CÁC kỹ THUẬT SINH học PHÂN tử TRONG CHẨN đoán VI KHUẨN LAO

Nguyên lý phát hiện đột biến kháng RIF trên gene rpoB và quá trình gắn các đầu dò phát quang với các DNA đích...6 Hình 3.1.. Trong hoàn cảnh đó, với sự phát triển của công nghệ sinh học

(-) Âm tính

AFB Acid fast bacilli (Trực khuẩn kháng cồn toan)

HIV Human Immunodeficiency Virus

(Virút gây suy giảm miễn dịch ở người) LPA Line Probe Assay (thí nghiệm lai với các đoạn dò)

MTB Mycobacterium Tuberculosis

MGIT Mycobacterial Growth Indicator Tube

(Nuôi cấy vi khuẩn lao trong ống chỉ thị) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase)

PPV Positive Predictive Value (Giá trị dự đoán dương tính)

NPV Negative Predictive Value (Giá trị dự đoán âm tính)

1 PCR (Polymerase chain reaction) 2

1.1 Đại cương 2

1.2 Nguyên lý của PCR 2

1.3 Giá trị của PRC trong chẩn đoán vi khuẩn lao 3

2 Gene Xpert MTB/RIF 5

2.1 Đại cương 5

2.2 Nguyên lý 5

2.3 Giá trị của Xpert MTB trong chẩn đoán vi khuẩn lao 7

2.4 Tập hợp bằng chứng khoa học 8

2.5 Các khuyến cáo hiện nay 10

3 Line probe assay 11

3.1 Đại cương 11

3.2 Nguyên lý 11

3.3 Các băng tín hiệu trên màng lai và nhận định kết quả 13

3.4 Giá trị của xét nghiệm Line probe assay 13

3.5 Bằng chứng khoa học 14

3.6 Khuyến cáo hiện nay 15

4 TB LAMP 16

4.1 Đại cương 16

4.2 Nguyên lý của phản ứng LAMP 17

4.3 Phát hiện sản phẩm của phản ứng TB-LAMP: 19

4.4 Bằng chứng khoa học 20

4.5 Khuyến cáo 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 1.1 Giá trị chẩn đoán của PCR trên các bệnh phẩm khác nhau 4

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phản ứng PCR 3

Hình 2.1 Nguyên lý phát hiện đột biến kháng RIF trên gene rpoB và quá trình gắn các đầu dò phát quang với các DNA đích 6

Hình 3.1 Nguyên lý phản ứng lai DNA và hiển thị kết quả trên thanh tín hiệu 12

Hình 3.2 Hiển thị kết quả trên thanh tín hiệu 13

Hình 4.1 Gene đích và các cặp mồi trong phản ứng LAMP 17

Hình 4.2 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu trong phản ứng LAMP 18

Hình 4.3 Giai đoạn lặp lại chu kỳ trong phản ứng LAMP 19

Hình 4.4 Nguyên lý phát quang trong phản ứng LAMP 20

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lao hiện vẫn còn là một gánh nặng trên thế giới cũng như ở ViệtNam Để đẩy lùi và tiến tới thanh toán bệnh lao, điều quan trọng là phát hiệnđược nhiều nhất số người mắc lao trong cộng đồng và điều trị khỏi để giảmdần nguồn lây nhiễm

Chẩn đoán lao là một thách thức vì các triệu chứng lâm sàng và chẩn đoánhình ảnh thường không điển hình, trong khi đó các kỹ thuật chẩn đoán lao truyềnthống đều có những hạn chế nhất định Kỹ thuật soi đờm trực tiếp tìm AFB cókhả năng chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao tuy nhiên tỉ lệ dương tính chỉ đạt khoảng50%, không xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn lao, ngoài ra kết quả cònphụ thuộc vào chất lượng lấy đờm và khả năng đọc kết quả [1], [2] Kỹ thuậtnuôi cấy là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán lao nhưng thời gian cho kết quả lâukhông đáp ứng được yêu cầu chẩn đoán và điều trị sớm [3], [4]

Trong hoàn cảnh đó, với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tửnói chung, các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán lao có rấtnhiều hứa hẹn khi trên phương diện lý thuyết có thể phát hiện ra vật chất ditruyền của một vài vi khuẩn trong điều kiện phòng xét nghiệm, điều này đặcbiệt có ý nghĩa với các thể lao soi đờm trực tiếp âm tính, lao ở người nhiễmHIV, lao trẻ em, lao ngoài phổi hoặc phát hiện sớm lao kháng thuốc

Nội dung chuyên đề trình bày về nguyên lý cũng như giá trị chẩn đoáncủa các kỹ thuật mới này góp phần giúp thầy thuốc chẩn đoán chính xác vàhiệu quả bệnh lao

1 PCR (Polymerase chain reaction)

1.1 Đại cương

PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóahọc vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này Kỹ thuật PCR cho phép xácđịnh tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng nhận biết vàsao chép để khuyếch đại về mặt số lượng đoạn trình tự đích (target region)đặc hiệu trên genome của vi khuẩn [5]

1.2 Nguyên lý của PCR

PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vàocác chu kỳ nhiệt Thành phần chính trong dung dịch phản ứng (PCR mix) baogồm: (1) enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), (2) DNAđích chứa đoạn trình tự đích cần được nhân lên trong phản ứng, (3) các đoạnmồi (primer) là các oligonucleotide có trình tự bổ sung đặc hiệu với đoạntrình tự đích và (4) 4 loại deoxynucleotide triphosphate (dNTP) gồm Adenin,Thymine, Guanine và Cytosine (dATP, dTTP, dGTP và dCTP)

Một chu kì nhiệt gồm 3 giai đoạn: biến tính, bắt cặp và kéo dài với 3

mức nhiệt khác nhau (hình 1) Ở giai đoạn biến tính, nhiệt độ được đưa lên

94oC khiến các liên kết hydro giữa 2 mạch đôi DNA trở lên lỏng lẻo do đóDNA bị biến tính thành các mạch đơn Tiếp đến giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ hạxuống 55-65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sungvào đoạn DNA đích Cuối cùng nhiệt độ được đưa lên 72oC là nhiệt độ phùhợp cho hoạt động của enzym Taq polymerase để nối các dNTP vào các đoạnmồi theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA đích để tổng hợp đoạn DNA bảnsao [5]

Hình 1.1 Phản ứng PCR

Ứng dụng PCR trong chẩn đoán vi khuẩn lao thường dựa trên việc pháthiện đoạn gen IS6110 [6] IS6110 là trình tự gắn (insert sequence) đặc hiệu

trong genome vi khuẩn thuộc nhóm Mycobacter tuberculosis bao gồm M.

tuberculosis, M africanum, M bovis, M cannetti, M caprae, M microti,

and M pinnipedi Kỹ thuật PCR cũng đã được cải tiến thêm như sử dụng đa

mồi (multiplex PCR) phát hiện 3 gene đích IS6110, IS1081 và 23S rDNAhoặc PCR tổ (nested PCR) để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng

1.3 Giá trị của PRC trong chẩn đoán vi khuẩn lao

Trong điều kiện phòng xét nghiệm chỉ cần một lượng nhỏ vi khuẩn (1-3

vi khuẩn/1mm3 bệnh phẩm) đã cho kết quả dương tính PCR không cho biết

vi khuẩn còn sống hay đã chết

Tỷ lệ dương tính giả cao do lây nhiễm trong quy trình xử lý và phân tích

bệnh phẩm Âm tính giả có thể do sự có mặt của nhiều chất ức chế DNA

polymerase trong bệnh phẩm hoặc những vi khuẩn không có đoạn IS6110 Chủng

vi khuẩn lao ở Việt Nam có tỉ lệ khuyết gen đích IS6110 khoảng 3-5% [7]

Noordhoek (1994) tổng hợp kết quả từ 7 phòng xét nghiệm khác nhau,nhận xét PCR trong chẩn đoán lao phổi có tỉ lệ dương tính giả cao từ 43-77%,nguy cơ lây nhiễm chéo rất cao [8] Nguyễn Thu Hà (2006) nghiên cứu trên

nhóm bệnh nhân lao phổi AFB âm tính, nhận thấy PCR đờm có Se 57,1%, Sp93,33%, PPV 85,7%, NPV 75,7%

Kỹ thuật PCR phát hiện đoạn gene IS6110 để chẩn đoán lao ngoài phổicũng đã được đánh giá trong nhiều nghiên cứu trên thế giới Nhìn chung xétnghiệm có độ nhạy rất dao động từ 31 – 100%, độ đặc hiệu tương đối cao [6].Kết quả này có thể giải thích do tỷ lệ ngoại nhiễm cao cũng như sử dụng các

bộ kit PCR khác nhau trong các nghiên cứu này Chính vì vậy, kỹ thuật PCR

không được WHO khuyến cáo sử dụng trong chẩn đoán Mycobacter

tuberculosis.

Bảng 1.1 Giá trị chẩn đoán của PCR trên các bệnh phẩm khác nhau [6]

Tác giả Bệnh phẩm Độ nhạy (Se%) Độ đặc hiệu (Sp%)

Quan (2006) Dịch não tủy 75 94

Rafi (2007) Dịch não tủy 98 100

Haldar (2010) Dịch não tủy 40 93

2 Gene Xpert MTB/RIF

2.1 Đại cương

Hệ thống Gene Xpert đã được giới thiệu từ năm 2004, Gene Xpert làmột kỹ thuật mang tính đột phá, tích hợp của 3 công nghệ (tách gen, nhân gen

và nhận biết gen) đã được phát triển trong khuôn khổ hợp tác của tổ chứcFIND (Foundation for Innovative New Diagnostics), Cepheid Inc và trườngĐại học Y - Nha khoa New Jersey Kỹ thuật nhằm xác định đoạn acid nucleicđích từ bệnh phẩm lâm sàng chưa cần qua xử lý dựa trên nguyên lý của kỹthuật PCR Khả năng phát hiện các vi khuẩn gây bệnh khác nhau có được dựatrên các hộp xét nghiệm (cartridge) đặc hiệu cho từng căn nguyên ví dụ:Staphylococcus aureus kháng methicllin (MRSA), Streptococcus agalactia,Mycobacteria tuberculosis [9].

Xpert MTB/RIF (viết tắt là Xpert MTB) là một xét nghiệm sinh học

phân tử phát hiện sự có mặt của vi khuẩn lao cũng như đột biến kháng RMPbằng cách sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu và 5 đầu dò (probes) có gắn chỉ thịhuỳnh quang khác nhau để đảm bảo độ đặc hiệu cao

Cho đến hiện nay Xpert đã được phát triển qua 4 phiên bản phần mềmnâng cấp, G1, G2, G3 và G4 Mỗi phiên bản là sự điều chỉnh về giá trịngưỡng chu kỳ nhân bản để làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu Xpert MTBtrong khả năng phát hiện kháng RMP Từ năm 2013, toàn bộ hệ thống sinhphẩm sử dụng cho chẩn đoán là thế hệ G4 [10]

2.2 Nguyên lý

Trong DNA vi khuẩn lao, gen rpoB có kích thước 3519 bp, mã hóa chotiểu phần β của RNA polymerase Đột biến kháng RMP thường xảy ra trênđoạn gen rpoB, đặc biệt là ở đoạn nằm trung tâm của gen dài 81 bp được giớihạn từ bộ ba 507 đến 533 (vùng “nóng” – hot-spot region) Đột biến ở các vịtrí khác nhau có mức độ kháng thuốc khác nhau Đột biến tại vị trí bộ ba thứ

516, 526, 531, cho kết quả đề kháng với RMP cao; đột biến ở bộ ba 510, 515

và 512 kháng RMP ở mức độ thấp hơn 45% các chủng có các đột biến mất ởcodon 531 (S531) trong khi 35% các chủng kháng thuốc có sự thay đổi codon

526 (H526) dẫn đến thay thế acid amin [9], [10], [11] Từ 90 - 97% các chủng

M tuberculosis kháng RMP được xác định là do các đột biến trên vùng gen

ngắn 81 bp này của rpoB, còn 5 - 10% đột biến kháng RMP khác được xácđịnh ở đoạn tận N hoặc ở vùng II của gen rpoB, hoặc liên quan tới có chếkháng thuốc khác [11], [12], [13].

Xét nghiệm được thiết kế để nhân đoạn trình tự 192bp của gen rpoB trên

vi khuẩn lao bằng phản ứng PCR Xét nghiệm sử dụng 5 mẫu dò riêng biệtgắn chỉ thị huỳnh quanh, chứa trình tự có thể cặp đôi với DNA của chủng vikhuẩn lao hoang dại Các trình tự của 5 mẫu dò được thiết kế đặc biệt để cókhả năng phát hiện đột biến cao nhất và đảm bảo chắc chắn xác định đượcvùng thường xuyên xảy ra đột biến chứa 81bp Xác định có vi khuẩn lao khi

có ít nhất 2 mẫu dò bắt cặp Xác định có đột biến kháng RMP dựa trên có mộtmẫu dò không bắt cặp [10], [12], [13], [14]

Hình 2.1 Nguyên lý phát hiện đột biến kháng RIF trên gene rpoB và quá

trình gắn các đầu dò phát quang với các DNA đích.

2.3 Giá trị của Xpert MTB trong chẩn đoán vi khuẩn lao

Xpert MTB có khả năng chẩn đoán lao và phát hiện lao kháng RIF vớinhiều ưu điểm: khép kín, tự động, dễ thao tác, trả kết quả sớm Chỉ thị phân tửnhắm vào gen rpoB đã bao trùm được tất cả những đột biến tìm thấy tronghơn 85% các chủng kháng RMP Không có phản ứng chéo với các vi khuẩn

mycobacteria không phải vi khuẩn lao; M tuberculosis và kháng RMP được

phát hiện chính xác cả khi có mặt DNA không phải của vi khuẩn lao hoặc trộnlẫn các chủng nhạy cảm và chủng đề kháng Kỹ thuật xác định kháng RMPqua phát hiện đột biến gen rpoB có độ tin cậy cao hơn xác định đột biến trêngen katG gây kháng INH hoặc các thuốc khác Ngoài ra trên 85% đột biếntrên rpoB kèm theo kháng INH, trong khi đó chỉ có 15% đột biến trên genkatG dẫn đến kháng đồng thời INH và RMP [11] Chính vì lý do đó mà pháthiện đột biến gen rpoB được sử dụng trong kỹ thuật Xpert MTB nhằm phát

hiện vi khuẩn lao M tuberculosis cũng như phát hiện sớm lao đa kháng thuốc

[10], [11], [14]

Thử nghiệm Xpert MTB có độ nhạy phân tích với 5 bản sao của bộ gen

(genom) - DNA được tinh chế và 131 cfu/ml vi khuẩn lao M tuberculosis có

trong mẫu đờm Hiện nay, phiên bản Xpert MTB/RIF Ultra với các hộp xétnghiệm với kích thước lớn có khả năng phát hiện vi khuẩn lao ở nồng độ 10cfu/ml – được coi là tương đương với kỹ thuật nuôi cấy môi trường lỏng [15],[16] Quy trình xử lý bệnh phẩm trong quá trình chuẩn bị bệnh phẩm và chạymáy Gene Xpert không tạo ra các hạt chứa vi khuẩn sống có khả năng lâynhiễm ở mức có thể phát hiện được so với các kỹ thuật như soi trực tiếp haynuôi cấy Đồng thời, hệ thống này có hai đối chứng nội tại bao gồm: SPC (đốichứng của quá trình xử lý mẫu) có thành phần là nha bào của vi khuẩnBacillus globigii SPC nhằm đảm bảo quá trình xử lý mẫu trong hộp xétnghiệm Một đối chứng khác là các đối chứng kiểm tra mẫu dò xác định cácchất đã được hydrat hoá, tuýp PCR trong xét nghiệm, mẫu dò toàn vẹn vàthuốc nhuộm ổn định Hai đối chứng này sẽ làm tăng độ tin cậy của kết quả[12], [10], [13], [14]

2.4 Tập hợp bằng chứng khoa học

Xpert MTB phát hiện vi khuẩn lao trong bệnh phẩm đờm soi dương

-nuôi cấy dương và soi âm - -nuôi cấy dương.

Boehme (2011) nghiên cứu tiến cứu 6648 bệnh nhân khu vực Nam Phi,Peru, Ấn Độ, Philippin, Uganda, so sánh Xpert MTB với soi trực tiếp, nuôicấy Kết quả Xpert MTB/RIF phát hiện 90,3% (933/1033) số trường hợp nuôicấy dương tính, so với phát hiện 67,1% (699/1041) soi kính Những trườnghợp soi trực tiếp âm tính, nuôi cấy dương tính, độ nhạy của Xpert MTB đạt76,9% (296/385), độ đặc hiệu 99,0% (2846/2876) [17] Mavenyengwa (2017)đánh giá 1842 bệnh phẩm ở những bệnh nhân có triệu chứng lao phổi, XpertMTB dương tính 32,20% (594/1842), trong số đó 24,05%(443/1842) soi trựctiếp AFB(+) Nghiên cứu gộp từ 24 nghiên cứu (33 trung tâm với 7247 ngườitham gia) cho kết quả với bệnh phẩm soi trực tiếp âm tính nhưng nuôi cấydương, Xpert MTB có độ nhạy từ 43% tới 100%, độ nhạy chung 68%, độ đặchiệu ít thay đổi hơn trong khoảng từ 86%-100% [18]

Genne Xpert phát hiện kháng RMP

Boehme (2011) nghiên cứu tiến cứu 6648 bệnh nhân nhận xét độ nhạyphát hiện kháng RMP là Se 94,4% (236/250) độ đặc hiệu Sp 98,3% (796/810)[17] Carriquiry (2012) nhận xét 131 bệnh nhân nhiễm HIV, có triệu chứngnghi lao rõ bao gồm ho, có hình ảnh tổn thương nghi lao trên Xquang ngực

Độ nhạy Xpert MTB phát hiện vi khuẩn lao Se 97,8% (44/45), độ đặc hiệu Sp97,7% (84/86), độ nhạy phát hiện kháng RMP là 100%, độ đặc hiệu 91,0%(30/33) [19] Steingart (2013) tổng kết từ 27 nghiên cứu (33 trung tâm, 2969người tham gia) về khả năng phát hiện kháng RMP của Xpert MTB, độ nhạytrong giới hạn từ 33-100%, độ nhạy thấp ở những nơi có số lượng người thamgia nghiên cứu thấp, độ đặc hiệu giá trị giao động ít hơn (83%-100%), độnhạy chung là 95%, độ đặc hiệu là 98% [20]

Nghiên cứu đánh giá giá trị của Xpert MTB tại Việt Nam

Mai Thanh Tú (2013) nghiên cứu 98 bệnh nhân nghi lao phổi điều trị

tại Trung tâm Hô hấp bệnh viện Bạch Mai được nội soi phế quản lấy dịch rửaphế quản phế nang làm xét nghiệm Gene Xpert cho thấy: 24 bệnh nhân có kếtquả Xpert MTB dương tính chiếm 24,5%, độ nhạy của xét nghiệm XpertMTB là Se 77,4%, độ đặc hiệu Sp 100%, giá trị dự đoán dương tính 100%,giá trị dự đoán âm tính 91% Những trường hợp bệnh nhân nuôi cấy vi khuẩnlao dương tính, độ nhạy của Gene Xpert Se 92,9%, độ đặc hiệu Sp 85,1%[21] Hoàng Hà (2014), nghiên cứu 151 bệnh nhân nghi lao, kết quả XpertMTB có vi khuẩn lao dương tính chiếm 31,6%, vi khuẩn lao có kháng RMP là4,5%, trong số vi khuẩn lao kháng RMP: tái phát phác đồ 2 chiếm 42,9%; cácthể tái phát phác đồ 1, thất bại phác đồ 2, lao/HIV AFB (+), lao AFB(-) đềugặp ít dưới 14,3% [22].

Lưu Bội Khanh (2014) sàng lọc 43.212 người trưởng thành tại 53khóm/ấp tại Cà Mau Trong đó 19.644 người đã khạc đờm đủ tiêu chuẩn làmxét nghiệm Xpert Có 155 người có kết quả dương tính với vi khuẩn lao bằngXpert MTB, tỉ lệ ước tính 425/100.000 Trong những người có kết quả dươngtính với vi khuẩn lao bằng xét nghiệm Xpert, 54% có kết quả “Số lượng vikhuẩn lao rất thấp”, 2,7% có vi khuẩn lao kháng RMP [23]

Nguyễn Kim Cương (2017) nghiên cứu giá trị của Xpert MTB trên 123bệnh nhân lao phổi AFB (-) có HIV Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ pháthiện vi khuẩn lao là 49,6%; so với xét nghiệm tiêu chuẩn là MGIT, có độnhậy Se 66,7%, độ đặc hiệu Sp 77,1%, giá trị dự đoán dương tính PPV82,0%, giá trị dự đoán âm tính NPV 59,7% Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn laokháng RMP là 18% (9/50), so với xét nghiệm tiêu chuẩn là kháng sinh đồ vớiRMP; độ nhậy Se 62,5%, độ đặc hiệu Sp 90,5%, giá trị dự đoán dương tínhPPV 55,6%, giá trị dự đoán âm tính NPV 92,7% [24]

2.5 Các khuyến cáo hiện nay

Tháng 12 năm 2010, WHO đã đưa ra khuyến cáo đầu tiên về sử dụng

Xpert MTB cho năm 2011, hỗ trợ và khuyến cáo việc triển khai nhanh kỹthuật xét nghiệm này.Trong đó, Xpert MTB có thể áp dụng cho các bệnhphẩm đờm, dịch não tủy, dịch hút dạ dày (trẻ em), và mảnh sinh thiếthạch.WHO khuyến cáo Xpert MTB nên được sử dụng như là xét nghiệm chẩnđoán đầu tiên cho người nghi ngờ có lao đa kháng thuốc hoặc lao đồng nhiễmHIV (khuyến cáo mạnh mẽ) Xpert MTB có thể được coi là một xét nghiệmtiếp theo nhuộm soi đờm trực tiếp ở các cơ sở ít có lao đa kháng thuốc hoặcHIV, hoặc sử dụng tiếp sau các mẫu nhuộm soi - âm tính (Khuyến cáo liênquan đến yếu tố điều kiện về nguồn lực) [9].

Năm 2013, WHO khuyến cáo Xpert MTB nên được sử dụng như xétnghiệm ban đầu thay cho soi thường quy, nuôi cấy, xét nghiệm nhạy cảmthuốc ở những trường hợp người lớn nghi MDR-TB hoặc lao nhiễm HIV(Khuyến cáo mạnh, bằng chứng tốt) Xpert MTB có thể sử dụng tiếp sau xétnghiệm soi trực tiếp những trường hợp người lớn nghi lao không có nguy cơMDR-TB, lao nhiễm HIV, đặc biệt khi xét nghiệm soi âm tính (Khuyến cáoxem xét điều kiện triển khai, bằng chứng tốt) [25]

Chương trình chống lao quốc gia Việt Nam (2015) hướng dẫn các đốitượng áp dụng Xpert MTB bao gồm người bệnh lao thất bại phác đồ I hoặc II,lao tái phát, lao bỏ trị, lao mới ở bệnh nhân HIV (+), lao mới có xét nghiệmsoi đờm trực tiếp (+) và người bệnh nghi lao hoặc lao mới có tiếp xúc vớingười bệnh mắc lao đa kháng [26]

3 Line probe assay

3.1 Đại cương

Line probe assay (LPA) là sử dụng nguyên lý của PCR và phương pháplai ghép ngược Một đoạn gen đích đặc hiệu sẽ được khuếch đại và đưa vàomàng nitrocellulose Đoạn dò DNA đặc hiệu trên màng lai cùng với đoạn gen

được khuếch đại sẽ gắn lên màng, sau đó chuỗi gen khuếch đại được gắn màu

và xuất hiện trên băng hiển thị Những xét nghiệm này được thiết kế để xácđịnh MTB và phát hiện những đột biến gen liên quan đến kháng thuốc ở cảbệnh phẩm trên lâm sàng cũng như bệnh phẩm phân lập từ nuôi cấy [27] LPAđược WHO khuyến cáo là xét nghiệm sàng lọc nhanh các bệnh nhân có nguy

cơ MDR-TB [28] Các kit LPA thương mại hiện nay bao gồm: INNOLiPA

RifTB), Genotype MTBDRplus, Genotype MTBDRsl (version 1 và 2).

3.2 Nguyên lý

Xét nghiệm LPA dựa trên công nghệ DNA-STRIP Quy trình gồm 3giai đoạn: (1) chiết xuất DNA từ mẫu đờm đã qua xử lý hoặc chủng nuôi cấy(trên môi trường đặc hoặc lỏng), (2) phản ứng khuếch đại đa chuỗi các đoạntrình tự đích thông qua các đoạn mồi được gắn biotin, và (3) phản ứng laighép ngược [29]

Trên bề mặt màng lai (membrane strip) có các đầu dò đặc hiệu theonguyên tắc bổ sung với các đoạn trình tự DNA được khuếch đại Sau khi biếntính các đoạn DNA khuếch đại thành các sợi đơn, các sợi đơn này sẽ gắn vàocác đầu dò (phản ứng lai ghép) Sự gắn đặc hiệu của đoạn DNA bổ sung dựatrên các điều kiện nghiêm ngặt về nhiệt độ và hóa chất đệm Vì vậy các đầu

dò có thể phân biệt được các trình tự khác nhau trên các vùng gen thửnghiệm Enzyme alkaline phosphatase gắn vào đoạn DNA trên màng lai thôngqua cầu nối streptavidin-biotin Streptavidin là một protein vi khuẩn có khảnăng liên kết với biotin với ái lực và độ đặc hiệu rất cao Cuối cùng, alkalinephosphatase sẽ chuyển hóa cơ chất không màu thêm vào thành cơ chất có màu

và có thể quan sát được trên màng lai [29]