NGHIÊN cứu hệ THỐNG tái SINH IN VITRO PHỤC vụ CHUYỂN GEN ở cây đậu NHO NHE (VIGNA UMBELLATA)

Còn đối với đậu Nho nhe, một loài cây hai lá mầm có thể tái sinh trong ống nghiệm hay không, tái sinh từ bộ phận nào của cây,công thức môi trường thích hợp cho tái sinh đa chồi.. - Nghiê

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu Nho nhe có tên khoa học Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & Ohashi

thuộc họ Đậu (Fabaceae) hay thường được gọi là đậu gạo, đậu nâu Loài đậunày được phát hiện lần đầu tiên ở Ấn Độ, sau đó được Ohwi và Ohashi miêu

tả khoa học đầu tiên vào năm 2010 Đậu Nho nhe phân bố khá rộng từ miềnNam Trung Quốc sau đó lan rộng ra miền Bắc Việt Nam, Lào, Thái Lan, Ởnước ta, đậu Nho nhe được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc nhưCao Bằng, Lào Cai, Yên Bái

Đậu đỗ nói chung và đậu Nho nhe nói riêng là nhóm cây có giá trị dinhdưỡng cao, đóng vai trò thiết yếu để nâng cao tiêu chuẩn thực phẩm cho conngười đặc biệt ở những nước đang phát triển trong tình trạng thiết hụt protein.Đậu Nho nhe thường được sử dụng làm thức ăn cho người và vật nuôi, là câymột năm, hệ rễ phát triển mạnh, có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạmnên thường được trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạcmàu chống xói mòn Đậu Nho nhe là cây sinh trưởng rất nhanh, sau 3 tháng

có thể phủ kín đất, đặc biệt hàm lượng dinh dưỡng trong thân và lá cao, làmphân bón rất tốt Một số những nghiên cứu gần đây, còn cho thấy đậu Nhonhe ngoài là cây lương thực thiết yếu còn có tác dụng trong việc chữa bệnh ỞTrung Quốc, đậu Nho nhe được dùng như một loại dược liệu để chữa cácbệnh liên quan đến đau nhức xương khớp, hay sắc uống để giải độc, giảm phù

nề [41]

Tuy nhiên, các cây trồng thuộc họ Đậu có khả năng chống chịu kém đốivới các tác nhân bất lợi từ ngoại cảnh và khả năng này ngày càng bị suy giảmnghiêm trọng do biến đổi khí hậu Do vậy nghiên cứu tìm biện pháp cải thiện

khả năng chống chịu của cây họ Đậu nói chung và cây đậu Nho nhe nói riêngđược quan tâm và mang tính thời sự.

Có nhiều cách tiếp cận nghiên cứu nâng cao khả năng chống chịu củacây họ Đậu bằng lai hữu tính, đột biến thực nghiệm và công nghệ gen Trong

đó ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để làm tăng khả năng chống chịu các stressphi sinh học là một hướng tiếp cận có triển vọng Việc xây dựng hệ thống táisinh là một trong những giai đoạn có ý nghĩa quan trọng và quyết định rất lớnđến sự thành công của kỹ thuật chuyển gen Đối với các cây họ Đậu như đậu

tương, đậu xanh, đậu cove việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro đã được

nghiên cứu và khẳng định Còn đối với đậu Nho nhe, một loài cây hai lá mầm

có thể tái sinh trong ống nghiệm hay không, tái sinh từ bộ phận nào của cây,công thức môi trường thích hợp cho tái sinh đa chồi Đây là những câu hỏi đặt

ra cho nghiên cứu này

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn

thạc sĩ là: “Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen ở cây

đậu Nho nhe (Vigna umbellata)”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được hệ thống tái sinh đa chồi in vitro phục vụ chuyển gen ở

cây đậu Nho nhe

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt để tạo mẫu sạch trong ống nghiệm.

- Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro qua mô sẹo, nách lá mầm, chồi ngọn.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetin đến sựtạo đa chồi ở cây đậu Nho nhe

- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro.

- Nghiên cứu điều kiện chuyển cây đậu Nho nhe in vitro ra ngoài môi trường tự

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU NHO NHE

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học của đậu Nho nhe

Đậu Nho nhe có những tên khác như: đậu gạo, đậu nâu, đậu Cao Bằng,

đậu đà, thua dài Tên khoa học của đậu Nho nhe là Vigna

umbellata (Thunb.) Ohwi & Ohashi Đậu Nho nhe thuộc chi Đậu (Vigna), họ

Đậu (Fabaceae), bộ Đậu (Fabales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida).

Chi Vigna là một trong những chi lớn của họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ là

Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus, Ceratotrophic, Lasionspron, Sigmoidotrotopis Đậu Nho nhe theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loại

thuộc hai chi phụ là Vigna và Ceratotrophic Chi phụ Ceratotrophic còn được

gọi là nhóm đậu Châu Á mang những mức độ điển hình thể hiện ở mức độ

cao nhất cho Vigna Năm 1970, Vercourt đã công bố 5 trong 16 loài của

Ceratotrophic đã được thuần hóa là: Đậu xanh ( Vigna radiata (L.) Wilczel),

đậu gạo (Vigna umbellata (Thunb.)), đậu adzukia (Vigna anguilaris (Willd), đậu ván (Vigna aconiti (Jacp)), Vigna trilobala (L.) Wilczel.

Đậu Nho nhe là dạng cây thân thảo, có thể mọc thẳng đứng, bán thẳnghoặc xoắn có dây leo, thường có chiều dài từ 30-100 cm, một số loài có thểcao đến 200 cm Thân cây có rãnh, phân nhánh Khi cây còn non có lôngngắn, mịn, trắng phát triển bao phủ, lông này sẽ rụng dần khi cây lớn lên

Lá của đậu Nho nhe phần lớn là mọc cách, thường là lá kép ba lá chét, lákèm hình ngọn giáo, chiều dài của lá từ 6-9 cm, cuống lá dài từ 5-10 cm Hệthống rễ của đậu Nho nhe phát triển mạnh mẽ, rễ cái có thể cắm sâu xuống đất100-150 cm có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm

Hoa thường có màu vàng tươi hoặc vàng nhạt Cụm hoa hình chùm mọc

ra từ nách lá Hoa lưỡng tính, đều hoặc không đều, mẫu 5 Hoa thường có 10nhị, màng hạt phấn có 3 rãnh - lỗ Bộ nhụy gồm có 1 noãn với nhiều noãn đảohay cong

Quả của đậu Nho nhe dài hình dải cong, mọc đứng dài từ 7,5-12,5 cm,rộng 4- 6 mm, chứa khoảng 6-10 hạt Hạt đậu dài 6-8 mm, rốn hạt lõm Hạtđậu Nho nhe có màu sắc đa dạng: vàng lục, vàng nâu, nâu, đen, đốm hoặcmàu rơm Các hạt màu vàng lục thường trở thành màu nâu vàng trong quátrình lưu trữ Hạt màu vàng nâu được cho là có giá trị dinh dưỡng cao hơn cả.Đậu Nho nhe phát triển nhanh vào mùa hè Ở Ấn Độ và Nepal, đậu Nhonhe được gieo vào tháng 2, tháng 3 để thu hoạch vào mùa hè và tháng 7,tháng 8 để thu hoạch vào tháng 12 Thời kỳ sinh trưởng của cây thay đổi tùytheo giống và vùng địa lý Khi được trồng ở Ăng-gô-la (vĩ độ 6°-17°S), theobáo cáo, cây trưởng thành sau 60 ngày kể từ khi gieo hạt, nhưng ở Tây Bengal

ở bán cầu bắc, cây trồng cần khoảng 130 ngày để tạo ra năng suất hạt giốngkinh tế [40]

Đậu Nho nhe là một cây họ đậu linh hoạt có thể phát triển ở vùng cậnnhiệt đới ẩm đến khí hậu ôn đới ấm áp và mát mẻ Cây không chịu đượcsương giá nhưng chịu được nhiệt độ cao, thường được tìm thấy mọc ở nhữngkhu vực có nhiệt độ trung bình từ 18-30°C Phạm vi nhiệt độ cho sự tăngtrưởng là 10-40°C với mức tối ưu trong khoảng từ 18-30°C Đậu Nho nhephát triển tốt ở vùng khí hậu ẩm ướt và mặc dù có khả năng chịu hạn tốt,nhưng để có năng suất tốt, nó đòi hỏi lượng mưa hàng năm là 1000-1500

mm Phạm vi lượng mưa hàng năm được báo cáo cho cây tăng trưởng là

300-2000 mm với mức tối ưu trong khoảng 700-1500 mm Đậu Nho nhe phát triển

mạnh trong điều kiện ánh sáng đầy đủ, sự tăng trưởng của nó có thể bị cản trởnếu trồng xen canh với cây trồng khác chẳng hạn như ngô, lúa [40].

Loài đậu này có thể được trồng trên nhiều loại đất, cả những loại đấtthoái hóa, khô cằn, nghèo dinh dưỡng nhưng để có năng suất tối ưu, nó đòihỏi phải có đất màu mỡ Tuy nhiên, độ phì nhiêu của đất cao có thể cản trở sựhình thành quả và làm giảm năng suất hạt Phạm vi pH đất cho sự tăng trưởng

là 5,5-8 với mức tối ưu trong khoảng 6-7,5

Đậu Nho nhe là một loại cây khỏe mạnh, có khả năng chống lại nhiềuloại sâu bệnh, nó không cần phân bón hoặc chăm sóc đặc biệt trong quá trìnhtăng trưởng Nó có nguồn gốc từ châu Á, được tìm thấy đầu tiên ở Ấn Độ vàmiền trung Trung Quốc sau đó lan sang Malaysia Loài đậu này được người ẢRập đưa vào Ai Cập, dọc theo bờ biển phía Đông châu Phi và các đảo Ấn ĐộDương Ngày nay, đậu Nho nhe được trồng rộng rãi ở các nước nhiệt đới châu

Á, ít được trồng ở Hoa Kỳ, Úc, Tây Nam châu Á, vùng nhiệt đới châu Phi vàchâu Mỹ Ở các cùng nhiệt đới châu Phi, nó được trồng ở Tây Phi, Đông Phi

và các đảo Ấn Độ Dương, và ít gặp hơn ở Trung và Nam Phi Ở nước ta, đậuNho nhe được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Cao Bằng, LàoCai, Yên Bái,

Hiện nay, chưa có số liệu cụ thể về tình hình sản xuất đậu Nho nhe, tuynhiên loài đậu này được sản xuất chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, Nhật Bản

là nước nhập khẩu chính, các nhà xuất khẩu chính là Thái Lan, Myanmar vàTrung Quốc Madagascar cũng là một trong những nước xuất khẩu chính đậuNho nhe Xuất khẩu trung bình hàng năm từ năm 1998-2000 ước tính là 1100triệu tấn [40]

Hình 1.1 Cây đậu Nho nhe (ảnh chụp của tác giả tại vườn thí nghiệm Khoa

Sinh học, 6/2018)

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng của đậu Nho nhe

Đậu Nho nhe là một loại đậu ít được biết đến và chưa được sử dụngđúng cách Tuy nhiên, gần đây loại đậu này đã gây được sự chú ý nhờ giá trịtiềm năng về mặt dinh dưỡng của nó Chất lượng dinh dưỡng của hạt đậu Nhonhe cao hơn so với nhiều loại đậu khác thuộc họ Vigna Trong nghiên cứuhiện tại, 16 kiểu gen khác nhau của hạt đậu Nho nhe đã đánh giá được cácthành phần dinh dưỡng chính là: hàm lượng protein, chất béo tổng hợp, chất

xơ, carbohydrate, vitamin, khoáng chất, axit amin và axit béo [28] Hạt đậuNho nhe khô chứa nước 13,3%, protid 20,9%, lipid 0,9%, glucid 64,9%, xơ4,8%, tro 4,2%, 100g cung cấp năng lượng là 1373KJ Ðậu gạo còn chứanhiều Ca, Fe, P và các loại vitamin của nhóm B như thiamin, niacin,

so với các loại cây trồng họ Đậu khác tốt cho các bà mẹ đang cho con bú.Protein cô đặc được điều chế từ hạt đậu đã cho thấy tác dụng chống tăng

huyết áp ở chuột đồng Botrytiscinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia

solani và Mycosphaerella arachidicola [16] Hơn nữa, nó đã cho thấy giảm

thiểu và chống lại hoạt động sao mã ngược của HIV-1 [18] Ở Ấn Độ lá đậuNho nhe cùng với bột gạo được dùng làm thuốc đắp vào bụng để trị đau dạdày.Tuy nhiên, các yếu tố chống dinh dưỡng cũng tìm thấy trong hạt đậu Nhonhe bao gồm các yếu tố ức chế trypsin, phytates, tannin và oligosacarit Việcngâm, tách vỏ, nảy mầm và nấu chín có thể làm giảm đáng kể các yếu tốchống dinh dưỡng này [33], [34]

Đậu Nho nhe là một cây họ đậu đa năng, không phổ biến như các loại

đậu khác: đậu đũa (Vigna unguiculata), đậu adzuki (Vigna angulari) và đậu xanh (Vigna radiata), đậu Nho nhe lại là một loại thực phẩm quan trọng và

thiết yếu trong dinh dưỡng của con người ở các nước đang phát triển, thiếuhụt nguồn dinh dưỡng trong thức ăn như: Ấn Độ, Nepal, Thái Lan…trong đó

có Việt Nam đặc biệt là các tỉnh miền núi phía Bắc (Lào Cai, Yên Bái, CaoBằng…)

Tất cả các bộ phận của cây đậu đều có thể ăn được và sử dụng trong cácchế phẩm thức ăn Hạt khô có thể luộc, ăn với cơm hoặc chúng có thể thaygạo khi hầm hoặc nấu soup Ở một số nước, hạt này được xay ra để tạo thànhloại bột dinh dưỡng có trong thức ăn dành cho trẻ em Quả non, lá, rau mầmđược luộc và ăn như rau Quả non đôi khi còn để ăn sống Đậu Nho nhe rấthữu ích cho chăn nuôi Những thứ còn lại sau thu hoạch như thân cây, lá,hạt… có thể để tươi hoặc phơi khô sử dụng làm thức ăn cho ra súc

Đậu Nho nhe được dùng để làm phân xanh, nó mọc rất nhanh và che phủkín mặt đất như một hàng rào sống hay hàng rào sinh học Ở những ngọn đồi

ở vùng biên giới Nepal, người nông dân dùng cây đậu với hai mục đích chính

là làm thức ăn cho gia súc, cải tạo các loại đất

1.2 NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

1.2.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tính toàn năng của tế bào

Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang thông tin di truyền giốngnhau Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau Các tếbào được lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinhtrưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ…) đều có thể được kích thích để tái sinh thànhcây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài, phát triển và ra hoa kết quả bình thường.Quá trình này có thể thông qua phát sinh cơ quan hoặc hình thành phôi vôtính và được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp có bổ sung cácchất kích thích sinh trưởng cần thiết Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thểthực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc là phát triểnthành tế bào mô sẹo Đó là loại tế bào không phân hoá, phân chia liên tục và

có khả năng phân hoá thành phôi, chồi để tạo cây hoàn chỉnh Khả năng đógọi là tính toàn năng của tế bào [9], [14]

Phản biệt hóa và tái biệt hóa

Quá trình tái sinh được chia làm hai giai đoạn: phản biệt hóa và tái biệt hóa.Phản biệt hóa là giai đoạn đưa tế bào từ trạng thái đã biệt hóa trở lạitrạng thái chưa biệt hóa Các tế bào đã biệt hóa là những tế bào có chức năngnhất định và có cấu trúc phù hợp để hoàn thành chức năng ấy Quá trình phảnbiệt hóa biến tế bào đã biệt hóa thành những tế bào có hình thức giống nhưnhững tế bào ở đỉnh sinh trưởng (tế bào mầm phôi), chúng có đặc điểm: tếbào đậm đăc, không bào nhỏ li ti hoặc không có, nhân to, kích thước tế bào

lớn Những tế bào như vậy coi như đã được phản biệt hóa xong và trongnhững điều kiện nuôi cấy nhất định chúng sẽ phát triển thành cơ thể mới Các

mô phản biệt hóa cần nuôi trên môi trường chứa các chất kích thích sinhtrưởng thuộc nhóm Auxin gồm: 2,4-D, α-NAA, IAA, IBA [7]

Tái biệt hóa là giai đoạn tế bào đã phản biệt hóa phát triển thành câyhoàn chỉnh và chỉ có các tế bào phôi mới có thể hình thành cơ thể mới [7].Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệthóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau Những tế bàocàng chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy

ra quá trình biệt hóa và ngược lại, như các tế bào mạch dẫn ở thực vật, tế bàothần kinh ở động vật Người ta đã chứng minh rằng: những tế bào càng gầntrạng thái của phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấynhiêu [1]

1.2.2 Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật

Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét cácthành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Đầu những năm 20

đã có một số công trình sử dụng môi trường dinh dưỡng tổng hợp, ngoài muốikhoáng và nguồn cacbon còn bổ sung thêm vitamin và một số chất khác [7].Trong những năm 60, nhiều môi trường nuôi cấy đã được xây dựng và được

sử dụng cho đến nay chỉ cần cải tiến chút ít. Đó là các môi trường White,

Knop (1953), Môi trường giàu chất dinh dưỡng Murashige - Skoog (1963)

[23]; Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình Gamborg (1968).

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài và

bộ phận nuôi cấy Tùy theo mục đích nuôi cấy muốn duy trì mô ở trạng thái

mô sẹo, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh, môi trườngnuôi cấy phải thay đổi nhiều hay ít Tuy vậy, tất cả các môi trường nuôi cấy

bao giờ cũng có các thành phần chính gồm: muối khoáng, cacbon, vitamin,các chất điều khiển sinh trưởng, các nhóm chất bổ sung, chất độn [7].

Các nguyên tố khoáng đa lượng:

Là những nguyên tố muối khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm,tức là trên 30mg/l, bao gồm các nguyên tố sau: N, P, S, K, Mg, Ca Cácnguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào vàxây dựng lên thành tế bào

được thử nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được sử dụng trong nhữngtrường hợp đặc biệt.

Vitamin

Mặc dù các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự

tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do

đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài, đặc biệt các vitamin thuộc nhóm B như:Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B6 Myo-inositol cũng hay được sử dụng

vì nó có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp thành tế bào

Các chất kích thích sinh trưởng

Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả

cũng như sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro Nó ảnh hưởng

trực tiếp tới sự phản biệt hóa, tái biệt hóa và sinh trưởng của tế bào, đặc biệt

là sự biệt hóa các cơ quan như chồi và rễ Nhu cầu về chất kích thích sinhtrưởng đối với từng loài cây qua từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau Vì vậy,

để nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thể để

tìm ra nồng độ cũng như tỷ lệ các chất kích thích sinh trưởng phù hợp

Người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật

đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic Những chất này đượcphân thành các nhóm vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý,tuy nhiên tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu mà chúng có những tác độngchồng chéo và hỗ trợ nhau Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạnsinh trưởng nhất định Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng banhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin, giberelin.[11], [13]

Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh líhọc thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất Auxin là những hoocmon thực

vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan,kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào.Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α-naphtylaxetic axit (NAA), Indotaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độcnhưng có tác dụng kích thích quá trình phânchia tế bào và thường được sửdụng nhiều nhất, NAA có tác dụng tạo rễ cho cây non [11], [13].

Nhóm cytokinin là nhóm chất hóa học có ảnh hưởng quyết định đến kíchthích phân chia tế bào Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 – Benzylamino purine (BAP); 6-Dimethylalylamnino purine(2iP); Zeatin Hiện naymột thế hệ mới của chất điều hòa sinh trưởng, chẳng hạn như thidiazuron(TDZ) – một cytokinin thuộc các phenylureas, đang nổi lên như là một thaythế thành công cho tái sinh trực tiếp với tần số cao của phôi vô tính [17], [26].Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua quá trình nghiên cứu bệnhnấm lúa von Nó tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thểcao lên được, như ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng Đạidiện cho nhóm này là axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nôngnghiệp [11], [13]

Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển củacây nhưng gần đây nó mới được coi là hoocmon thực vật Ethylen thườngđược sử dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnhhưởng đến quá trình phân bào Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng

độ cao sẽ kéo dài khả năng ra rễ của thân [11], [13]

Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởngđến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số câyngắn ngày thông qua việc tổng hợp ARN và protein [11], [13]

Nước dừa chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, được sử dụng để cung cấpdinh dưỡng cho mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật Các chất có hoạt tính trongnước dừa hiện đã được chứng minh là myo-insitol và một số amino acid khác.Nước dừa được sử dụng để kích thích sự phân hóa và nhân nhanh chồi ởnhiều loài cây Nước dừa thường được lấy từ quả để sử dụng tươi hoặc saubảo quản

Ngoài nước dừa, chuối xanh, khoai tây và cà chua cũng là những chất tựnhiên giàu dinh dưỡng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật

Than hoạt tính cũng là một chất phụ gia có nhiều tác dụng tích cực trongnuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện tối cho môi trường nuôicấy, có tác dụng hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vậtnhư các hợp chất phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ môi trường nuôi cấy Nhữngchất này gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Than hoạt tính làm thayđổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sựkích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ Ngoài ra, than hoạt tính cũng

có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin, làm thay đổi tỉ lệ thành phầncác chất có trong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường

1.2.3 Các yếu tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Vật liệu nuôi cấy

Tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: Mô phân sinhngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non,… khi đặt vào môitrường có chứa một lượng hoocmon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Tuynhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành

rễ, thân, cành, lá,… rất khác nhau Do đó việc chọn mẫu thực vật để sử dụngtrong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định Các kết quả nghiên cứu cho thấy,

để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng

đến các chồi bên và mô phân sinh đỉnh [3].

Vô trùng trong nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợpcho các loài nấm, vi khuẩn phát triển Để đảm bảo điều kiện vô trùng trongquá trình nuôi cấy đòi hỏi các yêu cầu sau: Vô trùng mô cấy, vô trùng dụng

cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy Trong thao tác cấy cần phải tránh làm rơinấm, khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy Mô cấy có thể là các bộ phậnkhác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các

bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm Phương pháp vô trùng mẫu cấyphổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn Hiệulực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ

và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy Ngoài ra, còn sử dụngcác chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol vào dungdịch diệt nấm, khuẩn [5], [14]

Ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả

năng nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố Cường độ ánh sáng trên

dàn nuôi cấy phải là ánh sáng có phổ gần như ánh sáng tự nhiên (230 -780nm) Nhiệt độ của phòng nuôi cấy được duy trì từ 25 -28oC [5]

Môi trường nuôi cấy

Tất cả các môi trường nuôi cấy đều gồm năm thành phần chính sau: cácmuối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nguồn cacbon, các chất điều hòasinh trưởng, chất độn Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu

cơ có thành phần xác định như acid amin, hoặc không xác định như: nướcdừa, dịch chiết nấm men,…vào trong môi trường tùy theo nhu cầu riêng của

được xây dựng và được sử dụng cho đến ngày nay, đó là các môi trường: Môi

trường nghèo chất dinh dưỡng White, Knop (1953); Môi trường giàu chất dinh dưỡng Murashige - Skoog (1963) [23]; Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình Gamborg (1968) [8].

1.3 HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY

HỌ ĐẬU

Trong thực tế thì các cây họ Đậu nói chung và cây đậu Nho nhe nóiriêng đều được sản xuất dễ dàng và hoàn toàn không có nhu cầu cần nhângiống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Tuy nhiên, việc nghiên cứu chuyểngen ở các cây họ Đậu sẽ khó thực hiện và thành công nếu trước hết không tiếnhành việc tái sinh cây Rudrabhatla Sairam và cs (2005) đã tổng hợp các kếtquả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá mầm và cây hai lá

mầm; sự tái sinh cây được thực hiện bằng nuôi cấy in vitro từ phôi soma

hoặc từ một bộ phận khác độc lập trên cây và điều đó còn phụ thuộc vàokiểu gen của giống [32]

Các cây trồng họ Đậu đều thuộc lớp 2 lá mầm,việc xây dựng hệ thống

tái sinh in vitro đã được nghiên cứu và khẳng định Một số nghiên cứu hệ thống tái sinh ở một loài cây thuộc chi Vigna đã thu được kết quả khả quan Kết quả tạo phôi soma từ tế bào nuôi cấy huyền phù ở cây đậu đũa (Vigna

unguiculata) được thực hiện bởi Ramakrishnan và cs (2005) [29] và cũng

bằng phương pháp này Prem và cs (2001) đã thu tần số tái sinh in vitro cao [27] Nghiên cứu khả năng tái sinh của 27 giống Đậu thuộc chi Vigna có

nguồn gốc từ Phillipine, Madagascar, Pakistan, India, Australia, China, JapanRenato và cs (2001) đã cho thấy kỹ thuật tái sinh cây từ nách lá mầm của hạtnảy mầm 4 ngày tuổi đạt hiệu quả tái sinh 80% - 100% và tái sinh chồi trực

tiếp từ mắt lá mầm như là chỉ thị cho hệ gen của loài đậu Vigna châu Á

(subgenus Ceratotropis) [30], [31] Tái sinh từ nách lá mầm của cây (Vigna

unguiculata (L.) Walp.) có tỷ lệ tái sinh là 100% Jayanti Sen và Spra Guha

Mukherjee (1998) đã công bố kết quả nghiên cứu tái sinh cây ở đậu xanh từphôi soma và từ nách lá mầm phục vụ chuyển gen [21], Ignacimuthu vàFranklin (1999) [19], Renato và cs (1999, 2001) [30], [31], Mai Trường và cs(2001) [12], Sita và cs (2006) [37], Kaviraj và cs (2006) [22] Năm 2007,Sonia và cs đã thu được kết quả chuyển gen mã hóa protein ức chế enzyme α-

amylase vào cây đậu xanh thông qua lây nhiễm bằng Agrobacterium được

thực hiện nhờ tái sinh đa chồi từ nách lá mầm [38] Đánh giá hiệu quả chuyển

gen ở cây Vigna mungo khi sử dụng kỹ thuật cấy in vitro từ nách lá mầm của

Muruganantham và của Amutha và cs (2006) cũng đã khẳng định hiệu quảcủa phương pháp này [24] Bhadra và cs (1991) đã nghiên cứu tái sinh đa chồithành công trên cây đậu Nho nhe Các chồi được tạo ra từ nách lá mầm củahạt đậu Nho nhe nảy mầm trên môi trường MS cơ bản, bổ sung muối B5,NAA (0,1-0,5mg/l), BAP (0,5mg/l), kinetine (0,5mg/l) và zeatin (0,5-1mg/l),môi trường kéo dài chồi được bổ sung IBA (0,005mg/l) và BAP (0,2mg/l),Cây ra rễ trên môi trường MS cơ bản [15] Tuy nhiên cho đến nay có rất ítcông trình nghiên cứu tối ưu tái sinh đa chồi ở đậu Nho nhe

Sự tái sinh in vitro ở cây đậu tương được tạo đa chồi từ nách lá mầm đã

được nghiên cứu, tuy nhiên đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thực

hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo mô sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và

ra cây [3] Những năm gần đây, kết quả tái sinh đa chồi từ nách lá mầm củađậu tương được công bố bởi Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Nguyễn ThuHiền (2014), Lò Thị Mai Thu (2014), Lò Thành Sơn (2015) [2], [4], [6],[10] Các tác giả đã làm nghiên cứu được các chồi được tạo ra từ nách lámầm hạt đậu tương nảy mầm đã gây tổn thương trên môi trường MS cơ bản,

0,5mg/l + IAA 0,1mg/l, ra rễ trên môi trường bổ sung IBA 0,1mg/l và ra câytrong bầu ở điều kiện nhà lưới.

Việc chuyển gen để tạo nên những dòng cây chuyển gen có đặc tínhsinh học ưu việt hơn giống gốc là cần thiết; tuy nhiên tỷ lệ thành công củachuyển gen vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy và tái

sinh in vitro sau chuyển gen Tái sinh cây in vitro với hiệu suất cao được xem

là mấu chốt quyết định đến sự thành công trong quy trình tạo cây chuyển gen[36]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu thực vật

Hạt đậu Nho nhe thu tại huyện Lục Yên, Tỉnh Yên Bái có hạt nhỏ, nhiềumàu khác nhau như xanh, vàng nâu, nâu đen Hạt đậu Nho nhe không bị mọt,nấm mốc được khử trùng, cho nảy mầm trong ống nghiệm để thu nguyên

liệu phục vụ nghiên cứu tái sinh in vitro.

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật,khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Thời giannghiên cứu từ tháng 5/2018 đến tháng 4/2019

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ thí nghiệm tổng quáttrình bày ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

2.2.1 Phương pháp khử trùng hạt, tạo cây con nuôi cấy in vitro

Mẫu nuôi cấy là hạt đậu Nho nhe trưởng thành có thể nhiễm nấm mốc và

vi khuẩn vì vậy cần phải khử trùng để loại bỏ

Chọn khoảng 100-150 hạt đậu Nho nhe: hạt mẩy, vỏ bóng mịn, rốn hạt

rõ, hạt có màu vàng nâu Tiến hành khử trùng trong box cấy Hạt đậu Nho nheđược chọn tráng qua nước cất vô trùng 2-3 lần sau đó khử trùng bề mặt bằngcách lắc nhẹ trong cồn 70 độ với thời gian 1 phút, sau đó tráng lại bằng nướccất khử trùng 3 lần Thêm dung dịch Javen, lắc đều trong 20-25 phút, sau đórửa bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần Thí nghiệm với các nồng độ Javen

và thời gian khác nhau như sau để tìm kết quả tốt nhất:

Javen 50%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút;

Javen 60%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút;

Javen 70%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút;

Môi trường hạt nảy mầm: Hạt sau khi khử trùng được thấm khô bằnggiấy thấm khử trùng và cấy vào bình tam giác chứa môi trường nảy mầm GMbảng 2.1 có bổ sung agar 9g/l, sucrose 30g/l Nuôi bình hạt trong phòng nuôicấy có ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Ngày tuổi của hạt nảy mầm được tính kể từ khi gieo hạt Khảo sát khảnăng nảy mầm hạt sau 7 ngày, theo dõi tỷ lệ nảy mầm của hạt

2.2.2 Tái sinh chồi đậu Nho nhe thông qua mô sẹo

Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (6-7 ngày tuổi), lựa chọn các câycon có lá thật, kích thước 3-4 cm, tiến hành dùng kéo thu lá, cắt bỏ viền lá vàgân chính Sau đó cắt thành những mảnh lá có kích thước khoảng 0,5 x 1cmđặt vào môi trường cảm ứng mô sẹo gồm: MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l,pH=5,8, 2,4-D (0-4mg/l) Cấy mật độ 6 mẫu/ bình môi trường loại 250ml Mẫu được chia thành hai lô, ở lô thứ nhất, mẫu nuôi cấy dưới ánh sángđèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gianchiếu sáng 12 giờ/ ngày Ở lô thứ hai, mẫu được nuôi cấy 7 ngày trong tối,sau đó được đưa ra nuôi cấy 2 tuần dưới điều kiện phòng nuôi cấy (ánh sáng

2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày ) Xác định tỷ

lệ mẫu tạo mô sẹo, đánh giá chất lượng mô sẹo trên các công thức thí nghiệm.Công thức đối chứng sử dụng môi trường MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l, không

bổ sung các chất kích thích sinh trưởng

Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo thu được sau 3 tuần nuôi cấy theo công thức:

Rc = Nsv Nr (%)Trong đó

Rc: Tỷ lệ tái sinh chồi (%);

Nr: Tổng số mô tái sinh chồi;

Nsv: Tổng số mô nuôi cấy;

2.2.3 Tái sinh đa chồi đậu Nho nhe thông qua nách lá mầm và chồi ngọn

(1) Nách lá mầm:

Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (3-4 ngày tuổi) thì tiến hànhdùng dao cắt bỏ phần thân và rễ mầm, vết cắt dưới mắt lá mầm khoảng 2-3mm Tách đôi 2 lá mầm thành 2 mẫu cấy riêng biệt sao cho phần thân mầmcòn lại được chia đều cho 2 lá mầm Cắt ngang bỏ phần đuôi lá mầm, tiếp đếnhủy bỏ chồi chính và gây tổn thương nách lá mầm bằng cách dùng mũi dao

nhọn chích nhẹ 5-7 lần vào cùng nách lá mầm Như vậy, từ một hạt giống nảymầm cho ra 2 mẫu cấy Sau đó các mẫu cấy được cấy úp nghiêng 45 độ trênmôi trường cảm ứng chồi SIM bảng 2.1 Cấy với mật độ 6 mẫu/ bình môitrường loại 250ml, nuôi cấy trong 8 tuần.

(2) Chồi ngọn:

Hạt đâu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (5-6 ngày tuổi), tiến hành dùngkéo cắt lấy đoạn ngọn (3-4cm) ra khỏi bình, tiếp đó cắt lấy phần chồi ngọn(0,5-1cm), cắt bỏ lá giữ lại phần cuống lá và chồi ngọn Sau đó các mẫu cấyđược cấy vào môi trường cảm ứng chồi SIM bảng 2.1 Cấy với mật độ 6 mẫu/bình môi trường loại 250ml, nuôi cấy trong 8 tuần

Đánh giá tỷ lệ tạo đa chồi trên từng vật liệu nghiên cứu (nách lá mầm,chồi ngọn) sau 8 tuần theo công thức:

Ci (%) = Ncp Nt x 100%

Trong đó:

Ci: Tỷ lệ tái sinh chồi ;

Ncp: Tổng số mẫu tái sinh chồi ;

Nt: Tổng số mẫu nuôi cấy ;

2.2.4 Môi trường ra rễ

Khi chồi đạt chiều cao từ 4-5cm, chuyển sang môi trường ra rễ RM bảng2.2 để tạo cây hoàn chỉnh Mỗi bình cấy từ 3-4 mẫu Đánh giá khả năng hìnhthành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 8 tuần

Bảng 2.1 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống tái

sinh cây đậu Nho nhe

Cảm ứng nảy mầm GM MS*; sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8

Cảm ứng tạo đa chồi SIM

MS*; BAP (0,5, 1, 1,5, 2mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; nước dừa 10%; pH = 5,8MS*; Kinetine (0,5, 1, 1,5, 2mg/l); sucrose30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8

Cảm ứng ra rễ RM MS*; IBA (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5mg/l);

sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8

Chú thích: MS*: Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog, 1962 [23].

Các khâu nuôi cấy từ tạo cảm ứng đa chồi đến khi ra rễ được tiến hành ởnhiệt độ dao động trong khoảng 25oC ± 2oC, dưới ánh sáng đèn của phòng câyvới cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày

Bảng 2.2 Giá thể nuôi cây

2.2.6 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu

Sử dụng bộ phần mềm SPSS để phân tích các trị số thống kê như trungbình mẫu, sai số và so sánh sự khác nhau giữa các trị số trung bình ở mức ýnghĩa α =0,05

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG HẠT ĐẬU NHO NHE

Vô trùng mẫu cấy là bước đầu tiên đóng vai trò quyết định sự thành công

của việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro Vì vậy, cần lựa chọn phương

pháp khử trùng và loại hóa chất thích hợp để loại bỏ hoàn toàn các nguồn vikhuẩn, nấm mốc, virus khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy Córất nhiều loại hóa chất được sử dụng để khử trùng Tuy nhiên, nồng độ khửtrùng thích hợp cho các đối tượng khác nhau là hoàn toàn khác nhau

Hạt đậu Nho nhe là loại hạt nhỏ, giàu chất dinh dưỡng điều kiện lý tưởngcho các loại vi sinh vật, nấm mốc phát triển Vì vậy, việc nghiên cứu đưa racông thức khử trùng tối ưu là rất cần thiết để chuẩn bị mẫu cho quá trình nuôi

cấy in vitro tiếp theo Phương pháp khử trùng thích hợp phải đảm bảo được

các yêu cầu, tỷ lệ hạt bị nhiễm thấp, thân mầm to, mập và chồi sinh trưởngphát triển tốt

Chúng tôi đã tiến hành vô trùng sơ bộ hạt đậu Nho nhe bằng cách lắcnhẹ hạt trong cồn 700 1 phút và javen ở các nồng độ 50%, 60%, 70% vớingưỡng thời gian khác nhau 15, 20, 25 phút Sau khi khử trùng, hạt được cấyvào môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l và agar 9 g/l Đánh giá khảnăng thu được mẫu sạch và khả năng nảy mầm của hạt là bước tiếp theo đểtìm ra công thức khử trùng tốt nhất

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, đối với công thức khử trùng 1, sử dụngdung dịch Javen pha loãng 50% cho thấy tỷ lệ mẫu nhiễm rất cao, tỷ lệ nảymầm thấp Cụ thể với thời gian khử trùng là 15, 20, 25 phút tỷ lệ mẫu nhiễmlần lượt là 30%, 23%, 17%, tỷ lệ nảy mầm lần lượt 70%, 77%, 82% Nếu tăngthời gian khử trùng tỷ lệ mẫu nhiễm có thể sẽ giảm nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm

độc sẽ tăng ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt cũng như chất lượngchồi.

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ Javen và thời gian khử trùng đến sự nảy

mầm của hạt đậu Nho nhe sau 7 ngày nuôi cấy

(%)

Thờigiankhửtrùng(phút)

Số mẫu(hạt)

Kết quảMẫu

nhiễm(%)

Mẫu chết(%)

Mẫusạch (%)

Nảymầm (%)

Ở công thức khử trùng 2, với dung dịch javen pha loãng 60% tỷ lệ mẫunhiễm giảm đáng kể đồng thời tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ hạt nảy mầm tăng cao.

Ở thời gian khử trùng là 15 phút thì tỷ mẫu nhiễm là 8%, thời gian 20, 25 phútthì tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm rất cao lần lượt là 98%, 90% tuy nhiên mẫu chếtlại xuất hiện ở thời gian khử trùng 25 phút với tỷ lệ 9% Như vậy, từ số liệutrên cho thấy công thức khử trùng thích hợp nhất là javen 60% với thời giankhử trùng là 20 phút

Kết quả nghiên cứu cho thấy, javen nồng độ 60% với thời gian 20 phút

là điều kiện thích hợp nhất cho khử trùng hạt đậu Nho nhe, tỷ lệ mẫu sạch100%, khả năng hạt bị chết thấp đảm bảo tỷ lệ nảy mầm cao 98% và chấtlượng chồi tốt Trong thực tế hạt đậu là đối tượng khó khử trùng, nếu khửtrùng bằng Javen ở nồng độ quá cao và thời gian quá dài thì tỷ lệ hạt bị tổnthương, bị chết cao, hạt nảy mầm kém và không đồng đều Ngược lại, nếunồng độ Javen thấp thì không đủ liều lượng để làm sạch cũng như diệt các visinh vật, nấm mốc nên tỷ lệ nhiễm sau khi cấy cao

Hình 3.1 Hạt đậu Nho nhe nảy mầm trên môi trường GM

3.2 TÁI SINH IN VITRO CÂY ĐẬU NHO NHE

3.2.1 Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ mô sẹo

Sử dụng mảnh lá cho thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo Lá đậu Nho nhe 6ngày tuổi được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước khoảng 0,5 x 1cm, cấytrên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo gồm: MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l; pH=5,8, 2,4-D (0-4mg/l), mẫu được chia thành 2 lô thí nghiệm Ở lô thứ nhất, mẫunuôi cấy dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ

25 ± 2oC Ở lô thứ hai, mẫu được nuôi cấy 7 ngày trong tối, sau đó được đưa

ra nuôi cấy 2 tuần dưới điều kiện phòng nuôi cấy (ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ

25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày)

Sau 3 tuần nuôi cấy, ở lô thứ 2 với 2,4-D nồng độ từ 0,5-3,5mg/l tỷ lệmẫu tạo mô sẹo là rất cao 95-100%, hầu hết tất cả các mẫu lá đều tạo mô sẹotuy nhiên tính chất mô sẹo có sự khác nhau ở các nồng độ Cụ thể ở nồng độ0,5mg/l; 1,5mg/l các mô sẹo đều màu trắng, đặc và có nhiều rễ không thíchhợp cho quá trình tái sinh Ở các nồng độ 2,0-3,5mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo giảmdần song tính chất mô sẹo đều không thích hợp cho quá trình tái sinh Ở côngthức đối chứng và 2,4-D nồng độ 4mg/l không tạo mô sẹo

Xét đồng thời các chỉ tiêu cho thấy 2,4-D nồng độ 1,0mg/l là công thứcthích hợp nhất cho quá trình tạo mô sẹo từ mảnh lá ở cây đậu Nho nhe

Trong đó, ở lô thứ nhất các mẫu nuôi cấy đặt trong điều kiện phòng nuôi cấy ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC không tạo mô sẹo, các mẫu cấy khô dần và chết.

Hình 3.2 Hình ảnh mô sẹo tạo từ mảnh lá sau 3 tuần nuôi cấy trên môi

trường bổ sung 2,4-D 1mg/lCác mô sẹo có chất lượng tốt nhất được thu từ mảnh lá được cấy chuyểnsang môi trường cảm ứng tạo chồi SIM ở bảng 2.1 Sau 4 tuần theo dõi, ở cácnồng độ BAP, kinetine khác nhau (0,5-2mg/l), các mẫu cấy đều không có khảnăng tái sinh, các mẫu cấy trở nên đen và mủn (Hình 3.3.)

Hình 3.3 Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường SIM sau 4 tuần

3.2.2 Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ nách lá mầm và chồi ngọn

Tái sinh chồi từ lá mầm

Đối với nhóm đậu đỗ nói riêng và nhóm cây hai lá mầm nói chung thìviệc sử dụng nách lá mầm làm vật liệu tái sinh đa chồi được xem như mộtphương pháp nhanh chóng và tương đối hiệu quả đem lại tỷ lệ đa chồi cao.Nách lá mầm đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng đặc biệt là các loại

thuộc họ Đậu: đậu Xanh [20], [30], đậu tương [25], Vigna mugo [35], lạc [39]

… Xuất phát từ những nghiên cứu trước, chúng tôi đã sử dụng lá mầm củacây đậu Nho nhe (3-4 ngày tuổi) để tạo đa chồi, mẫu cấy được cấy trên môitrường cảm ứng tạo đa chồi bảng 2.1, với các nồng độ khác nhau từ 0,5-2mg/l

để thăm dò nồng độ thích hợp

Sau khi cấy trên môi trường cảm ứng chồi SIM, mẫu cấy trở lên xanhhơn, diện tích bề mặt lá mầm, nách lá mầm tăng nhanh Sau 2 tuần, ở khu vựcgây tổn thương bằng kim nhọn sùi lên có màu trắng đục (Hình 3.4A) Sau 4tuần, màu sắc của lá mầm trở nên vàng hơn, các vết sùi khô lại, có màu nâu,ngừng phát triển (Hình 3.4B) Sau 6-8 tuần, lá mầm chuyển sang màu vàng,các khối mô sùi đen lại và chết, không có hiện tượng cảm ứng chồi (Hình3.4C)

Hình 3.4 Nách lá mầm được nuôi cấy trên môi trường cảm ứng chồi SIM

Trong thí nghiệm này, mỗi công thức được tiến hành trên 30 mẫu, thínghiệm được lặp lại 3 lần Sau 8 tuần, toàn bộ các mẫu cấy đều chết và không

có hiện tượng cảm ứng chồi Từ kết quả thí nghiệm trên có thể nhận thấy rằngchưa tìm được công thức tạo đa chồi phù hợp với vật liệu nách lá mầm

Tái sinh chồi từ chồi ngọn

Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (5-6 ngày tuổi), tiến hành dùngkéo cắt lấy đoạn ngọn (3-4 cm) ra khỏi bình, tiếp đó cắt lấy phần chồi ngọn(0,5-1 cm), cắt bỏ lá giữ lại phần cuống lá và chồi ngọn Sau đó các mẫu cấyđược cấy vào môi trường cảm ứng chồi SIM ở bảng 2.1, theo dõi và đánh giá

tỷ lệ đa chồi sau 8 tuần nuôi cấy

Sau khi cấy mẫu trên môi trường cảm ứng chồi SIM, mẫu cấy trở nênxanh hơn và phát triển nhanh về chiều cao Sau 2 tuần nuôi cấy, mặt cắt củachồi ngọn được tiếp xúc trực tiếp với môi trường cảm ứng tạo chồi bắt đầu cóhiện tượng sùi trắng, khối mô sùi có đường kính khoảng 1cm, các mẫu cấytăng nhanh về chiều cao và số lượng lá, chồi nách và chồi ngọn xuất hiện Sau

4 tuần, số lượng chồi và chiều cao chồi ở các mẫu cấy tăng đáng kể Từ tuần 6đến tuần 8, số lượng chồi ở mẫu cấy không tăng nhiều, chủ yếu phát triển vềchiều cao chồi và số lượng lá

Sau 8 tuần theo dõi cho thấy hầu hết chồi ngọn đều có khả năng tạo cảmứng chồi Vì vậy, chúng tôi lựa chọn chồi ngọn là vật liệu thích hợp để nghiêncứu tái sinh chồi, với tỷ lệ đa chồi tương đối cao

Hình 3.5 Hình ảnh đa chồi từ chồi ngọn sau 4 tuần nuôi cấy

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 2 chất kích thích sinh trưởngthuộc nhóm cytokinin là BAP và kinetin để tái sinh chồi từ chồi ngọn của câyđậu Nho nhe Tuy nhiên, sau 8 tuần theo dõi thì việc sử dụng kinetine để tạo

đa chồi không hiệu quả bằng BAP ở các nồng độ tương ứng và việc bổ sung

thêm 10% nước dừa vào môi trường nuôi cấy cũng làm tăng đáng kể tỷ lệ tạo

đa chồi cũng như chất lượng chồi (Hình 3.6.) Cụ thể: ở các nồng độ 0,5mg/l;1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l tỷ lệ đa chồi ở BAP lần lượt là 54,44%; 63,8%;84,44%; 42,23% còn với kinetine tỷ lệ đa chồi lần lượt là 26,70%; 40%; 50%;16,67% Có thể thấy tỷ lệ đa chồi của kinetine thấp hơn rất nhiều so với BAP

Từ kết quả trên chúng tôi chọn chất kích thích sinh trường là BAP để tái sinh

đa chồi từ chồi

n ng đ 0,5mg/l ồng độ 0,5mg/l 0 ộ 0,5mg/l n ng đ 1 mg/l ồng độ 0,5mg/l ộ 0,5mg/l n ng đ 1,5 mg/l ồng độ 0,5mg/l ộ 0,5mg/l n ng đ 2 mg/l ồng độ 0,5mg/l ộ 0,5mg/l 10

20 30 40 50 60 70 80 90 100

ND Kinetin

Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ tạo đa chồi của chồi ngọn dưới tác động của

BAP và kinetin sau 8 tuần

chúng tôi chọn chất kích thích sinh trường là BAP để tái sinh đa chồi từ chồingọn của cây đậu Nho nhe.

3.2.3 Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh chồi từ chồi ngọn

BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng cytokinin Về vai trò sinh lý, cácchất thuộc nhóm cytokinin đều có tác dụng kích thích phân chia tế bào rấtmạnh thông qua việc hoạt hóa tổng hợp axit nucleic và protein, đây là tính đặctrưng nhất [7] Chính vì vậy, BAP thường được sử dụng để cảm ứng tạo chồi,kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh, hạn chế sự già hóa của tế bàođồng thời thúc đẩy sự phân hóa chồi, kích thích chồi phát triển ở nhiều loàithực vật khác nhau Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, nồng độ BAP thay đổ từ1,0 – 3,0 mg/l thích hợp cho nhiều loại mô nuôi cấy Ở các nồng độ cao hơnhoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém Với nồng độ cao sẽ hoạthóa hình thành chồi bất định

Khả năng cảm ứng tạo chồi và số lượng chồi trung bình/ một mẫu lànhững thông số dùng để đánh giá tính thích ứng của giống trong hệ thống nuôi

cấy in vitro.Theo dõi thí nghiệm và đánh giá kết quả sau các khoảng thời gian

nuôi cấy Kết quả theo dõi các chỉ tiêu thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.4

và hình 3.8

Sau khi cấy trên môi trường cảm ứng chồi, mẫu cấy tăng nhanh về chiềucao, vết cắt tiếp xúc trực tiếp với mặt thạch sùi to dần Sau 2 tuần nuôi cấycác chồi chính và mầm chồi được hình thành trực tiếp từ khu vực vết sùi tạivết cắt Sau 4 tuần nuôi cấy tiếp theo trên môi trường cảm ứng chồi, chồichính phát triển mạnh mẽ, thân và lá của chồi mập, xanh và khỏe, kích thướcchồi chính đạt 3-4 cm Lúc này chồi chính đã có thể được tách khỏi cụm chồichuyển qua môi trường ra rễ, các mầm chồi đã nảy chồi, và hình thành lá.Tiếp tục nuôi các cụm chồi này trên môi trường cảm ứng chồi các chồi tăng

nhanh về chiều dài, đồng thời số lượng lá cũng tăng đáng kể và xòe rộng(Hình 3.8C).

A B C D Hình 3.8 Hình ảnh chồi đậu Nho nhe nuôi cấy trên môi trường cảm ứng

chồi SIM

A: sau 1 ngày; B: sau 2 tuần; C: sau 4 tuần; D: sau 8 tuần

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của đậu Nho nhe

-Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong từng cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở

mức α=0,05 bởi phương pháp Test Ducan Chất lượng chồi: (-): chồi yếu, có màu vàng hoặc trắng; (+): chồi khỏe, mập, có màu xanh.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hầu hết các đoạn chồi ngọn của đậu Nhonhe đều có khả năng tái sinh chồi trên môi trường nghiên cứu Khả năng tạo

đa chồi có sự khác biệt trên các môi trường khi thay đổi nồng độ BAP Trên

môi trường đối chứng không có chất điều hòa sinh trưởng, các mẫu cấy không

có dấu hiệu cảm ứng tạo chồi Điều đó cho thấy, các đoạn chồi ngọn của đậuNho nhe không có đủ các chất điều hòa sinh trưởng nội sinh cần thiết mà phảicần được cung cấp từ bên ngoài môi trường để cảm ứng tạo chồi Trên môitrường nuôi cấy có bổ sung BAP với nồng độ tăng dần từ 0,5mg/l đến2,0mg/l, quan sát thấy số chồi/mẫu tăng, cao nhất là môi trường nuôi cấy có

bổ sung BAP 1,5mg/l, hiệu quả tạo đa chồi sau 4 tuần nuôi cấy đạt 3,77 chồi/mẫu, sau 6 tuần mẫu nuôi cấy là 3,97 chồi/mẫu Sau 8 tuần nuôi cấy là 4,07chồi/ mẫu Các công thức thí nghiệm còn lại cho số chồi/mẫu đạt từ 1,40 đến2,70 chồi/ mẫu (sau 4 tuần nuôi cấy), 1,50 đến 3,03 chồi/ mẫu (sau 6 tuầnnuôi cấy), 1,63 đến 3,07 chồi/ mẫu ( sau 8 tuần nuôi cấy)

Kết quả theo dõi chỉ tiêu về chiều cao chồi cho thấy, khi tăng nồng độBAP (0,5mg/l đến 2,0mg/l) thì chiều cao chồi tăng dần, tăng cao nhất làmôi trường MS có bổ sung BAP 1,5mg/l Sau 4 tuần, chiều cao chồi tăng từ1,31 – 1,60 cm; sau 6 tuần tăng từ 1,60 – 2,29 cm, sau 8 tuần tăng từ 2,29 –3,03cm Các công thức thí nghiệm đều thu được kết quả tạo đa chồi so vớiđối chứng

Xét đồng thời các chỉ tiêu nghiên cứu trong giai đoạn tạo đa chồi cây đậuNho nhe thì môi trường thích hợp nhất trong các nồng độ thăm dò, cho hiệuquả tạo chồi cao nhất là MS + sucrose 30g/l + agar 9,0g/l có bổ sung BAP1,5mg/l, cho hệ số tạo chồi cao đạt 4,07chồi/mẫu, sự sinh trưởng phát triển củachồi khỏe, chất lượng chồi tốt

Hình 3.9 Cụm chồi nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi với BAP 1,5mg/l sau 4 tuần

3.2.4 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro

Giai đoạn ra rễ là công đoạn cuối cùng trong quy trình tái sinh Hoàn thiện

giai đoạn này chúng ta sẽ thu được những cây tái sinh in vitro hoàn chỉnh.Giai

đoạn này, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhómauxin để kích thích sự ra rễ của chồi Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụngIBA để xác định ảnh hưởng của nó đến sự hình thành rễ của chồi cây đậu Nhonhe IBA là chất thuộc nhóm kích thích sinh trưởng auxin có khả năng kíchthích sự ra rễ, đặc biệt là rễ bất định ở cành giâm, cành chiết, mô nuôi cấy.Sau 8 tuần nuôi cấy trong môi trường cảm ứng tạo đa chồi, chúng tôi tiếnhành lựa chọn các chồi mập có chiều cao từ 4-5cm, lá nhiều, có màu xanh đậmđược chuyển sang môi trường ra rễ được bổ sung nồng độ IBA khác nhau0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,4mg/l; 0,5mg/l Sau 1 tuần đầu tiên, rễ đầu tiên bắtđầu xuất hiện trên môi trường IBA 0,3mg/l Sau 2 tuần, rễ xuất hiện ở tất cảmôi trường IBA nghiên cứu nhưng chất lượng rễ ở các môi trường không giốngnhau (Hình 3.10A) Sau 4 tuần, chiều dài của rễ tăng đáng kể, có thêm nhiều rễphụ (Hình 3.10B) Từ 6-8 tuần, số lượng rễ hầu như không tăng thêm mà chủyếu phát triển về chiều dài và số lượng các rễ phụ (Hình 3.10C)

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi tái sinh

Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong từng cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở

mức α=0,05 bởi phương pháp Test Ducan Chất lượng rễ: Rễ tốt: số lượng rễ nhiều, dài, mập, có màu trắng, khỏe; Rễ xấu: số lượng rễ ít, ngắn, còi cọc, có màu vàng nâu.

A B C

Hình 3.10 Cây đậu Nho nhe trên môi trường chứa IBA 0,3mg/l

A: sau 2 tuần; B: sau 4 tuần; C:sau 8 tuần

Kết quả nghiên cứu cho thấy cây tạo rễ trên môi trường bổ sung IBA

0,3mg/l là thích hợp nhất cho sự ra rễ của đậu Nho nhe in vitro với tỷ lệ tạo rễ

là 98% với số lượng rễ nhiều, mập khỏe, có màu trắng đục

3.3 CHUYỂN CÂY IN VITRO RA MÔI TRƯỜNG TỰ NHIÊN

Việc nghiên cứu điều kiện chuyển cây tái sinh in vitro ra ngoài môi trường cũng là một khâu rất quan trọng Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn

định về mọi mặt: dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và đặc biệt luôn ở trong điều

kiện vô trùng Khi chuyển cây in vitro ra trồng ở vườn ươm là nơi có điều kiện

khác biệt rất nhiều so với môi trường trong ống nghiệm, cây phải tự thích nghivới điều kiện tự nhiên nơi mọi thứ đều có thể thay đổi thất thường, không ổnđịnh Chính vì vậy, cây phải có chế độ chăm sóc và huấn luyện để thích nghi dầnvới điều kiện môi trường tự nhiên bên ngoài trước khi đưa ra vườn ươm

Các cây được lựa chọn để đưa ra môi trường ngoài tự nhiên là những câykhỏe mạnh, thân mập, lá có màu xanh đậm, bộ rễ khỏe có màu trắng đục (Hình3.10) Cây được đưa ra khỏi phòng nuôi cấy 2-3 ngày để thích nghi với ánh sángmặt trời và nhiệt độ môi trường ngoài Sau đó, tiến hành các thao tác lấy cây ra