PHÂN TÍCH kết QUẢ PHÂN LOẠI BẠCH cầu ở máu NGOẠI VI của máy đếm tế bào tự ĐỘNG YUMIZEN h550

Số lượng hồng cầu giảm dầnxuống, huyết cầu tố F được thay thế bởi huyết cầu tố A, số lượng và thành phầnkháng nguyên bề mặt tế bào máu thay đổi, sự tương quan của các dòng bạch cầuchủ yế

NGUYỄN THỊ TÂM

PH¢N TÝCH KÕT QU¶ PH¢N LO¹I B¹CH CÇU

ë M¸U NGO¹I VI CñA M¸Y §ÕM TÕ BµO Tù §éNG

YUMIZEN H550

Chuyên ngành : Xét nghiệm Y học

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Nguyễn Quang Tùng

HÀ NỘI - 2019

LXMC

Công thức bạch cầuLơxêmi cấp

Phương pháp thủ công

Số lượng bạch cầuWhite blood cell

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Sinh máu bình thường của cơ thể 3

1.1.1 Vị trí sinh máu của cơ thể qua các thời kỳ 3

1.1.2 Vi môi trường tủy xương 4

1.1.3 Tế bào nguồn sinh máu 4

1.1.4 Điều hòa sinh máu 5

1.2 Quá trính tăng sinh và biệt hóa dòng bạch cầu bình thường 6

1.2.1 Bạch cầu dòng tủy 6

1.2.2 Bạch cầu dòng lympho 8

1.3 Thay đổi tế bào máu ngoại vi và CTBC trong một số bệnh máu 8

1.3.1 LXM kinh dòng hạt 8

1.3.2 LXM cấp 9

1.3.3 Thiếu máu tan máu 10

1.4 Các phương pháp phân loại bạch cầu 11

1.4.1 PLBC bằng phương pháp thủ công 11

1.4.2 PLBC bằng MĐTBTĐ 12

1.5 Phân loại CTBC bằng máy Yumizen H550 14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu 17

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 17

2.2 Địa điểm nghiên cứu 17

2.3 Thời gian nghiên cứu 17

2.4 Thiết kế nghiên cứu 18

2.5 Sơ đồ nghiên cứu 18

2.6 Biến số và chỉ số nghiên cứu 19

2.7.2 Phương tiện, dụng cụ nghiên cứu 25

2.8 Sai số và phương pháp kiểm soát sai số 26

2.8.1 Sai số 26

2.8.2 Yếu tố nhiễu 26

2.8.3 Phương pháp kiểm soát sai số 26

2.9 Phương pháp phân tích số liệu 26

2.10 Đạo đức nghiên cứu 26

Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 So sánh kết quả PLBC ở nhóm người khỏe mạnh bình thường giữa máy Yumizen H550 với máy DxH 800 và PPTC 27

3.2 So sánh kết quả PLBC ở các nhóm bệnh nhân Lơxêmi cấp giữa máy Yumizen H550 với máy DxH 800 và PPTC 29

3.3 So sánh kết quả PLBC ở các nhóm bệnh nhân Lơxêmi kinh dòng hạt giữa máy Yumizen H550 với máy DxH 800 và PPTC 31

3.4 So sánh kết quả PLBC ở các nhóm bệnh nhân thiếu máu tan máu giữa máy Yumizen H550 với máy DxH 800 và PPTC 33

Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 35

4.1 Kết quả PLBC ở người khỏe mạnh bình thường 35

4.2 Kết quả PLBC ở bệnh nhân Lơxêmi cấp 35

4.3 Kết quả PLBC ở ở bệnh nhân Lơxêmi kinh dòng hạt 35

4.4 Kết quả PLBC ở ở bệnh nhân thiếu máu tan máu 35

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 36

DỰ KIẾN KHUYẾN NGHỊ 37

LẬP KẾ HOẠCH DỰ TRÙ KINH PHÍ, THỜI GIAN, NHÂN LỰC 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 2.1 Công thức bạch cầu bình thường ở người trưởng thành 19 Bảng 3.1 Sai lệch tỷ lệ % kết quả PLBC giữa máy Yumizen H550 và máy

DxH 800 trong nhóm người khỏe mạnh bình thường 27 Bảng 3.2 So sánh tỷ lệ % các thành phần bạch cầu giữa máy Yumizen

H550 và máy DxH 800 trong nhóm người khỏe mạnh bình thường 27 Bảng 3.3 Sai lệch tỷ lệ % kết quả PLBC giữa máy Yumizen H550 và

PPTC trong nhóm người khỏe mạnh bình thường 28 Bảng 3.4 So sánh tỷ lệ % các thành phần bạch cầu giữa máy Yumizen

H550 và PPTC trong nhóm người khỏe mạnh bình thường 28 Bảng 3.5 Sai lệch tỷ lệ % kết quả PLBC giữa máy Yumizen H550 và máy

DxH800 trong nhóm bệnh nhân Lơxêmi cấp 29 Bảng 3.6 So sánh tỷ lệ % các thành phần bạch cầu giữa máy Yumizen

H550 và máy DxH 800 trong nhóm bệnh nhân lơxêmi cấp 29 Bảng 3.7 Sai lệch tỷ lệ % kết quả PLBC giữa máy Yumizen H550 và

PPTC trong nhóm bệnh nhân lơxêmi cấp 30 Bảng 3.8 So sánh tỷ lệ % các thành phần bạch cầu giữa máy Yumizen

H550 và PPTC trong nhóm bệnh nhân lơxêmi cấp 30 Bảng 3.9 Sai lệch tỷ lệ % kết quả PLBC giữa máy Yumizen H550 và máy

DxH800 trong nhóm bệnh nhân Lơxêmi kinh dòng hạt 31 Bảng 3.10 So sánh tỷ lệ % các thành phần bạch cầu giữa máy Yumizen

H550 và máy DxH 800 trong nhóm bệnh nhân lơxêmi kinh dòng hạt 31 Bảng 3.11 Sai lệch tỷ lệ % kết quả PLBC giữa máy Yumizen H550 và

PPTC trong nhóm bệnh nhân lơxêmi kinh dòng hạt 32

Bảng 3.13 Sai lệch tỷ lệ % kết quả PLBC giữa máy Yumizen H550 và

máy DxH800 trong nhóm bệnh nhân thiếu máu tan máu 33 Bảng 3.14 So sánh tỷ lệ % các thành phần bạch cầu giữa máy Yumizen

H550 và máy DxH 800 trong nhóm bệnh nhân thiếu máu tan máu 33 Bảng 3.15 Sai lệch tỷ lệ % kết quả PLBC giữa máy Yumizen H550 và

PPTC trong nhóm bệnh nhân thiếu máu tan máu 34 Bảng 3.16 So sánh tỷ lệ % các thành phần bạch cầu giữa máy Yumizen

H550 và PPTC trong nhóm bệnh nhân thiếu máu tan máu 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển Y học là sự tiến bộ không ngừng của lĩnh vực cận lâmsàng, trong đó bao gồm các xét nghiệm huyết học Xét nghiệm tổng phân tích tế bàomáu ngoại vi là một xét nghiệm huyết học cơ bản đầu tay để kiểm tra sức khỏe,chẩn đoán, tiên lượng và theo dõi hiệu quả điều trị của bệnh nhân trong nhiều bệnhthuộc nhiều chuyên khoa khác nhau Phân loại công thức bạch cầu (CTBC) là mộtphần thiết yếu của xét nghiệm này nhằm mục đích đánh giá về số lượng, thànhphần, tỷ lệ các loại bạch cầu; giúp cho việc chẩn đoán, theo dõi điều trị và tiênlượng bệnh chính xác hơn

Năm 1642, Leeuwenhook đã chế tạo thành công kính hiển vi quang học(KHVQH) và phát hiện ra tế bào máu Năm 1846, Hay phân biệt lymphocyte vàbạch cầu hạt nhờ kích thước tế bào và năm 1874 Malasser giới thiệu phương phápđếm bạch cầu bằng buồng đếm tế bào máu [1], [2]

KHVQH ra đời là bước phát triển quan trọng của y học Nhờ đó, các xétnghiệm tế bào máu ngoại vi được đếm một cách thủ công Việc đếm thủ công làphương pháp xét nghiệm kinh điển tuy nhiên lại là phương pháp cho sai số chọnmẫu vì có quá ít tế bào được đếm Năm 1950, máy đếm tế bào tự động (MĐTBTĐ)đầu tiên ra đời đánh dấu bước ngoặt mới cho các nhà huyết học Từ đó đến nay,cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, MĐTBTĐ có thể đếm được nhiều tếbào nên các kết quả này rất có giá trị Có nhiều cơ chế hoạt động của MĐTBTĐ,đầu tiên phải kể đến là nguyên lý trở kháng, phân biệt các loại tế bào dựa trênkích thước tế bào do vậy không phân biệt được các loại tế bào một cách chínhxác Tiếp theo là nguyên lý sử dụng các xung điện cộng hưởng đa chiều laser,giúp bộc bộ các khác biệt về hình thái cấu trúc nhân tế bào Bên cạnh đó, nguyên

lý tế bào học dòng chảy Flow cytometry là một kỹ thuật được sử dụng để pháthiện và đo lường các đặc tính vật lý và hóa học của tế bào Theo nguyên lý này,dòng chảy các tế bào đi qua một khe đếm hẹp mà tại một thời điểm chỉ có một tếbào riêng lẻ đi qua, tại khe đếm này có chiếu ánh sáng laser Các tế bào được

đánh dấu huỳnh quang để được hấp thụ và sau đó phát ra cộng hưởng các bướcsóng rồi được nhận định xử lý bằng máy tính.

Máy Yumizen H550 là một MĐTBTĐ hiện đại, thuộc thế hệ máy ứng dụngphương pháp đo thể tích và độ hấp phụ bằng phương pháp lưu lượng dòng chảy tếbào Flow cytometry để xác định công thức bạch cầu Tuy nhiên chưa có công trìnhnào tiến hành nghiên cứu khả năng phân loại bạch cầu ở máu ngoại vi của máy này

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm mục tiêu: “Phân tích kết quả phân loại bạch cầu ở máu ngoại vi của máy đếm tế bào Yumizen H550”.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Sinh máu bình thường của cơ thể

1.1.1 Vị trí sinh máu của cơ thể qua các thời kỳ.

Sinh máu ở người là đỉnh cao của sự tiến hóa, quá trình sinh sản các tế bàomáu đạt tới mức hoàn thiện nhất với một cơ chế điều hòa tinh tế nhất Có thể chiasinh máu ở người thành ba thời kỳ chính là (1) sinh máu trong thời kỳ phôi thai, (2)sinh máu ở thời kỳ sơ sinh và trẻ em, cuối cùng là (3) sinh máu ở người trưởngthành [3], [4]

Ngay từ ngày thứ tám của phôi, sinh máu đã bắt đầu được hình thành bởi cáctiểu đảo Woll – Pander, gọi là sinh máu ở trung bì phôi Từ tuần thứ tư trở đi, sinhmáu được thực hiện tại trung mô trong phôi mà rõ nhất là ở gan và lách Đến thángthứ ba thì tủy xương, hạch và tuyến ức cũng bắt đầu quá trình sinh máu Sinh máu ởthời kỳ phôi thai là một quá trình biệt hóa không ngừng và rất mạnh mẽ Lúc đầu, ởđâu có một mảnh trung mô thì ở đó có sinh máu nhưng dần dần khu trú hẳn về tủyxương, lách và hạch lympho; các dòng tế bào máu cũng được hoàn thiện dần về sốlượng, hình thái, chức năng và cả tính kháng nguyên bề mặt [3], [4]

Sau khi trẻ ra đời, sinh máu khu trú dần ở ba cơ quan chính, trong đó tủyxương giữ vai trò chủ yếu Trong những năm đầu của cuộc đời, mỗi dòng tế bàomáu cũng vẫn tiếp tục có những biến đổi quan trọng Số lượng hồng cầu giảm dầnxuống, huyết cầu tố F được thay thế bởi huyết cầu tố A, số lượng và thành phầnkháng nguyên bề mặt tế bào máu thay đổi, sự tương quan của các dòng bạch cầu(chủ yếu là bạch cầu hạt và lympho) cũng thay đổi Có thể coi sinh máu ở giai đoạn

sơ sinh và trẻ em là một giai đoạn chuyển tiếp quan trọng trong đời sống cá thể, làgiai đoạn chuyển tiếp tạo ra những yếu tố cần thiết cho cơ thể thích nghi với ngoạicảnh Chính sự biến đổi thích nghi này đã làm cho sinh máu ở người trưởng thànhthật sự đạt tới mức hoàn thiện cao [3], [4]

1.1.2 Vi môi trường tủy xương

Trong cơ thể con người, chỉ duy nhất tủy xương có một vi môi trường sinhmáu hoàn hảo Tổ chức đệm tạo ra vi môi trường sinh máu, bao gồm toàn bộ cácyếu tố tế bào và gian bào cần thiết cho việc sinh máu Tổ chức đệm được cấu tạobởi các tế bào đệm và chất đệm gian bào [3], [4]

Tế bào đệm là tất cả các tế bào của hệ thống liên kết có mặt ở tủy xương, baogồm hai thành phần chính là lớp tế bào “vỏ khoang” và các tế bào liên kết khác.Lớp tế bào “vỏ khoang” được tạo thành bởi liên kết lỏng lẻo của các tế bào nội mômạch máu và các tế bào liên võng ngoại mạc Cấu trúc này tạo thành hàng rào ngăncách tương đối giữa tế bào sinh máu và tuần hoàn tủy xương, giúp kiểm soát sự xâmnhập của tế bào lạ từ máu vào tủy xương; đồng thời điều hòa việc phóng thích tếbào trưởng thành từ tủy xương ra máu Tế bào liên võng ngoại mạc tỏa các tua bàotương vào khoang sinh máu làm thành khung đỡ cho tế bào máu cư trú Các tế bàoliên kết khác, bao gồm đại thực bào, lympho, tạo cốt bào, hủy cốt bào, tế bào xơ và

tế bào mỡ, có vai trò sản xuất ra các yếu tố điều hòa sinh máu (cytokine) và cácprotein của tổ chức đệm Các tế bào sinh máu được phân tán trên nền xơ – mỡ của

vi môi trường sinh máu [3], [4]

Chất đệm gian bào bao gồm toàn bộ các protein ngoại bào của mô liên kết nhưproteoglycan, fibrinectin, collagen, laminin, osteonectin,… Các protein này đóngvai trò dẫn truyền thông tin điều hòa sinh máu trong tương tác giữa tế bào gốc và tếbào đệm [3], [4]

1.1.3 Tế bào nguồn sinh máu

Tế bào nguồn sinh máu chiếm 0,01-0,05% tế bào tủy xương và có rất ít ở máungoại vi (1/100 số lượng tế bào nguồn ở tủy xương) Cũng có thể thấy tế bào nguồn

ở lách và hạch nhưng thực ra đó là tế bào nguồn từ máu ngoại vi đến Trong quátrình phát triển, tế bào nguồn sinh máu có khả năng sinh sản và biệt hóa thành các tếbào máu trưởng thành có chức năng riêng biệt Người ta chia tế bào nguồn sinh máuthành bốn loại: [3], [4]

1.1.3.1 Tế bào nguồn sinh máu vạn năng (pluripotential stem cells)

Là tế bào gốc non nhất, phát triển sớm nhất, bao quát tất cả các dòng tế bào, cókhả năng sống dài ngày và tái sinh sản tốt Người ta thấy chúng có hình thái giốngcác lympho nhưng không tạo hoa hồng với hồng cầu cừu và cũng không có khảnăng đáp ứng miễn dịch khi kích thích bằng kháng nguyên Tế bào gốc vạn năng cónhóm quyết định CD 34 Tế bào gốc vạn năng có chủ yếu trong tủy xương nhưngcũng có một tỷ lệ nhỏ ở lách và ở máu ngoại vi [3], [4]

1.1.3.2 Tế bào nguồn sinh máu đa năng (multipotential stem cells)

Phát triển từ tế bào nguồn sinh máu vạn năng Chúng có khả năng tạo tế bàogốc cho từng nhóm tế bào, còn gọi là tế bào nguồn sinh máu định hướng như nhómđịnh hướng dòng tủy (myeloid) CFU-GEMM, nhóm định hướng dòng lympho(lymphoid) CFU-L [3], [4]

1.1.3.3 Tế bào nguồn có khả năng sinh hai dòng tế bào (bipotential stem cells)

Tế bào này chỉ sinh được hai dòng tế bào như CFU-EM (Erythroid/ Megakaryocyte)chỉ sinh ra hồng cầu và tiểu cầu, hoặc CFU-GM (Granulocyte/Macrophage) chỉ sinh

ra bạch cầu hạt và bạch cầu mono (đại thực bào) [3], [4]

1.1.3.4 Tế bào nguồn chỉ có khả năng sinh ra một dòng tế bào và biệt hóa thành tế bào chín (unipotential stem cells)

Đó là các tế bào mẹ của dòng hồng cầu (BFU-E, CFU-E), dòng bạch cầu hạt(CFU-G), bạch cầu ưa acid (CFU-Eo), bạch cầu ưa base (CFU-Ba) và mẫu tiểu cầu(CFU-Meg) [3], [4]

1.1.4 Điều hòa sinh máu

Cơ thể có các yếu tố tăng sinh gắn vào màng tế bào gốc sẽ khởi phát hai cơchế khác nhau giúp chuyển tín hiệu tăng sinh hoặc biệt hóa đi vào nhân Các yếu tốkích thích sinh máu là các protein dạng hormon được phân loại thành các yếu tốkích thích tạo cụm đa dòng (multi CSF); yếu tố kích thích tạo cụm dòng hạt mono(GM-CSF); các yếu tố tăng sinh đặc hiệu dòng và các lymphokin, monokin [3], [4]

1.2 Quá trính tăng sinh và biệt hóa dòng bạch cầu bình thường

1.2.1 Bạch cầu dòng tủy [3], [4]

Tế bào gốc đa năng dòng tủy (CFU-GEMM: Granulocyte/ Erythroid/Monocyte/ Megakaryocyte) là tế bào nguồn chung sinh ra các tế bào tiền thân củadòng hồng cầu, dòng tiểu cầu, dòng mono, dòng bạch cầu hạt trung tính, bạch cầuhạt ưa base và bạch cầu hạt ưa acid

1.2.1.1 Bạch cầu hạt

Bạch cầu hạt trung tính được sinh ra từ tiền thân là CFU-G Tế bào đầu dòng

có thể nhận dạng được bằng hình thái học là nguyên tủy bào (Myeloblast) Đây là tếbào to, tròn, đường kính khoảng 10-15µm Nhân to, lưới màu nhân mịn, thường cómột hạt nhân rõ Bào tương ưa base đậm, bắt đầu có các hạt nhỏ mịn ưa azua gọi làhạt sơ cấp Bằng phương pháp nhuộm hóa học tế bào, người ta thấy các hạt sơ cấpchứa men peroxydase, lysozyme, protease, hydrolase, phosphatase acid và một sốpeptid khác

Từ một nguyên tủy bào cho hai tiền tủy bào (Promyelocyte) Nhân tế bào đôngđặc hơn, lưới màu thô hơn, hạt nhân nhỏ hoặc chỉ còn vết hoặc không thấy nữa Đặcđiểm đáng lưu ý là bào tương chứa nhiều hạt ưa azua, kích thước hạt to hơn, bắtmàu đỏ tím trên tiêu bản nhuộm giemsa, có một vùng sáng gần nhân do bộ máygolgi phát triển

Đến tủy bào, tính chất biệt hóa của tế bào được thể hiện rõ nét Nhân nhỏ lại, hìnhbán nguyệt, lưới màu nhân thô hơn, không còn hạt nhân Bào tương ưa acid hoặc cómàu vàng nâu (trung tính) Bắt đầu xuất hiện hạt thứ cấp gọi là hạt đặc hiệu (0,1-0,3µm) chứa collagenase, lactoferrin, phosphatase kiềm, protein gắn B12, plasminogen

và các chất hoạt hóa bổ thể Các hạt trung tính tăng dần đến bạch cầu đoạn

Hậu tủy bào là tế bào không còn khả năng phân bào Từ đây, tế bào chỉ cònkhả năng hoàn chỉnh sự trưởng thành của nó mà thôi Kích thước tế bào nhỏ hơn tủybào, nhân hình lưỡi liềm hoặc hình thận, lưới màu thô bắt màu rất thẫm trên tiêubản nhuộm giemsa

Bạch cầu đũa có nhân đặc hơn nhưng vẫn chưa tạo thành các múi rõ rệt Hìnhthái chung gần giống bạch cầu trưởng thành.

Bạch cầu đoạn trung tính là tế bào trưởng thành thực hiện chức năng Thờigian biệt hóa và trưởng thành từ một tế bào gốc tiền thân (CFU-G) đến bạch cầuđoạn trung tính mất khoảng 1-2 tuần Ở máu ngoại vi, số lượng bạch cầu đoạn trungtính đếm được khoảng 4,0 - 11,0 x 109/l Số lượng chính xác của bạch cầu đoạntrung tính ở máu ngoại vi khoảng gấp đôi số đếm vì một nửa bạch cầu đoạn trungtính nằm sát thành mạch, không tham gia vào thành phần máu lưu hành

Bạch cầu hạt ưa acid và bạch cầu hạt ưa base chiếm một tỷ lệ nhỏ trong quầnthể bạch cầu hạt Bạch cầu hạt ưa acid được tạo thành từ tế bào tiền thân là CFU-Eo.Quá trình biệt hóa và trưởng thành của bạch cầu hạt ưa acid cũng giống như bạchcầu hạt trung tính Các hạt xuất hiện sớm nhất ở giai đoạn tủy bào Các hạt của bạchcầu ưa acid có kích thước lớn, chứa men thủy phân, peroxydase và các protein khác.Bạch cầu hạt ưa acid trưởng thành dễ nhận biết bởi các hạt màu da cam trong bàotương và nhân thường chia hai múi Số lượng bạch cầu hạt ưa acid trong máukhoảng 0,1-0,4 x 109/l và tồn tại khoảng 12 giờ

Bạch cầu hạt ưa base thường không gặp ở máu ngoại vi hoặc với một tỷ lệ rấtthấp trong một số trường hợp, nhất là bệnh lý tăng sinh tủy ác tính Nhân thườngchia hai đoạn, bào tương có vài hạt lớn bắt màu xanh tím trên tiêu bản nhuộmgiemsa Các hạt ưa base chứa các proteoglycan gồm heparin, histamin, proteasetrung tính và một số men khác Về hình thái cần phân biệt với dưỡng bào Thời gianlưu hành trong máu của bạch cầu hạt ưa base khoảng 1-2 ngày

1.2.1.2 Bạch cầu mono

Ở máu ngoại vi, bạch cầu mono có kích thước thay đổi tử 10 đến 20µm Trêntiêu bản máu ngoại vi nhuộm giemsa, bạch cầu mono có nhân to hình hạt đậu, cóthể thấy hạt nhân Bào tuơng rộng , màu xanh xám hoặc xám Có thể gặp không bàotrong bào tương Trong bào tương có ít hạt màu đỏ cam, gồm hai nhóm Nhóm hạtphổ biến chứa phosphatase acid và men peroxydase tương tự như hạt sơ cấp của

bạch cầu hạt trung tính Nhóm còn lại vẫn chưa rõ chức năng Số lượng bạch cầumono ở máu ngoại vi khoảng 1-6% số lượng bạch cầu.

1.2.2 Bạch cầu dòng lympho [3], [4]

Tế bào mẹ (CFU-HL) của lympho chung được phát triển từ tế bào gốc tạo máu(CFU-S) Từ đây, chúng phân chia thành ba nhóm chính là lympho B, lympho T vàNK-Natural killer cell Quá trình biệt hóa của các tế bào dòng lympho, về bản chấtliên quan đến sự thêm vào và mất đi của hàng loạt các kháng nguyên bề mặt(Cluster of Differentiation-CD) Hầu hết các kháng nguyên bề mặt chủ yếu đượcxác định bằng kháng thể đơn dòng Về hình thái, lympho được chia thành hai loại làlympho nhỏ có kích thước tương tự hồng cầu trưởng thành (chiếm phần lớn) vàlympho lớn có đường kính 9-12 µm Đây là loại tế bào có nhân tròn, chiếm gần hếtbào tương, không thấy hạt nhân

1.3 Thay đổi tế bào máu ngoại vi và CTBC trong một số bệnh máu

1.3.1 LXM kinh dòng hạt

Lơxêmi kinh dòng hạt (LXMKDH) là một bệnh ác tính hệ tạo máu, đặc trưngbởi sự tăng các tế bào dòng bạch cầu hạt biệt hóa, hậu quả là số lượng bạch cầu tăngcao ở máu ngoại vi với đủ các tuổi của dòng bạch cầu hạt [5]

LXMKDH là một bệnh thuộc hội chứng tăng sinh tủy mạn ác tính Đây là mộtnhóm bệnh lý đơn dòng của tế bào gốc vạn năng có cơ chế bệnh sinh do sự tăngsinh không kiểm soát của tế bào gốc sinh máu trong tủy xương, tiến triển mạn tính

do các tế bào gốc này vẫn còn khả năng biệt hóa đến giai đoạn trưởng thành [5]Tiến trình tự nhiên của LXMKDH bao gồm ba giai đoạn: (1) giai đoạn mạntính; (2) giai đoạn tăng tốc; (3) giai đoạn chuyển cấp [5]

Kết quả xét nghiệm máu ngoại vi cho thấy:

(1) Giai đoạn mạn tính thường có biểu hiện: thiếu máu bình sắc thường lànhẹ hoặc vừa, kích thước hồng cầu bình thường, số lượng bạch cầu tăng cao thường

>50G/l, có thể tăng rất cao >100G/l; tỉ lệ tế bào blast bao gồm nguyên tủy bào, tiền

tủy bào dưới 10% gặp đủ các tuổi dòng bạch cầu hạt trong công thức bạch cầu máungoại vi; tăng bạch cầu đoạn ưa acid và bạch cầu đoạn ưa base; số lượng tiểu cầubình thường hoặc tăng, có khi số lượng tiểu cầu tăng trên 400 G/l (gặp trong 50-70% trường hợp) [5] [11] [12]

(2) Giai đoạn tăng tốc thường có số lượng bạch cầu tăng cao, tăng tỷ lệ tếbào blast hoặc nguyên tủy bào và tiền tủy bào từ 10-20%; giảm số lượng hồng cầu

và lượng huyết sắc tố; số lượng tiểu cầu thường giảm [5] [11] [12]

(3) Giai đoạn chuyển cấp số lượng bạch cầu thường tăng, thậm chí tăng rấtcao, có tăng tỉ lệ tế bào blast, nguyên tủy bào và tiền tủy bào ≥20%; giảm số lượnghồng cầu và lượng huyết sắc tố; số lượng tiểu cầu thường giảm [5] [11] [12]

Lơxêmi cấp gồm dòng hạt và dòng lympho

Kết quả xét nghiệm máu ngoại vi cho thấy:

(1) Đa số các bệnh nhân thể hiện tình trạng giảm ba dòng bình thường củamáu ngoại vi và xuất hiện tế bào non ác tính trong CTBC Số lượng bạch cầu có thểtăng nhưng chủ yếu là bạch cầu đầu dòng chưa biệt hóa hoặc ít biệt hóa, trong đóbạch cầu trưởng thành rất ít và xuất hiện khoảng trống bạch cầu Số lượng bạch cầu

có thể từ 1-200 G/l, đa số bệnh nhân có số lượng bạch cầu khoảng 5-30 G/l Tỷ tệ tếbào ác tính >20% [6] [13]

(2) Các chỉ số hồng cầu máu ngoại vi thường cho thấy một tình trạng thiếumáu bình sắc hồng cầu bình thường không phục hồi Số lượng tiểu cầu thườnggiảm, độ tập trung kém [6] [13]

1.3.3 Thiếu máu tan máu [7]

Thiếu máu tan máu là hiện tượng giảm ngắn đời sống hồng cầu do tăng pháhủy hồng cầu Đời sống hồng cầu ngắn (dưới 120 ngày) nên số lượng hồng cầu bịtiêu hủy tăng lên nhiều gây thiếu máu nhanh chóng, tủy xương tăng sinh mạnh để

bù lại tình trạng thiếu máu

Hồng cầu vỡ sớm là do những bất thường ở hồng cầu, như những bất thường ởmàng, ở enzym hay ở hemoglobin của hồng cầu (tan máu do nguyên nhân tại hồngcầu); hoặc do những bất thường ở ngoài hồng cầu, cơ chế miễn dịch hay không domiễn dịch (tan máu do nguyên nhân ngoài hồng cầu):

- Nguyên nhân tại hồng cầu:

+ Do thiếu men hồng cầu: G6PD-glucose 6 phosphat dehydrogenase; pyruvat kinase

PK-+ Bất thường về số lượng huyết sắc tố (bệnh alpha thalassemia, bệnh betathalassemia, ), bất thường về chất lượng (bệnh huyết sắc tố S, bệnh huyết sắc tố M,bệnh huyết sắc tố E, )

+ Bất thường do cấu trúc của màng hồng cầu: Hồng cầu hình gai, hồng cầuhình thoi, bệnh đái huyết sắc tố kịch phát về ban đêm

- Nguyên nhân ngoài hồng cầu:

+ Tan máu miễn dịch: tan máu huyết tán trẻ sơ sinh, tan máu do tự kháng thểlạnh, tan máu miễn dịch do thuốc,…

+ Tan máu ngoài hồng cầu không do cơ chế miễn dịch: Đái huyết sắc tố kịchphát do lạnh, thiếu máu huyết tán mắc phải không do tự kháng thể sinh,

Kết quả xét nghiệm máu ngoại vi:

- Hồng cầu lưới tăng, có thể tới 10-20%

- Nhiều hồng cầu to

- Nguyên hồng cầu máu nhiều

- Hồng cầu hình cầu, hình bia, hình liềm, hồng cầu nhiều hạt kiềm

- Đời sống hồng cầu ngắn khi đánh dấu bằng Cr51: thời gian bán hủy chỉ từ

7-15 ngày, trong khi bình thường T/2 = 30 ± 3 ngày

1.4 Các phương pháp phân loại bạch cầu

Theo Groner (1995), lịch sử nghiên cứu số lượng và thành phần tế bào máu cóthể chia làm ba giai đoạn:

- Giai đoạn phát hiện (1642-1881): Năm 1642, Leeuwenhoek chế tạo thành côngkính hiển vi quang học Leeuwenhoek, với chiếc kính hiển vi đơn giản tự tạo đầu tiêncủa mình, ông đã phát hiện ra trong máu có nhiều vật thể, gọi là tế bào [14] Năm 1942,Donne phát hiện ra tiểu cầu Năm 1846, Hayem phân biệt giữa lymphocyte và bạch cầuhạt nhờ kích thước tế bào và năm 1874, Malaseez giới thiệu phương pháp đếm BCbằng buồng đếm tế bào máu Tiến bộ trong giai đoạn này dựa trên kỹ thuật quang học

và phương pháp nhuộm tế bào với mục đích phân biệt hình thái và cấu trúc cơ bản của

bộ trong giai đoạn này dựa trên sự đối chiếu giữa phân tích tỉ mỉ hơn các chi tiết tếbào học với các triệu chứng và tiến triển lâm sàng của bệnh

- Giai đoạn củng cố (1950-1965): giai đoạn này không có những phát hiện mới

về tế bào học nhưng việc áp dụng kỹ thuật tự động trong đếm tế bào máu đã gópphần tích cực trong lĩnh vực xét nghiệm, đáp ứng kịp thời và chính xác hơn chochẩn đoán và điều trị bệnh [19]

1.4.1 PLBC bằng phương pháp thủ công

Phương pháp xác định số lượng bạch cầu trong 1 lit máu toàn phần dựa trênnguyên tắc pha loãng bạch cầu trong máu toàn phần với dung dịch phá hủy hồng

cầu theo một tỷ lệ nhất định, rồi đếm trên kính hiển vi quang học và nhân lên theo

tỷ lệ pha loãng Đây là phương pháp kinh điển được áp dụng rộng rãi trong cácphòng xét nghiệm Phương pháp dễ triển khai, ít tốn kém do đó rất phù hợp vớinhững cơ sở còn hạn chế về kinh phí, tuy nhiên sai số là rất lớn có thể đến 20%.Phương pháp lập công thức bạch cầu trên tiêu bản nhuộm giemsa bằng kìnhhiển vi quang học là phương pháp kinh điển Đây là phương pháp có giá trị caotrong nhận định hình thái các loại tế bào, kể cả hình thái bình thường và hình tháibất thường (rối loạn hình thái, tế bào bất thường) Phương pháp này đòi hỏi mấtnhiều thời gian và phụ thuộc vào trình độ chuyên môn của xét nghiệm viên [20],[21],[22]

1.4.2 PLBC bằng MĐTBTĐ

Lịch sử phát triển của PLBC bằng máy được bắt đầu bởi Mellor vàPapanicolaou vào năm 1952 Trong thập niên 60, người ta sử dụng hệ thống máyphân tích ảnh trên tiêu bản máu nhuộm (Image processing) để phân loại bạch cầu.Năm 1965, Mack Fulwyler là người phát minh ra tiền thân máy đo lưu lượng dòngchảy tế bào và đến năm 1968, Wolfgang Gothde được cấp bằng sáng chế về máy đo

tế bào dòng chảy dựa trên huỳnh quang [8],[9],[10] Đến thập kỷ 70, các hãngGeometric Data (1974), Coulter (1974) và Abbott (1978) đã sản xuất các máy tựđộng phân loại bạch cầu dựa trên nguyên tắc phân tích hình ảnh tế bào Tuy nhiênhướng đầu tư công nghệ này đã không phát triển tiếp được vì giá thành xét nghiệmquá cao Năm 1974, hãng Technicon đã thành công trong việc nghiên cứu phân loạibạch cầu bằng máy dựa trên nguyên tắc nhuộm hóa học tế bào Người ta sử dụng kỹthuật nhuộm Peroxidase trên máy đếm tế bào quang học để nhận dạng bạch cầuđoạn trung tính, bạch cầu lympho và bạch cầu ưa acid; kỹ thuật nhuộm Esterase đểnhận dạng mono và kỹ thuật nhuộm Peroxidase vẫn còn được ứng dụng trong côngnghệ của máy Advia Năm 1981, Technicon cho ra đời máy đếm tế bào H6000 sử

dụng nguyên tắc trở kháng đã phân loại được 5 thành phần bạch cầu Ngay sau đó,các hang Coulter, Abbott, Sysmex và Roche đã phát triển mạnh mẽ công nghệ máyđếm tế bào theo hướng này [19]

Máy đếm tế bào tự động, đặc biệt là thế hệ hiện đại là một cuộc cách mạngtrong việc nâng cao năng xuất và độ chính xác của xét nghiệm bạch cầu, bao gồm

cả đếm số lượng và phân loại bạch cầu Phương pháp xét nghiệm này mang tínhkhách quan, ổn định và có độ chính xác cao Tuy nhiên tùy thuộc vào nguyên tắchoạt động máy là trở kháng đơn thuần hay kết hợp với laser quét và hóa học tế bào

mà kết quả xét nghiệm có độ chính xác khác nhau Nói chung, các máy đếm tế bàothế hệ trở kháng đơn thuần còn nhiều hạn chế nhất là đối với phân loại bạch cầu Sai

số khi đếm số lượng bạch cầu bằng phương pháp máy đếm tế bào thường <5%,nhưng sai số trong phân loại bạch cầu lại rất khác nhau Điều này phụ thuộc vào haiyếu tố chính đó là:

Nguyên lý hoạt động của máy đếm: Máy đếm tế bào thế hệ trở kháng chỉ căn

cứ đơn thuần vào kích thước bạch cầu đi qua lỗ đếm để phân loại, do đó tất cảnhững biến đổi kích thước tế bào bạch cầu đều có nguy cơ gây ra sai số trong phânloại bạch cầu Máy đếm có chùm tia laser quét nhuộm hóa học tế bào kết hợp sẽgiúp khắc phục được nhược điểm này của máy trở kháng

Đặc điểm biến đổi hình thái của tế bào bạch cầu: Nếu bạch cầu chỉ thay đổikích thước tế bào (to hoặc nhỏ hơn bình thường), thường chỉ gây sai số cho máyđếm tế bào trở kháng đơn thuần, ít có khả năng gây sai số cho các máy hiện đạihơn trong phân loại bạch cầu Nhưng những biến đổi phức tạp kết hợp cả kíchthước tế bào, hình thái tế bào, hình thái nhân sẽ gây khó khăn trong nhận diệnthành phần bạch cầu đối với nhiều loại máy đếm tế bào Trong những trường hợpnày, phân loại bạch cầu trên tiêu bản nhuộm giemsa bằng kính hiển vi quang họclại trở nên cần thiết

1.5 Phân loại CTBC bằng máy Yumizen H550 [23]

MĐTBTĐ Yumizen H550 là sản phẩm của hãng Horriba (Nhật Bản), sử dụng

phương pháp lưu lượng dòng chảy tế bào flow cytometry để xác định công thứcbạch cầu

- Chuẩn bị:

+20 µL máu và 1mL ABX Diluent được hút và đưa vào buồng Dil/HGB Tỷ lệpha loãng ban đầu là 1/51

+Thêm 1,4 mL Whitediff 1L và ủ trong 22 ± 2 giây ở 37 ± 2 ° C Whitediff 1L

có tác dụng phá hủy màng hồng cầu và ổn định bạch cầu Tỷ lệ pha loãng cuối cùng

là 1/112

+93,25 µL dung dịch pha loãng cuối cùng được bơm vào buồng đếm để đo thểtích và độ hấp thụ của từng tế bào

- Nguyên tắc phân loại bạch cầu: Nguyên lý

phát hiện WBC dựa trên hệ thống Double

Hydrodynamic Sequential “DHSS” cho phép dòng

chảy tế bào đi qua đường dẫn có ánh sáng chiếu qua

Các tế bào đi qua khe đếm hẹp có đường kính 60µm

trong 11 X 1 giây và được đo bởi dòng điện (dựa

vào sự thay đổi trở kháng) Ánh sáng chiếu góc 0 °

để đo dựa vào cấu trúc bên trong mỗi tế bào và độ

hấp thụ của nó Ánh sáng không được hấp phụ sẽ

xuyên qua vật chất nhân của mỗi tế bào Điều đó

được biết như hiện tượng khuếch tán

+Bạch cầu lympho: là những tế bào

tròn, nhỏ, tế bào chất cô đặc và có một nhân

Các tế bào bạch cầu này có kích thước nhỏ

nên được định vị ở phần dưới trục Y và bên

trái trục X

+Bạch cầu mono: là những tế bào lớn

với một nhân xốp và đôi khi có không bào

Các tế bào này có kích thước lớn nên được

định vị ở phần dưới trục Y và bên phải trục X

1: Bạch cầu lympho 2: Bạch cầu mono 3: Bạch cầu trung tính 4: Bạch cầu ưa acid 5: Bạch cầu ưa base 6: Tế bào chưa trưởng thành 7: Vùng nhiễu

+ Bạch cầu trung tính: là các tế bào có kích thước trung bình, nhân chia đoạn.Các tế bào này được định vị ở giữa trục Y và dọc theo phần giữa của trục X

+ Bạch cầu ưa acid: do tác dụng của thuốc thử, bạch cầu ưa acid được định

vị ở phần cao nhất của trục Y

+ Bạch cầu ưa base : nằm giữa quần thể bạch cầu lympho, bạch cầu mono

và bạch cầu trung tính, Bạch cầu này có kích thước trung bình và có độ hấp phụtrung bình

+ Tế bào chưa trưởng thành: có kích thước lớn nên các tế bào nhưmetamyelocytes nằm ở bên phải của bạch cầu trung tính Myelocytes vàpromyelocytes nằm ở bên phải của ma trận Cả Metamyelocytes, myelocytes vàpromyelocytes đều được phân loại là LIC

+ Vùng nhiễu: được tạo ra khi có tiểu cầu và các mảnh vỡ tế bào hồng cầu,nằm ở góc dưới bên trái ma trận

MĐTBTĐ Yumizen H550 hiện đang được sử dụng tại Trung tâm xétnghiệm GreenLab và một số cơ sở khác, cho kết quả của 27 thông số máu ngoại

CV Dải biến thiên phân bố kích thước hồng cầu EOS# Số lượng bạch cầu acid

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu gồm 400 người chia làm 2 nhóm

1 Người trưởng thành khỏe mạnh: 100 người, là những người cho máu tạiViện Huyết học –Truyền máu Trung ương

2 Nhóm bệnh nhân bệnh máu: 300 bệnh nhân được khám và điều trị tại ViệnHuyết học - Truyền máu Trung Ương Gồm:

o Bệnh nhân Lơxêmi cấp: 100 bệnh nhân

o Bệnh nhân Lơxêmi kinh dòng hạt: 100 bệnh nhân

o Bệnh nhân thiếu máu tan máu: 100 bệnh nhân

 Máu ngoại vi: lấy 2ml máu tĩnh mạch của đối tượng nghiên cứu vào ốngnghiệm chuyên dụng cho xét nghiệm tế bào máu ngoại vi, chống đông bằng EDTA Tiếnhành xét nghiệm trong vòng 2 giờ kể từ khi lấy máu, bảo quản ở nhiệt độ phòng

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu

- Bệnh nhân được chỉ định làm xét nghiệm công thức máu

- Bệnh nhân có đầy đủ thông tin cá nhân, hồ sơ bệnh án đầy đủ thông tin vềcận lâm sàng, chẩn đoán lâm sàng

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Mẫu máu huyết tán

- Mẫu máu bị đông dây

- Mẫu máu lấy sai thể tích quy định

2.2 Địa điểm nghiên cứu

Trung tâm xét nghiệm GreenLab, số 121 Bùi Thị Xuân- Hai Bà Trưng – Hà Nội

2.3 Thời gian nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ 01/01/2020 đến 31/03/2020

- Thời gian thu thập số liệu: Từ 01/01/2010 đến 31/03/2020

2.4 Thiết kế nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang

2.5 Sơ đồ nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu:

Người trưởng thành khỏe mạnh Lơxêmi cấp

Lơxêmi kinh dòng hạtThiếu máu tan máu

DxH800

Chạy máy Yumizen H550

Nhuộm Giemsa

Xếp loại CTBC

bằng PPTC Xếp loại CTBC bằng máy Yumizen H550

Xếp loại CTBC bằng máy DxH800

So sánh kết quả xếp loại CTBC bằng máy Yumizen H550 với

PPTC và máy DxH800

Thu thập, phân tích số liệu và kết luận