2.1 Quy trình định danh nấm Malassezia có cải tiến () 49

Hình 3.1 Đường cong ROC mô tả độ nhạy, độ đặc hiệu của PCR

sequencing theo nuôi cấy định danh 57Hình 3.2 Đường cong ROC mô tả độ nhạy, độ đặc hiệu của PCR

sequencing theo nuôi cấy định danh 58Hình 3.3 Đường cong ROC mô tả kết quả định lượng tế bào nấm men 83Hình 3.4 Đường cong ROC mô tả kết quả định lượng tế bào nấm men 86

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

M caparae : Malassezia caparae

M cuniculi : Malassezia cunniculi

M dermatis : Malassezia dermatis

M equina : Malassezia equina

M furfur : Malassezia furfur

M globosa : Malassezia globosa

M japonica : Malassezia japonica

M nana : Malassezia nana

M obtusa : Malassezia obtusa

M pachydermatis : Malassezia pachydermatis

M restricta : Malassezia restricta

M slooffiae : Malassezia slooffiae

M sympodialis : Malassezia sympodialis Malassezia spp : Malassezia species plus

P orbiculair : Pityrosporum orbiculair

P ovale : Pityrosporum ovale

TB/VT : Tế bào/Vi trường

MỞ ĐẦU

Nhiễm nấm là một trong những bệnh khá phổ biến trên thế giới Nấmtồn tại mọi nơi trên cả cơ thể người và động vật, phát triển và gây bệnh khigặp điều kiện thuận lợi Tại Mỹ, tỷ lệ tử vong do nấm đứng hàng thứ 10 trongcác nguyên nhân tử vong từ các bệnh nhiễm trùng, đến 1997 tỷ lệ này tănggấp 3 lần, đứng hàng thứ 4 Tại Pháp, trong 10 năm gần đây (2001-2010) ướctính khoảng 36000 người nhiễm nấm, trong đó 28% trường hợp tử vong dobệnh nấm [1]

Tại bệnh viện Da liễu Trung Ương, số bệnh nhân đến khám và làm xét

nghiệm tìm nấm rất đông và đa dạng Trong đó, vi nấm Malassezia spp gây bệnh ngoài da chiếm tỷ lệ khá cao Malassezia có 14 loài, mỗi loài có độc tính

khác nhau nên khả năng gây bệnh đa dạng: Lang ben, viêm da dầu, viêm da

cơ địa, viêm nang lông, Bệnh biểu hiện các triệu chứng lâm sàng như:Ngứa, đỏ da, bong vẩy,…Thương tổn có thể gặp bất kỳ vùng nào trên cơ thểnhưng thông thường khu trú vùng tiết nhiều bã nhờn như: da đầu, lưng, ngực,mặt Ngoài ra, có thể gặp ở nếp kẽ, nang lông, vùng móng…thậm chí vi nấmxâm nhập các cơ quan, bộ phận gây nhiễm nấm nội tạng, nhiễm nấm huyết

Do đó, nếu thiếu điều kiện xét nghiệm dễ dẫn đến chẩn đoán nhầm hoặc bỏ

qua Bệnh da do nhiễm Malassezia spp không tử vong, nhưng gây nhiều

phiền toái ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân, đặc biệt nếukhông điều trị đúng và kịp thời sẽ diễn biến dai dẳng, tiến triển nặng nề

Thực tế, việc xác định nấm bằng phương pháp trực tiếp là bước chẩnđoán sơ bộ quan trọng giúp các bác sỹ đối chiếu với đặc điểm lâm sàng đểquyết định điều trị ngay khi chưa có điều kiện làm kháng nấm đồ Sự tồn tạisong song vi nấm men này trên da người khỏe mạnh và da người bệnh đặt ranhiều giả thuyết khác nhau về đặc tính sinh bệnh học của loài này Một số tác

giả cho rằng, sự xuất hiện của vi nấm trong một số bệnh da không phải tácnhân gây bệnh tiên phát mà chỉ bội nhiễm thứ phát Các nghiên cứu được tiếnhành ở nhiều nơi trên thế giới, nhưng cơ chế gây bệnh của vi nấm vẫn chưathực sự rõ ràng Những hiểu biết hiện tại cho thấy khả năng gây bệnh của vinấm không chỉ dừng lại ở việc chuyển từ dạng men sang dạng sợi như một sốloài nấm khác (Candida ) mà chính là do sự tồn tại một lượng lớn nấm mentrên da thúc đẩy quá trình khởi phát bệnh khi có điều kiện thuận lợi Tuy

nhiên, kiến thức về nấm Malassezia chưa phổ biến ở Việt Nam, cho nên,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát triển và ứng dụng một số kỹ thuật xác

định chủng Malassezia gây bệnh Lang ben nhằm mục tiêu:

1 Đánh giá đặc điểm phân bố các chủng vi nấm Malassezia gây bệnh

lang ben tại một số bệnh viện tại khu vực Hà Nội.

2 Đánh giá đặc điểm phân bố các chủng vi nấm Malassezia trên da

người khỏe mạnh.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Nấm Malassezia

1.1.1 Vài nét lịch sử

Bệnh nấm da nói chung mô tả rất sớm trong lịch sử loài người Năm

1910, Sabouraud là người đầu tiên đưa ra bảng định danh các loài nấm, đặcđiểm lâm sàng và phương pháp điều trị bệnh nấm Từ những năm 40 – 50 củathế ký 19, các tác giả đã ghi nhận vai trò gây bệnh của Pityrosporum và nhậnthấy sự hiện diện của vi nấm trên một số bệnh như: Lang ben, viêm da dầu,viêm nang lông, viêm da cơ địa Cũng trong thời gian đó, Sabouraud đã xác

định vi sinh vật gây hiện tương gầu da đầu cũng có tên gọi là Pityrosporum Còn Louis - Charler lại mô tả vi nấm này dưới tên gọi Malassezia Ban đầu một số nhà khoa học cho rằng hình thái Malassezia là tồn tại dưới dạng sợi

nấm, còn Pityrosporum là hình thái nấm men Năm 1995-1996, thành tựukhoa học công nghệ phát triển nhanh chóng đã ứng dụng thành công trongviệc giải mã trình tự bộ gen của vi nấm này và tìm được 7 loài phụ thuộc

lipid, đặt tên chung là Malassezia spp [16] Hệ thống loài Malassezia tiếp tục

hoàn thiện, đến năm 2004, các nhà khoa học Nhật Bản đã công bố thêm 4 loài

mới: M dermatis và M japonica phân lập từ viêm da cơ địa, M yamatoensis

từ da người khỏe mạnh và một bệnh nhân bị viêm da dầu [2] Một số loài mới

phụ thuộc lipid cũng được mô tả như M nana [3], M caparae, M equina [4],

M cuniculi [5] phân lập từ da động vật, do đó hiện nay tổng số loài được

công nhận lên tới 14 loài

- Tồn tại trạng thái đơn bào, có nhân chuẩn.

- Hình dạng: Là nấm không màu, vách ngăn rộng, hình tròn hoặc hình bầudục, đôi khi gặp dạng sợi hoặc vô định hình

- Kích thước dao động từ 3-10 mm, thông thường lớn hơn gấp 10 lần so với

vi khuẩn

- Sinh sản vô tính theo phương thức nảy chồi Khi bào tử chồi được sinh ratheo dạng tuyến tính không phân cắt thì hình thành nên cấu trúc gọi là giảsợi nấm

- Khả năng thích nghi môi trường đường cao

- Tồn tại trong thiên nhiên, trong các môi trường chứa đường như hoa quả,rau dưa, mật mía…

- Có 14 loài Malassezia spp trên da người và động vật, trong đó 3 loài chính gặp nhiều nhất là M globosa, M sympodialis, M furfur [6], [7], [8].

1.1.3 Cơ chế gây bệnh

Sự xâm nhập diễn ra khi một bào tử nấm nhiễm vào cơ thể ở trạngthái nghỉ không hoạt động, sau đó chuyển hóa trong cơ thể vật chủ, nẩymầm và sinh sản rồi xâm nhập vào mô Mỗi hình thái nấm như: Sợi nấm,bào tử nấm hoặc tế bào nấm men có tính kháng nguyên đặc trưng khácnhau Do đó, khi xâm nhập vào cơ thể nấm gây ra sự đáp ứng miễn dịch

với cơ thể vật chủ và có hai cơ chế bảo vệ: Miễn dịch dịch thể và miễn dịchqua trung gian tế bào [26].

Trong quá trình trao đổi chất vì lý do nào đó è thiếu hụt gen mã hóaEnzym tổng hợp axit béo è vi nấm không tự tổng hợp axit béo è sử dụngnguồn axit béo từ bên ngoài Xu hướng tìm vùng giàu chất bã nhờn: da đầu,

mặt, lưng, ngực Malassezia spp tiết 8 loại Lipase và 3 loại Phospholipaseè

Thủy phân axit béo trung tínhè axit béo tự doè phản ứng trung gian tếbàoè kích hoạt con đường gây viêm [18]

1.1.4 Một số yếu tố thuận lợi

* Yếu tố bên trong:

- Sinh lý: phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh

- Bệnh lý toàn thân: Nhiễm trùng cấp và mạn tính, bệnh chuyển hóa, béophì…Các bệnh lý như bỏng, ung thư, Hodking, nhiễm HIV/AIDS…

- Bệnh lý tại chỗ làm thay đổi tính chất da: Viêm da cơ địa, Rụng tóc, Bạchbiến…

- Sử dụng hóa chất: Dùng kháng sinh phổ rộng, kéo dài làm thay đổi sự cânbằng vi hệ…

* Yếu tố bên ngoài:

- Người già sức đề kháng suy giảm

- Loét do bỏng

- Điều kiện vệ sinh kém, không ý thức bệnh tật hoặc thiếu kiến thức

- Môi trường vi khí hậu thay đổi…

- Ngoài ra thói quen dùng dầu dưỡng tóc, kem chống nắng, môi trường nóng

ẩm… là những yếu tố rất thuận lợi cho vi nấm Malassezia spp phát triển

và gây bệnh

cơ địa những người tăng tiết chất nhờn kết hợp nhiễm nấm Malassezia spp [23], [46] Các nghiên cứu về Malassezia ở bệnh nhân viêm da dầu đều cho

thấy vai trò đặc biệt của nấm men trong cơ chế bệnh sinh của viêm da dầu.Giả thuyết này càng mạnh mẽ khi thấy hiệu quả của các thuốc chống nấm

trong điều trị bệnh, sự giảm số lượng Malassezia sau khi điều trị và trong mỗi đợt bệnh tái phát có sự tái nhiễm của Malassezia Các nghiên cứu trên thế giới

thấy rằng, điều trị viêm da dầu bằng thuốc chống nấm làm giảm số lượng

Malassezia do đó làm cải thiện các triệu chứng lâm sàng của bệnh [30], [42].

 Gầu da đầu

Các biểu hiện trên da đầu mà thường được gọi là "gàu" gây ra bởi nhiều

yếu tố của cơ thể kết hợp với hệ vi nấm Malassezia spp Thật vậy, các nghiên

cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng chính tác dụng của thuốc kháng nấm tương quanvới một tình trạng lâm sàng được cải thiện, khi da khô gặp không khí lạnhtrong suốt mùa đông là nguyên nhân phổ biến nhất của ngứa, bong vẩy gàu ởđầu Đó là một trong những nguyên nhân thường gặp nhất của gàu TheoFlakes những người da khô thường tiết ít dầu hơn so với những người da bình

thường nên dễ bị kích thích tăng tiết nhiều bã nhờn trên da Khi da tăng tiết bã

là tức là bệnh ảnh hưởng không chỉ đến da đầu mà còn xuất hiện trên các bộphận khác của cơ thể, chẳng hạn như lông mày của bạn, hai bên mũi và lưng,xương ức, vùng nách, vùng háng đôi khi gặp ở cánh tay và chân Nếu khônggội đầu thường xuyên thì dầu và các tế bào da từ da đầu có thể phát triển ởcác vùng da khác của cơ thể [42], [29], [21]

 Viêm nang lông

Vi nấm Malassezia gây viêm nang lông với biểu hiện thương tổn

thường lành tính thường gặp như ngứa, mụn mủ, sẩn đỏ nang lông phân bốchủ yếu ở thân mình, lứa tuổi hay gặp là người trung niên và trẻ tuổi Bệnhtuy không nguy hiểm nhưng gây nên tình trạng rất khó chịu cho người bệnh

Năm 1969 một nghiên cứu đã lần đầu tiên mô tả vi nấm Pityrosporum gây

tình trạng viêm nang lông Sau đó, vào năm 1973, Potter đã nhận thấy viêm

nang lông có căn nguyên do vi nấm Malassezia khi ông tiến hành nhiều

phương pháp riêng biệt cùng lúc như: dấu hiệu lâm sàng, nấm học và môbệnh học đều cho kết quả phù hợp Bệnh thường xuất hiện tổn thương mạntính, ban đỏ, sẩn ngứa và mụn mủ Những tổn thương thường biểu hiện vị trí

ở lưng và ngực đôi khi trên cổ, vai, cánh tay hiếm khi hiện diện trên khuônmặt Thông thường rất ngứa, có mụn mủ nhỏ ở da kèm theo ban đỏ Một sốvùng có yếu tố khí hậu ảnh hưởng đến tỷ lệ những người nhiễm vi nấm

Malassezia gây viêm nang lông Những người sống ở vùng khí hậu ấm và ẩm

ướt có tỷ lệ nhiễm cao hơn và ngày càng gia tăng ở vùng này Vi nấm này chủyếu gặp ở tuổi vị thành niên, phổ biến nhất ở những người khoảng 13-45 tuổivới tỷ lệ nữ/nam là 1,5/1 [9]

 Nấm móng do Malassezia spp.

Mặc dù hầu hết các trường hợp của nấm móng gây ra bởi các chủng nấm

da Tuy nhiên, gần đây có nhiều báo cáo trong y văn đã phân lập được

Malassezia spp là căn nguyên gây bệnh nấm móng Tuy móng không phải là

một nguồn thức ăn lý tưởng của vi nấm nhưng do nấm men thiếu khả năng sừnghóa (keratolytic) đồng thời xuất hiện những biến đổi không bình thường trongquá trình sinh trưởng nên chúng xâm chiếm và phá hủy móng, chủ yếu móngtay Tuy nhiên, vẫn có những báo cáo trái ngược nhau xoay quanh vấn đề vi nấm

Malassezia là một tác nhân gây bệnh thực sự ở móng hay không [38].

 Một số biểu hiện khác do nhiễm nấm Malassezia spp

- Malassezia thuộc vi hệ nên vi nấm này có mặt khắp nơi và gây bệnh nhiều

vị trí với các biểu hiện triệu chứng đa dạng trong rất nhiều bệnh cảnh lâm

sàng Malassezia có thể gặp trong viêm da cơ địa và thông thường Malassezia làm trầm trọng thêm tình trạng bệnh Ngoài ra, trong một số

bệnh lý khác: Trứng cá thông thường, U nhú thể mảng, Gaiden, Bạchbiến

- Xâm nhập cơ quan, hệ thống: Người ta đã phát hiện bệnh nhân nằm điều

trị hồi sức tích cực bị nhiễm Malassezia spp huyết Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác đã cùng nhận định Malassezia spp là tác nhân gây bệnh ở phổi,

viêm màng bụng, nhiễm khuẩn huyết qua đặt Catheter [51],[29],[48] Sau

đó, các nhà khoa học thuộc đại học Amsterdam đã tiến hành nuôi cấy, địnhloại nấm và thực hiện kỹ thuật sinh học phân tử đã xác định có hai loài gây

bệnh hệ thống hay gặp: M pachydermatis chiếm khoảng 46% và M furfur

chiếm 63% [40]

- Theo nghiên cứu CDC (1984) nhận thấy vi nấm Malassezia spp gây bệnh

nhiều nơi Khi người ta tiến hành lấy các mẫu từ bệnh phẩm: máu, nước

tiểu, đờm, phân đều có thể phân lập được Malassezia spp với tỷ lệ khá

cao [52],[42]

1.2 Bệnh lang ben

1.2.1 Dịch tễ

Lang ben là một trong những bệnh nấm ở da phổ biến nhất trên thếgiới Tần suất mắc bệnh khác nhau ở mỗi vùng, mỗi khu vực Nơi có khí hậulạnh như Bắc Âu, tỉ lệ gặp bệnh rất thấp xấp xỉ 1% dân số; tuy nhiên tỉ lệ nàylại gặp khá cao ở các nước có khí hậu nóng ẩm, chiếm tới 5% dân số Mặc dùviệc đánh giá chính xác tỉ lệ mắc bệnh là khó, nhưng có thể ước tính tỉ lệ mắcbệnh lang ben vào khoảng 5-8% dân số [10], [11] Theo Hellgren L và cộng

sự, tại trung tâm Thụy Điển, nơi có khí hậu lạnh, thuộc vùng ôn đới, tỉ lệ gặpbệnh chỉ là 0,5% dân số [10] Tại Italy thuộc châu Âu, Indogo V và cộng sựnghiên cứu trên các thủy thủ trẻ tuổi, tỷ lệ gặp 2,1% [10] Các tác giả tạiOntario, Canada thông báo rằng tỉ lệ gặp bệnh khoảng 3% trong số nhữngbệnh nhân đi khám chuyên khoa da liễu [12] Theo Elham Zeinali và cộng sựnghiên cứu 713 người trong 1 năm, tại Tehran, Iran, tỉ lệ mắc bệnh là 9,5%trong số bệnh nhân bị bệnh nấm [13] Mặc dù không có số liệu thống kê về tỉ

lệ mắc bệnh tại khu vực hàn đới, nhưng có thể ước chừng tỉ lệ này dưới 1%dân số Như vậy, tỉ lệ mắc bệnh thay đổi giữa các khu vực khác nhau, trongkhoảng 1-50% dân số, gặp nhiều nhất ở những nước có khí hậu nhiệt đới, vàthấp hơn ở các nước có khí hậu lạnh, nhất là các nước thuộc vùng hàn đới

Việt Nam cũng là một nước nhiệt đới, kiểu khí hậu chủ yếu là nóng ẩmmưa nhiều, có điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của bệnh lang ben Tuynhiên, tại Việt Nam, số lượng nghiên cứu về bệnh không nhiều và cũng chưa

có một nghiên cứu cụ thể nào về tỷ lệ bệnh trong toàn dân Các nghiên cứumang tính chất khu vực, nên chỉ có giá trị tham khảo Theo một số tác giả khiđiều tra về tỉ lệ mắc bệnh da tại xã Vĩnh Phúc, Thanh Trì, Hà Nội thì thấybệnh lang ben chiếm 3,1% số người được khám [14] Theo Phạm Văn Hiển

và cộng sự, tỉ lệ bị bệnh là 3,5% khi nghiên cứu đặc điểm bệnh ngoài da tạiThượng Đình, Hà Nội, tháng 12/1994 [15] Tại Bệnh viện Da liễu TrungƯơng, Hà Nội, tỉ lệ bệnh là 1,76% số bệnh nhân đến khám ở phòng khám,theo Nguyễn Thị Tuyết Mai và cộng sự [16] Bệnh không xuất hiện theo mùa,

có thể gặp quanh năm tuy nhiên có tỉ lệ gặp khá cao vào mùa xuân hè Ở cácnước ôn đới, các tác giả thông báo rằng, tỉ lệ bệnh gặp nhiều nhất vào nhữngtháng mùa hè [12], [17] Ở các nước nhiệt đới, do có điều kiện thời tiết nóng,

ẩm, (một số vùng có thể là khô hạn), bệnh có thể gặp quanh năm, cao nhấtvào khoảng tháng 7,8,9 [18] Tại Việt Nam, theo Nguyễn Thị Tuyết Mai vàcộng sự, tương tự như các nước nhiệt đới khác, bệnh hay gặp vào nhữngtháng cuối hè đầu thu, và những tháng đầu mùa xuân [16]

Bệnh có thể gặp ở bất cứ lứa tuổi nào, từ trẻ nhỏ cho đến người giànhưng hay gặp nhất là tuổi trưởng thành trong khoảng từ 20-40 tuổi [18] ỞOntario, Canada, theo tác giả Gupta, bệnh có thể gặp ở độ tuổi từ 9 đến 75tuổi, độ tuổi trung bình là 36,8 tuổi [12] Theo tác giả Elham Zeinali, ở Iran,bệnh hay gặp nhất ở độ tuổi từ 20-29 tuổi, chiếm 32,3%, ít gặp ở trẻ nhỏ,nhóm tuổi 0-9 tuổi chỉ chiếm 2,9% [13] Trong một nghiên cứu tiến hành tạiBuerarema- BA, Brazil, của tác giả Juliano O.S và cộng sự, độ tuổi hay gặp

là 10-19 tuổi, chiếm 29,5% [19] Nghiên cứu của Abdul-Razak S.H.và cộng

sự ở Bagda, Irag, nhóm tuổi 21-31 gặp nhiều nhất 45,3%, xếp thứ 2 là nhómtuổi 12-21 (31,3%) [20] Theo Nguyễn Thị Tuyết Mai và cộng sự, tuổi haygặp là 15-30 tuổi (56,84%), tương đồng với các nước nhiệt đới nóng ẩm khácnhư Brazil [16]

Bệnh có thể gặp ở cả 2 giới Nhiều tác giả cho rằng tỉ lệ gặp bệnh có xuhướng cân bằng Tại Bosnia, theo Asja Prohic và cộng sự, tỉ lệ nam/nữ là 1/1[17] Theo Bita Tarazoonie và cộng sự, tại Iran, tỉ lệ nam/nữ xấp xỉ 1/1 [21].Tại Iraq, tác giả Abdul- Razak thông báo tỉ lệ nam/nữ xấp xỉ 3/2 [20] Một

nghiên cứu khác của Juliano O.S.tại Brazil, tỉ lệ nam/nữ là 1/2 [19] TheoNguyễn Thị Tuyết Mai và cộng sự, tỉ lệ nam/nữ là 1/1 [16].

1.2.2 Căn nguyên

Năm 1853, C Robin tìm ra trên vảy da của bệnh nhân bị bệnh lang ben,

có một loại nấm, đặt tên là Micosporum furfur Đến năm 1874, Malassez

(1842–1909) đã mô tả tác nhân gây bệnh là những tế bào hình tròn hoặc bầu

dục, phát triển ở lớp sừng của da bệnh nhân lang ben, đặt tên là M furfur Từ

đó, M furfur được coi là căn nguyên duy nhất của bệnh Đầu thập niên 1990,

thành tựu khoa học công nghệ phát triển nhanh chóng đã ứng dụng thànhcông trong việc giải mã trình tự bộ gen của vi nấm này và tìm được 7 loài phụ

thuộc lipid, đặt tên chung là Malassezia spp [16] Năm 2000, F Sanchez nhận ra rằng căn nguyên gây lang ben là M globosa [22].

Ngày nay, nhờ kỹ thuật PCR người ta đã xác định được thêm 6 loài

Malassezia mới có khả năng gây bệnh lang ben là: M dermatis, M japonica,

M yamatoensis, M nana, M caprae, và M equina cùng với 5 loài đã được xác định từ trước gồm: M globosa, M sympodialis, M obtusa, M slooffiae,

M furfur Từ đó, các loài Malassezia đã hoàn chỉnh hơn về cơ cấu và sự phân

bố các loài [1]

Như vậy, căn nguyên gây bệnh lang ben là vi nấm Malassezia.

Theo Guangxi Wu và cs (2015) trên cơ sở phân tích sâu về bộ gen của

M globosa đã phát hiện một hệ thống gồm nhiều enzym phân giải lipid rất đa

dạng có nhiệm vụ quyết định mọi hoạt động và cơ chế sinh bệnh của vi nấm,

bao gồm: Mg Lip1, Mg Lip2, Mg MDL2 Trong đó, Mg Lip2 (Malassezia globosa lipase 2) là enzym quan trọng nhất có khả năng chuyển hóa hầu hết

các chất béo có trong tuyến bã nhờn (trừ triglyceride) và thích hợp với pH tốithuận 6,0 [23], [24] Ngoài ra, một enzym khác được Vullo D và cs báo cáo

carbonic anhydrase (MgCA) có tác động trực tiếp đến các acid amin và aminoacid như adrenalin, serotonin, histamin… [25] Kết quả gây ra quá trình viêm,gặp chủ yếu trong bệnh viêm da dầu và gàu da đầu [26], [27]

Từ thế kỷ 20, M furfur được cho là căn nguyên duy nhất gây bệnh lang

ben Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu tìm hiểu khẳng định vai trò của loàinấm này Đến năm 2013, Preuss J tìm ra enzym chính quyết định hoạt động

phân giải lipid và protein: Malassezia furfur tryptophanaminotransferase

(MfTam1) Enzym này hoạt động ở pH từ 6,0-10,0, tối thuận ở pH 8,0 vànhiệt độ thích hợp 40ºC [28] Điều này cũng giải thích lý do một trong những

điều kiện thuận lợi của lang ben là pH da kiềm Bên cạnh đó, M furfur còn có

khả năng tự tổng hợp melanin nội tế bào [29] Theo Yongchim, trong quá

trình tổng hợp melanin M furfur có khả năng tự kích hoạt L-DOPA để tạo ra

hợp chất giống melanin gây ra các thương tổn sắc tố trên da [29]

Nghiên cứu cơ chế gây bệnh của M sympodialis có nhiều giả thuyết

khác nhau Một trong những giả thuyết được công nhận khi làm sáng tỏ vaitrò của 1→6-β-D-glucan – một kháng nguyên quan trọng có mặt trên vách tế

bào nấm [30] Nhờ đó, M sympodialis tham vào cơ chế bệnh sinh của viêm

da cơ địa gây nên đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào thông qua IgE vàInterleukin [31],[32] Có lẽ điều này liên quan đến các thương tổn dát hồngtrong bệnh lang ben

1.2.3 Đặc điểm lâm sàng

Lang ben điển hình, triệu chứng lâm sàng rất dễ nhận biết Bệnh thườngbắt đầu bằng những chấm hồng, nâu hoặc trắng ở trên da Các chấm lớn dần,lan rộng và liên kết với nhau thành mảng ranh giới rõ rệt với da lành Thươngtổn có hình bầu dục hoặc đa cung Kích thước đám thương tổn có từ 1-3 cmđường kính Bề mặt có những vảy nhỏ, cạo bong ra dễ dàng được gọi là dấuhiệu “vỏ bào”

Bệnh đặc trưng bởi những dát có ranh giới rõ ràng với da lành, trên có vảy

da mỏng như cám Dát này có thể là tăng sắc tố hoặc giảm sắc tố, có khi là dáthồng, chúng có khả năng liên kết lại với nhau và lan rộng trên bề mặt da

Khi soi thương tổn trong phòng tối bằng ánh sáng của đèn Wood,thương tổn sẽ phát sáng màu vàng lưu huỳnh, kể cả những thương tổn khôngthấy được dưới ánh sáng mặt trời

Thương tổn lang ben có thể gặp ở mọi vị trí trên cơ thể M furfur phát triển ở một số vùng da thuận lợi có độ ẩm, pH kiềm M globosa phát triển ở

điều kiện da bình thường, khả năng gây bệnh ở mọi vị trí trên cơ thể, hay gặpvùng da tiết nhiều bã nhờn

Những vảy mỏng trên da tổn thương xuất hiện nhiều hơn khi căng dahoặc cạo da Vị trí các tổn thương phản ánh sự phân bố các loài nấm da ưa mỡ

tự nhiên và xuất hiện nhiều hơn ở những vùng da giàu bã nhờn Vì vậy, dátthường xuất hiện ở thân mình và có thể lan rộng Vị trí thường gặp ở lưng,ngực, cổ, ít gặp hơn là các chi và da đầu Tuy nhiên, các thương tổn có thể lanrộng trên nhiều vùng của cơ thể, trừ lòng bàn tay, bàn chân

Thương tổn không đau, có thể không ngứa hoặc ngứa ít, ngứa tăng lênkhi ra mồ hôi

Nguyên nhân chủ yếu là do trong quá trình gây bệnh, nấm Malassezia tạo

ra các sản phẩm ức chế cạnh tranh với tyrosinase làm giảm sản xuấtmelanin và gây độc trực tiếp tế bào sắc tố

+ Thể tăng sắc tố: đặc trưng bởi các dát nâu (dát tăng sắc tố), hay gặp ởlưng, ngực, tổn thương thường lan rộng trên một vùng cơ thể, ít khi đơnđộc mà thành đám thương tổn, quan sát thấy rõ bằng mắt thường, dấu hiệu

vỏ bào (+) Nguyên nhân là do tuy số lượng của các tế bào sắc tố ở vùngthương tổn không tăng so với vùng da lành nhưng các hạt melanosometrong các tế bào sắc tố to ra làm tăng cường sản xuất sắc tố melanin

+ Thể viêm: thương tổn là các dát màu hồng nhạt (dát viêm hay tăng, giảm

sắc tố) Hiện tượng này do Malassezia tương tác với da gây nên quá trình

viêm giải phóng các cytokin, chymokin, kích thích sản xuất cácinterleukin Tổn thương thường lan rộng trên một vùng cơ thể, vảy da khóquan sát bằng mắt thường, khi nạo bằng thìa cùn có thể thấy vảy da

+ Thể theo vị trí tổn thương: Thể thông thường xuất hiện ở vùng lưng, ngực,

có thể mặt Thể Lang ben ở các đầu chi như cẳng tay, cẳng chân nhất làbàn tay, bàn chân được coi là thể đặc biệt (thể đầu chi) Tổn thương củathể này tương tự thể thông thường, các dát thường đứng đơn độc ở mặt mutay, mu chân, không bao giờ thấy tổn thương ở lòng bàn tay, bàn chân.+ Thể theo hình thái tổn thương: hình vòng cung (circinate), thể teo(atrophic)

+ Thể theo tuổi: bệnh ít gặp ở trẻ em, thương tổn thường là các dát trắng,xuất hiện ở mặt, cổ, đứng đơn độc hoặc thành đám tổn thương Thể langben gặp ở người già, thương tổn có thể là dát trắng hoặc nâu, thường xuấthiện ở vị trí điển hình lưng, ngực, bệnh tiến triển trong thời gian dài, đứngđơn độc hoặc thành đám tổn thương

+ Thể đảo ngược: Thường gặp ở vị trí các mặt gấp ở tay và chân

+ Thể viêm nang lông do pityrosporum: chủ yếu ở phụ nữ trẻ, đặc trưng bởicác sẩn và mụn mủ ở nang lông, kèm theo triệu chứng cơ năng ngứa Vị trígặp ở thân mình, cánh tay, cổ và ít khi ở mặt Nguyên nhân do trong nang

lông M furfur và M globosa phát triển quá mức tạo ra các sản phẩm

trung gian từ các sản phẩm của nấm men và các acid béo tự do được sảnxuất từ men lipase của nấm Chính điều này gây ra biểu hiện viêm.Ngoài ra quá trình viêm còn liên quan chặt chẽ tới yếu tố Ahr do nấmkích thích sản xuất Xét nghiệm chỉ thấy dạng bào tử của nấm men màkhông thấy dạng sợi

ở thương tổn giảm sắc tố

- Khi soi thương tổn trong phòng tối bằng ánh sáng của đèn Wood, thươngtổn sẽ phát sáng màu vàng lưu huỳnh, kể cả những thương tổn không thấyđược dưới ánh sáng mặt trời

- Soi trực tiếp dưới kính hiển vi: thấy bào tử nấm và sợi nấm đứng gần nhau,giống hình ảnh “mỳ spaghetti và thịt viên”

- Nuôi cấy định danh và PCR sequencing xác định chính xác loài

Malassezia gây bệnh.

1.2.5 Chẩn đoán xác định

 Biểu hiện lâm sàng

- Thông thường thể điển hình dễ nhận biết hình thái lâm sàng:

+ Đám vảy da ranh giới rõ từ trắng, hồng đến nâu hoặc hỗn hợp

+ Thương tổn mất sắc tố

+ Sẩn mày đay nang lông

- Vị trí: chủ yếu vùng cổ, ngực, lưng, liên bả cột sống, có thể lan ra vai,cánh tay, và vùng bụng, đùi Hiếm khi thấy cẳng tay, cẳng chân, hầu nhưkhông thấy lòng bàn tay, bàn chân

- Soi đèn Wood: Phát quang dưới ánh đèn wood màu vàng lưu huỳnh, kể cảthương tổn mắt thường không nhìn thấy

- Cơ năng: ngứa khi ra mồ hôi

 Cận lâm sàng

- Xét nghiệm trực tiếp: Dùng KOH 20% + ParkerTM blue black ink tỷ lệ (1:2)soi trực tiếp dưới kính hiển vi Nhận định hình thái, số lượng và mật độ

Malassezia.

- Nuôi cấy và định danh loài Malassezia gây bệnh.

- PCR sequencing: dựa trên đoạn DNA đặc trưng nhằm xác định loài nấm 1.2.6 Chẩn đoán phân biệt

- Chàm khô (Pityriasis alba): thương tổn là dát giảm sắc tố trên có vảy phấn.Kích thước đám thương tổn từ 1-2 cm đường kính Vị trí khu trú ở mặt,cánh tay, cẳng tay

- Giảm sắc tố sau viêm của các bệnh lý khác

- Bạch biến: dát trắng ranh giới rõ, bờ thẫm màu, thường đối xứng, không

có vảy, liên quan đến các bệnh lý tự miễn

- Phong thể I: dát trắng mất cảm giác đau và nóng, lạnh

- Viêm da dầu: thường gặp ở vùng da đầu, thương tổn cơ bản là các dát đỏ,trên có vảy da kèm theo gàu ở da đầu

- Vảy phấn hồng Gilbert: thường gặp ở trẻ em, thương tổn là dát màu hồng,xung quanh gờ cao, có vảy phấn, ở giữa hơi lõm Thương tổn thường ởvùng mạng sườn hoặc đùi Bệnh tự khỏi sau 4-6 tuần

- Nấm thân mình: điển hình là bệnh hắc lào, dấu hiệu đầu tiên là ngứa vùng

bị bệnh, sau đó thấy một vệt màu hơi đỏ, có viền, bờ rõ rệt, trên viền đó cócác mụn nước lấm tấm, lan rộng tạo thành nhiều hình vòng cung

- Giang mai II: Dát trắng, đen trong thời kỳ II của giang mai là vết tích củađào ban giang mai II, kèm theo sưng hạch ngoại vi không đau Xét nghiệmhuyết thanh chẩn đoán giang mai dương tính

- Vảy nến thể giọt: dát đỏ ranh giới rõ, trên có vảy da dễ bong Vị trí tậptrung vùng tì đè

- Viêm nang lông do nguyên nhân khác, đặc biệt viêm nang lông có ngứa vàtrứng cá

1.2.7 Điều trị

Điều trị bệnh lang ben tuy không khó nhưng bệnh hay tái phát, có thể

do việc dùng thuốc không đúng và đủ liều hoặc bệnh nhân thực hiện phòngbệnh chưa đúng cách Ngoài ra, bệnh còn tái phát do sự thay đổi các thànhphần hóa học, tính chất da và một số yếu tố thuận lợi khiến bệnh phát sinh,phát triển [33], [34]

Nếu bệnh nhân dùng thuốc bôi tại chỗ có thể bỏ sót thương tổn và khóbôi thuốc trên diện rộng Còn nếu bệnh nhân uống thuốc, có nhiều phác đồkhác nhau, tùy thuộc vào mức độ nhạy cảm của từng chủng nấm với khángsinh chống nấm mà lựa chọn cho phù hợp Tuy nhiên, điều này phụ thuộctừng vào khả năng của từng phòng xét nghiệm có thể định danh và làm khángnấm đồ…Vì vây, các tác giả khuyến cáo nên phối hợp 2 phương pháp điều trị:tắm gội toàn thân và uống cho bệnh nhân [34]

+ Điều trị tại chỗ

Áp dụng với hầu hết bệnh nhân có thương tổn ít, khu trú Các thuốc sửdụng bao gồm: kem hoặc dầu gội kháng nấm có chứa imidazole (ví dụ nhưketoconazole), kẽm, selen sulfit, và chứa acid salicylic sulfur Liệu trình điềutrị tại chỗ có thể kéo dài một đến vài tuần, sau đó nhắc lại 1-2 tuần tiếp Thậmchí ngày nay, người ta còn sử dụng diclofenac và adaphtalen bôi tại chỗ Một

số phương pháp khác cũng có thể áp dụng như: tắm xà phòng satid ngày 1 lầntrong 3 tuần, gel Daktarin mỗi ngày bôi 2 lần trong 2-3 tuần

Phác đồ đầu tay là dùng dầu gội có chứa ketoconazole Cách dùng xoatắm và gội hàng ngày trong 2 tuần, mỗi lần lưu dầu trong 5-10 phút [10], [34]

+ Điều trị toàn thân

Khi điều trị tại chỗ không có kết quả hoặc chưa đạt được như mongmuốn, bệnh tái phát trở lại, điều trị toàn thân được xem xét cho liệu trình điềutrị tiếp theo hoặc có thể phối hợp ngay từ đầu đối với một số thể bệnh ở mức

độ vừa và nặng…[34]

Có thể dùng 1 trong 2 phác đồ: fluconazole 300mg/ tuần, trong thờigian 2 tuần, hoặc dùng itraconazole hàng ngày trong 5 đến 7 ngày [35], [34].Việc sử dụng phác đồ nào tùy thuộc vào sự cân nhắc của bác sĩ và bệnh nhân,thực tế tỉ lệ chữa khỏi của fluconazole và itraconazole không có sự khác biệt.Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đều khẳng định dùng phác đồ Fluconazole liềungắt quãng tỷ lệ tái phát giảm rõ rệt [33]

Liệu pháp điều trị toàn thân có nhiều tác dụng phụ hơn Imidazole vàtriazole (ví dụ như fluconazole và itraconazole) đều được chuyển hóa quacytochrome P450 cho nên có thể xảy ra sự tương tác thuốc, vì vậy cần tránhdùng cho bệnh nhân đang sử dụng astermizole Terbinafin có thể gây nên cácbiến cố tim mạch [36] Intraconazole đường uống cũng có ảnh hưởng đến tình

trạng nhiễm độc gan và suy tim sung huyết nên cần tránh sử dụng cho bệnhnhân đang có bệnh lý gan hoặc có tiền sử suy tim sung huyết Những tác dụngphụ nguy hiểm ít gặp hơn đối với Fluconazole đường uống.

1.3 Các phương pháp chẩn đoán Malassezia trong bệnh lang ben

1.3.1 Phương pháp xét nghiệm trực tiếp

1.3.1.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm

Các xét nghiệm soi trực tiếp có tầm quan trọng trong việc nhận định

hình thái và số lượng Malassezia nhưng chỉ mang tính tương đối Tuy nhiên phần nào đã chứng tỏ sự hiện diện vi nấm Malassezia tồn tại vi hệ đã trở

thành tác nhân gây bệnh cơ hội trên một số bệnh da Theo một số tác giả vấn

đề nuôi cấy không cần thiết đối với các bệnh phẩm lâm sàng không chỉ bởithời gian mọc chậm mà vi nấm khó mọc và đòi hỏi môi trường đăc biệt Quanđiểm này phù hợp với nghiên cứu V Silva và cộng sự cho biết tầm quan trọngcủa xét nghiệm trực tiếp tìm nấm cho kết quả chẩn đoán sơ bộ nhanh, chínhxác nhưng cũng đòi hỏi kinh nghiệm Bên cạnh đó, trong y văn cũng đề cậptới một số phương pháp xét nghiệm khác có độ nhạy và đặc hiệu cao như:miễn dịch học, PCR…

Nghiên cứu của Husein M và cs (2010) so sánh hiệu quả xét nghiệmchẩn đoán lang ben của 2 phương pháp băng dính trong và dao cùn(phương pháp KOH chuẩn) [37] Nghiên cứu tiến hành trên 50 bệnh nhânlang ben, tiến hành song song 2 phương pháp trên cùng 1 thương tổn củabệnh nhân Kết quả cho thấy, phương pháp sử dụng băng dính cho tỉ lệ pháthiện tế bào nấm men cao hơn dao cùn Ngoài ra tác giả cũng nhận thấybăng dính có nhiều ưu điểm hơn như không gây các sang chấn tổn thương

da, rút ngắn được thời gian xét nghiệm và có thể sử dụng được cho nhiềuđối tượng khác nhau

Gần đây, nghiên cứu của B Navya và Saroj Golia (2017) phát triểnphương pháp băng dính trên các bệnh nấm nông nói chung [38] Tác giả sosánh với phương pháp sử dụng KOH tiêu chuẩn trên 250 mẫu bệnh phẩmtrong đó có 71 mẫu từ bệnh nhân lang ben Kết quả thu được băng dính làhiệu quả hơn KOH tiêu chuẩn với tỉ lệ dương tính 96,4% Đồng thời, băngdính cũng cho kết quả nhanh hơn 15-20 phút so với phương pháp dao cùn

Tại Việt Nam, trong y học, băng dính được ứng dụng như một phươngpháp sử dụng thuốc tại chỗ hay để hàn gắn vết thương Nhận thấy được tiềmnăng hiệu quả của băng dính, tuy nhiên, trong xét nghiệm nấm, băng dính vẫnchưa được áp dụng rộng rãi

 Ưu, nhược điểm của phương pháp băng dính

Kỹ thuật lấy bệnh phẩm đóng vai trò quyết định trong giá trị của xétnghiệm soi trực tiếp tìm nấm Đây là bước đầu tiên quan trọng, phụ thuộcnhiều vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên Hiện nay tại phòng Nấm khoa xétnghiệm Vi sinh nấm ký sinh trùng chúng tôi đang áp dụng kỹ thuật dùng băngdính để lấy bệnh phẩm Kỹ thuật này mang lại nhiều ưu điểm như dễ dàngthực hiện nhất là đối với trẻ nhỏ đồng thời áp dụng được với nhiều loại tổnthương khác nhau, kể cả ở vùng bán niêm mạc như quy đầu Nếu như dùngdao cùn, chúng tôi phải hấp sấy dụng cụ thường xuyên để đảm bảo đủ tiêuchuẩn xét nghiệm, đồng thời, kỹ thuật viên phải được tập huấn thực hànhthành thạo kỹ năng sử dụng dao cùn này với từng loại thương tổn khác nhau.Các thương tổn vảy da do nấm thường mỏng, là nấm sợi thì thường khó bong,còn nấm men, đa phần vảy da mỏng, ẩm, dễ bong, khó quan sát thấy bằng mắtthường Điểm hạn chế của việc sử dụng dao cùn là khi cạo đôi khi không lấyhết được vảy da của bệnh nhân làm ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm Nhiều

trường hợp chúng tôi gặp bệnh nhân than phiền về việc sử dụng dao cùn gâykhó chịu cho họ, nhất là gây tăng cảm giác đau rát

Đối với kỹ thuật sử dụng băng dính, chúng tôi thấy dễ dàng hơn trongtiếp cận với thương tổn của bệnh nhân Băng dính có thể sử dụng được trongrất nhiều trường hợp mà trước đây dao cùn gặp khó khăn như những thươngtổn ở nếp kẽ trẻ sơ sinh, ở mặt của trẻ nhỏ Hầu hết trẻ nhỏ luôn mang tâm lý

sợ bác sĩ cũng như kỹ thuật viên, khi nhìn thấy dao cùn đôi khi làm tăng cảmgiác sợ hãi, trẻ quấy khóc, vận động mạnh gây khó khăn cho lấy bệnh phẩm,đôi khi sử dụng dao cùn có thể làm tổn thương trẻ Kỹ thuật sử dụng băngdính tương đối nhẹ nhàng, không đau đớn, không gây nguy hiểm gì cho trẻ.Chúng tôi sử dụng loại băng dính thông thường có sẵn ngoài thị trường Saukhi lấy bệnh phẩm, băng dính đươc sử dụng trực tiếp để nhuộm soi cho nên

sử dụng loại băng dính trong mang lại hiệu quả tốt hơn

Hơn nữa, Malassezia là nấm men thuộc vi hệ Sử dụng dao cùn có thể

lấy được bệnh phẩm trên một diện tích rất lớn Tuy nhiên, để đánh giá một vinấm thuộc vi hệ có gây bệnh hay không, mật độ và số lượng là tiêu chí quantrọng hơn Với tiêu chí này, băng dính lấy bệnh phẩm trên một diện tích danhất định, cho nên chúng ta hoàn toàn có thể đánh giá được mức độ gây bệnhcủa vi nấm, mang lại nhiều thông tin hơn giúp các bác sĩ lâm sàng đưa ra cácquyết định chẩn đoán chính xác và điều trị tốt hơn cho bệnh nhân

Bên cạnh đó, chúng tôi cũng áp dụng phương pháp lấy bệnh phẩm bằngbăng dính này cho kỹ thuật nuôi cấy

1.3.1.2 Hóa chất nhuộm soi

Phương pháp soi tìm nấm trực tiếp dưới kính hiển vi được áp dụng phổbiến trong hơn 150 năm qua từ khi được Malassez mô tả năm 1874 Hình tháiđiển hình quan sát được là những sợi nấm thô ngắn đứng thành đám như “mìống” và “ thịt viên” Bên cạnh đó hình thái sợi nấm thoái hóa hoặc tế bào nấmmen cũng được nhiều tác giả mô tả Phương pháp này cho kết quả nhanh,giúp bác sĩ lâm sàng nhận diện hình thái có vi nấm trên tổn thương Thời gianđọc kết quả tùy thuộc vào kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp

Dung dịch KOH với các nồng độ khác nhau, thường được dùng vớinồng độ 20%, hoặc 10% là dung dịch có tính kiềm mạnh, thấm tốt vào lớp

sừng giúp làm mềm và trong tổ chức, bộc lộ hình thái vi nấm, tuy nhiên dùngKOH đơn thuần rất khó nhận định hình thái, dễ bỏ sót Sử dụng NaOH manglại nhiều ưu điểm hơn vì tác dụng mạnh và nhanh hơn.

Các tác giả cải tiến phương pháp nhuộm soi đơn thuần bằng thêm cáchthêm một loại mực đóng vai trò như một chất màu có ái tính cao với tế bàonấm Các loại mực có thể được dùng bao gồm: parkerTM blue black, parkerTM

ink, Chicago sky blue 6B , calcofluor white Nghiên cứu của N Lodha và S

A Poojary (2015) so sánh mực Chicago sky blue 6B và KOH 10% có độtương đồng 94% với hệ số kappa 0,38 (mức độ tương đồng thấp) [39] Nghiêncứu của A Noviandini và cs (2017) khi so sánh KOH và parkerTM blue black(KB) với Chicago sky blue 6B (CBS) cho thấy tỉ lệ chẩn đoán đúng tronglang ben là tương đương nhau 100% [40] Nghiên cứu của Rathnapriya N và

cs cho thấy KB và KOH 10% có độ nhạy tương đương nhau [41]

Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành kỹ thuật soi trực tiếp bằng NaOH10% kết hợp mực ParkerTM blue black Đây là kỹ thuật có thể áp dụng rộng rãi

và hữu ích trong chẩn đoán cận lâm sàng: (a) Thời gian cho kết quả nhanh, (b)Nhận định hình thái vi nấm rõ nét và dễ dàng hơn, (c) Tránh bỏ sót vi nấmkhi soi trực tiếp, (d) Đánh giá mật độ tập trung của vi nấm chính xác

 Ưu nhược điểm của kỹ thuật NaOH kết hợp Parker blue black ink trong chẩn đoán lang ben

Khi kết hợp NaOH 10%+ Parker Blue Black ink tỉ lệ 2:1, chúng tôithấy nhiều ưu điểm:

+ Thao tác đơn giản, rút ngắn thời gian

+ Dễ dàng quan sát hình thái nấm do vừa làm mềm biểu bì nhanh, đồngthời mực PI giúp bắt màu vi nấm kể cả sợi nấm hay tế bào nấm thaoishóa ngay cả khi bệnh nhân đã từng dùng thuốc diệt nấm

+ Không cần thêm Glycerin vì dung dịch PI có khả năng bôi trơn rất tốt

Do đó khi để lam kính trong một thời gian rất lâu vẫn không có hiệntượng kết tinh

+ Hóa chất tự pha chế, dễ tìm mua ngoài thị trường

+ Xét nghiệm có tính chất định tính bán định lượng

+ Định hướng chẩn đoán lâm sàng

+ Có thể áp dụng đào tạo và triển khai rộng rãi ở tuyến y tế cơ sở

Bảng 1.2 So sánh soi trực tiếp tìm Malassezia bằng NaOH+BI và KOH

Thời gian trả kết quả Sau 1-2h Sau 30 phút-1h

- Chỉ có tác dụng làmtrong và mềm biểu mô

NaOH 20%

- Tác dụng mạnh vànhanh hơn vì là Bazomạnh nhất

Blue black ink

- Tạo nền màu tươngphản, nhuộm màu sợinấm xanh tím và tạonền vi trường màu tốinên khi quan sát khôngmỏi mắt

- Có ái tính với tế bàonấm men

Nhận định kết quả - Khó quan sát khi sợi

nấm thoái hóa

- Khó nhận định tế bàonấm men

- Có thể nhầm lẫn sợinấm với nấm hoại sinh,vách tế bào sừng, hoặc

tế bào men với bongkhí, bóng hơi

- Kỹ thuật viên xétnghiệm phải có kinhnghiệm

- Quan sát được sợinấm thoái hóa

- Nhận định được sốlượng, mật độ, hình thái

tế bào nấm men

- Phân biệt được cáccấu trúc nấm men vớivách tế bào sừng, bónghơi, tế bào mỡ

- Kỹ thuật viên xétnghiệm dễ dàng thựchiện

1.3.2 Nuôi cấy định danh

1.3.2.1 Môi trường nuôi cấy

Nuôi cấy, định loại luôn được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong xác địnhcăn nguyên vi vinh vật nói chung, trong đó đặc biệt xác định chính xác loài

Malassezia gây bệnh Bệnh phẩm là vảy da của bệnh nhân lang ben Các môi

trường nuôi cấy có thể sử dụng bao gồm: thạch Sabouraud, thạch m-Dixon, thạch Leeming- Notman Lần đầu tiên Sabouraud nuôi cấy trên môi

trường cấy nấm thông thường tuy nhiên Malassezia phát triển rất kém, hầu như không mọc Chỉ duy nhất M pachydermatis mọc trên môi trường này bởi

chúng phát triển không cần lipid

Dựa vào đặc tính ưa lipid, Sabouraud cải tiến thành m-Dixon phủ thêm

dầu oliu với nồng độ 1% Sabouraud phát hiện 7 loài bao gồm: M furfur,

M pachydermatis, M restricta, M sympodialis, M slooffiae, M globosa,

M obtusa [42], [43] Trên môi trường này, khuẩn lạc có thể thu được sau 2-3

ngày nuôi cấy với nhiều hình thái khác nhau Tuy nhiên, để phân biệt hình

thái khuẩn lạc giữa các loài Malassezia là tương đối khó khăn, bởi hình ảnh

đại thể gần như giống nhau giữa các loài Môi trường Leeming- Notman cũngđưa vào sử dụng và thu được hình ảnh khuẩn lạc trơn, màu hồng đến tím đậm

Trong đó M furfur, M sympodialis, M slooffiae phát triển tốt, M globosa và

M obtusa phát triển kém hơn, M restricta phát triển rất kém

Bảng 1.3 Đặc điểm các môi trường thường dùng trong nuôi cấy

Malassezia [44]

Thạch Dixon 36g đường malt, 6g peptone, 20g bile, 10ml Tween

40, 2 mL lycerol, 2 mL acid oleic và 12 g thạchThạch

Leeming-Notman

10 g peptone, 5 g glucose, 0.1 g nấm men, 4 g mật,

1 mL glycerol, 0,5 g glycerol monostearate, 0.5 mlTween 60, 10 ml sữa and 12 g thạch

Môi trường Ushijima

(M pachydermatis)

10 g trypticase peptone (BBL), 5 g nấm men, 3 gglucose, 2 g NaCl, 12 g KH2 PO4 (khan), 15 gthạch, 0,1 g ampicillin, và 0,25 g cycloheximide;

pH 5,5Thạch CHROM sửa

và một số tính chất sinh hóa trên một số môi trường khác được đưa vào sử

dụng như một phương pháp định danh Malassezia chủ yếu ở Nhật [46] Kaneko dựa trên sự phát triển của Malassezia trong môi trường thạch

CHROM, đồng thời các phản ứng với Catalase, Cremophor Esculin để xác

định được 7 loài: M furfur, M sympodialis, M globosa, M obtusa, M slooffiae, M restricta và M pachydermatis [46], [47]

Gần đây, phương pháp nhận định khả năng sản xuất chất kết tủa Tween 40

dựa trên các môi trường thạch CHROM Malassezia, thạch dextrose của

Sabouraud, Cremophor EL, Tween 60 và phản ứng Catalase được dùng để

phân biệt 9 loài Malassezia bao gồm 7 loài trên cộng thêm 2 loài M dermatis

và M japonica [48], [47]

Bảng 1.4 Đặc điểm kiểu hình của 14 loài Malassezia dựa trên đặc tính

sinh lý và sinh hóa

Loài Malassezia

Tài liệu tham khảo

SD A 32

Catalas e 32

M globosa - + -/± - - -/IGP -/IGP - - - + [43]

M restricta - + + - - -/IGP -/IGP - - - - [43]

M caparae - + -/± - -/IGP +/IGP +/IGP IGP+/- - +/- IGP + [53]

M

pachydermatis +/± + + + +/IGP + + + +/IGP +/- IGP +/± [55]

(SDA: thạch Sabouraud dextrose, mDA: thạch Dixon cải tiến, Tween: thạchSabouraud có chứa lipid, Cremphor EL: thạch Dixon có chứa lipid, v: có giátrị, IGP: không mọc (hoặc hiếm khi mọc), NE: không xác định được)

Trên thực tế khi quan sát đại thể và vi thể, xét về mặt hình thái học, các

loài Malassezia tương đối giống nhau nên phân định khá khó Các tác giả sử

dụng các tính chất sinh lý sinh hóa và sự phát triển ở các điều kiện nhiệt độkhác nhau từng loài để xác định chính xác loài Sabouraud phát hiện một số

đặc tính ưa nhiệt độ chọn lọc khác nhau tùy loài: M globosa, M obtusa và M restricta phát triển tốt ở 32oC, nhưng ở 37oC chúng hầu như không phát triểnhoặc phát triển rất yếu Phản ứng Catalase âm tính được coi như bước quan

trọng để xác định loài M restricta Tuy nhiên, với các loài khác, thử nghiệm quan trọng định danh một số loài ưa lipid: M furfur, M yamatoensis, M dermatis, M slooffiae, M japonica, M globosa, M obtusa, M cuniculi, M sympodialis là sử dụng các loại Tween khác nhau ở thành phần acid béo trong

đó Tween 20 có acid lauric, Tween 40 có acid palmitic, Tween 60 có acidstearic và Tween 80 có acid oleic

Dựa trên khả năng hấp thu khác nhau với các loại Tween trên để xác

định các loài Malassezia: M furfur, M yamatoensis, M dermatis hấp thu cả 4 loại Tween; M globosa, M obtusa, M dermatis không hấp thu cả 4 loại Tween; M sympodialis hấp thu yếu hoặc không hấp thu Tween 20; M slooffiae hấp thu yếu hoặc không hấp thu Tween 80, M japonica hấp thu 2

loại Tween 40 và Tween 60

Ngoài ra, để xác định hình thái và tính chất khuẩn lạc, các tác giả

khuyến nghị sử dụng môi trường CHROM agar Malassezia Kết quả thu được

M furfur đặc trưng bởi khuẩn lạc màu hồng nhạt và có nếp nhăn; M dermatis với khuẩn lạc hồng nhạt và trơn; M yamatoensis không tạo khuẩn lạc đặc trưng, M globosa tạo khuẩn lạc tím và trơn; M obtusa với khuẩn lạc hồng và trơn; M cuniculi không tạo được khuẩn lạc đặc trưng.