CẢI TIẾN kỹ THUẬT SOI TRỰC TIẾP tìm nấm MALASSEZIA

BỘ Y TẾ BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNGCẢI TIẾN KỸ THUẬT SOI TRỰC TIẾP TÌM NẤM MALASSEZIA Người thực hiện: Chủ nhiệm: Ths.Bs.. Tuy nhiên, thực tế lấybệnh phẩm bằng dao cùn đôi khi gây tâm

BỘ Y TẾ BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG

CẢI TIẾN KỸ THUẬT SOI TRỰC TIẾP

TÌM NẤM MALASSEZIA

Người thực hiện:

Chủ nhiệm: Ths.Bs Trần Cẩm Vân Thư ký: CN Trần Kim Chi

Hà Nội, tháng 12 năm 2017

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

M caparae : Malassezia caparae

M cuniculi : Malassezia cunniculi

M dermatis : Malassezia dermatis

M equina : Malassezia equina

M furfur : Malassezia furfur

M globosa : Malassezia globosa

M japonica : Malassezia japonica

M nana : Malassezia nana

M obtusa : Malassezia obtusa

M pachydermatis : Malassezia pachydermatis

M restricta : Malassezia restricta

M slooffiae : Malassezia slooffiae

M sympodialis : Malassezia sympodialis Malassezia spp : Malassezia species plus

P orbiculair : Pityrosporum orbiculair

P ovale : Pityrosporum ovale

BI : ParkerTM Blue Black inkTB/VT : Tế bào/Vi trường

MỤC LỤC

IỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ

Malassezia spp là nấm men thuộc vi hệ da người và

động vật Vi nấm được biết đến hơn 150 năm qua, đóng vaitrò là căn nguyên cũng như bội nhiễm thứ phát trong nhiều

bệnh lý khác nhau Malassezia có 14 loài, mỗi loài có độc tính

riêng nên khả năng gây bệnh đa dạng: Lang ben, viêm da

dầu, viêm da cơ địa, viêm nang lông Bệnh biểu hiện các

triệu chứng lâm sàng như: Ngứa, đỏ da, bong vẩy,…Thươngtổn có thể gặp bất kỳ vùng nào trên cơ thể nhưng thôngthường khu trú vùng tiết nhiều bã nhờn như: da đầu, lưng,ngực, mặt Ngoài ra, có thể gặp ở nếp kẽ, nang lông, vùngmóng…thậm chí vi nấm xâm nhập các cơ quan, bộ phận gâynhiễm nấm nội tạng, nhiễm nấm huyết Do đó, nếu thiếu điềukiện xét nghiệm dễ dẫn đến chẩn đoán nhầm hoặc bỏ qua Tại Bệnh viện Da liễu Trung Ương, bệnh nhân đến khám

và làm xét nghiệm tìm nấm rất đông và đa dạng Mỗi năm cókhoảng 30.000.000 lượt đến khám và xét nghiệm nấm trong

đó tỉ lệ dương tính khoảng 60% Theo Trần Cẩm Vân và cs

(2012), tỉ lệ nhiễm Malassezia trong lang ben cao nhất 1,48%,

tiếp theo là viêm da dầu chiếm 0,37%, ít nhất là viêm da cơđịa 0,28% trong tổng số bệnh nhân đến khám bệnh [1] Bệnh

da do nhiễm Malassezia không tử vong, nhưng gây nhiều

phiền toái ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnhnhân, đặc biệt nếu không điều trị đúng và kịp thời sẽ diễnbiến dai dẳng, tiến triển nặng nề

Thực tế, việc xác định nấm bằng phương pháp trực tiếp làbước chẩn đoán sơ bộ quan trọng giúp các bác sỹ đối chiếuvới đặc điểm lâm sàng để quyết định điều trị ngay khi chưa cóđiều kiện làm kháng nấm đồ Trong đó lấy bệnh phẩm là bướcđầu tiên quan trọng để xét nghiệm chính xác căn nguyên gâybệnh Đối với nấm da, hiện nay các phòng thí nghiệm thườnglấy bệnh phẩm vảy da bằng dao cùn Kỹ thuật này tương đốihiệu quả trong đa phần các trường hợp Tuy nhiên, thực tế lấybệnh phẩm bằng dao cùn đôi khi gây tâm lý sợ hãi không hợptác của trẻ nhỏ đối với kỹ thuật viên thực hiện, thậm chí, hiệuquả không cao trong một số trường hợp thương tổn ở vị tríđặc biệt như mặt, nếp kẽ, sinh dục Gần đây, tại phòng xétnghiệm Nấm khoa Vi sinh Nấm Ký sinh trùng Bệnh viện Daliễu Trung Ương, chúng tôi áp dụng kỹ thuật lấy bệnh phẩmbằng băng dính để xét nghiệm các loại vi nấm men gây bệnhnấm nông Đây là kỹ thuật mới, chưa được áp dụng rộng rãitrong tất cả các trường hợp bị nấm Để phục vụ tốt hơn chocông tác chẩn đoán và điều trị bệnh nhân, chúng tôi tiến

hành: “Cải tiến kỹ thuật soi trực tiếp tìm Malassezia tại

Bệnh viện Da liễu Trung Ương”.

Mục tiêu:

1. So sánh hiệu quả kỹ thuật soi trực tiếp tìm Malassezia bằng băng dính và dao cùn có sử dụng hóa chất NaOH + Parker TM blue black ink trên bệnh nhân lang ben và người khỏe mạnh tình nguyện

2. Xây dựng quy trình soi trực tiếp tìm Malassezia cải tiến

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nấm Malassezia

1.1.1 Vài nét lịch sử

Bệnh nấm da nói chung mô tả rất sớm trong lịch sử loàingười Năm 1910, Sabouraud là người đầu tiên đưa ra bảngđịnh danh các loài nấm, đặc điểm lâm sàng và phương phápđiều trị bệnh nấm Từ những năm 40 – 50 của thế ký 19, cáctác giả đã ghi nhận vai trò gây bệnh của Pityrosporum vànhận thấy sự hiện diện của vi nấm trên một số bệnh như:Lang ben, viêm da dầu, viêm nang lông, viêm da cơ địa Cũngtrong thời gian đó, Sabouraud đã xác định vi sinh vật gây hiện

tương gầu da đầu cũng có tên gọi là: Pityrosporum Còn Louis

- Charler lại mô tả vi nấm này dưới tên gọi Malassezia Ban đầu một số nhà khoa học cho rằng hình thái Malassezia là tồn tại dưới dạng sợi nấm, còn Pityrosporum là hình thái nấm

men Năm 1995-1996, thành tựu khoa học công nghệ pháttriển nhanh chóng đã ứng dụng thành công trong việc giải mãtrình tự bộ gen của vi nấm này và tìm được 7 loài phụ thuộc

lipid, đặt tên chung là Malassezia spp [16] Hệ thống loài Malassezia tiếp tục hoàn thiện, đến năm 2004, các nhà khoa học Nhật Bản đã công bố thêm 4 loài mới: M dermatis và M japonica phân lập từ viêm da cơ địa, M yamatoensis từ da

người khỏe mạnh và một bệnh nhân bị viêm da dầu [2] Một

số loài mới phụ thuộc lipid cũng được mô tả như M nana [3],

M caparae, M equina [4], M cuniculi [5] phân lập từ da động

vật, do đó hiện nay tổng số loài được công nhận lên tới 14

loài

1.1.2. Đặc điểm Malassezia spp.

Malassezia spp là một nấm men tồn tại trên vi hệ nấm

da của người và động vật Hiện nay, nấm Malassezia là một

trong những căn nguyên quan trọng trong nhiều bệnh lý về danhư lang ben, viêm da dầu, viêm da cơ địa, vảy nến…

- Thuộc ngành Basidomycota, phân ngànhUstilaginomycotina, lớp Exobasidomycetes, bộ Malasseziales,

và họ Malasseziacae

- Tồn tại trạng thái đơn bào, có nhân chuẩn

- Hình dạng: Là nấm không màu, vách ngăn rộng, hìnhtròn hoặc hình bầu dục, đôi khi gặp dạng sợi hoặc vô địnhhình

- Kích thước dao động từ 3-10 µm, thông thường lớn hơngấp 10 lần so với vi khuẩn

- Sinh sản vô tính theo phương thức nảy chồi Khi bào tửchồi được sinh ra theo dạng tuyến tính không phân cắt thìhình thành nên cấu trúc gọi là giả sợi nấm

- Khả năng thích nghi môi trường đường cao

- Tồn tại trong thiên nhiên, trong các môi trường chứađường như hoa quả, rau dưa, mật mía…

- Có 14 loài Malassezia trên da người và động vật, trong

đó 3 loài chính gặp nhiều nhất là M globosa, M sympodialis,

M furfur [6], [7], [8].

1.1.3 Cơ chế gây bệnh

Sự xâm nhập diễn ra khi một bào tử nấm nhiễm vào cơthể ở trạng thái nghỉ không hoạt động, sau đó chuyển hóatrong cơ thể vật chủ, nẩy mầm và sinh sản rồi xâm nhập vào

mô Mỗi hình thái nấm như: Sợi nấm, bào tử nấm hoặc tế bàonấm men có tính kháng nguyên đặc trưng khác nhau Do đó,khi xâm nhập vào cơ thể nấm gây ra sự đáp ứng miễn dịch với

cơ thể vật chủ và sẽ có hai cơ chế bảo vệ: Miễn dịch dịch thể

và miễn dịch tế bào [9]

Trong quá trình trao đổi chất vì lý do nào đó  thiếu hụtgen mã hóa Enzym tổng hợp axit béo vi nấm không tự tổnghợp axit béo  sử dụng nguồn axit béo từ bên ngoài Xuhướng tìm vùng giàu chất bã nhờn: da đầu, mặt, lưng, ngực

Malassezia spp tiết 8 loại Lipase và 3 loại Phospholipase

Thủy phân axit béo trung tính axit béo tự do phản ứngtrung gian tế bào kích hoạt con đường gây viêm [10]

1.1.4 Một số yếu tố thuận lợi

* Yếu tố bên trong

- Sinh lý: phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh

- Bệnh lý toàn thân: Nhiễm trùng cấp và mạn tính, bệnhchuyển hóa, béo phì…Các bệnh lý như bỏng, ung thư,Hodking, nhiễm HIV/AIDS…

- Bệnh lý tại chỗ làm thay đổi tính chất da: Viêm da cơđịa, Rụng tóc, Bạch biến…

- Sử dụng hóa chất: Dùng kháng sinh phổ rộng, kéo dàilàm thay đổi sự cân bằng vi hệ…

* Yếu tố bên ngoài

- Người già sức đề kháng suy giảm

- Loét do bỏng

- Điều kiện vệ sinh kém, không ý thức bệnh tật hoặc thiếukiến thức

- Môi trường vi khí hậu thay đổi…

- Ngoài ra thói quen dùng dầu dưỡng tóc, kem chốngnắng, môi trường nóng ẩm… là những yếu tố rất thuận lợi cho

vi nấm Malassezia phát triển và gây bệnh.

1.1.5 Lang ben và một số biểu hiện bênh lý khác do

nấm Malassezia

1.1.5.1 Lang ben

Lang ben (Pityriasis Versicolor) là một bệnh mạn tính củalớp sừng, gây ra bởi một nhóm nấm men trước đây có tên là

Pityrosporium, nay thống nhất dưới tên gọi là Malassezia spp.

Bệnh gặp bất kỳ tuổi nào, hay gặp ở nhóm 20 – 45 tuổi, ít gặp

ở trẻ em và người già Theo Eduado Silva bình thường bệnhkhông lây vì nó thuộc vi hệ Dưới ảnh hưởng một số yếu tốthuận lợi: khí hậu nóng ẩm, tính chất da thay đổi, sức đềkháng suy giảm…tạo điều kiện vi nấm tăng sinh và gây bệnh.Nhưng Jose Latoni thì cho rằng bệnh có thể lây do dùng chung

ga giường, quần áo

* Triệu chứng lâm sàng

Bệnh biểu hiên thể điển hình với các triệu chứng rất dễ

nhận biết Đó là đám màu hồng nâu, hình tròn, ranh giới rõ,đôi khi là những đám thương tổn mất sắc tố Thường khu trúvùng cổ, ngực, lưng, vai, cánh tay Hiếm khi ở cẳng tay, châncũng như lòng bàn tay và bàn chân [44]

* Chẩn đoán của lang ben nói chung là đơn giản

- Triệu chứng lâm sàng điển hình

- Xét nghiệm: Kết quả soi trực tiếp cho kết quả dương tính

80 - 90%, trong đó đa phần cho hình ảnh điển hình là “mì ống

và thịt viên” Theo dữ liệu của một số nghiên cứu gần đây về

nuôi cấy, định loại và kỹ thuật ADN đã khẳng định M globosa

là loài gây bệnh phổ biến nhất trong bệnh lang ben; mộtnghiên cứu năm 2000 do Crespo Erchiga thực hiện đã chỉ ra

rằng căn nguyên gây lang ben là M globosa [11] Trong đó, M.globosa chiếm khoảng 53,3%, tiếp theo M furfur 25,3%, M sympodialis 9,3%, còn M obtusa 8,1% và M slooffiae 4,0% Bên cạnh đó, Gupta và cs cũng tìm thấy M sympodialis là tác

nhân chủ yếu trong lang ben đối với vùng khí hậu ôn đới, còn

M globosa là tác nhân chính ở các vùng nhiệt đới [12]

1.1.5.2 Một số bệnh lý khác do nấm Malassezia

+ Viêm da dầu: chủ yếu ở trẻ sơ sinh, tuổi dậy thì và độ

tuổi ngoài 50, nam gặp nhiều hơn nữ [13] Nhiều nghiên cứucho thấy viêm da dầu thường xảy ra trên cơ địa những người

tăng tiết chất nhờn kết hợp nhiễm nấm Malassezia [13], [14].

Khi điều trị viêm da dầu bằng thuốc chống nấm làm giảm số

lượng Malassezia do đó làm cải thiện các triệu chứng lâm

sàng của bệnh [15]

+ Gầu da đầu: Các biểu hiện trên da đầu mà thường

được gọi là "gàu" gây ra bởi nhiều yếu tố của cơ thể kết hợp

với hệ vi nấm Malassezia.

+ Viêm da cơ địa: Khoảng 30-80% bệnh nhân viêm da cơ địa có

test lẩy da dương tính với Malassezia spp [16], [17], [18], [19] Lý giải cho

sự nhạy cảm cao của Malassezia spp với bệnh viêm da cơ địa còn chưa rõ,

nhưng được cho là sự kết hợp giữa các yếu tố gây rối loạn hàng rào chức năng

da, di truyền và các yếu tố môi trường

+ Viêm nang lông: biểu hiện như ngứa, mụn mủ, sẩn đỏ

nang lông phân bố chủ yếu ở thân mình, lứa tuổi hay gặp làngười trung niên và trẻ tuổi [20], vị trí ở lưng và ngực đôi khitrên cổ, vai, cánh tay hiếm khi hiện diện trên khuôn mặt,thường rất ngứa, có mụn mủ nhỏ ở da kèm theo ban đỏ, chủyếu gặp ở tuổi vị thành niên, phổ biến nhất ở những ngườikhoảng 13-45 tuổi với tỷ lệ nữ /nam là 1,5:1[10]

+ Nấm móng do Malassezia: Tuy móng không phải là

một nguồn thức ăn lý tưởng của vi nấm nhưng do nấm menthiếu khả năng sừng hóa (keratolytic) đồng thời xuất hiệnnhững biến đổi không bình thường trong quá trình sinh trưởngnên chúng xâm chiếm và phá hủy móng, chủ yếu móng tay

+ Một số biểu hiện khác do nhiễm nấm Malassezia:

Trứng cá thông thường, U nhú thể mảng, Gaiden, Bạch biến.Người ta đã phát hiện bệnh nhân nằm điều trị hồi sức tích cực

bị nhiễm Malassezia spp huyết Theo nghiên cứu CDC (1984) nhận thấy vi nấm Malassezia spp gây bệnh nhiều nơi Khi

người ta tiến hành lấy các mẫu từ bệnh phẩm: máu, nước

tiểu, đờm, phân đều có thể phân lập được Malassezia spp.

- Thông thường dùng dao cùn cạo vẩy da (hoặc băng dính) và

soi trong KOH 10% hoặc 20% hoặc 30%

- Sau này thêm Glycerin tránh kết tủa Gần đây sử dụng kếthợp mực Parker pha trộn với tỷ lệ khác nhau

- Nhuộm soi: Giêmsa, Gram, Jien- Neihsen, PAS, …

* Nuôi cấy và định danh:

- Môi trường Sabouraud cổ điển

- Môi trường Dixon

- Môi trường Dixon có cải tiến

- Môi trường Leeming- Nottman

- Môi trường thạch CHROM có sửa đổi

Bằng phương pháp xét nghiệm trực tiếp: soi tìm nấm dướikính hiển vi chỉ cho biết có hay không thấy nấm nhưng khôngthể biết đó là loài nấm gì Vì vậy, cần phải tiếp tục nuôi cấy

để phân lập và định danh nấm Môi trường hay dùng nhất làmôi trường Sabouraud, thường nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, sau1-2 tuần quan sát sự phát triển của nấm và xác định loài Nếuchưa rõ hoặc chưa xác định được nên theo dõi thêm 1 tuầntiếp Trên thực tế tỉ lệ giữa triệu chứng lâm sàng, kết quả soitrực tiếp và nuôi cấy là 3:2:1 (3 trường hợp có triệu chứng lâmsàng soi trực tiếp dương tính 2 và nuôi cấy dương tính )

1.2. Kỹ thuật xét nghiệm trực tiếp tìm Malassezia cải

tiến

1.2.1 Hóa chất sử dụng để nhuộm soi dưới kính hiển vi

Phát hiện Malassezia bằng phương pháp soi trực tiếp là xét nghiệm có

độ nhạy cao giúp các bác sỹ đưa ra các quyết định điều trị Hóa chất thườngđược dùng là KOH với các nồng độ khác nhau từ 10% đến 30% Dung dịchKOH có vai trò quan trọng làm phân rã protein ở lớp sừng qua đó làm trong,

mềm lớp sừng và bộc lộ rõ ràng hình thái vi nấm Malassezia Kỹ thuật này hiện được coi là tiêu chuẩn, rất hữu ích chẩn đoán sơ bộ tìm Malassezia trong

phòng xét nghiệm

Trong quá trình soi trực tiếp, khi nhuộm bằng hóa chất KOH đơn thuần

rất khó quan sát hình thái vi nấm Malassezia dưới kính hiển vi Hơn nữa, khi

sử dụng KOH đơn thuần, thời gian trả kết quả thông thường mất từ 90-120phút Tại bệnh viện Da liễu Trung ương, mỗi ngày có gần 2000 lượt ngườikhám và chữa bệnh, trong đó trên 50% số bệnh nhân có xét nghiệm soi trựctiếp tìm nấm Thời gian trả kết quả lâu cũng sẽ ảnh hưởng nhiều đến công táckhám và chữa bệnh của bệnh viện

 Quy trình cũ sử dụng hóa chất KOH

* Cơ chế tác dụng của KOH: KOH là một dung dịch kiềm tuy không

mạnh bằng NaOH nhưng cũng có tác dụng làm trong và mềm biểu mô da, do

đó bộc lộ sợi nấm để quan sát

* Ưu điểm:

+ Hóa chất đơn giản vì chỉ có một loại đơn thuần

+ Tự pha chế dễ dàng

+ Giá thành rẻ, dễ mua trên thị trường

* Nhược điểm: Trong một số trường hợp rất khó quan sát nên dễ bỏ sót

+ Nếu sợi nấm thoái hóa do bệnh nhân từng bôi thuốc diệt nấm thì thành

và bào tương không còn nguyên vẹn cấu trúc, trong khi đó KOH 20% khônglàm sợi nấm bắt màu nên rất khó quan sát

+ Khi quan sát tế bào nấm men trong nhiều mẫu bệnh phẩm có thể dễ

bỏ sót vì kích thước tế bào nấm men rất nhỏ (chỉ từ 3-4µm) và khó quansát do dung dịch KOH không có ái tính với vi nấm men nên tế bào nấmkhông bắt màu

* Mặc dù để khắc phục một số nhược điểm của KOH chúng tôi đã thêmGkycerin với tỷ lệ nhất định nhưng hầu như chỉ tác dụng làm giảm hiện tượngkết tinh KOH, nhằm giữ tiêu bản lâu hơn trong thời tiết khô hanh hoặc khi hơqua ngọn lửa đèn cồn Bên cạnh đó, nhân viên xét nghiệm cũng tiến hành thayđổi nồng độ dùng dịch KOH 10%, 20% hoặc 30% Nhưng dường như dù ở

nồng độ nào KOH cũng không làm mềm tổ chức nhanh hơn và không mấy rõnét khi quan sát tiêu bản nhuộm.

 Quy trình mới sử dụng NaOH kết hợp Parker TM blue black ink

Để thực hiện tốt công việc đó, bên cạnh sự cố gắng của những người làmxét nghiệm nấm vừa kế thừa kinh nghiệm của những người đi trước Đồngthời, tiếp thu lĩnh hội kiến thức mới cập nhật từ các chuyên gia hàng đầu trongchuyên ngành nấm học của ASM/CDC Hoa Kỳ Qua chuyển giao công nghệ

kỹ thuật của ASM/ CDC chúng tôi áp dụng hóa chất soi tìm nấm: KOH 20%

(thêm Glycerin)+ ParkerTM blue black ink với tỷ lệ 3:1 Tuy nhiên, trong quá

trình thử nghiệm chúng tôi nhận thấy dung dịch NaOH 20% (không có glycerin) + Parker blue black ink với tỷ lệ 1:2 cũng cho kết quả rất tốt.

Do đó, chúng tôi tiến hành thay đổi hóa chất sử dụng là NaBI soi tìm nấmvới mục đích rút ngắn thời gian xét nghiệm và tăng khả năng phát hiện

Malassezia trong mẫu bệnh phẩm

* Cơ chế tác dụng và tính chất của NaOH 20% + Parker blue black ink

+ NaOH là một ba-zơ có tính kiềm mạnh nhất nên được ứng dụng nhiềutrong ngành công nghiệp như xử lý nước, làm giấy, dệt, nhuộm, làm xàphòng… Đặc biệt được sử dụng nhiều trong phòng thí nghiệm

+ Có độ hòa tan cao trong dung môi nước do có hiện tượng phân ly hoàntoàn thành ion và tạo ra một lượng nhiệt rất lớn

+ NaOH có thể hòa tan dầu mỡ, chất béo và một số protein, trong đó cólớp sừng Do vậy, khi sử dụng hóa chất này để soi tìm nấm chúng tối nhậnthấy rất hữu ích bởi vì:

• Thấm sâu vào lớp biểu bì nên làm mềm tổ chức nhanh hơn đặc biệt vùng dadày sừng, chàm hóa

• Không cần hơ qua ngọn lửa đèn cồn vì do tính chất tỏa nhiệt mạnh khi hòa tantrong nước

+ ParkerTM blue black ink là một loại mực có ái tính với tế bào nấm men

Malassezia, qua đó quan sát rõ ràng hình thái vi nấm dưới kính hiển vi.

áp dụng được với nhiều loại tổn thương khác nhau, kể cả ởvùng bán niêm mạc như quy đầu Nếu như dùng dao cùn,chúng tôi phải hấp sấy dụng cụ thường xuyên để đảm bảo đủtiêu chuẩn xét nghiệm, đồng thời, kỹ thuật viên phải được tậphuấn thực hành thành thạo kỹ năng sử dụng dao cùn này vớitừng loại thương tổn khác nhau Các thương tổn vảy da donấm thường mỏng, là nấm sợi thì thường khó bong, còn nấmmen, đa phần vảy da mỏng, ẩm, dễ bong, khó quan sát thấybằng mắt thường Điểm hạn chế của việc sử dụng dao cùn làkhi cạo đôi khi không lấy hết được vảy da của bệnh nhân làmảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm Nhiều trường hợp chúngtôi gặp bệnh nhân than phiền về việc sử dụng dao cùn gâykhó chịu cho họ, nhất là gây tăng cảm giác đau rát

1.2.2.2 Tính mới của kỹ thuật lấy bệnh phẩm sử dụng băng dính

Đối với kỹ thuật sử dụng băng dính, chúng tôi thấy dễ

dàng hơn trong tiếp cận với thương tổn của bệnh nhân Băngdính có thể sử dụng được trong rất nhiều trường hợp mà trướcđây dao cùn gặp khó khăn như những thương tổn ở nếp kẽ trẻ

sơ sinh, ở mặt của trẻ nhỏ Hầu hết trẻ nhỏ luôn mang tâm lý

sợ bác sĩ cũng như kỹ thuật viên, khi nhìn thấy dao cùn đôikhi làm tăng cảm giác sợ hãi, trẻ quấy khóc, vận động mạnhgây khó khăn cho lấy bệnh phẩm, đôi khi sử dụng dao cùn cóthể làm tổn thương trẻ Kỹ thuật sử dụng băng dính tương đốinhẹ nhàng, không đau đớn, không gây nguy hiểm gì cho trẻ.Chúng tôi sử dụng loại băng dính thông thường có sẵn ngoàithị trường Sau khi lấy bệnh phẩm, băng dính đươc sử dụngtrực tiếp để nhuộm soi cho nên sử dụng loại băng dính trongmang lại hiệu quả tốt hơn

Hơn nữa, Malassezia là nấm men thuộc vi hệ Sử dụng

dao cùn có thể lấy được bệnh phẩm trên một diện tích rất lớn.Tuy nhiên, để đánh giá một vi nấm thuộc vi hệ có gây bệnhhay không, mật độ và số lượng là tiêu chí quan trọng hơn Vớitiêu chí này, băng dính lấy bệnh phẩm trên một diện tích danhất định, cho nên chúng ta hoàn toàn có thể đánh giá đượcmức độ gây bệnh của vi nấm, mang lại nhiều thông tin hơngiúp các bác sĩ lâm sàng đưa ra các quyết định chẩn đoánchính xác và điều trị tốt hơn cho bệnh nhân

1.2.2.3 So sánh hiệu quả của kỹ thuật lấy bệnh phẩm bằng băng dính và dao cùn

Bảng 1 1 So sánh tính hiệu quả giữa 2 kỹ thuật lấy bệnh phẩm bằng băng dính và dao cùn trong xét nghiệm

trực tiếp tìm nấm

Lấy bệnh phẩm Băng dính Dao cùn

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu cho nhóm bệnh nhân lang ben

- Bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàngbệnh lang ben [21] Lâm sàng trên da

có dát thay đổi màu sắc (Trắng, nâuhoặc hồng) Vị trí chủ yếu: lưng, ngực,bụng, tay, vai, cổ Bề mặt thương tổnphủ lớp vảy da ẩm, mỏng và dễ bong

- Bệnh nhân không giới hạn độ tuổi

- Không dùng thuốc kháng nấm, bongsừng bạt vảy trước đó 7 ngày

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

- Không đồng ý tham gia nghiên cứu

- Bệnh nhân dùng thuốc kháng nấm,bong sừng bạt vảy trước đó 7 ngày

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu cho nhóm người khỏe mạnh

 Tiêu chuẩn lựa chọn

- Người khỏe mạnh bình thường baogồm: các học viên sau đại học và nhânviên bệnh viện không mắc bệnh da tạiBệnh viện Da liễu Trung Ương

- Da người khỏe mạnh không mắc bệnh

lý đã được khám và xét nghiệm (khicần) loại trừ

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

- Soi đèn wood phát hiện các tổn thương thay đổi màusắc da

- Không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Đèn wood

- Kính hiển vi quang học thông thường

và có chụp ảnh

- Dung dịch NaOH 20%

- Dung dịch ParkerTM blue black ink

- Thuốc nhuộm Lactophenol blue

- Dao cùn vô khuẩn

- Băng dính trong

- Lam kính, lá kính

- Giá để lam, lá kính

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu cho nhóm bệnh nhân lang ben

2.4.1.1.Thiết kế nghiên cứu

So sánh ngẫu nhiên 2 phương pháp xét nghiệm

2.4.1.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

* Cỡ mẫu tính theo công thức thử nghiệm lâm sàng của Tổchức Y tế Thế giới:

n1 = n2 =

2 2 1

2 2 2

1 1

2 / 1

)(

)1()1()

1(2

P P

P P

P P

Z P P Z

−

−+

−+

−

Z1- α /2: Hệ số tin cậy 95% (= 1,96)

Zβ: Lực mẫu 80% (= 0,842)

n1: cỡ mẫu của nhóm nghiên cứu soi trực tiếp bằng băngdính

n2: cỡ mẫu của nhóm chứng soi trực tiếp bằng dao cùn

P1: tỷ lệ bệnh nhân có xét nghiệm dương tính nhóm băngdính: ước lượng là 90%

P2: tỷ lệ bệnh nhân có xét nghiệm dương tính nhóm daocùn : ước lượng 70%

cỡ mẫu nghiên cứu chúng tôi chọn 60 bệnh nhân cho mỗinhóm nghiên cứu