NGHIÊN cứu đặc điểm HÌNH THÁI và TRÌNH tự VÙNG GEN matKITS của một số mẫu cây THUỘC CHI DƯƠNG ĐỒNG (adinandra)

Trong dự án sàng lọc hoạt tính sinh học của thực vật Việt Nam, dịch chiết của một số loài thuộc chi Dương đồng Adinandra, họ Chè được dự báo có hoạt tính chống ung thư.. Trên thế giới, m

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KIỀU THỊ TRÀ GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI

VÀ TRÌNH TỰ VÙNG GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY

THUỘC CHI DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KIỀU THỊ TRÀ GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI

VÀ TRÌNH TỰ VÙNG GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY

THUỘC CHI DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra)

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Quân

Thái Nguyên, năm 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Mọi trích dẫn trongluận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn làtrung thực và chưa được ai công bố

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019

Tác giả luận văn

Kiều Thị Trà Giang

XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN

PGS.TS Nguyễn Thị Tâm

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

TS Nguyễn Hữu Quân

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới

TS Nguyễn Hữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đạihọc Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ emtrong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Em cũng xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Phạm Văn Khang, giảng viênKhoa Hóa học đã hướng dẫn em về tách chiết và định tính các chất hóa học

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viênphòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, cô Cao Thị Phương Thảo, kỹ thuậtviên phòng thí nghiệm Thực vật học và các thầy cô kỹ thuật viên các phòng thínghiệm Khoa Sinh học; phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, TrườngĐại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp em trong suốtquá trình nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học hiện đại vàGiáo dục sinh học, bộ phận sau đại học thuộc Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sưphạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quátrình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích vàgiúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài KH&CN Quỹ NAFOSTED “Phântích thành phần hóa học và tìm kiếm các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng ung

thư và kháng viêm từ một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) ở

Việt Nam” mã số 106.02-2018.338

Tác giả luận văn

Kiều Thị Trà Giang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra ) 3

1.2 Tình hình nghiên cứu về chi Dương đồng (Adinandra) 5

1.2.1 Trên thế giới 5

1.2.2 Ở Việt Nam 11

1.3 Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật 11

1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các loài cây thuốc 14

1.5 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro 15

1.6 Vai trò của polyphenol, coumarin, dẫn xuất của flavon và flavonol 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 21

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp phân loại hình thái 22

2.2.2 Phương pháp giải phẫu thực vật 22

2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử 24

2.2.4 Phương pháp hóa sinh 25

2.2.5 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 28

2.2.6 Phương pháp xử lý và phân tích kết quả 29

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

3.1 Đặc điểm hình thái ngoài và phân bố của loài Adinandra lienii 30

3.2 Cấu tạo giải phẫu của loài Adinandra lienii 31

3.2.1 Đặc điểm giải phẫu cắt ngang thân cây 31

3.2.2 Đặc điểm giải phẫu cắt ngang phiến lá cây 32

3.3 Đặc điểm của vùng gen matK phân lập từ loài Adinandra lienii 34

3.4 Khảo sát các hợp chất có trong các phân đoạn dịch chiết của cây Adinandra lienii 39

3.4.1 Định tính polyphenol 39

3.4.2 Định tính các flavonoid 40

3.4.3 Định tính các coumarin 40

3.4.4 Phân tích thành phần các hợp chất trong cao chiết của loài A lienii 41

3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ loài Adinandra lienii 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

I KẾT LUẬN 46

II KIẾN NGHỊ 46

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết

tắt

Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng việt

APG II An update of the Angiosperm

Phylogeny Group classificationfor the ordors and families offlowering plants

Hệ thống phân loại thực vật

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic Axit

(DNA)

EC50 Effective dose 50% Liều hiệu quả đáp ứng 50%EDTA Ethylene diamine tetraa acid cetic Etylen diamin tetraxetic AxitELISA Enzyme linked

immunosorbentassay

Thử nghiệm miễn dịch gắn enzyme

EtOH Ethyl acetatae

Hep G2 Hepatocellular carcinoma human Ung thư gan ở người

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thểISSR Inter Simple Sequence Repea Đánh giá sự sai khác di truyền

ở thực vật

ITS Internal transcribed space Vùng gen ITS

sinh vật

MIC Minimalinhibitory concentration Nồng độ tối thiểu ức chế

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymeraseRAPD Random Amplification

of Polymorphic DNA

Đa hình DNA nhân bản ngẫunhiên

RNA Ribonucleic acid Ribonucleic Axit

TTC Triphenyl tetrazolium Chloride Chỉ thị màu

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam 3

Bảng 1.2 Tác dụng chống ung thư của dịch chiết các hợp chất phenolic tự do trên 2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7 10

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 21

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 22

Bảng 2.3 Thông tin về cặp mồi nhân gen matK 25

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR nhân gen matK 25

Bảng 3.1 Các trình tự nucleotide của đoạn gen matK sử dụng trong phân tích 36

Bảng 3.2 Hệ số tương đồng và hệ số phân ly trình tự các nucleotide của đoạn gen matK từ loài Adinandra lienii và các loài thuộc chi Adinandra 38

Bảng 3.3 Hoạt tính sinh học của dịch chiết từ cây A lienii 42

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) 4

Hình 1.2 Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A nitida 6

Hình 1.3 Các hợp chất triterpene saponins từ A nitida 7

Hình 1.4 Các hợp chất flavonoid từ A nitida 8

Hình 1.5 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro 17

Hình 1.6 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh ký tự 18

Hình 2.1 Sơ đồ chiết phân đoạn các hợp chất từ cây A lienii 26

Hình 3.1 Hình thái ngoài của cây A.lienii (Ảnh chụp của tác giả thu tại Lào Cai, tháng 3, năm 2018) 30

Hình 3.2 Giải phẫu cắt ngang thân cây A lienii 32

Hình 3.3 Giải phẫu cắt ngang phiến lá cây A lienii 33

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của loài A lienii 34

Hình 3.5 Kết quả giải trình tự đoạn gen matK của loài A lienii thu tại Lào Cai 35 Hình 3.6 Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự đoạn gen matK của loài A lienii so với trình tự đoạn gen matK trên GenBank bằng BLAST trong NCBI.36 Hình 3.7 Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ loài A lienii thu tại Lào Cai, Việt Nam và trình tự đoạn gen matK công bố trên GenBank 37

Hình 3.8 Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự các nucleotide của đoạn gen matK 39

Hình 3.9 Phản ứng với muối sắt (III) (a) và với dung dịch H2SO4 đặc (b) 39

Hình 3.10 Định tính các flavonoid 40

Hình 3.11 Định tính coumarin phản ứng với NaOH (a) và HCl đặc (b) 41

Hình 3.12 Sắc kí đồ cao chiết ethanol (A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung môi n-hexan : acetone tỉ lệ 1:1 41

Hình 3.13 Sắc kí đồ cao chiết ethanol (A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung môi dichloromethane : n-hexan tỉ lệ 3:1 41

Hình 3.14 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn B subtilis 43

Hình 3.15 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn L plantarum 43

Hình 3.16 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S aureus 44

Hình 3.17 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn E.coli 44 Hình 3.18 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S marcescens 45 Hình 3.19 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S lutea 45

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Vấn đề sức khỏe của con người ngày nay đang bị ảnh hưởng nghiêm trọngtrước các biến đổi của khí hậu, ô nhiễm môi trường và nguồn thực phẩm dẫn tớixuất hiện các bệnh hiểm nghèo như ung thư Do đó, việc tìm ra phương pháp hiệuquả để điều trị các bệnh liên quan tới ung thư là vấn đề cấp bách và đặt ra nhiềuthách thức lớn cho các nhà khoa học Trước thực trạng đó, những nghiên cứu đểphát hiện ra các chất có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật để sử dụng làm thuốcchữa bệnh cho người là cần thiết Trong dự án sàng lọc hoạt tính sinh học của thực

vật Việt Nam, dịch chiết của một số loài thuộc chi Dương đồng (Adinandra), họ

Chè được dự báo có hoạt tính chống ung thư

Trên thế giới, một số công trình nghiên cứu về các chất hóa học và tác dụngsinh học của một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng đã thể hiện phổ hoạt tínhkháng viêm, chống độc và giảm đau, chống oxi hóa, diệt trừ các gốc tự do, chốngung thư cũng như chống lại một số loài vi khuẩn gây bệnh Ở Việt Nam, những

nghiên cứu về chi Adinandra mới chỉ tập trung ở việc thống kê danh sách thành

phần loài Còn về đặc tính sinh học cũng như thành phần hóa học của chúng chưađược nghiên cứu

Hiện nay, một số loài thuộc chi Dương đồng như Adinandra bockiana, Adinandra glischroloma và Adinandra lienii bước đầu được nghiên cứu về vị trí

phân bố địa lý Những nghiên cứu về đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học cũng

như trình tự vùng gen matK/ITS của các loài trên chưa được tác giả nào thực hiện.

Vì vậy, nghiên cứu về các đặc tính sinh học cũng như xây dựng mã vạch DNA từ

một số loài thuộc chi Adinandra, trong đó có loài A lienii là rất cần thiết Xuất

phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm

hình thái và trình tự vùng gen matK/ITS của một số mẫu cây thuộc chi Dương đồng (Adinandra)”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nhận diện được mẫu cây thuộc chi Dương đồng bằng phương pháp giảiphẫu, hình thái

- Xác định được trình tự đoạn gen matK của loài Adinandra lienii thuộc chi Dương đồng (Adinandra).

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Adinandra lienii.

- Phân lập và giải trình tự nucleotide đoạn gen matK của loài A lienii.

- Thu cao chiết, định tính thành phần các nhóm chất và xác định hoạt tính

kháng khuẩn từ cao chiết của loài A lienii.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra )

Chi Adinandra (thuộc họ Chè Theaceae) thường là cây bụi hay cây nhỡ, có khoảng 85 loài phân bố ở các nước Châu Phi, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Srilanka, Banglades và một số nước Đông Nam Á [24] Ở Việt Nam, chi Adinandra đã được tìm thấy có 13 loài, phân bố ở các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng và Gia Lai (Bảng 1.1) [10] Loài Sum Liên Adinandra lienii là loài bản địa được tìm thấy năm 1986 nhưng mới được công nhận vào năm 2012 Loài Sum Hòn Giao Adinandra hongiaoensis mới được phát hiện ở Hòn Giao Lâm Đồng năm 2014 [39].

Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam

Phân bố

1 Adinandra annaenzymesis Sum đỏ Quảng trị

3 Adinandra donnaiensis Sum đồng nai Đồng Nai

4 Adinandra glischochroma Sum lông Sapa

5 Adinandra hainanensis Sum Hải Nam Hải Ninh

6 Adinandra integerrima Sum nguyên Miền Trung

7 Adinandra microcarpa Sum trái nhỏ Hòn Bà

8 Adinandra millettii Sum millett Sapa, Tam Đảo

9 Adinandra petelotii Sum petelot Sa

10a Adinandra poilanei Sum poilan Lâm Đồng

11 Adinandra rubropunctata Sum điểm đỏ Tiên Yên, Quảng Trị

13 Adinandra hongiaoensis Sum Hòn Giao Lâm Đồng

Chi Dương đồng Adinandra thuộc họ Theaceae, bộ Theales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta và giới thực vật [26].

Theo sách đỏ Việt Nam, các loài trong chi Adinandra là nguồn gen hiếm Các hợp chất có trong cây thuộc chi Adinandra có nhiều tác dụng chữa bệnh như

giảm huyết áp, kháng viêm, chống độc và giảm đau Đặc biệt, flavonoid đã được

tìm thấy trong lá của loài Adinandra nitida, có hoạt tính chống oxi hóa, diệt trừ

các gốc tự do, chống viêm, chống trầm cảm, chống ung thư cũng như chống lạimột số loài vi khuẩn gây bệnh

Ngoài ra, trong các cây thuộc họ Chè cũng chứa tinh dầu, một hợp chất có vaitrò quan trọng trong lĩnh vực y học Nhờ các hợp chất có trong cây mà từ xưa y học

cổ truyền đã sử dụng các loài thuộc chi Adinandra được làm thuốc điều trị bệnh ung thư vòm họng, đau dạ dày, rắn cắn, Cây Sum millett (A millettii) được sử dụng điều trị đau dạ dày; cây Sum nguyên A integerrima được dùng để trị bong gân, rắn cắn Lá và thân cây Sum đỏ hay Sum Hải Nam A Hainanensis (A rubropunctata)

được dùng cho các trường hợp viêm, ung thư vòm họng[5]

Hình 1.1 Một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra)

A: A hongiaoensis, B: A millettii, C: A dumosa, D: A glischroloma

Chi Adinandra là cây gỗ ít khi là cây bụi, nhánh non có lông nhung Lá đơn,

mọc so le, có kích thước trung bình hay lớn Hoa mọc đơn ở nách lá, lưỡng tính,

hoa mẫu 5 Lá đài có lông mềm hoặc lông ráp Cánh hoa không lông hay chỉ cólông ở mặt ngoài Nhị nhiều, có khoảng 25 nhị Bao phấn có lông ngắn hoặc dài

và có mũi nhọn Bầu trên, không lông hoặc có lông mềm; noãn nhiều Quả khôkhông tự mở; hạt nhiều, nhỏ (Hình 1.1) [26]

1.2 Tình hình nghiên cứu về chi Dương đồng (Adinandra)

1.2.1 Trên thế giới

Trên thế giới có khoảng hơn 80 loài thuộc chi Andinandra phân bố ở nhiều

vùng khác nhau Tuy nhiên, mới chỉ thấy có các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào

loài Andinandra nitida ở Trung Quốc Loài A nitida là cây thuộc vùng nam Trung

Quốc, lá cây được sử dụng lâu năm làm chè uống (Shiyacha) và thuốc dược liệu

tốt cho sức khỏe Loài A nitida có nhiều tác dụng điều trị như kháng khuẩn, giảm đau, giảm huyết áp Ở Trung Quốc, loài A nitida còn được sử dụng trong nhiều

công thức bào chế, thang thuốc để điều trị ung thư, chống oxy hóa

1.2.1.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Lá của cây A nitida được sử dụng lâu năm làm chè uống và thuốc dược liệu

tốt cho sức khỏe, tuy nhiên chưa có nhiều các nghiên cứu khoa học về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của loài A nitida Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của loài A nitida được phát hiện thuộc nhóm là flavonoid, flavonoid

glycoside và triterpene saponin [34], [35], [40], [42], [43]

Hướng nghiên cứu về thành phần hóa học: Chen và Shi (1996) đã chứng

minh lá của loài A nitida có nhiều tác dụng để chữa bệnh Do đó, loài này được sử

dụng để thương mại hóa cho ngành dược phẩm

Năm 2003, Wang và cộng sự đã công bố phân lập được 6 hợp chất apigenin

(1), camellianin A (2), quercitrin (3), kajiichigoside F1 (4), nigaichigoside F2 (5),

và peduncloside (6) trên tạp chí Trung Quốc (Hình 1.2) [40]

Năm 2008, Liu và cộng sự đã phân lập được flavonoid thuộc loại camellianin

A từ lá của loài A nitida Merr ex Li bằng phương pháp HPLC và chứng minh được

khả năng chống oxy hóa cao từ dịch chiết flavonoid bằng phương pháp làm sạchDPPH và các gốc tự do [32] Cùng hướng nghiên cứu này, Liu và cộng sự (2013) đãphân lập, tối ưu hóa phương pháp tách chiết flavonoid và thu được camellianin A từ

lá của loài A nitida; đồng thời chứng minh được khả năng chống oxy hóa của

flavonoid ở nồng độ 0,02 mg/ml [33] Như vậy, một số nghiên cứu đã chỉ ra

flavonoid như epicatechin, apigenin, quercitrin, camellianin A và camellianin B cóhoạt tính sinh học và có khả năng chống oxy hóa.

O

O OH

O HO O HO HO HO O

O O

OH HO

HOMe

2 3 4 5 6

7 8 910

1' 2' 3' 4' 5' 6'

1'' 2'' 3'' 4''

5'' 6''

HO HO

HO

O O O

OH OH HO

OH

HO HO

HO

O O O

OH OH HO

O

OH

OH HO

OH

OH

Hình 1.2 Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A nitida

Bằng một số phương pháp sắc ký cột, thành phần hóa học của loài A nitida đã

được Wang và cộng sự (2008) phân lập và xác định được cấu trúc của các hợp chấtsaponin gồm 6 loại lần lượt là 2alpha, 3alpha, 19alpha-trihydroxy-olean-12 en-28-oicacid-28-O-beta-D-glucopyranoside; arjunetin; sericoside; glucosyl torenzymetate;nigaichigoside F1 và arjunglucoside I Trong đó chất 2alpha, 3alpha, 19alpha-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-beta-D glucopyranoside là hợp chất mới;

các chất còn lại là chất lần đầu tiên được phát hiện trong loài A nitida [41].

Công bố tiếp theo năm 2008, nhóm nghiên cứu phân lập thêm 5 hợp chất

triterpene glycosides gồm arjunetin (7), sericoside (8), glucosyl torenzymetate (9), nigaichigoside F1 (10) và arjunglucoside I (11) (Hình 1.3) [42].

O

OH

OH HO

OH

CH3

H3C

HO HO

HO

CH3

O O

O

OH

OH HO

HO

O O

O

OH

OH HO

OH

OH

HO HO

HO

O O

O

OH

OH HO

OH

Nigaichigoside F1 (9) Glucosyl torenzymetate (10)

HO HO

HO

O O

O

OH

OH HO

OH

OH

Arjunglucoside I (11)

Hình 1.3 Các hợp chất triterpene saponins từ A nitida

Bên cạnh các nghiên cứu của Wang và cộng sự (2008) về thành phần hóahọc, một số nhóm nghiên cứu ở Trung Quốc khác lại tập trung vào phân tích thành

phần flavonoid, thành phần chiếm hàm lượng lớn (> 20%) có trong lá A nitida với

camellianin A là thành phần chính [35], [43] Theo nghiên cứu của Liu và cộng

sự, hàm lượng camellianin A, camellianin B và phần aglycon apigenin trong dịchchiết EtOH chiếm tỉ lệ 41,98; 2,67 và 1,73% tương ứng [35] Hàm lượngflavonoid chiếm hơn 45% trong dịch chiết EtOH

Sử dụng sắc ký lỏng 2 chiều (2D-LC) kết hợp phổ khối để phân tích thành

phần hóa học đã có hơn 57 chất đã được phát hiện trong dịch chiết MeOH lá A.

nitida, trong đó 5 hợp chất epicatechin (12), camellianin A (2), rhoifolin (13),

camellianin B (14) và apigenin (1) được phát hiện dựa trên thời gian lưu, khối

OH

O HO O

OH

O O O HO

O

OH HO

yếu chứa các flavonoid như camellianin A (2), camellianin B (14) và aglycon apigenin (1) [34].

1.2.1.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Loài A nitida đã được nghiên cứu các tác dụng sinh học khác nhau như

chống oxy hóa, ức chế enzyme chuyển (ACE giảm huyết áp) và chống ung thư[29], [30], [34], [35], [43]

Liu và cộng sự đã thử tác dụng chống oxy hóa, tác dụng ức chế enzymechuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất chính camellianin A, camellianin B vàapigenin Trong tác dụng chống oxy, kết quả cho thấy IC50 của dịch chiết EtOH,

camellianin A, camellianin B và apigenin tương ứng là 14,74 μg/ml, 1,62 mg/ml,g/ml, 1,62 mg/ml,1,8 mg/ml, và 0,95 mg/ml Tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất flavonoidkém hơn nhiều so với dịch chiết EtOH trong phép thử DPPH và Rancimat (khoảng

100 lần) Kết quả cho thấy tác dụng chống oxy hóa của lá cây A nitida có thể phụ

thuộc vào các thành phần hóa học khác [35]

Về tác dụng giảm huyết áp, ức chế enzyme chuyển (angiotensin convertingenzyme ACE) các hợp chất flavonoid camellianin A, camellianin B và apigenin cótác dụng tốt hơn dịch chiết EtOH Ở nồng 500 μg/ml, 1,62 mg/ml,g/ml, tác dụng ức chế enzymechuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất camellianin A, camellianin B và apigenintương ứng là 29,7; 30,16; 40,68 và 30,27% Hoạt tính ức chế enzyme chuyển củadịch chiết EtOH có lẽ phụ thuộc nhiều vào các hợp chất flavonoid [35]

Do lá cây A nitida được sử dụng để làm chè uống với tác dụng chống ung thư, hợp chất chính camellianin A (hàm lượng được xác định chiếm 19,25% bằng HPLC

được thử nghiệm hoạt tính chống ung thư trên dòng tế bào ung thư Hep-G2 và ungthư vú MCF-7 Ở nồng độ 200 μg/ml, 1,62 mg/ml,M, camellianin A ức chế 33,8% và 8,7% tế bào ungthư MCF-7 và Hep-G2 Có thể thấy tác dụng độc tế bào của camellianin A là kháyếu Tuy nhiên, trong nghiên cứu chu trình tế bào, camellianin A làm tăng mật độ tếbào ở giai đoạn G0/G1 Việc tăng mật độ các tế bào HepG-2 và MCF-7 trong giaiđoạn đầu của quá trình chết tế bào được phát hiện Như vậy, camellianin A khôngchỉ ảnh hưởng đến quá trình nhân lên của tế bào ung thư mà còn thúc đẩy các tế bào

đi vào chu trình chết tế bào (apoptosis) [30]

Nghiên cứu của Liu và cộng sự (2015) khi so sánh thành phần phenolic của 4

loài thuộc chi Adinandra ở Trung Quốc là A nitida, A glischroloma var jubata,

A millettii và A latifolia về tác dụng chống oxy hóa và so sánh chống ung thư của

4 loài này trên các dòng ung thư HepG-2 và MCF-7 [29]

Hàm lượng các hợp chất phenolic trong A nitida cao nhất là 140,54±1,04 mg/g, tiếp đến loài A millettii (125,96±3,19 mg/g), loài A glischroloma var jubata (84,14±2,97 mg/g) Loài A latifolia có hàm lượng phenolic ít nhất (71,29 ± 2,69 mg/g) Tương tự, thành phần flavonoid có trong loài A nitida là cao nhất

88,72±2,13 mg/g, tiếp đến là loài A glischroloma var jubata (44,74±1,79 mg/g)

và loài A millettii (43,54±1,48 mg/g) Loài A latifolia có hàm lượng flavonoid ít nhất (19,13 ± 0,54 mg/g) Do vậy, trong 4 loài thuộc chi Adinandra nghiên cứu, tác dụng chống oxy hóa và chống ung thư của loài A nitida và A millettii có tác dụng tốt hơn so với loài A jubata và A latifolia Điều này có thể được giải thích

là phù hợp với hàm lượng các hợp chất phenolic có trong các loài này Dịch chiết của các loài Adinandra có các hợp chất phenolic tự do có khả năng ức chế quá trình nhân lên của tế bào ung thư Các dịch chiết có thể ức chế với EC50 từ 1,05-

6,44 mg/ml trên tế bào ung thư gan Hep-G2 và EC50 từ 2,26-8,02 mg/ml trên tế

bào ung thư gan MCF-7 (Bảng 1.2)

Thành phần hợp chất flavonoid của loài A nitida có chứa camellianin A,

camellianin B, apigenin, quercitrin trong khi thành phần flavonoid của loài

A milettii chưa được phát hiện [29].

Bảng 1.2 Tác dụng chống ung thư của dịch chiết các hợp chất phenolic tự do

trên 2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7

Như vậy, tác dụng sinh học và thành phần hóa học của các loài thuộc chi

Adinandra còn chưa rõ ràng, chưa được nghiên cứu sâu Việc tiến hành nghiên

cứu về các loài thuộc chi này là rất cần thiết nhằm hiểu biết thêm về thành phầnhóa học cũng như hoạt tính sinh học Dựa trên phương pháp hoạt tính dẫn đường,kết hợp với phương pháp sắc kí phổ hiện đại, các hợp chất mới có tác dụng chống

ung thư trong chi Adinandra sẽ được phát hiện.

1.2.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu duy nhất về loài thuộc chi Adinandra được Lê Nguyễn Thành và Vũ Thị Kim Oanh bước đầu thực hiện trên loài Adinandra rubropunctata Nghiên cứu đã phát hiện ra lớp chất triterpen vòng ursan (ursolic

acid) và vòng lupan (betulinic acid) từ thân của loài A rubropunctata, các hợp

chất betulinic acid, ursolic acid thường có hoạt tính chống ung thư tốt

1.3 Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật

Theo phương pháp truyền thống, việc phân loại hay giám định sinh vật chủyếu dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý, sinh hóa bên trong nhờvào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Phương pháp phân loại truyền thống nàytrong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế như là nhiều sinh vật

có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phânloại (hệ gen rất khác nhau) Ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác nhaunhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau) Mặt khác,phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phânbiệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài Đặc biệt, đối với những mẫu vật

có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về hình thái như là những mẫu sinh vật đãchết, bị chôn vùi dưới đất, ở các công trình xây dựng, đã qua chế biến thì khôngthể xác định được bằng chỉ thị hình thái Gần đây, nhờ vào sự phát triển của khoahọc công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phépcác nhà nghiên cứu nhanh chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyềngiữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài Từ đó cóthể định danh được sinh vật và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cáthể, quần thể hay xuất xứ Việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tửDNA sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh vậtkhác một cách chính xác Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công

cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật Trong đó,

mã vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định sinh vật và xác địnhmối quan hệ di truyền giữa các loài [12]

Mã vạch DNA là kỹ thuật sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gencủa sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau

Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên

cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen matK mã hóa cho

tRNALys (UUU) của lục lạp Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong

intron của gen trnK và chưa rõ chức năng Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng cây phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp Do vậy gen matK trở thành gen chỉ thị quan

trọng để giúp phân loại thực vật [38]

Nhận thấy vai trò, ý nghĩa và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mãvạch DNA, ở Việt Nam các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý đã bước đầutiếp cận và quan tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng mộtngân hàng dữ liệu mã vạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật (động vật, thựcvật, vi sinh vật, ) phục vụ phân loại, giám định, chẩn đoán bệnh, bảo tồn và quản

lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta

Năm 2003, Paul Hebert đưa ra khái niệm đầu tiên về mã vạch DNA nhằmgiúp nhận diện các mẫu vật Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằmtrong hệ gen của sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinhvật với nhau [31]

Ở Việt Nam, nghiên cứu về mã vạch DNA được triển khai ở một số cơ sởnghiên cứu Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn nhỏ lẻ, tập trung trên một số đốitượng sinh vật, chưa có tính hệ thống, đồng bộ nên chưa thể xây dựng được cơ sở

dữ liệu về mã vạch DNA Vũ Thị Thu Hiền và Đinh Thị Phòng (2011) đã sử dụng

kỹ thuật DNA vào việc đánh giá mối quan hệ di truyền tập đoàn cây gỗ trắc đỏ

(Dalbergia cochinchinensis) ở Việt Nam đang có nguy cơ tuyệt chủng Kết quả

nghiên cứu đã cho thấy, trong số 51 chỉ thị phân tử (28 chỉ thị RAPD và 23 chỉ thị

ISSR) phân tích cho 35 mẫu D cochinchinensis thì có 31/51 chỉ thị (12/28 RAPD

và 19/23 ISSR) cho tính đa hình Tổng số có 163 phân đoạn DNA được nhân bảnthì có 99 phân đoạn đa hình (chiếm 60,74%), số lượng các phân đoạn nhân bảndao động từ 1 đến 8 với kích thước nhân bản trong khoảng 250 bp đến 2000 bp

Mối quan hệ di truyền của 35 mẫu D cochinchinensis được thể hiện trên sơ đồ

hình cây, đã phân ra làm 02 nhánh và có hệ số sai khác di truyền dao động trongkhoảng 5,1% (1-0,949) đến 29,3% (1-0,707) Nhánh chính I duy nhất là mẫu DC9với hệ số sai khác di truyền với các mẫu còn lại khoảng 29,3% (1-0,707) Nhánh

chính II bao gồm 34 mẫu còn lại và có hệ số sai khác di truyền dao động trongkhoảng từ 5,1% (1-0,949) đến 26,0% (1-0,740) [8]

Nguyễn Thị Thanh Nga (2012) tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di

truyền một số loài Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch DNA” Nghiên

cứu đã góp phần xác định các mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi

Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự DNA của một gen mã vạch như ITS, matK, trnK Nghiên cứu đã khuếch đại thành công hai vùng gen ITS và matK Kết quả phân tích sự đa hình trên mỗi vùng gen cho thấy vùng gen ITS có kích thước từ

638-650 bp xuất hiện 113 điểm đa hình, chiếm 17,4% trên toàn bộ trình tự vùng gen,

có độ đa hình cao hơn so với gen matK kích thước 871 bp với 61 điểm đa hình xuất

hiện, chiếm 7% trên toàn bộ trình tự và cây phát sinh chủng loại được xây dựng Dựavào kết quả phân tích trình tự DNA và cây phát sinh chủng loại thu được, có thể kết

luận vùng gen matK có khả năng phân biệt tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể được sử dụng để phân biệt dưới loài của chi Codonopsis [21].

Năm 2013, Trần Thu Hoa và cộng sự đã tiến hành “khảo sát đặc tính dược

liệu và bước đầu định danh bằng trình tự gen ITS và matK cho một mẫu Ngải mới

tìm thấy ở vùng núi Cấm - An Giang” nhằm hướng đến ứng dụng trong việc điềuchế các thuốc chữa bệnh, nhóm nghiên cứu đã thu thập được hơn 20 mẫu cây họGừng có tên bắt đầu bằng chữ “Ngải” tại vùng núi Cấm Đặc điểm chung của cácmẫu này là hình thái của chúng khá giống nhau Trong đó, loài “Ngải sậy củ lớn”(tên phổ thông thường gọi ở vùng núi Cấm, Tịnh Biên, An Giang) đã được chứngminh là cây thuốc có tiềm năng trị ung thư Nhóm nghiên cứu đã xây dựng câyphát sinh loài [9]

Hà Văn Huân (2014) đã lựa chọn gen matK để làm mã vạch phục vụ cho các

nghiên cứu về đa dạng di truyền, phân loại và giám định loài góp phần nâng caohiệu quả bảo tồn nguồn gen và phát triển loài Sến mật ở Việt Nam Trên cơ sở các

thông tin của gen matK đã công bố, một cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế để nhân dòng gen matK từ DNA tổng số của 3 mẫu Sến mật trồng tại Thanh Hóa (S1, S2 và S3) Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng: Trình tự nucleotit của gen matK

phân lập từ mẫu S1, S2 và S3 dài 1521 nucleotit, trong đó, trình tự nucleotit của

gen matK ở mẫu S1 và S3 giống nhau 100%, trình tự nucleotit của mẫu S2 có sai

khác với hai mẫu S1 và S3 duy nhất 1 nucleotit ở vị trí 877 (C được thay thế bằng

G) Trình tự nucleotit của gen matK phân lập từ mẫu S1, S2 và S3 (được ký hiệu

là Senthanhh) có sự tương đồng đến 98,43% so với trình tự nucleotit của gen

matK ở cây Sến lá to (Madhuca macrophyll) đã công bố trên GenBank (mã số:

DQ924091.1) “Senthanhh” có thể được sử dụng là cơ sở dữ liệu quan trọng phục

vụ cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền, phân loại và giám định loài góp phầnnâng cao hiệu quả bảo tồn nguồn gen và phát triển loài Sến mật ở Việt Nam [11].Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứngdụng chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền,bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta

1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các loài cây thuốc

Năm 1992, Nakatomi và cộng sự đã nghiên cứu về các hợp chất alkaloid cómùi hăng của cây Cúc áo Nghiên cứu nhận thấy cặn chiết từ cây Cúc áo có khả

năng ức chế được nhiều loại vi sinh vật: Staphylococcus albus, Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae, Salmonella gallinarum, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris và nấm enzyme Candida albicans [36] Năm 2006, Mai Sỹ Tuấn

và cộng sự đã nuôi cấy in vitro thành công được cây Cúc áo Bước đầu công bố

khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô vòm họng, tế bào ung thư vú ở người vàkháng vi sinh vật kiểm định của cặn chiết thô từ chồi cây Cúc áo nuôi trên môi

trường thạch [27]

Võ Thị Mai Hương và Trần Thanh Phong (2013) đã nghiên cứu dịch chiết

của quả Nhàu (Morinda citrifolia L.) đều có khả năng kháng với 4 loại vi sinh vật kiểm định gồm S aureus, Salmonella typhi, E coli và Bacillus pumilus Trong đó, loài S aureu là chủng nhạy cảm nhất với dịch chiết [13]. Năm 2015, Bùi Thị Lê

Minh và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của tỏi (Allium sativum L.) trên vi khuẩn E coli và ảnh hưởng của tỏi lên sự sinh trưởng của gà được bổ sung

tỏi tươi vào khẩu phần thức ăn tại Đại học Cần Thơ Kết quả nghiên cứu cho thấy

các khuẩn E.coli nhạy cảm với dịch chiết tỏi tươi với giá trị MIC 12,5-35 µg/ml;

sự tăng trọng và hệ số chuyển hóa thức ăn ở các khẩu phần ăn có bổ sung thêm tỏi

và không bổ sung thêm là khác nhau, việc bổ sung thêm tỏi tươi vào khẩu phần

thức ăn của gà phòng được bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli gây ra[20]

Năm 2017, Bùi Kim Anh và cộng sự bước đầu nghiên cứu thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của Củ ngải đen Từ dịch chiết methanol của thân rễ ngải

đen (Kaempferia parviflora) nhóm nghiên cứu đã phân lập được 6 hợp chất tectochrysin (1), apigenin 7,4'-dimethyl ether (2) 3,5,7-trimethoxyflavon (3), 5,7-

dimethoxyflavon (4), β-sitosterol (5) và daucosterol (6) Cấu trúc của các hợp chất

được xác định bằng việc phân tích các dữ liệu phổ và so sánh với số liệu đã công

bố Cặn chiết MeOH và hợp chất 4 thể hiện hoạt tính độc tế bào ở dòng ung thưbiểu mô-KB với giá trị IC50 lần lượt là 55,21 và 14,95 μg/ml, 1,62 mg/ml,g/ml [1]

Nguyễn Thị Hồng Anh và cộng sự (2017) đã phân lập các hợp chất phenolic từcặn ethyl acetate của cây Tỏa dương. Từ cặn ethyl acetate của cây Tỏa dương, 4 hợp chất đã được phân lập bao gồm epoxyconiferyl alcohol (1), salicifoliol (2), 5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyd (3) và ethyl caffeat (4) Cấu trúc của các hợp chất

này được xác định bằng các phương pháp phổ như 1D - NMR, ESI - MS và sosánh với các dữ liệu đã công bố Các hợp chất này đều được phân lập lần đầu tiên

từ cây Tỏa dương Hợp chất 1, 2 và 3 được công bố lần đầu tiên từ

chi Balanophora [2].

Lê Việt Dũng và cộng sự nghiên cứu thành phần hóa học của phần trên mặt

đất cây Lấu thu hái tại Việt Nam vào năm 2017 Kết quả nghiên cứu cho thấy từ

dịch chiết ethanol 96% phần trên mặt đất của cây Lấu (Psychotria asiatica L.) đã

phân lập được 5 hợp chất β-sitosterol (1), 2 - [(N - benzoylphenylalanyl) - amino]

- 3 - phenylpropyl benzoat (2), asperglaucid (3), daucosterol (4) và catechin (5).

Cấu trúc các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ NMR, MS,kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo Trong đó, hai hợp chất 2,5 lần đầu tiênđược phân lập từ cây Lấu [7]

1.5 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro

Với sự phát triển của khoa học công nghệ, hiện nay trên thế giới đã phát triển

nhiều phương pháp thử các hoạt tính sinh học in vitro có thời gian thực hiện ngắn

nhưng cho kết quả chính xác cao Có thể phân loại các phương pháp này bằng kỹthuật đưa chất thử vào hệ thử [28]

Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc: Nguyên tắc của

phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được tẩm vào khoanh giấy,

khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ốngtrụ đựng chất Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh (Hình 1.5A).

Phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường đặc: Nguyên tắc của phương

pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được cho vào giếng thạch, khuếchtán vào lớp thạch ức chế sự phát triển của vi khuẩn trên bề mặt thạch Vùng ức chếcàng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh (Hình 1.5B)

Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc: Nguyên tắc của phương

pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được cho vào ống trụ, khuếch tánvào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ Vùng

ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh

Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng: Nguyên tắc của phương

pháp là dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng, có chất dinh dưỡngthích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu Thêm những nồng độkhác nhau của chất nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống Xác định nồng

độ thấp nhất của chất nghiên cứu ức chế được sự phát triển của vi khuẩn Nồng độnày được gọi là nồng độ tối thiểu ức chế (MIC: minimal inhibitory concentration).Phương pháp này còn được gọi là phương pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp hoặcphương pháp hệ nồng độ (Hình 1.5C)

D

Hình 1.5 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro

(A) Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc; (B) Phương phápdùng ống trụ trên môi trường đặc; (C) Phương pháp hệ nồng độ trong môi trườnglỏng; (D) Phương pháp vi định lượng trong môi trường lỏng

Phương pháp vi định lượng trong vi môi trường lỏng: Nguyên tắc của

phương pháp này chủ yếu cũng như phương pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp, nhưngphải có dàn máy ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay: thử nghiệm miễndịch gắn enzyme), nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn, tự động, tiết kiệm và

có tính định lượng cao hơn so với phương pháp hệ nồng độ thông thường ở chỗ:(1) Kỹ thuật thông thường chỉ dùng một hoặc vài ba dãy thí nghiệm, trong khi ởđây dùng 8 dãy thí nghiệm; (2) Kỹ thuật thông thường dùng 6-8 độ pha loãng khácnhau của chất thử còn ở đây có thể dùng đến 11 độ pha loãng; (3) Kỹ thuật thôngthường đọc kết quả bằng mắt thường (có thể cho thêm chỉ thị TTC(Triphenyltetrazolium Chloride)), nhưng ở đây được xác định bằng cách đo mật độ quanghọc ở bước sóng 492 nm của dàn máy ELISA (Hình 1.5D)

Phương pháp sinh tự ký (Bioautography): Phương pháp này sử dụng khi

đã xác định được dịch chiết toàn phần của một dược liệu nghiên cứu có tác dụngkháng khuẩn trên một loại vi khuẩn nào đó và muốn xác định xem thành phần nàotrong dược liệu này có tác dụng Nguyên tắc tương tự như các phương pháp sửdụng môi trường đặc, sau khi chạy sắc ký dịch chiết tổng có hoạt tính trên bảnmỏng, tiến hành láng môi trường thạch đặc có chứa vi khuẩn nghiên cứu, ủ 18-24h

để xác định vùng vết chất làm vi khuẩn không mọc được; đó là chất có tác dụngkháng khuẩn Để phát hiện vi khuẩn mọc được dễ dàng nên dùng chỉ thị màu TTC(Hình 1.6)

Hình 1.6 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh ký tự 1.6 Vai trò của polyphenol, coumarin, dẫn xuất của flavon và flavonol Vai trò của polyphenol: (1) Các polyphenol là một chất vận chuyển điện tử

trong quá trình hô hấp (2) Là chất điều khiển, chất đặc trưng cho mỗi loài về màusắc, mùi vị (3) Polyphenol có vai trò như những kháng thể chống lại tác nhân gâybệnh (4) Nhiều polyphenol có hoạt tính của vitamin P có tác dụng làm bền thànhmạch, hạn chế các hiện tượng chảy máu dưới da (5) Polyphenol là chất chống oxyhóa (6) Polyphenol có khả năng chống ung thư, bảo vệ hệ tim mạch, chống lãohóa [4]

Vai trò của dẫn xuất của flavon và flavonol: Flavonol đã được chứng minh

là có một số các hoạt tính sinh học và dược lý như: chống dị ứng, chống viêm,chống oxy hóa, chống vi khuẩn (kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus), chốngưng thư, hoạt tính chống tiêu chảy, ức chế enzyme topoisomerase gây đột biếnDNA trong bạch cầu

(1) Tác dụng chống oxi hóa: Dẫn xuất của flavon và flavonol sinh ra các gốc

tự do bền vững hơn các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh lí (viêmnhiễm, ung thư, lão hóa …) Các gốc tự do tạo bởi flavon và flavonol phản ứngvới các gốc tự do hoạt động và trung hòa chúng nên không tham gia vào dâychuyền phản ứng oxi hóa tiếp theo

(2) Tác dụng đối với enzyme: (i) Làm tăng hoạt tính của prolin hydroxylase

là một enzyme quan trọng trong quá trình làm lành vết thương và tạo sẹo (ii) Kìm

hãm các enzyme lypoxygenase và enzyme tổng hợp prostaglandin, chất chuyểnacid béo không no về các dạng dẫn xuất chứa oxy.

Nhờ các tác dụng sinh học đối với enzyme mà các dẫn xuất của flavon vàflavonol có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, mau chóng làm lànhvết thương, giảm các nguy cơ về tim mạch,…

(3) Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm: Hầu hết các flavon và flavonolđều có tác dụng chống viêm nhiễm và kháng khuẩn bằng cách kìm hãm sự hô hấphay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucose Trong các dòng tế bào người,Herpesvirus hominis bị kìm hãm bởi quercetin - một flavonol, khi thêm quercetinvào virus gây bệnh ở người, virus sẽ bị kìm hãm nếu có vỏ bọc và chết nếu không

có vỏ bọc bảo vệ

(4) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch: Rối loạn tim mạch có thể bị ảnhhưởng bởi chế độ ăn uống thực phẩm có chức của dẫn xuất flavon và flavonol.Nghiên cứu về bệnh tim mạch đã cho thấy cơ chế tác dụng sau đây của dẫn xuấtflavon và flavonol: ức chế đông máu, giảm nguy cơ xơ vữa động mạch, giảmhuyết áp động mạch và giảm stress oxy hóa và đường dẫn hiệu có liên quan trong

tế bào mạch máu sửa đổi cơ chế viêm mạch máu

(5) Tác dụng đối với ung thư: Trong các hướng nghiên cứu nhằm tìm ra cáchoạt chất chống ung thư, flavonoid là một trong những hợp chất được quan tâmđặc biệt là flavon và flavonol bởi chúng là những chất có hoạt tính chống oxy hóacao, tác dụng đến nhiều hệ enzyme và ít độc đối với cơ thể sống Các kết quả thựcnghiệm cho thấy một số flavon có tác dụng chống ung thư thông qua khả nănghoạt hóa các enzyme trong gan có nhiệm vụ chuyển hóa các chất gây ung thưthành những sản phẩm có tính gây ung thư thấp hơn Lượng flavon và flavonolchế độ ăn uống có liên quan với giảm nguy cơ ung thư dạ dày ở phụ nữ và giảmnguy cơ ung thư đường tiêu ở người hút thuốc

(6) Tác dụng kháng khuẩn: Dẫn xuất flavon và flavonol đã được chứng minh

là có tác động trực tiếp kháng khuẩn, khả năng kết hợp với các thuốc kháng sinh

và có khả năng ngăn chặn các yếu tố độc tính của vi khuẩn trong nhiều thí nghiệm

in vitro [15].

Vai trò của coumarin: (1) Chống co thắt, làm giãn động mạch vành với cơ

chế tương tự như papaverin (2) Chống đông máu, làm bền và bảo vệ thành mạch.(4) Chữa bệnh lang trắng, bệnh vảy nến Tính chất này chỉ có ở những dẫn chấtfuranocoumarin như psoralen, angelicin, xanthotoxin, imperatorin (5) Nhiều dẫnchất coumarin có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt nhất là novobiocin một chất

kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng có trong nấm Streptomyces niveus (6) Một

số coumarin có tác dụng chống ung thư