Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen HLA của các đơn vị máu dây rốn tại ngân hàng máu dây rốn cộng đồng viện HH TM trung ương

Kết quả của các nghiên cứu có so sánh đã chỉ ra rằng: ghép TBG máu dây rốn có thể thực hiện ở bệnhnhân người lớn nếu đơn vị máu dây rốn có đủ số lượng TBG [2].. Trong các tiêu chuẩn lựa

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trên thế giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng, ghép tế bào gốc vẫn làphương pháp điều trị hiện đại, triệt để nhất đối với các bệnh lý cơ quan tạo máu vàmột số bệnh lý khác đặc biệt là nhóm bệnh ác tính Theo báo cáo của Tổ chức y tếthế giới (WHO), trung bình mỗi năm có khoảng 50.000 ca ghép TBG được thựchiện trên toàn thế giới và con số này đang tăng lên nhanh chóng [1]

Nguồn tế bào gốc sử dụng cho ghép chủ yếu được lấy từ máu ngoại vi,tủy xương và máu dây rốn Trong đó, nguồn TBG từ máu dây rốn đang ngàycàng được sử dụng phổ biến hơn Ở Nhật Bản, 50% các trường hợp ghépkhông cùng huyết thống được ghép bằng MDR Kết quả của các nghiên cứu

có so sánh đã chỉ ra rằng: ghép TBG máu dây rốn có thể thực hiện ở bệnhnhân người lớn nếu đơn vị máu dây rốn có đủ số lượng TBG [2] TBG máudây rốn có rất nhiều ưu điểm như: sẵn có, thu thập dễ dàng mà không ảnhhưởng tới sức khỏe người mẹ và thai nhi, yêu cầu hòa hợp về HLA không quácao và tỷ lệ nhiễm Cytomegalo virus thấp Bên cạnh đó, tỷ lệ tìm thấy sự hòahợp HLA ở những mẫu máu dây rốn của người cho cùng huyết thồng chỉ là

25 - 30%, vì vậy, 75% còn lại phụ thuộc vào việc tìm kiếm mẫu máu dây rốnphù hợp từ ngân hàng máu dây rốn cộng đồng

Trong các tiêu chuẩn lựa chọn một đơn vị máu dây rốn phù hợp, tiêuchuẩn hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người cho là một trong những điềukiện quan trọng nhất, quyết định tới sự thành công của ca ghép Điều này dẫnđến sự ra đời và phát triển của kỹ thuật xét nghiệm định type HLA Từ kỹthuật đơn giản đầu tiên là kỹ thuật vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể ra đời từnhững năm 1980 [3] với độ nhạy và độ đặc hiệu chưa cao, đến nay đã có thêmrất nhiều kỹ thuật mới sử dụng tới công nghệ di truyền phân tử Đặc biệt là kỹthuật PCR sử dụng đầu dò đặc hiệu - SSO, đã giúp cải thiện đáng kể tính chính

xác cũng như cho kết quả định nhóm HLA ở độ phân giải cao hơn so với kỹthuật PCR - sử dụng đoạn mồi đặc hiệu SSP [4] hay còn gọi là HLA độ phângiải thấp Các đơn vị máu dây rốn được lưu trữ tại Ngân hàng máu dây rốn củaViện HH - TM TW có ưu điểm vượt trội hơn so với các ngân hàng khác đó làđều được xét nghiệm HLA độ phân giải cao, nhờ thế bước đầu đã mang lạihiệu quả rất đáng khích lệ thể hiện khả năng tìm kiếm rất cao (97,8%) [5] Đểtìm hiểu vai trò của xét nghiệm HLA đối với việc tìm kiếm nguồn TBG, chúng

tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen HLA của các đơn

vị máu dây rốn tại ngân hàng máu dây rốn cộng đồng Viện HH - TM Trung ương” với hai mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm kiểu gen HLA của các đơn vị máu dây rốn tại Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng Viện Huyết học - Truyền máu TW.

2 Bước đầu đánh giá khả năng tìm kiếm đơn vị máu dây rốn cho bệnh nhân có nhu cầu ghép máu dây rốn tại Viện.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TẾ BÀO GỐC TRONG QUÁ TRÌNH SINH MÁU

1.1.1 Khái niệm tế bào gốc

Danh từ tế bào gốc (Stem cells) có từ trên 60 năm nay, kể từ khi nghiêncứu thành công tạocolony tế bào lách (CFU - S) trong nghiên cứu sinh máu ởchuột (1950) Từ đó đến nay, dựa trên các tiến bộ về khoa học kỹ thuật, người

ta đã phân lập và biết được quá trình phát triển của cơ thể người và động vậtbắt đầu từ tế bào gốc “trùm” (gangleader - stem cells) hay còn gọi là tế bàogốc nguyên thủy (primitive stem cells), hay tế bào gốc toàn năng (Totipotentstem cells = TSC)

Tế bào gốc là tế bào có khả năng sinh sản, tự tái sinh và biệt hóa thànhcác tế bào gốc kế cận, rồi phát triển thành TBG có chức năng riêng, cuối cùngtrở thành tế bào trưởng thành của toàn cơ thể người và động vật [6], [7]

1.1.2 Tế bào gốc sinh máu

Các tế bào gốc sinh máu được định nghĩa dựa trên ba đặc trưng cơ bản,

đó là khả năng tự tái tạo, khả năng biệt hóa đa dòng và khả năng phục hồi hệtạo máu Ngoài ra còn một số đặc điểm khác như khả năng di chuyển từ tủy ramáu, tính mềm dẻo trong biệt hóa và chết theo chương trình [8]

 Khả năng tự tái tạo

Bằng chứng rõ ràng nhất về khả năng tự tái tạo của các TBG là việccung cấp liên tục các tế bào máu trong suốt cuộc đời của một cá thể Khảnăng này liên quan chặt chẽ với hoạt tính của enzym tổng hợp chuỗi có khảnăng tổng hợp chuỗi DNA mới Ở người, thời gian tổng hợp chuỗi DNA rấtngắn trong quá trình phân bào của TBG, đặc biệt khi tác động mạnh như trongquá trình ghép

 Khả năng biệt hóa đa dòng.

Tế bào gốc sinh máu có khả năng biệt hóa thành tất cả các tế bào máu,đầu tiên là tạo ra các tế bào định hướng dòng tủy và dòng lympho Sau đó, các

tế bào định hướng dòng lympho sẽ tiếp tục phân chia và biệt hóa thành cácdòng lympho T, B và NK Các tế bào gốc định hướng dòng tủy sẽ phân chia

và biệt hóa thành các tế bào đầu dòng bạch cầu hạt, dòng mono, dòng mẫutiểu cầu, dòng hồng cầu

 Khả năng hồi phục hệ sinh máu

Các tài liệu sớm nhất đã công bố về khả năng phục hồi hệ sinh máu củaTBG dựa trên thực nghiệm ghép trên chuột sau khi chiếu xạ liều chí tử.Tương tự như vậy, các tế bào gốc ở người cũng đặc trưng bởi đặc tính quaytrở lại tủy xương, tái tạo mô sinh máu Sau khi trở lại, cư trú tại tủy xương,các tế bào gốc sinh máu tăng sinh, biệt hóa, đáp ứng với những tín hiệu kíchthích từ môi trường đệm gian bào

1.1.3 Vị trí sinh máu

Sinh máu ở người là đỉnh cao của sự tiến hóa, quá trình sinh sản các tếbào máu đạt tới mức hoàn thiện nhất với một cơ chế điều hòa tinh tế nhất Cóthể chia sinh máu ở người thành 3 thời kỳ chính là: sinh máu trong thời kỳphôi thai, sinh máu thời kỳ sơ sinh và trẻ em, cuối cùng là sinh máu ngườitrưởng thành

Ngay từ tuần thứ 8 của phôi, sinh máu đã bắt đầu được hình thành bởicác tiểu đảo Woll - Pander, gọi là sinh máu trung bì phôi Từ tuần thứ 4 trở đi,sinh máu được thực hiện tại trung mô trong phôi mà rõ nhất ở gan và lách.Đến tháng thứ 3 thì tủy xương, hạch, tuyến ức cũng bắt đầu quá trình sinhmáu Sinh máu thời kỳ phôi thai là quá trình biệt hóa không ngừng và rấtmạnh mẽ Lúc đầu ở đâu có một mảnh trung mô thì ở đó có sinh máu nhưngdần khu trú hẳn về tủy xương, lách và hạch lympho Các dòng tế bào máu

cũng dần được hoàn thiện về số lượng, hình thái, chức năng và cả tính khángnguyên bề mặt Sau khi trẻ em ra đời, sinh máu khu trú dần ở 3 cơ quanchính, trong đó tủy xương giữ vai trò chủ yếu [9].

1.1.4 Tạo nguồn tế bào gốc sinh máu

 Các nguồn tế bào gốc sinh máu

 Nguồn tế bào gốc từ tủy xương

Nguồn cung cấp tế bào định hướng sinh máu được sử dụng cho ghépđầu tiên là từ tủy xương người cho Trong hơn 20 năm qua, nguồn cung cấpchính tế bào gốc cho ghép là tủy xương Tế bào CD34+ trong tủy xươngchiếm khoảng 1/100 đến 1/1000 tế bào có nhân trong tủy [10]

Nguồn tế bào gốc từ tủy xương được sử dụng cho ghép đồng loàinhất là các trường hợp không thể huy động TBG ra máu; có thể thu thập từtủy của người cho hòa hợp toàn bộ hoặc một phần, có hoặc không có liên

 Nguồn tế bào gốc từ máu ngoại vi

Đây là nguồn TBG định hướng sinh máu từ tủy xương, được huy động ramáu ngoại vi bằng cách sử dụng những yếu tố kích thích tăng trưởng, thường

sử dụng G - CSF có kèm hoặc không kèm hóa trị liệu [11], [12] Số lượngCD34+ tăng lên từ ngày thứ ba và đạt cao nhất vào ngày thứ năm và thứ sáu[12] Khi số lượng CD34+ lớn hơn hoặc bằng 10 tế bào/microlit máu thì cóthể thu được khoảng 1 x 106 tế bào CD34/kg cân nặng của người cho Một số

nghiên cứu cho thấy, có sự liên quan giữa số lượng TBG thu nhận được vớithể tích máu lấy ra Với thể tích máu lớn, có thể nhận được tỷ lệ tế bàoCD34+ nhiều hơn từ 2,5 đến 3 lần so với tỷ lệ này trong máu tại thời điểm bắtđầu xử lý [10], [11].

Thời gian mọc mảnh ghép có liên quan chặt chẽ với số lượng tế bàoCD34+ và TBCN thu nhận được, thường phải đảm bảo từ 1x106 đến hơn5x106 TBCN/kg trọng lượng người nhận

Các tế bào gốc ra máu sẽ được thu thập bằng máy gạn tách tế bào Hiệnnay đây là nguồn chính sử dụng cho ghép đồng loài Các nghiên cứu lâm sàng

so sánh khi sử dụng TBG máu ngoại vi với sử dụng TBG từ tủy cho thấy: kếtquả mọc ghép sớm hơn, khả năng hồi phục miễn dịch nhanh hơn, tỷ lệ tửvong liên quan đến biến chứng ghép thấp hơn, nguy cơ xuất hiện bệnh ghépchống chủ cấp tương đương ở cả hai nhóm nhưng bệnh ghép chống chủ mạnlại gặp nhiều hơn ở bệnh nhân ghép TBG máu ngoại vi huy động [13] Bêncạnh đó, tại các nước đang phát triển như ở Việt Nam, khó khăn đặt ra vớinhững bệnh nhân không có người cho cùng huyết thống, khi mà ngân hàngTBG từ người cho không cùng huyết thống chưa được thành lập, cơ hội đượcghép TBG gần như đóng lại Vì vậy, nhu cầu đặt ra là cần phải có một nguồnTBG mới, vẫn đảm bảo hiệu quả mà lại phù hợp với điều kiện của đất nước

 Nguồn tế bào gốc từ máu dây rốn

Năm 1989, lần đầu tiên Gluckman và Broxmeyer đã tiến hành ghép thành

công tế bào gốc MDR cho bệnh nhi Fanconi, và đến nay hàng nghìn trường hợpbệnh nhân bị bệnh máu ác tính và không ác tính đã được điều trị bằng ghépMDR [14], [15]

Trong khoảng 15 năm trở lại đây, MDR đã và đang trở thành nguồn quantrọng cung cấp TBG cho ghép đồng loài Một số ưu điểm vượt trội hơn so vớicác nguồn TBG từ người trưởng thành như: yêu cầu hòa hợp HLA thấp hơn

(tối thiểu 4/6 allele HLA - A, - B, - DR ở độ phân giải cao), quá trình thu thậpkhông ảnh hưởng đến sức khỏe của người hiến, đồng thời được lưu giữ sẵnsàng trong ngân hàng nên thời gian cung cấp được rút ngắn, các biến chứngliên quan đến ghép chống chủ cũng giảm hơn so với TBG từ người hiếntrưởng thành [80] Trong MDR rất giàu tế bào định hướng sinh máu ở giaiđoạn sớm và giai đoạn đa dòng (early and committed progenitor - cell), sốlượng tế bào CD34+ từ 1/100 đến 1/10000 TBCN, khả năng sinh sản gấp 2lần TBG tủy và máu ngoại vi người trưởng thành [16] Cho đến nay, đã cóhơn 4,3 triệu đơn vị máu dây rốn lưu trữ dịch vụ và hơn 600.000 đơn vị TBGmáu dây rốn được lưu trữ cộng đồng trên toàn thế giới, qua đó hơn 30.000 caghép TBG bằng nguồn này đã được thực hiện thành công [81] Tuy vậy, nó cónhược điểm là lượng TBG thu được nhỏ, liều TBG chỉ đủ ghép cho trẻ emdưới 30kg Giải quyết nhược điểm này, gần đây một số tác giả đã dùng liều tếbào gốc “pool” của 2 mẫu máu cuống rốn có gen HLA tương đồng [17], do đó

có thể dùng cho cả người trưởng thành Tuy nhiên phương pháp này cũng có

ưu điểm và nhược điểm Sử dụng 2 đơn vị không phù hợp không hoàn toànHLA có nguy cơ bệnh ghép chống chủ độ II cao hơn, nhưng tử vong do ghéphay GVHD mạn thì không cao hơn và hiệu ứng mảnh ghép chống leucemi thìtrội hơn [99]

Muốn làm được điều này cần có một lượng lớn máu dây rốn để lựachọn Đây là mục tiêu của việc xây dựng ngân hàng máu dây rốn Xu hướnghiện tại của các nghiên cứu về tế bào gốc trong máu dây rốn tập trung vào cácvấn đề:

Tính an toàn và hiệu quả của ghép tế bào từ máu dây rốn

Khả năng sử dụng TBG máu dây rốn ghép cho người lớn

Mở rộng phạm vi ghép không hòa hợp HLA nhưng vẫn duy trì an toàn

và hiệu quả mọc mảnh ghép

Các nghiên cứu lâm sàng ở những trẻ nhận tế bào gốc MDR từ ngườicho không có liên quan huyết thống cho thấy nguy cơ xuất hiện GVHD thấphơn so với ghép TBG từ tủy xương [18], [19] Điều này phù hợp với số lượngthấp của T lympho trưởng thành ở máu dây rốn Thời gian phục hồi các dòng

tế bào sinh máu cũng có khác nhau, đối với ghép TBG từ máu dây rốn, dòngbạch cầu hạt hồi phục sau 26 đến 27 ngày, dòng tiểu cầu sau 60 ngày, trongkhi đó nếu ghép TBG tủy xương thì thời gian phục hồi bạch cầu hạt và tiểucầu lần lượt là 18 đến 19 ngày và 29 ngày [20]

Ngoài việc đó là một nguồn tế bào gốc quan trọng có thể thay thế tếbào gốc tủy xương và máu ngoại vi, TBG máu dây rốn được cả thực nghiệm

và lâm sàng chứng minh có khả năng phục hồi các mô bị tổn thương và lànguồn dồi dào cho kỹ thuật Tế bào trị liệu, như tế bào gốc trung mô(Mesenchymal Stem cell: MSC) hay các tế bào gốc đa năng cảm ứng(induced pluripotential stem cell: iPS) và tế bào Muse (Multilineagedifferentiating stress enduring) có thể tách từ đơn vị máu dây rốn Các loại tếbào này có khả năng biệt hóa thành nhiều loại mô và tạo được cải thiện lâmsàng trên nhiều bệnh mà ngày nay y học chưa có phương pháp điều trị Ngoài

ra các TBG trung mô còn có chức năng điều hòa miễn dịch cho phép tái tạo

mô bị hư hại, nhưng cơ chế của các hiện tượng này chưa được biết rõ rang[96], [97], [98]

1.1.5 Xử lí và bảo quản khối tế bào gốc

Sau khi mẫu TBG được thu thập, sẽ được chuyển về ngân hàng TBG,tại đây sẽ tiến hành quá trình xử lý TBG nhằm mục đích có được khối TBGtinh sạch nhất, loại bỏ những thành phần không cần thiết như huyết tương,hồng cầu [21], [22]

Sau khi trải qua quy trình xử lý, các đơn vị TBG này tiếp tục được trộnvới dung dịch bảo quản để có thể bảo vệ tế bào trong môi trường đông lạnh

Loại chất bảo quản hiệu quả nhất hiện nay đó là dung dịch Dimethylsulfoxide (DMSO) và được pha để đạt nồng độ 10% trong túi sản phẩm cuối.Chất bảo quản này có tác dụng làm ổn định màng tế bào, tránh tổn thương tếbào bởi các tinh thể hình thành trong quá trình hạ nhiệt độ và lưu trữ dài hạntrong hệ thống nitơ lỏng ở nhiệt độ - 1500C đến - 1960C Sau khi thêm dungdịch bảo quản, các đơn vị TBG được làm lạnh theo chương trình hạ nhiệt độcủa máy tự động.

1.1.6 Đánh giá và kiểm tra chất lượng khối TBG sau bảo quản

 Đếm số lượng tế bào có nhân.

Mọi chế phẩm tế bào gốc cần được xác định số lượng tế bào, số lượng

tế bào đơn nhân Số lượng này kết hợp với các xét nghiệm khác, xác định số

lần thu hoạch cần thiết để có đủ lượng tế bào đảm bảo cho mọc mảnh ghép.Ngoài ra, các thông số này cũng giúp tính toán tỷ lệ tế bào còn lại sau xử lý vàcung cấp dữ liệu cho quá trình kiểm soát chất lượng của các bước xử lý vàbảo quản sản phẩm

 Đếm tỷ lệ tế bào sống chết bằng phương pháp nhuộm Xanh Trypan

Nguyên lý của kỹ thuật là do sự tổn thương màng tế bào của các tế bào

bị chết dẫn đến chất nhuộm đi qua màng và nhuộm màu tế bào Ngược lại,các tế bào sống với sự toàn vẹn màng tế bào không cho chất nhuộm đi qua, do

đó các tế bào sống sẽ không bắt màu [23] Xét nghiệm này đơn giản, ít tốnkém và cho kết quả nhanh trong vòng vài phút nhưng nó chỉ xác định dược tỷ

lệ sống chết chung, chứ không phải của riêng tế bào gốc

 Nuôi cấy tạo cụm tế bào tạo máu.

Các tế bào gốc được nuôi cấy trong điều kiện có đủ các chất dinhdưỡng và các chất kích thích, chúng sẽ tăng sinh và biệt hóa thành các đơn vị

tế bào trưởng thành [23] Phương pháp này không chỉ xác định được tế bào

sống mà còn đánh giá được hiệu lực tế bào gốc, đánh giá được khả năng tăngsinh và biệt hóa của tế bào gốc Tuy nhiên có một số nhược điểm là tốn kém,mất nhiều thời gian để đánh giá (7 - 14 ngày), do đó không cung cấp kịp thờicho các nhà lâm sàng, phụ thuộc nhiều vào chủ quan của người đọc, không

đánh giá được khả năng tái định cư của tế bào gốc Phương pháp này chủ yếu

được sử dụng trong nghiên cứu TBG

 Kỹ thuật xác định tế bào CD34+ sống bằng kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy (Flowcytometry).

Nguyên lý của kỹ thuật là xác định số lượng tế bào CD34+ sống dựavào 7AAD (7 amino actinnomycin) hay chất nhuộm màu nhân và các khángthể đơn dòng gắn huỳnh quang CD45 - FITC/CD34 - PE.7AAD chỉ nhuộmđược nhân trong trường hợp màng tế bào không còn nguyên vẹn hay những tếbào chết [24] Xét nghiệm có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, cho kết quả chính xácnhưng cũng tốn kém và đòi hỏi các trang thiết bị hiện đại [25]

Ghép mô hay cơ quan của người này cho người khác sẽ thất bại nếukhông phù hợp nhóm hồng cầu ABO, nhưng dù phù hợp ABO tỷ lệ thất bạivẫn rất cao Điều này được dự đoán: do không phù hợp kháng nguyên củanhững tế bào khác nữa (ngoài hồng cầu) Thuận tiện nhất là lấy bạch cầu đểnghiên cứu Nguồn kháng thể chống kháng nguyên bạch cầu dễ kiếm nhất là

từ huyết thanh những người được truyền máu nhiều lần và những phụ nữ cóthai nhiều lần Dùng các loại huyết thanh này làm thuốc thử, nhiều phòng thínghiệm đã phát hiện trên bề mặt bạch cầu có rất nhiều kháng nguyên khácnhau và chỉ sau ít năm đã phải có các hội nghị quốc tế để thống nhất cáchphân loại và tên gọi các HLA Tuy nhiên HLA không chỉ có ở bạch cầu màcòn có ở nhiều loại tế bào khác và đó là lý do mà HLA còn được gọi là phức

hệ hòa hợp mô chủ yếu (MHC)

 Danh pháp

Theo Marsh SG và cộng sự (2010) danh pháp HLA như sau [26] :

Tên gen + dấu * + mã số allele + dấu: + mã số protein HLA riêng + dấu:+ mã số ADN tương ứng trong vùng mã hóa + dấu : + mã số ADN ngoài vùng

mã hóa + hậu tố

- Hậu tố N: allele không được biểu hiện (Null);

- Hậu tố L: allele của protein biểu hiện ở bề mặt tế bào thấp hơn bìnhthường (Low);

- Hậu tố S: allele của protein tan nhanh nhưng không biểu hiện trên bềmặt tế bào (Secret);

- Hậu tố C: allele của protein ở trong tế bào chất chứ không ở bề mặt tếbào (Cytoplasm);

- Hậu tố A: khi nghi ngờ protein có được biểu hiện không (Aberrant);

- Hậu tố Q: allele có đột biến trước đó đã được chứng minh là có ảnhhưởng đến việc biểu hiện trên tế bào nhưng chưa được xác nhận vị trí và vẫncòn nghi vấn (Questionable)

Mỗi chữ số sau dấu “:” thể hiện một nhóm protein của allele HLA đó vàmức độ quan trọng của nó càng giảm dần khi càng ở xa chữ số đầu tiên Kết

quả xét nghiệm HLA càng nhiều chữ số thì thể hiện độ chi tiết hay độ phângiải của kháng nguyên HLA càng cao, đi sâu đến các loại protein phụ trên bềmặt kháng nguyên và đôi khi chỉ là đôi khi chỉ là sự khác biệt về mặt cấu trúcADN nhưng không mã hóa cho một cấu trúc protein cụ thể nào.

Hình 1.1 Cấu trúc tên HLA [26]

Ví dụ: Allele HLA-A*11:01 là: locus HLA-A, họ allele 11, allele 01

1.2.2 Cấu trúc hệ kháng nguyên bạch cầu.

 Cấu trúc hệ gen HLA.

Phức hợp gen sản xuất HLA/MHC nằm ở cánh ngắn của NST số 6, banđầu gồm 4 cụm chính với tên gọi khá đơn giản: A, B, C, D; sau phát hiệnthêm các cụm khác E, F, G do vậy các cụm đầu tiên được gọi là kinh điển,còn các cụm sau được gọi là không kinh điển và đúng là chúng cũng ít quantrọng hơn

 D lại không phải là một cụm mà là 3 cụm riêng rẽ: DP, DQ và DR Càngchi tiết thêm khi trong D lại phát hiện thêm DO, DX, DZ (được coi là không kinhđiển) Từ đó các cụm gen được chia thành lớp class: I và II

 Như vậy, các cụm gen (các loci) A, B, C, E, F,G họp thành MHC (hayHLA) lớp I, còn các cụm DP, DQ, DR (cả O, X, Z) thuộc MHC lớp II Nằmgiữa lớp I và II lại phát hiện một cụm khổng lồ không kém: nó mang tên lớp

III (là lớp gồm các gen sản xuất một số thành phần bổ thể và cytokin: C2, C4,

Bf, TNFα, TNFβ,…) Mỗi loci lại có các dưới nhóm (subloci): A1, B1, B2 ) Mỗi loci lại có các dưới nhóm (subloci): A1, B1, B2 các dưới nhóm có các cấu trúc gen

Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc gen hệ HLA

Các loại lại có nhiều gen: cho tới nay người ta đã biết khoảng 160 gen,các gen này tạo được kháng thể đặc hiệu để phát hiện Dự đoán có khoảng

500 gen thuộc hệ HLA

Bảng 1.1 Số gen HLA phát hiện được (2004)

+ Loci A có 28 gen + Loci DR có 18 gen

+ Loci B có 61 gen + Loci DP có 6 gen

+ Loci C có 10 gen + Loci DQ có 9 gen

HLA lớp I (và cả lớp II) thuộc đại gia đình Ig nên cũng có chung 1 sốcấu trúc đại cương: gồm hai chuỗi peptid (thường gọi là α và β) liên kết vớinhau bằng các cầu nối S - S liên chuỗi Trong mỗi chuỗi có một hay vài bacấu nối S - S nội chuỗi để tạo thành các vòng cung, nhưng mỗi vòng cung lạicuộn lại thành một khối hình cầu, chắc đặc gọi là domain.

- Phần trong bào tương: giữ nhiệm vụ truyền thông tin vào nội bào khi

có mảnh peptid KN được gắn vào phần đặc hiệu với tận cùng là nhómcarboxyl (- COO -)

 Chuỗi β (chuỗi nhẹ): chỉ có một phần nằm trên bề mặt tế bào, có trọnglượng phân tử khoảng 12.000 Da với khoảng 99 acid amin

 Đáng chú ý là ở các phân tử MHC lớp I, hai chuỗi peptid không dàitương đương mà chuỗi α lớn gấp ba lần chuỗi β Các gen lớp I ở NST 6 chỉsản xuất chuỗi lớn α, còn chuỗi nhỏ β lại nhờ NST 15 sản xuất Điều này tạonên tính đa dạng của HLA lớp I

có thể được trình Vị trí để peptid KN gắn vào do một phần của các đoạn α1

và α2 tạo nên Nó là một rãnh với bề ngang và chiều dài cho phép đặt vào đó

1 peptid dài 10 acid amin Đáy rãnh phẳng do chuỗi α trải qua trải lại để tạothành một lá nhưng lá vẫn có một số hố lõm và chính những hố này quy địnhpeptid nào có thể gắn khớp và neo vào rãnh mà không bị vênh và bong ra Hai

bờ rãnh do chuỗi α cuộn lại như hình lò xo và bị bịt kín lại khiến peptid KNnếu dài hơn 10 acid amin thì không thể nằm gọn trong rãnh của MHC I được

 Tính đặc hiệu của rãnh đó là rãnh nào thì trình peptid KN ấy So với

KT thì mức độ đặc hiệu của MHC khi trình bày peptid KN chỉ bằng 1/10 hay

1/100 nhưng vẫn cứ là đặc hiệu Một rãnh có thể trình 10, 100 hay hơn nữacác peptid khác nhau miễn là chúng hao hao giống nhau Sự kiên kết có thểlỏng hay chặt vì số điểm neo kết có thể từ 2 đến 5 hay 6 (nghĩa là ái tính khácnhau) MHC nhận ra peptid từ một mặt còn TCR sẽ nhận ra peptid đó từ mặtđối lập Đó là một trong những nguyên nhân khiến tế bào T chỉ nhận ra KNkhi nó được MHC trình cho.

Hình 1.4 Rãnh gắn peptid kháng nguyên (nhìn từ trên xuống)

1.2.3 Phân bố gen HLA trong cơ thể

Bảng 1.2 Một số đặc điểm và phân bố gen HLA trong cơ thể.

HLA - A, B, C HLA - DR, DQ, DPPhân bố

trên các tế bào

Tất cả các tế bào cónhân, nhưng chủ yếu là ở

tế bào T và B lympho,bạch cầu hạt, tiểu cầu

Có ở tế bào mono, Blympho, tế bàodendritic, đại thực bào,

T lympho hoạt hóa.Cấu trúc Chuỗi peptid lớn α

Chuỗi nhỏ β

Hai chuỗi α và βtương đương nhauQuan hệ phân tử

 HLA lớp I (class I) có chức năng hoạt động tế bào T lympho gây độc(Tc), trực tiếp tham gia phản ứng trung gian tế bào, tiêu diệt tế bào đích cókháng nguyên lạ đặc hiệu Khi một virus xâm nhập vào tế bào, nó làm biếnđổi DNA của nhân tế bào đó, làm chúng sản xuất ra những protein lạ HLAlớp I sẽ làm nhiệm vụ trình diện KN protid lạ đó lên bề mặt tế bào và tế bào

Tc sẽ phá hủy tế bào mang virus đó

 HLA lớp II tham gia hoạt hóa tế bào trình diện kháng nguyên Các KNphân tử lớn từ bên ngoài vào cơ thể, đại thực bào nuốt KN này, rồi phân KNthành các mảnh nhỏ, các mảnh nhỏ KN sẽ chuyển lên màng tế bào Thực bàolúc này trở thành tế bào trình diện KN (APC) và sẽ tiếp tục chuyển KN cho tếbào miễn dịch (T, B lymphocytes) HLA lớp II đóng vai trò quan trọng tronghoạt hóa đại thực bào trình diện KN, đồng thời tạo ra các cytokin và khuếchđại phản ứng miễn dịch của cơ thể

 HLA lớp I và II hợp tác trong quá trình miễn dịch bao gồm cả trả lờimiễn dịch và phản ứng KN - KT của cả miễn dịch tế bào (HLA lớp I và T-CD8), miễn dịch dịch thể (HLA lớp II với T-CD4 và B lympho) Thiếu khángnguyên HLA tế bào miễn dịch sẽ không nhận biết KN, do đó khi ghép cơquan, tổ chức, việc lựa chọn người cho tương đồng hệ HLA còn nhằm mụcđích giảm nhận biết KN lạ của tế bào miễn dịch thông qua hệ MHC

1.2.5 Kỹ thuật định danh HLA và kháng thể kháng HLA

 Các kỹ thuật định nhóm HLA

Từ khi bắt đầu những ca ghép TBG đồng loài đầu tiên, người ta đã xácđịnh sự hòa hợp HLA cho người cho và người nhận [27] Các kỹ thuật đã vàđang được sử dụng để định nhóm HLA bao gồm:

 Kỹ thuật vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể (Complement dependentcytotoxicity test - CDC)

Đây là kỹ thuật đầu tiên dành cho định nhóm HLA được thực hiện từnhững năm 1980 [28] Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý cơ bản của miễn dịch:

sử dụng kháng thể để xác định kháng nguyên trên bề mặt tế bào

Kết quả của kỹ thuật này có thể cho biết tên của kháng nguyên biểuhiện trên bề mặt tế bào Tuy nhiên, hiện tại nó ít được sử dụng vì nhiều lí do,trong đó quan trọng nhất là tính đặc hiệu không cao Nguyên nhân là do mỗikháng nguyên HLA có rất nhiều epitop, đôi khi có thể dẫn đến phản ứng chéokhông đặc hiệu với các kháng thể khác khiến kết quả sai lầm

 Kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi đặc hiệu - SSP (sequence specific primer).PCR - SSP là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR để khuếch đại đoạn genHLA sử dụng đoạn mồi đặc hiệu đã biết trước, sau đó sử dụng kỹ thuật điện

di trên gel để phát hiện các gen HLA đó [29]

Kỹ thuật này được ứng dụng khá rộng rãi trong các trường hợp xácđịnh hòa hợp ghép TBG tạo máu đồng loại với người cho cùng huyếtthống, ghép tạng Tuy nhiên một hạn chế của kỹ thuật là số lượng alleleHLA phân tích không nhiều, do đó thường được sử dụng định nhóm HLA ở

mã hóa riêng bằng màu laser; chạy mẫu và phân tích mẫu trên hệ thốngLuminex để xác định HLA của mẫu.

Nhờ công nghệ Xmap trên hệ thống Luminex, số lượng hạt nhựa có thể

mã hóa tối đa lên đến 100 loại khác nhau, đồng thời số lượng đầu dò ADNgắn lên hạt rất nhiều nên kỹ thuật PCR - SSO đã giải quyết được khó khăncủa PCR - SSP, đó là phân tích được nhiều gen HLA hơn và độ phân giảiđược nâng cao hơn Thường kết quả định nhóm HLA của xét nghiệm này là

độ phân giải từ trung bình đến cao với mức chi tiết từ 4 chữ số trở lên (ví dụ:A*02:03) so với độ phân giải thấp cho kết quả 2 chữ số của các xét nghiệmkhác như HLA - SSP (ví dụ A*02) Với kết quả độ phân giải ở mức trungbình, xét nghiệm này là đủ để áp dụng cho việc tìm kiếm người cho có nguồn

tế bào gốc đòi hỏi mức độ hòa hợp vừa phải như máu dây rốn Tuy nhiên, kỹthuật này cũng còn tiềm ẩn những hạn chế tương tự như kỹ thuật PCR - SSP,

đó là sử dụng những trình tự ADN của allele HLA đã biết để thiết kế ra cácthuốc thử đặc hiệu, vì vậy nếu gen HLA của bệnh nhân không nằm trong sốđầu dò đã biết của thuốc thử thì không thể xác định HLA được Chính vì vậy,nhu cầu của một kỹ thuật mới, hiện đại hơn và toàn diện hơn đã được đặt ravới các nhà nghiên cứu về HLA

 Kỹ thuật giải trình tự (SBT- sequencing based typing)

Giải trình tự gen có thể được sử dụng để xác định chính xác trình tựDNA mã hóa cho phân tử HLA [30] Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật này sẽ

là độ phân giải cao, đạt mức chi tiết 6 chữ số (VD A*02:03:01), giúp cho việcđánh giá sự hòa hợp HLA giữa người cho và người nhận được chính xác hơn.Hiện nay, nó được đánh giá là hiện đại nhất, hiêu quả nhất trong việc xác địnhHLA vì không phải phụ thuộc vào một lượng hạn chế gen HLA biết tên trước

đó Tuy nhiên khó khăn lớn nhất đó là chi phí cao nên chỉ phù hợp cho nhữngtrung tâm lớn có lượng mẫu xét nghiệm dồi dào, liên tục

1.2.6 Kỹ thuật định danh kháng thể kháng HLA

 Trong ghép tế bào gốc tạo máu và ghép tạng, việc xuất hiện cáckháng thể trong cơ thể người nhận chống lại các kháng nguyên HLA của tếbào người cho và ngược lại, tế bào người cho sinh ra kháng thể chống lại các

tế bào của người nhận là yếu tố quan trọng tiên lượng khả năng xuất hiệnbệnh ghép chống chủ và thải ghép Chính vì vậy, nhu cầu cấp thiết đặt ratrước khi tiến hành một ca ghép tế bào gốc đồng loại là xác định sự tồn tại củacác kháng thể này để tiên lượng và có điều chỉnh phù hợp

 Kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để định danh kháng thể kháng HLA

là kỹ thuật vi độc tế bào (CDC) [4] và sau đó là kỹ thuật ELISA (Enzyme linked immune - sorbent assay) áp dụng từ năm 1993 [31] Tuy nhiên độ nhạy

-và độ đặc hiệu của các xét nghiệm này vẫn chưa cao

 Hiện nay, kỹ thuật Luminex được coi là có độ nhạy hơn hẳn Ngoài

ra độ đặc hiệu cũng được cải thiện rõ rệt và số lượng kháng thể có thể pháthiện trong xét nghiệm cũng được tăng cao

1.2.7 Ứng dụng của HLA trong lĩnh vực ghép

Kháng nguyên bạch cầu người (HLA) có thể đại diện cho các khángnguyên của hầu hết các tế bào khác trong cơ thể Do vậy khi ghép, yêu cầu phùhợp HLA là điều kiện vô cùng quan trọng, giúp cho mảnh ghép tồn tại lâu dài

Theo quy luật di truyền, xác suất để hai anh chị em có cùng bộ genHLA giống nhau hoàn toàn trong gia đình là khoảng 25% và gia đình càngnhiều người cho thì càng dễ tìm được người hòa hợp Tuy nhiên ngay cả khigia đình có 4 người cho thì vẫn không hoàn toàn chắc chắn tìm được ngườiphù hợp, đặc biệt khi gia đình bệnh nhân không có người cho TBG thì lúc đóhoàn toàn phụ thuộc vào người cho không cùng huyết thống [37]

Nếu các allele HLA của người nhận và người hiến giống nhau hoàntoàn là hoà hợp tổ chức 100%; nếu chỉ có 50% giống nhau được gọi là

haplotype Tốt nhất là hoà hợp tổ chức 100%, tối thiểu là 50%; thấp hơn 50%thường không được áp dụng Thực tế ghép ở Việt Nam đã áp dụng nghiêmngặt các chỉ tiêu này [75], [76].

ít đươc chú ý lựa chọn Trong đó sự không phù hợp HLA - DR gây ảnh hưởnglớn nhất đến kết quả ghép thận trong 3 tháng đầu sau ghép Điều này có thể hiểuđược là do HLA - DR là kháng nguyên có trên bề mặt của tất cả các tế bào cóthẩm quyền miễn dịch, đóng vai trò nòng cốt trong việc loại trừ các yếu tố bênngoài Sự không hòa hợp HLA - B có ảnh hưởng lâu dài đến kết quả sau ghépthận HLA - A ít có ảnh hưởng đến kết quả ghép thận hơn so với HLA - B vàHLA - DR, nên khi không hòa hợp HLA - A không ảnh hưởng nhiều đến kếtquả ghép thận [77]

 Ghép các tạng khác

Theo quan điểm của các tác giả về miễn dịch, ghép gan không yêucầu sự hòa hợp về HLA, do đó không cần xét nghiệm HLA để lựa chọnngười cho trước khi ghép gan mà yếu tố quan tâm nhiều hơn là sự tươnghợp về nhóm máu [88]

Trong ghép tim, vai trò của hòa hợp HLA còn nhiều tranh cãi Trong một

số nghiên cứu tổng hợp với 34 báo cáo về ghép tim, tác giả D Ansari (2014)nhận thấy mức độ bất đồng về HLA - DR có mối liên quan với thời gian tồn tạimảnh ghép cũng như khả năng thải ghép cấp, vì vậy cần cân nhắc đến yếu tố nàytrong lựa chọn người hiến tim [88] Tuy nhiên với sự tiến bộ của miễn dịch học

và sự ra đời của nhiều thuốc ức chế miễn dịch thế hệ mới, vấn đề hòa hợp vềHLA trong ghép tạng ngoài thận càng ít ảnh hưởng đến các kết quả ghép hơn

 Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài

Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài là một phương pháp có giá trị caotrong điều trị bệnh máu; với nhiều bệnh, ghép tế bào gốc đồng loài có thể chữakhỏi được bệnh hay kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, nâng cao chất lượngcuộc sống cho bệnh nhân

Trong ghép tế bào gốc tạo máu, các tế bào máu cũng bao gồm các tếbào của hệ thống miễn dịch, đặc biệt là các bạch cầu lympho, bạch cầu mono.Những tế bào này quy định sự tương tác của mảnh ghép và vật chủ theo cả haichiểu Các tế bào có mức độ tiếp xúc, phơi nhiễm về mặt miễn dịch càngnhiều thì nguy cơ gây ra các tương tác càng lớn, dẫn đến các hiệu ứng nhưghép chống chủ (GVHD) do tế bào của mảnh ghép tấn công tế bào cơ thểngười nhận và thải ghép do cơ thể đào thải mảnh ghép Điều này cũng đượctăng cường tùy theo mức độ bất đồng về HLA giữa hai cơ thể Như đã nói ởtrên, hiện nay có hai loại nguồn TBG với đặc điểm miễn dịch khác nhau, đó lànguồn người hiến trưởng thành và nguồn máu dây rốn

 Ghép từ người hiến trưởng thành

Nguồn TBG từ người hiến trưởng thành cùng huyết thống hòa hợpHLA hoàn toàn luôn là nguồn TBG được đánh giá là tối ưu nhất dành choghép bởi đây là nguồn tế bào gốc dồi dào, có thể lấy được liều cao dẫn đếnmọc mảnh ghép nhanh và hạn chế được những hệ quả do bất đồng HLA như

ghép chống chủ hay thải ghép Đối với mọi nguồn TBG, mức độ hòa hợpHLA càng cao thì hiệu quả càng tốt Một số nghiên cứu cho thấy kết quả ghép

từ nguồn người hiến không cùng huyết thống hòa hợp HLA hoàn toàn (hòahợp 10/10 locus HLA - A, - B, - C, - DR, - DQ ở độ phân giải cao) thì hiệuquả cũng tương đương với ghép từ nguồn người hiến cùng huyết thống hòahợp hoàn toàn [90], [91] Tuy nhiên, xác suất để tìm kiếm được người hiếnkhông cùng huyết thống hòa hợp HLA hoàn toàn là rất thấp và đòi hỏi phải có

hệ thống đăng ký khá lớn lên đến hàng triệu người tình nguyện hiến Theohướng dẫn của Hội Ghép tủy và Miễn dịch Anh, yêu cầu về mức độ hòa hợpHLA đối với nguồn TBG này tối thiểu là 8/10 locus HLA - A, - B, - C, - DR, -

DQ ở độ phân giải cao [78], [92] Lý do chỉ được phép bất đồng tối đa 2 trong

10 locus HLA nói trên có thể vì nguồn TBG từ người hiến trưởng thành chứanhiều tế bào miễn dịch, đặc biệt là lympho T và có thể gây nguy cơ biến chứngthải ghép hoặc ghép chống chủ khi chúng tương tác với các tế bào của bản thânngười nhận nếu số locus bất đồng quá nhiều

Theo báo cáo của Chương trình Người hiến tủy Nhật Bản (JMDP), bấtđồng các locus HLA lớp I như HLA - A và - B liên quan nhiều tới ghép chốngchủ cấp mức độ nặng và giảm thời gian sống [93] Báo cáo của các trung tâmlớn tại Mỹ lại cho thấy sự hòa hợp các locus HLA lớp II giúp dự phòng ghépchống chủ tốt hơn và thời gian sống dài hơn [94]

 Ghép từ máu dây rốn

Nguồn TBG máu dây rốn có một ưu điểm quan trọng là sự phơi nhiễmvới tác nhân miễn dịch hầu như chưa có, do đó nó có khả năng dung nạp tốthơn với tế bào của bệnh nhân và mức độ hòa hợp HLA cũng lỏng lẻo hơn.Theo hướng dẫn lựa chọn nguồn TBG của Hội ghép tủy và Miễn dịch Anh,yêu cầu hòa hợp HLA không hoàn toàn ở mức tối thiểu 4/6 locus HLA - A, -

B, - DR ở độ phân giải cao và mức độ hòa hợp càng cao thì tỷ lệ thành công

càng lớn [37], [38], [92] Chính vì thế nên khả năng tìm kiếm được mẫu máudây rốn hòa hợp tối thiểu 4/6 cho bệnh nhân ghép lên rất cao tới 97,7% [32]với trữ lượng đơn vị MDR cần thiết không nhiều như số lượng người trưởngthành đăng ký hiến TBG Và cũng theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, đềuthống nhất vai trò của các locus HLA - A, - B, - DR (DRB1), nếu có thể thìhòa hợp thêm với HLA - DQB1 [33], [34], [35], [36] với hiệu quả của ghép.

(*HLA mm: HLA mismatch – số locus HLA bất đồng)

Hình 1.5 Mối liên quan giữa mức độ bất đồng HLA và hiệu quả ghép [95]

Khi lựa chọn nguồn TBG từ máu dây rốn, mức độ hòa hợp HLA cũng

có liên quan đến liều tế bào, cụ thể là những đơn vị MDR có mức độ hòa hợpHLA càng thấp với bệnh nhân thì liều TBCN tính trên cân nặng càng phảicao: liều ghép hòa hợp 4/6 cần ≥ 5 x 107 TB/kg; hòa hợp 5/6 cần ≥ 4x 107TB/kg và hòa hợp 6/6 cần ≥ 3 x 107 TB/kg [92]

1.2.8 Một số ứng dụng lâm sàng khác của HLA.

 HLA và bệnh lý

Một số bệnh thường gặp ở người mang gen tương ứng, vì vậy HLA đãđược đưa vào nghiên cứu dịch tễ bệnh

Tỷ lệ gặp HLA - B27 ở bệnh viêm cột sống dính khớp là 90% so với40% ở người bình thường, DWI4, DW4 với bệnh thấp khớp là 40%, HLA -B27 với hội chứng Reiter là 40%, DQW8 với bệnh đái tháo đường là 32% vàDR2 trong bệnh lupus ban đỏ là 3% [9].

 HLA và truyền máu

 Tiểu cầu không có HLA - C, D, chỉ có HLA - A, B và rất ít khángnguyên hệ ABO hồng cầu Để giảm phản ứng miễn dịch đối với HLA, người tachọn người cho tiểu cầu là anh, chị em ruột trong gia đình Truyền tiểu cầu không

có lựa chọn HLA có thể gây phản ứng miễn dịch muộn chống tiểu cầu làm giảmtiểu cầu sau truyền máu (2 - 3 tháng sau truyền)

 Phản ứng truyền máu không gây tan máu: gây độc bạch cầu, làm giảmbạch cầu do truyền máu không định nhóm kháng nguyên HLA

 Bệnh phổi cấp sau truyền máu: do vai trò của kháng nguyên bạch cầu,kháng nguyên này tạo ra kháng thể, phản ứng KN - KT (phức hợp miễn dịch)lắng đọng ở mao mạch phổi gây bệnh phổi cấp

 Bệnh ghép chống chủ sau truyền máu (GVHD) phụ thuộc nhiều yếu tốtrong đó có khả năng miễn dịch của người nhận và lympho sống có khả năngmiễn dịch của người cho máu

1.2.9 Các nghiên cứu về tần suất HLA

 Tần suất HLA trong cộng đồng trên thế giới

Nghiên cứu của Gourraud và các cộng sự trên 7015 người Pháp Đãtìm thấy 114 allele HLA - A, 185 allele HLA - B Trên quần thể này thìHLA - A*02 (29,2%), HLA - B*07 (11,4%) và HLA - DRB1*07 (15,9%)

có tỷ lệ cao nhất [37]

Một nghiên cứu khác được thực hiện ở Venezuela của tác giả Del PilarFortes và các cộng sự (2013) đã xác định tỷ lệ các HLA lớp I và lớp II bằngphản ứng chuỗi polymerase và lai với các đầu dò oligo - nucleotide Cụ thể

các allele HLA độ phân giải thấp có tỷ lệ cao nhất là HLA A*02, HLA A*24, HLA - A*68, HLA - B*35, HLA - B*44, HLA - B*51, HLA - B*07,HLA -B*15, HLA - C*07 và lớp II là các allele HLA - DQB1*03, HLA -DRB1*04, HLA - DRB1*15, HLA - DRB1*13, HLA - DRB1*07 [38].

-Ở châu Á, theo nghiên cứu của tác giả Trachtenberg thực hiện với 264người Hán ở miền nam Trung Quốc đã tìm được 20 allele HLA - A, trong đóphổ biến là HLA - A*11 với tỷ lệ 26% còn lại các allele HLA - A*24, HLA -A*33, HLA - A*02 xuất hiện trên 10%, 4 allele trên chiếm hai phần ba tổng sốcác allele HLA - A Có 50 allele HLA - B được tìm thấy, nhiều nhất lần lượt là:HLA - B*40 (14,5%), HLA - B*46 (11,9%), HLA - B*58 (8,9%) Ở locusHLA - C đã tìm thấy 20 allele, bốn alelle HLA - C*07, HLA - C*01, HLA -C*08 và HLA - C*03 xuất hiện trên 10% Đối với kháng nguyên bạch cầungười lớp II phát hiện 28 allele HLA - DRB1 trong đó HLA - DRB1*09, HLA

- DRB1*12, và HLA - DRB1*15 phổ biến nhất, xuất hiện trên 10% Khángnguyên HLA -DQB 1*03 là kháng nguyên xuất hiện nhiều nhất của locus HLA

DQB1 với tỷ trên 40%, trong đó HLA DQB1*03 (24,2%) và HLA DQB1*03 (15,0%) [39]

- Tần suất HLA trong quần thể không ngẫu nhiên trên thế giới

Theo tác giả Patel JS (2013) nghiên cứu trên 552 người hiến thận vànhận thận ở miền tây Ấn Độ Kết quả được tìm thấy ở những người nhận thìHLA -A*01 (16,9%), HLA - A*01 (16,5%), HLA - B*01 (13,2%) là phổ biếnnhất Trong khi đó ở những người hiến thận HLA - A*01 (16,7%), HLA -A*01 (18,5%), HLA - B*01 (13,6%) [40]

Theo nghiên cứu của tác giả Hei (2008) trên 718 người hiến tủy khỏemạnh tại Trung Quốc Tổng cộng có 28 allele HLA - A, 61allele HLA - B, 30allele HLA - C, 40 allele HLA - DRB1 và 18 allele HLA - DQB1 đã được xácđịnh Trong đó các allele: HLA - A*11, HLA - A*24, HLA - A*02, HLA -

B*40, HLA C*07, HLA C*01, HLA C*03, HLA DRB1*09, HLA DRB1*15, HLA - DQB1*03, HLA - DQB1*03 và allele HLA - DQB1*06đều có tỷ lệ trên 10% trong nhiên cứu này [41]

- Nghiên cứu ở Việt Nam

Theo nghiên cứu của tác giả Bạch Khánh Hòa và cộng sự (2007) với

170 người dân tộc Kinh khỏe mạnh tại Hà Nội thì tìm thấy: 21 allele HLA

-A, 37 allele HLA - B, 18 allele HLA - C, 25 allele HLA - DRB1 và 14 alleleHLA - DQB1 Trong đó thì allele: HLA - A*11, HLA - A*24, HLA - A*33,HLA -B*15, HLA - B*46, HLA - C*01, HLA - C*07, HLA - C*08 đã đượctìm thấy với tỷ lệ trên 10% Cụ thể HLA - A*11, HLA - A*24, HLA - A*33chiếm tỷ lệ tương ứng là 22,9%, 13,8% và 11,5% Với tỷ lệ thấp hơn là cácallele: HLA -A*02, HLA - A*02, HLA - A*29 được tìm thấy với tỷ lệ tươngứng là 8,5%, 7,9% và 6,2% HLA - B*15 và HLA - B*46 là hai allele HLA -

B chính được tìm thấy với tỷ lệ tương ứng là 13,5%, 11,5%; phổ biến tiếptheo là các allele HLA - B*07, HLA - B*58, HLA - B*40, HLA - B*15(7,4%; 6,5%; 6,2%; 5,9%) Phổ biến của HLA - C là HLA - C*01, HLA -C*08, HLA - C*07 với tỷ lệ là: 16,5%; 15,6% và 14,7% Đối với HLA -DRB1 thì kháng nguyên chiếm đa số là HLA - DRB1*12:02 (35,5%), còn đốivới HLA - DQB1 có các allele HLA - DQB1*03 (12,6%) và HLA -DQB1*05 (11,8%) là phổ biến [42]

Nghiên cứu của tác giả Lê Xuân Hải và cộng sự (2013) với 761 trườnghợp bệnh nhân ghép và người hiến tạng, làm xét nghiệm HLA tại Viện HH -

TM TW, đã phát hiện được 18 allele HLA - A, 28 allele HLA - B, 12 alleleHLA - C, 13 allele HLA - DRB1 và 6 allele HLA - DQB1 Trong đó, alleleA*11 và A*02 là những allele hay gặp nhất với các tỷ lệ tương ứng là 31,41%

và 22,6%, sau đó là A*24 (18,33%) và A*33 (12,42%) Các allele ít gặp (tầnsuất < 5%) là A*29, A*26, A*03, A*31, A*30 và A*69, còn có những allele

rất hiếm gặp là A*23 và A*36 (0,07%) Với locus B thì B*15 và B*46(23,52% và 11,5%) là những allele hay gặp nhất, phổ biến tiếp theo là B*58,B*07, B*40 và B*38 (7,29%; 7,03%; 6,96% và 6,37%), các allele B*28,B*47, B*50 cũng rất hiếm gặp trong quần thể nghiên cứu với tần suất bắt gặp

là 0,7% Bốn loại allele hay gặp nhất của locus C lần lượt là: Cw*03(24,32%); Cw*07 (18,92%); Cw*01 (18,65%) và Cw*08 (16,49%) Có 2allele rất hiếm, chiếm tỷ lệ 0,27% là Cw*02 và Cw*10 Đối với HLA - DRB1thì kháng nguyên chiếm đa số là DRB1*12 (30,09%), DRB1*09 (11,17%) vàDRB1*15 (10,97%), còn với HLA - DQB1, tỷ lệ bắt gặp cao nhất làDQB1*03 (45,95%) sau đó là DQB1*05 (19,46%) [43]

Cũng trong nghiên cứu này, các tác giả cũng cho thấy, chỉ có 32,2%bệnh nhân cần ghép tủy có thể tìm được người cho TBG tạo máu phù hợpHLA từ anh, chị, em ruột Tương tự như thế, nghiên cứu của tác giả Nguyễn

Bá Khanh và cộng sự (2015) với 175 bệnh nhân cần điều trị bằng ghép TBGđồng loài, chỉ có 41,5% số trường hợp tìm được người cho phù hợp HLAcùng huyết thống Ngược lại thì với xét nghiệm HLA độ phân giải cao cho

1008 mẫu máu dây rốn cộng đồng tại Ngân hàng TBG Viện HH - TM TW, cótới 97,7% số trường hợp bệnh nhân đã tìm thấy mẫu máu dây rốn hòa hợp tốithiểu 4/6 locus chính (A, B, DR) [32]

Như vậy nếu chỉ dựa vào nguồn TBG tạo máu từ anh chị em ruột thì cóđến 2/3 số bệnh nhân không thể tìm được người cho Điều này cho thấy tầmquan trọng của việc hình thành ngân hàng tế bào gốc máu cuống rốn và tế bàogốc tạo máu cũng như việc trao đổi sản phẩm tế bào gốc giữa các ngân hàng

để tìm kiếm nguồn TBG đồng loài phù hợp HLA

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

 3000 đơn vị máu dây rốn của ngân hàng máu dây rốn cộng đồng đượcxét nghiệm HLA tại Ngân hàng Tế bào gốc, Viện HH - TM TW từtháng 4/2014 đến tháng 6/2017, đáp ứng đủ tiêu chuẩn lựa chọn sau:

 Sản phụ

 Không mắc các bệnh trong thời kỳ mang thai (các bệnh nhiễm trùng,nhiễm virus, bệnh mạn tính, bệnh ung thư), bệnh lý sản khoa (tiền sảngiật, rau tiền đạo…) Mỗi loci lại có các dưới nhóm (subloci): A1, B1, B2 ), truyền máu hoặc chế phẩm máu

 Xét nghiệm âm tính với các virus HIV, HCV, HBV, giang mai,CMV,…) Mỗi loci lại có các dưới nhóm (subloci): A1, B1, B2 , hồng cầu máu ngoại vi có MCV > 85 fl, điện di huyếtsắc tố không có bất thường

 Quá trình chuyển dạ và đẻ không có biểu hiện sốt, thời gianchuyển dạ < 24h

 Tình nguyện hiến tặng máu dây rốn của con mình

 Thai nhi: thai từ 36 đến 42 tuần, không đa thai, không phát hiện dị tậttrong quá trình mang thai và khám định kỳ, quá trình chuyển dạ, thaikhông suy hô hấp, không suy thai,…) Mỗi loci lại có các dưới nhóm (subloci): A1, B1, B2

 Nước ối không vẩn đục, không có mùi bất thường, bánh rau và dâyrốn không rách vỡ, dập nát

 Tiêu chuẩn của đơn vị máu dây rốn trước xử lý: thể tích đơn vị máu dâyrốn ≥ 80 ml, MCV ≥ 95 fl, lưu trữ ở nhiệt độ phòng, không bị đông

 117 bệnh nhân mắc bệnh lý huyết học có chỉ định điều trị bằng tế bàogốc máu dây rốn, đáp ứng các tiêu chuẩn lựa chọn sau:

 Độ tuổi theo tiêu chuẩn của từng nhóm bệnh lý khác nhau.

 Bệnh nhân không có người hiến TBG là anh chị em ruột, phù hợpHLA - A, - B và - DR ≥ 4/6 allele

 Tình trạng sức khỏe đủ điều kiện tiến hành ghép

 Bệnh nhân và gia đình đồng ý tham gia nghiên cứu

 Được Hội đồng khoa học kỹ thuật và Hội đồng đạo đức của ViệnHuyết học - Truyền máu Trung ương thông qua

2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Từ tháng 4/2014 đến tháng 6/ 2017

- Địa điểm nghiên cứu: Ngân hàng Tế bào gốc và Khoa Ghép tế bào gốcViện Huyết học - Truyền máu Trung ương

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

 Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang

 Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu thuận tiện có chủ đích cho đến khiđơn vị máu dây rốn và bệnh nhân

2.3.2 Các bước tiến hành nghiên cứu

- Xây dựng ngân hàng dữ liệu máu dây rốn:

+ Thu thập, xử lý, lưu trữ các đơn vị TBG máu dây rốn từ sản phụ tìnhnguyện hiến

+ Xét nghiệm sàng lọc loại trừ các đơn vị MDR bất thường

+ Xét nghiệm định danh HLA, CD34+, TBCN, nhóm máu của đơn vị MDR.+ Tổng hợp dữ liệu, sẵn sàng tìm kiếm

+ Phân tích tần suất xuất hiện của các allele HLA, số lượng tế bàoCD34+, TBCN, nhóm máu của các đơn vị máu dây rốn

- Tìm kiếm đơn vị máu dây rốn phù hợp cho bệnh nhân

+ Xét nghiệm định danh HLA, nhóm máu, đo cân nặng…) Mỗi loci lại có các dưới nhóm (subloci): A1, B1, B2

+ Đối chiếu kết quả với ngân hàng dữ liệu chọn ra đơn vị MDR phù hợpnhất cho bệnh nhân.

+ Thống kê: đặc điểm HLA của bệnh nhân, kết quả tìm kiếm và xác suấttìm được đơn vị MDR hòa hợp HLA

2.3.3 Nội dung nghiên cứu

 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu: các đơn vị MDR, sản phụ,thai nhi, bệnh nhân

 Đặc điểm HLA của các đơn vị MDR

 Đặc điểm HLA của bệnh nhân

 Kết quả và đánh giá khả năng tìm kiếm mẫu MDR phù hợp cho cácbệnh nhân có nhu cầu ghép TBG

+ Liều TBCN tối ưu với hòa hợp 4/6: 5 x 107 TB/kg; với hòa hợp 5/6: 4

x 107 TB/kg; với hòa hợp 6/6: 3 x 107 TB/kg cân nặng bệnh nhân

- Bệnh nhân: tuổi, dân tộc, cân nặng, nhóm máu, giới tính, chẩn đoán,kết quả định nhóm HLA, kết quả định danh kháng thể kháng HLA

- Kết quả và khả năng tìm kiếm đơn vị máu dây rốn phù hợp HLA

2.3.5 Vật liệu nghiên cứu, hóa chất, trang thiết bị.

a Vật liệu:

- Các mẫu máu dây rốn thu gom từ dây rốn trẻ sơ sinh ngay sau khi đẻvào trong túi chất dẻo 250ml có sẵn chất chống đông CPD - A1.

- 1ml mẫu từ đơn vị TBG thu nhận làm xét nghiệm TPTTBM, xétnghiệm đếm tế bào CD34+, xét nghiệm nhóm máu, xét nghiệm HLA

- Mẫu máu của các bệnh nhân cần tìm kiếm TBG (8ml) chống đông bằngEDTA

- Máy PCR, máy ủ nhiệt, máy ly tâm lạnh, máy trộn mẫu vortex

- Hệ thống máy LUMINEX định nhóm HLA và kháng thể kháng HLA

- Máy đếm tế bào tự động Beckman Coulter của Mỹ

- Máy Flowcytomety FC500 của Mỹ, bộ panel kháng thể đơn dòng gắnhuỳnh quang

- Dụng cụ định nhóm máu

2.3.6 Các tiêu chuẩn

- Tiêu chuẩn lựa chọn đơn vị máu dây rốn trước thu thập theo quy trìnhchuẩn được Bộ y tế phê duyệt tại Ngân hàng tế bào gốc Viện HH - TM TW.

- Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

- Tiêu chuẩn lựa chọn đơn vị máu dây rốn phù hợp cho bệnh nhân có nhucầu ghép: hòa hợp về HLA, số lượng TB CD34+, số lượng TBCN

2.3.7 Các quy trình áp dụng

 Các quy trình tạo nguồn TBG:

- Thu thập mẫu máu dây rốn trước sổ rau theo quy trình chuẩn tại Ngânhàng tế bào gốc Viện HH - TM TW

- Quy trình xử lý, bảo quản đông lạnh mẫu máu dây rốn theo quy trìnhchuẩn tại Ngân hàng tế bào gốc Viện HH - TM TW

 Các quy trình đánh giá khối TBG:

- Xét nghiệm HLA của đơn vị máu dây rốn và của bệnh nhân bằng kỹthuật PCR - SSO theo quy trình chuẩn tại Ngân hàng tế bào gốc Viện HH -

- Đếm số lượng CD34+ trên máy đếm tế bào dòng chảy FC 500 của hãngBeckman Coulter theo quy trình chuẩn tại Ngân hàng tế bào gốc Viện HH -

TM TW

Cấy vi khuẩn và nấm: được thực hiện tại khoa Vi sinh của Viện HH

-TM TW, bằng máy Batec

- Xác định tỷ lệ TBCN sống theo phương pháp nhuộm Xanh Trypan theoquy trình chuẩn tại Ngân hàng tế bào gốc Viện HH - TM TW.

 Quy trình tìm kiếm đơn vị máu dây rốn phù hợp HLA được thực hiệntheo quy trình chuẩn tại Ngân hàng tế bào gốc Viện HH - TM TW

 Đối với các biến định lượng sử dụng test t - student Sự khác biệt có

ý nghĩa thống kê với p < 0,05

2.4 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

Mọi thông tin thu thập được đảm bảo bí mật cho sản phụ cũng nhưbệnh nhân, chỉ phục vụ mục đích nghiên cứu

 Kết quả nghiên cứu được sự đồng ý và phê duyệt của lãnh đạo khoa,phòng và viện HH - TM TW

 Kết quả nghiên cứu được phản hồi lại cho khoa và viện HH - TM TW

 Từ kết quả nghiên cứu, lựa chọn một số thông tin cần thiết và có íchcho việc điều trị và tư vấn cho bệnh nhân

Sản phụ

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Chương 3 KẾT QUẢ

Bệnh nhân

Chỉ định ghép

Tìm kiếm

Đặc điểm HLA bệnh nhân Đánh giá khả

năng tìm kiếm

Đặc điểm HLA

máu dây rốn

3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đặc điểm của sản phụ và thai nhi

Bảng 3.1 Đặc điểm chung của các sản phụ hiến máu dây rốn (n = 3000)

Đặc điểm sản phụ Trung bình Nhỏ nhất - Lớn nhất

Cân nặng trước sinh (kg) 65,2 ± 5,7 45 - 90

Thời gian chuyển dạ (giờ) 8,3 ± 6,2 1 - 72

MCV máu ngoại vi (fl) 91,5 ± 3,7 85 - 107

Nhận xét: Các sản phụ hiến máu dây rốn có tuổi trung bình là 30,1 ±3,9 tuổi; nhỏ nhất là 18 tuổi và lớn nhất là 35 tuổi Cân nặng trung bình trướcsinh là 65,2 ± 5,7 kg; cân nặng thấp nhất là 45kg và lớn nhất là 90kg Thờigian chuyển dạ trung bình 8,3 ± 6,2 giờ Thể tích trung bình hồng cầu của cácsản phụ là 91,5 ± 3,7 fl, nhỏ nhất là 85 fl và lớn nhất là 107 fl

Bảng 3.2 Một số đặc điểm của thai nhi (n = 3000)

Cân nặng thai (gram) 3242,7 ± 341,9 2820 4500

Nhận xét: Tuổi thai nhi trung bình là 39,4 ± 0,9 tuần, nhỏ nhất là 36tuần, lớn nhất là 41 tuần Cân nặng thai nhi trung bình trong nghiên cứu là

3242 ± 341,9 gram, nhỏ nhất là 2820 gram và lớn nhất là 4500 gram

3.1.2 Đặc điểm của đơn vị máu dây rốn thu thập

Bảng 3.3 Đặc điểm chung của đơn vị MDR (n = 3000)

Bảng 3.4 Đặc điểm thể tích và tế bào của đơn vị MDR (n = 3000)

Tổng số TBCN trong đơn vị

TBG (107 tế bào)

131,5 ± 43,7 37,3 - 497,7

Nhận xét: Thể tích thu thập trung bình của đơn vị MDR là 133,7 ± 20,2

ml Số lượng trung bình tế bào CD34+ của các đơn vị MDR thu thập được là46,5 ± 32 x 105 tế bào, số lượng trung bình tế bào có nhân là 131,5 ± 43,7 tếbào Số lượng tế bào có nhân có mối tương quan thuận và chặt chẽ với thểtích MDR thu thập cũng như với số lượng tế bào CD34+

Category 1 0

Biểu đồ 3.1 Phân bố số lượng đơn vị TBG theo liều TBCN tối thiểu

Nhận xét: Số đơn vị MDR ghép cho bệnh nhân dưới 30 kg chỉ có 2,4%,trong khi đó, có đến 66,7% đơn vị tế bào gốc MDR ghép được cho bệnh nhântrên 50 kg và 28,8 % đơn vị đủ liều để ghép cho bệnh nhân trên 70 kg

3.1.3 Đặc điểm của bệnh nhân có nhu cầu tìm kiếm đơn vị MDR phù hợp Bảng 3.5 Đặc điểm của bệnh nhân có nhu cầu tìm kiếm MDR (n = 117)

X ± SD (kg)

43,3 ± 18,7 (10 - 77)

Nhận xét: Trong 117 bệnh nhân tìm kiếm TBG để điều trị ghép đồngloài, chiếm chủ yếu là nhóm bệnh nhân Lơ - xê - mi cấp (55,6%), các bệnh lýlành tính như Suy tủy xương hay Thalassemia chiếm tỷ lệ khá cao (18,8% và14,5%); ít nhất là nhóm bệnh nhân Lơ - xê - mi kinh và Rối loạn sinh tủy Tỷ

lệ bệnh nhân nam là 71,2%; nữ là 28,2%; với độ tuổi trung bình 24,1 ± 16,1tuổi; cân nặng trung bình là 43,3 ± 18,7 kg; trong đó bệnh nhân nhỏ nhất là 3tuổi và nặng 10kg; cũng có bệnh nhân cân nặng lên tới 77kg

3.2 ĐẶC ĐIỂM KIỂU GEN HLA CỦA CÁC ĐƠN VỊ MÁU DÂY RỐN

3.2.1 Đặc điểm tần suất các allele HLA của từng locus

1 0

Họ allele HLA - A Họ allele HLA - B Họ allele HLA - C Họ allele HLA - DR Họ allele HLA - DQ

Biểu đồ 3.2 Số lượng các họ allele HLA phân tích được

Nhận xét: Locus HLA - B được phân tích cho ra kết quả với số lượng

họ allele nhiều nhất là 27 họ, locus HLA - A, HLA - C và HLA - DRB1 với

14, 13 và 13 họ allele Số lượng ít nhất là locus HLA - DQ với 6 họ

Tỷ lệ (%)