Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nanoemulgel tetrahydrocurcumin

Áp dụng phương pháp định lượng đã xây dựng để định lượng tetrahydrocurcumin của chế phẩm trong 3 lô sản xuất thử nghiệm .... Một nghiên cứu in vitro so sánh tác dụng chống oxy hóa của te

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ KIM THOA

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN

CƠ SỞ CHO NANOEMULGEL

TETRAHYDROCURCUMIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ KIM THOA

MÃ SINH VIÊN: 1401587

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN

CƠ SỞ CHO NANOEMULGEL

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho

Nanoemulgel Tetrahydrocurcumin”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực của bản

thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Dược liệu, thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Viện Dược liệu đã tạo rất nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Lê Đình Chi – GV Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã đóng góp ý kiến, tận tình sửa chữa giúp em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Lê Thị Kim Vân – Khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược liệu, người đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược liệu đã hỗ trợ em trong quá trình nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy em suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 02 tháng 06 năm 2019

Phạm Thị Kim Thoa

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về tetrahydrocurcumin 2

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất 2

1.1.2 Tác dụng dược lý 3

1.1.3 Ứng dụng 5

1.2 Nanoemulgel 6

1.2.1 Khái niệm 6

1.2.2 Các tiêu chí đánh giá một nanoemulgel 6

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 12

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.2 Hoá chất, chất chuẩn 12

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 13

2.2 Nội dung nghiên cứu: 13

2.2.1 Định tính 13

2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin trong chế phẩm 13

2.2.3 Các tiêu chí khác 13

2.2.4 Áp dụng phương pháp định lượng đã xây dựng để định lượng tetrahydrocurcumin của chế phẩm trong 3 lô sản xuất thử nghiệm 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Định tính 14

2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin trong chế phẩm 14

2.3.3 Các tiêu chí khác 18

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Định tính 20

3.2 Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin bằng HPLC 21

3.2.1 Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện sắc ký 21

3.2.2 Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình xử lý mẫu 24

3.2.3 Thẩm định phương pháp 25

3.2.4 Áp dụng phương pháp định lượng đã xây dựng để định lượng tetrahydrocurcumin trong chế phẩm của 3 lô sản phẩm 31

3.3 Các tiêu chí khác 32

3.3.1 Cảm quan 32

3.3.2 pH 32

3.3.3 Độ đồng nhất 33

3.3.4 Độ nhớt 33

3.3.5 Kích thước giọt và phân bố kích thước giọt 34

3.4 Tiêu chuẩn cơ sở dự kiến 35

3.5 Bàn luận 36

3.5.1 Về phương pháp xử lý mẫu 36

3.5.2 Về chương trình sắc ký và thẩm định phương pháp 36

3.5.3 Về tiêu chuẩn cơ sở dự kiến 37

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

Chemists Hiệp hội các nhà hoá học phân tích

HLB Hydrophilic lipophilic balance Chỉ số cân bằng dầu nước

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

RSD (%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ ACN trong pha động 22

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát lựa chọn acid thêm vào pha động (A- acid formic 0,1%, B- acid acetic 2%, C- acid phosphoric 0,1%) 23

Bảng 3.3 Các thông số đánh giá điều kiện sắc ký THC 24

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thể tích dung môi chiết mẫu 24

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống 25

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ tuyến tính 27

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ chụm 28

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ thu hồi 30

Bảng 3.9 Kết quả định lượng THC 31

Bảng 3.10 Kết quả đo pH 32

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá độ đồng nhất 33

Bảng 3.12 Kết quả đánh giá độ nhớt 33

Bảng 3.13 Kết quả kích thước giọt và phân bố kích thước giọt 34

Bảng 3.14 Tiêu chuẩn cơ sở dự kiến 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của tetrahydrocurcumin 2

Hình 1.2 Độ ổn định của THC so với curcumin và trong đệm pH khác nhau [14] 3

Hình 1.3 Nguyên lý hoạt động của thiết bị Nano partica SZ-100 series sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng động 10

Hình 1.4 Lực trượt tạo nên một gradient tốc độ trượt giữa các mặt song song của chất lỏng [7] 11

Hình 2.1 Chế phầm Hemulgel White (Nanoemulgel chứa THC) 12

Hình 3.1 Sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn 20

Hình 3.2 Phổ UV-Vis của pic THC trong mẫu chuẩn và thử 20

Hình 3.3 Phổ UV-Vis của pic THC thu được khi phân tích dung dịch chuẩn THC 21

Hình 3.4 Sắc ký đồ đánh giá độ phù hợp hệ thống 25

Hình 3.5 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc 26

Hình 3.6 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ 27

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mỗi quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic 28

Hình 3.8 Sắc ký đồ đánh giá độ thu hồi của tetrahydrocurcumin 30

Hình 3.9 Cảm quan của Nanoemulgel Tetrahydrocurcumin 32

Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện kích thước và phân bố kích thước giọt 34

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Curcumin nguồn gốc từ nghệ vàng (Curcuma longa L.), họ Gừng (Zingiberaceae)

có nhiều tác dụng như chống viêm, chống oxy hoá, chống virus, và chống ung thư Curcumin được sử dụng để ngừa mụn, liền sẹo trong mỹ phẩm Tuy nhiên, các sản phẩm chứa curcumin có nhược điểm về thẩm mỹ như gây dính trên da, vàng da Do vậy, các chất bán tổng hợp từ curcumin mà có tác dụng tương tự curcumin được tập trung nghiên cứu để khắc phục nhược điểm trên, đáng chú ý nhất là tetrahydrocurcumin Tetrahydrocurcumin hay curcumin trắng là sản phẩm bán tổng hợp dựa trên cơ sở của phản ứng khử hoá curcumin bằng dòng khí hydro ở điều kiện thích hợp với sự có mặt của chất xúc tác như PtO2, Pd/C Tetrahydrocurcumin có khả năng dọn dẹp các gốc tự

do trên bề mặt da và ức chế sự hình thành sắc tố da melanin Do đó, mỹ phẩm chứa tetrahydrocurcumin ngày càng được ưa chuộng làm sản phẩm dưỡng trắng da, chống lão hoá ở dạng bào chế dùng ngoài da như gel, kem ở trong và ngoài nước Tại Viện Dược liệu, trong đề tài cấp cơ sở cũng đã hoàn thành bào chế sản phẩm nanoemulgel chứa tetrahydrocurcumin Mặc dù vậy, trong Dược điển chưa có chuyên luận nào quy định tiêu chuẩn của tetrahydrocurcumin hay chế phẩm chứa tetrahydrocurcumin Vì vậy,

chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nanoemulgel

tetrahydrocurcumin” với hai mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin bằng DAD

HPLC-2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dự kiến cho sản phẩm nghiên cứu

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của tetrahydrocurcumin

- Tên khoa học: 1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)heptan-3,5-dion

- Tên khác: Tetrahydrodiferuloylmethan

- Công thức phân tử: C21H24O6 (công thức cấu tạo xem hình 1.1)

- Khối lương phân tử: 372,2 g/mol

Tính chất vật lý:

Bột kết tinh màu trắng, không mùi, không vị

Độ tan:

- Tan trong aceton, ethanol, DMSO, DMF Tan nhẹ trong nước nóng

- THC có độ tan cao trong PEG 400 (207,93 ± 3,32 mg/ml) có thể là do THC tạo được dạng liên kết hydro với nhóm polyethylen oxyd của PEG 400

- Với các chất diện hoạt thân nước có HLB cao từ 13-15 như Cremophor RH40 (189,95

± 4,42), Cremophor EL (159,61 ± 2,19), Labrasol (177,08 ± 1,94) (có chứa các nhóm polyethylen oxyd) cũng có khả năng hòa tan cao THC

- Capryol 90 và Labrafac PG đều có khả năng hòa tan cao THC (với Capryol 90 là 40,78 ± 0,91 mg/ml và với Labrafac PG là 13,85 ± 0,20 mg/ml [28])

Nhiệt độ nóng chảy: 95-97ºC

Hình 1.2 Độ ổn định của THC so với curcumin và trong đệm pH khác nhau [14] 1.1.2 Tác dụng dược lý

Tác dụng chống viêm

Curcumin và 4 dẫn xuất tổng hợp được nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm trong mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin và mô hình gây viêm u hạt bằng dầu hạt bông trên chuột cống Hoạt lực chống viêm của curcumin, các dẫn xuất của curcumin

và phenylbutazon được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau:

Natri curcumin> tetrahydrocurcumin> curcumin > phenylbutazon> triethylcurcumin

Khi so sánh curcumin và các dẫn xuất của nó trong các mô hình viêm cấp và bán cấp thì kết quả cho thấy các dẫn xuất của curcumin có tác dụng chống viêm mạnh hơn curcumin [14]

Các nghiên cứu cả trên in vivo và in vitro đều chỉ ra rằng THC có khả năng chống

oxy hóa mạnh hơn curcumin, các curcuminoid khác [19, 24]

Poorichaya S và cộng sự đã nghiên cứu so sánh hoạt tính chống oxy hóa của curcumin cùng các dẫn xuất của nó đối với gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) và chỉ ra rằng THC thể hiện khả năng dọn gốc tự do DPPH cao nhất với giá trị IC50 = 18,7 µM Hoạt tính này giảm dần theo thứ tự: THC > HHC = OHC > curcumin > DMC > BDMC Nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng THC có khả năng

ức chế mạnh nhất đối với AAPH (2,2-azobis(2-amidinopropan)dihydroclorid) - một tác nhân gây ra quá trình peroxy hóa lipid Lý giải cho những điều này, các tác giả cho rằng chính sự có mặt của nhóm methoxyphenyl và đặc biệt là sự hydro hóa hệ nối đôi liên hợp trong mạch carbon trung tâm đã làm tăng hoạt tính của curcumin lên một cách đáng

kể [30]

Một nghiên cứu in vitro so sánh tác dụng chống oxy hóa của tetrahydrocurcumin

và các curcuminoid khác đã được thực hiện trên tế bào hồng cầu thỏ và gan chuột, sử dụng acid linoleic là chất nền trong hệ ethanol/nước, được phân tích bằng phương pháp thiocyanat và phương pháp TBA Kết quả cho thấy rằng THC có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong tất cả các curcuminoid [14, 19]

Tác dụng ức chế của curcumin và tetrahydrocurcumin đối với quá trình peroxy hóa lipid trên màng hồng cầu gây bởi tert-butylhydroperoxid đã được nghiên cứu gần đây Kết quả đã chứng minh rằng THC cho thấy hiệu quả tốt hơn curcumin Các tác giả kết luận rằng, THC có khả năng dọn các gốc tự do như tert-butoxyl và peroxyl một cách triệt để [14]

Giải thích về cơ chế tác dụng và đặc tính chống oxy hóa mạnh hơn của THC so với curcumin, các tác giả cho rằng THC là chất chuyển hóa chính của curcumin ở đường tiêu hóa Họ cho rằng THC đóng vai trò quan trọng trong cơ chế chống oxy hóa của

5

curcumin trong cơ thể, khi mà curcumin được chuyển hóa thành THC Nhóm phenolic đóng vai trò dọn các gốc tự do trong giai đoạn đầu của quá trình chống oxy hóa bằng THC Mặt khác, nhóm β-diketon cũng đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa của THC, bởi vì sự phân cắt liên kết C–C trong khung β-diketon được quan sát thấy trong quá trình chống oxy hóa Như vậy, nhóm β-diketon đóng vai trò dọn các gốc

tự do trong giai đoạn sau của quá trình chống oxy hóa [14, 19]

Tác dụng trên tế bào ung thư

Nghiên cứu chứng minh rằng THC có tác dụng mạnh hơn curcumin trong việc

ức chế sự phát triển tụ điểm ẩn khác thường ACF (aberrant crypt foci) và sự tăng nhanh

tế bào, và tác dụng tương tự curcumin trong việc chống lại tác nhân gây ung thư trong

cơ thể [14]

Nhiều công trình nghiên cứu cũng đã chứng minh THC có khả năng ức chế một

số tác nhân gây ra nhiều bệnh ung thư như: ung thư da, ung thư máu, ung thư ruột kết, ung thư đại tràng… [11, 34]

Nghiên cứu của Ching-Shu Lai và cộng sự đã chứng minh THC có tác dụng tốt hơn curcumin trong việc ức chế azoxymethan (AOM) – một tác nhân gây ung thư đại tràng ở chuột [11]

1.1.3 Ứng dụng

Trong mỹ phẩm, với vai trò chống oxy hóa đã được khẳng định, THC giúp bảo

vệ các tế bào sừng của da người chống lại các tổn thương do hypoxanthin/xanthin

oxidase trong các nghiên cứu in vivo Bên cạnh đó, THC được cho rằng có khả năng dọn

dẹp các gốc tự do trên bề mặt da sinh ra do tiếp xúc với tia tử ngoại, hóa chất và các yếu

tố môi trường, giúp làm chậm quá trình lão hóa da Đồng thời, với khả năng ức chế tyrosinase, THC cũng giúp làm chậm quá trình tạo sắc tố da Vì những lý do này, THC

có thể sử dụng làm thành phần của các chế phẩm chống lão hóa và dùng ngoài để duy trì sức khỏe và sự mịn màng của da [14]

Trong các ứng dụng điều trị khác, THC còn được sử dụng trong điều trị bệnh bạch biến, tăng cường hệ chống oxy hoá của thận và bảo vệ tổn thương do oxy hoá khi giúp giảm đáng kể nồng độ urê huyết thanh và creatinine nên giảm được độc tính trên thận khi sử dụng đường uống [6, 21]

6

Các thử nghiệm trên chuột cho thấy hiệu quả đối với các triệu chứng mãn kinh

và viêm khớp, cũng như glucose huyết, insulin huyết tương và men gan ở bệnh đái tháo đường Kỳ vọng có thể can thiệp được các bệnh lý này trên người [20, 23]

1.2 Nanoemulgel

1.2.1 Khái niệm

Nanoemulgel là sự kết hợp nanoemulsion vào trong mạng lưới hydrogel Hoạt chất được hòa tan trong pha dầu, sau đó được phân tán trong nước tạo ra nanoemulsion với sự hỗ trợ của các chất diện hoạt và đồng diện hoạt, đạt kích thước hạt dưới 250 nm Nhũ tương sẽ được phối hợp với tác nhân tạo gel, tạo thành nanoemulsion gel có độ nhớt lớn, thể chất ổn định hơn, giúp ức chế kết tinh và tăng độ ổn định của dạng nano [25, 31]

Dạng bào chế này hiện đang được chú ý và nhiều loại thuốc dùng qua da, niêm mạc đang được bào chế dưới dạng này

1.2.2 Các tiêu chí đánh giá một nanoemulgel

1.2.2.1 Định lượng

Có nhiều phương pháp để định lượng hoạt chất có trong chế phẩm, sau đây xin chỉ đề cập đến một số phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin

Nghiên cứu trong nước

Năm 2017, trong bài nghiên cứu “Đánh giá sinh khả dụng đường uống của hệ tiểu phân nano curcumin trên chuột thí nghiệm” của Dương Hồng Ánh, đã tiến hành định lượng đồng thời curcumin và tetrahydrocurcumin trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với điều kiện sắc ký như sau: cột sắc ký Kinetex C18, 100 × 2,1 mm, 1,7 µm Nhiệt độ cột 40°C Pha động: ACN- dung dịch acid formic 0,05% (60:40) Tốc

độ dòng 0,3 ml/phút Thể tích mẫu tiêm 10 µl Giới hạn định lượng dưới LLOQ của phương pháp LC-MS/MS đối với tetrahydrocurcumin là 0,5 ng/ml [2]

Năm 2012, trong “Nghiên cứu bào chế thuốc dùng qua da chứa tetrahydrocurcumin”, Nguyễn Thị Những đã tiến hành định lượng THC trong chế phẩm kem, gel của mình bằng phương pháp HPLC với điều kiện như sau: Cột SB-C18 4,6 ×

150 mm, hạt nhồi 5 µm Pha động: ACN- dung dịch acid acetic 2% (40:60) Pha động được lọc qua màng 0,45 µm, siêu âm 30 phút Tốc độ dòng 1 ml/phút Detector UV phát hiện ở 272 nm Thể tích tiêm mẫu 20 µl [4]

Dung môi pha mẫu: ACN

Hệ thống sắc ký: Shimadzu Nexera UHPLC kết hợp với Shimadzu LCMS 8040

Điều kiện sắc ký: cột Waters Acquity UPLC BEH C18, pha động: ACN- acid formic 0,1%

Dung môi pha mẫu: Methanol

Điều kiện sắc ký: pha động: ACN- acid acetic 2% (70:30), thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ dòng 1 mL/phút, bước sóng 282 nm Thời gian sắc ký 8 phút, tR= 6,9 phút

[32]

HPLC

Nano nhũ

tương THC

Dung môi pha mẫu: Methanol

Phương pháp xử lí mẫu: voltex trong 5 phút, sau đó li tâm 1000 vòng/phút trong 20 phút

Điều kiện sắc ký: Cột phân tích pha đảo Qualisil BDS (5 µm, 4.6 mm × 250 mm), pha động Acetonitril và methanol theo tỷ lệ 53:47, với axid acetic 0,26%, tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl Bước sóng phát hiện 280

nm và nhiệt độ duy trì ở 25˚C ± 0,5˚C, tR =5,4 phút

[17]

Điều kiện sắc ký: cột C18 (Phenomenex Luna

250 mm × 4.6 mm), ACN- H2O (70:30) với acid acetic 0,005% (0,05 mL/L), thể tích tiêm

10 uL, thời gian chạy 5 phút, tốc độ dòng 0,2 mL/phút

Khoảng pH này khá rộng từ 4-7 tuỳ thuộc vào vùng da, tuổi tác, giới tính, bã nhờn và độ ẩm trên da, ngoài ra còn các yếu tố bên ngoài như chất tẩy rửa, mỹ phẩm, xà phòng… [12, 26] Tuy nhiên đã có chứng minh rằng, pH của da khoẻ mạnh sẽ nằm trong khoảng 4,1-5,8 (trừ ở bộ phận sinh dục), trung bình ở 4,8 [16]

Do vậy, thông thường các sản phẩm mỹ phẩm nên kiểm soát pH nằm trong khoảng 4,1-5,8 để phù hợp cho sử dụng ngoài da và không gây kích ứng

Đo pH với mẫu có độ nhớt cao

Gel có đặc tính là nhớt, đặc quánh Hơn nữa, nanoemulgel lại là nano nhũ tương được phân tán vào gel, kích thước giọt rất nhỏ Nếu đo pH trực tiếp, các mẫu này làm tắc các điểm trên đầu điện cực dẫn đến chậm phản ứng điện cực, gây sai số đo pH Độ dày của mẫu có thể cũng gây ra vấn đề chuyển mẫu - sau khi điện cực pH được lấy ra khỏi mẫu, một số mẫu có thể bám vào điện cực[27]

9

Do vậy, để đo các mẫu có độ nhớt cao nói chung, sẽ dung loại đầu điện cực dành riêng để đo mẫu có độ nhớt (nhũ tương, gel, kem…) Các điện cực này thường là điện cực mở hoặc là các mối nối mở chống tắc nghẽn và điện cực thì dễ rửa sạch như điện cực InLab® Viscous (pH meter TOLEDO), hoặc các điện cực ROSS Sure-Flow, Ag/AgCl Sure-Flow and AquaPro (Thermo Scientific)

Tuy nhiên, với điều kiện thiết bị tại phòng thí nghiệm, không có đầu điện cực để

đo trực tiếp Vấn đề đặt ra là phải đo được pH gần chính xác nhất và không ảnh hưởng tới đầu điện cực Qua tham khảo tài liệu, gel sẽ được pha loãng với nước trước khi đo pH[3, 4]

- Độ đồng nhất

Trong phụ lục của thuốc dùng ngoài, kem, gel thì độ đồng nhất là một chỉ tiêu chung trong DĐVN V Phần tiến hành sẽ được trình bày cụ thể trong phần phương pháp nghiên cứu

- Đánh giá kích thước giọt và phân bố kích thước giọt

Trong các phương pháp đánh giá kích thước giọt và phân bố kích thước giọt, thường sử dụng 3 phương pháp sau: Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microsopy –TEM), kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy – SEM), phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering – DLS) Trong 3

kỹ thuật thì phương pháp tán xạ ánh sáng động là kỹ thuật hay được sử dụng và phù hợp nhất để đo kích thước và phân bố kích thước của giọt dầu trong nano nhũ tương hay gel chứa nano nhũ tương vì phương pháp đơn giản, độ nhạy và độ chọn lọc cao, rút ngắn được thời gian đo lường…

DLS là một kỹ thuật trong vật lý dựa vào sự tương tác của chùm sáng laser với các hạt và phân tích các biến động cường độ ánh sáng để đo chuyển động Brown Các hạt cầu ở trong môi trường lỏng như: nước, ethanol… chuyển động hỗn độn và va chạm với nhau theo chuyển động Brown Khi chiếu chùm sáng đơn sắc như laser vào dung dịch, các hạt cầu đang chuyển động Brown sẽ gây ra dịch chuyển Doppler khi ánh sáng chạm tới hạt, làm thay đổi bước sóng của ánh sáng tới Sự thay đổi này có liên quan tới kích thước hạt Ta có thể tính toán được sự phân bố kích thước hạt bằng cách đưa ra mô

tả chuyển động của các hạt này trong môi trường, đo được hệ số khuếch tán dựa vào

η: độ nhớt của môi trường phân tán

Phương pháp này có thể sử dụng để đo kích thước hạt đặc biệt là trong khoảng 2-500 nm Thường sử để mô tả các đặc điểm của hạt nano như tính toán kích thước hạt, phân bố kích thước hạt [33]

Với thiết bị Nano partica SZ-100 series: một nguồn sáng được chiếu qua cốc đo,

và ánh sáng tán xạ được thu nhận tại hai góc 90° hoặc 173° (xem hình 1.3) Hệ thống

sẽ tự động lựa chọn góc tán xạ tối ưu và vị trí của cốc đo phụ thuộc vào nồng độ mẫu và cường độ ánh sáng

Hình 1.3 Nguyên lý hoạt động của thiết bị Nano partica SZ-100 series sử dụng

phương pháp tán xạ ánh sáng động

11

- Độ nhớt

Độ nhớt phản ánh khả năng lưu lại trên da của chế phẩm Các thuốc dùng cho da

và niêm mạc cần có độ nhớt thích hợp giúp chế phẩm có khả năng bám dính tốt từ đó duy trì tác dụng tốt hơn Đồng thời độ nhớt cũng ảnh hưởng đến quá trình giải phóng thuốc cũng như mức độ bao phủ bề mặt của chế phẩm Vì vậy, đánh giá độ nhớt là một đánh giá thường quy đối với các chế phẩm bôi ngoài da và niêm mạc

Độ nhớt (η) của một chất lỏng được mô tả một cách đơn giản chính là sự kháng lại sự chảy hoặc chuyển động Newton là người đầu tiên nghiên cứu định lượng sự chảy của chất lỏng và nêu ra định luật Newton [15]

Định luật Newton về sự chảy [15]: Khối chất lỏng được coi gồm những lớp phân

tử xếp song song Lớp đáy được xem như cố định Nếu lớp trên cùng di chuyển với một tốc độ hằng định thì mỗi lớp bên dưới sẽ di chuyển với một tốc độ tỷ lệ với khoảng cách của nó so với lớp đáy Biến thiên tốc độ dν giữa hai lớp cách nhau một khoảng dr gọi là gradient tốc độ (dν/dr hoặc δ/h) hay tốc độ trượt (γ) Lực tác dụng trên một đơn vị diện tích (F/A) gọi là lực trượt hay ứng suất trượt (τ hoặc σ) Độ nhớt tỷ lệ thuận với ứng suất trượt và tỷ lệ nghịch với lực trượt (xem hình 1.4):

F /A = η * (dν / dr) hay η = τ / γ Đơn vị của độ nhớt là Pa.s và P (1cP = 1 mPa.s)

Hình 1.4 Lực trượt tạo nên một gradient tốc độ trượt giữa các mặt song song

của chất lỏng [7]

12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chế phẩm nanoemulgel tetrahydrocurcumin- sản phẩm nghiên cứu của khoa Bào chế và Chế biến, Viện Dược liệu (xem hình 2.1)

Hình 2.1 Chế phầm Hemulgel White (Nanoemulgel chứa THC)

Thành phần trong 1 đơn vị sản phẩm (10g):

- Tetrahydrocurcumin

- Tá dược vừa đủ

- Nước vừa đủ 10g

Công dụng: Làm mờ sẹo, chống lão hoá da, ngăn ngừa thâm nám

Cách dùng: Rửa sạch da, làm khô, sau đó thoa lên vùng da cần điều trị

2.1.2 Hoá chất, chất chuẩn

- Chất chuẩn: Tetrahydrocurcumin (CAS No, Chemsface, 96%)

- Mẫu placebo không chứa tetrahydrocurcumin do khoa Bào chế và chế biến, Viện Dược liệu cung cấp

- Dung môi, hoá chất tinh khiết HPLC: ACN, acid formic, acid phosphoric, acid acetic (Merk, HPLC grade)

13

- Dung môi, hoá chất tinh khiết phân tích: Methanol (Trung Quốc, PA)

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

- Cân kĩ thuật Satorius TE3102s (Đức)

- Cân phân tích Satorius BP121S (Đức)

- Cân phân tích 5 số Mettler Toledo MS105 (Mỹ)

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản)

- MRC Digital Viscometer

- Máy phân tích kích thước hạt SZ 100 (Horiba)

- Máy đo pH MILLWAUKEE

- Bể siêu âm

- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 µm

- Bình định mức, pipet, vial, eppendof, màng lọc 0,22 µm

- Micropipet và các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm

2.2 Nội dung nghiên cứu:

2.2.1 Định tính

2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin trong chế phẩm 2.2.2.1 Tối ưu hoá điều kiện sắc ký

Khảo sát thành phần và tỷ lệ dung môi pha động

2.2.2.2 Tối ưu hoá quy trình xử lý mẫu

Thể tích dung môi chiết mẫu

14

- pH: được đo bằng máy đo pH

- Độ đồng nhất: đánh giá theo phụ lục 1.12-DĐVN V [1]

- Độ nhớt: được đánh giá bằng máy đo độ nhớt dạng xoay

- Kích thước giọt và phân bố kích thước giọt: đánh giá bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động sử dụng thiết bị Nano partica SZ-100 series (Horiba)

2.2.4 Áp dụng phương pháp định lượng đã xây dựng để định lượng tetrahydrocurcumin của chế phẩm trong 3 lô sản xuất thử nghiệm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Định tính

Định tính THC trong chế phẩm được xác định thông qua so sánh thời gian lưu,

và phổ UV-Vis của mẫu thử và THC chuẩn trên hệ thống HPLC-DAD

Yêu cầu: tại thời gian lưu của THC chuẩn phải xuất hiện pic THC của mẫu thử,

và phổ UV-Vis phải tương đồng nhau, có hệ số match trong khoảng 0,8-1,2

2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng tetrahydrocurcumin trong chế phẩm 2.3.2.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn

Mẫu chuẩn: tiến hành cân chính xác 5mg chất chuẩn tetrahydrocurcumin hoà tan trong vừa đủ 5ml methanol thu được dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/ml Pha loãng dung dịch gốc thu được dãy chuẩn có nồng độ: 25, 50, 75, 100, 125, 150 µg/ml

2.3.2.2 Khảo sát điều kiện pha động

Mẫu thử: Cân chính xác 1,0g mẫu thử, phân tán vào vừa đủ 25 ml với methanol Siêu âm 10 phút Đem li tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút Hút dịch phía trên lọc với màng lọc 0,22 µm trước khi khai triển sắc ký

Phân tích mẫu thử trong các điều kiện pha động khác nhau để chọn điều kiện tối

ưu nhất dựa trên các tiêu chí:

- Pic của THC tách hoàn toàn khỏi các pic khác

- Pic của THC đạt yêu cầu về độ cân xứng, số đĩa lý thuyết

2.3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Dựa vào các tài liệu đã tham khảo, các điều kiện được cố định như sau:

- Phương pháp chiết: Siêu âm

- Dung môi chiết mẫu: methanol

- Thời gian chiết: 30 phút

- Độ chọn lọc

Độ chọn lọc của phương pháp là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, độ chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ các mẫu thử, mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp

Chuẩn bị mẫu placebo, mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu placebo thêm chuẩn So sánh sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên Yêu cầu: Khi chạy mẫu placebo, tại

vị trí tương ứng với tR của tetrahydrocurcumin không xuất hiện pic

- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được theo phương pháp định lượng đã xây dựng

Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Số lần phân tích lặp lại 4 lần Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N

= Signal to noise ratio) LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp

2-5 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N =3

Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:

Hệ số hồi quy tuyến tính:

0,995≤ R ≤ 1

Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn: sau khi lập đường chuẩn xong, kiểm tra bằng cách tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để xây dựng đường chuẩn, từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức:

∆i = (Ct – Cc)/Cc × 100

Trong đó:

∆i: độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct: nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc: nồng độ của các điểm chuẩn

Giá trị ∆i không được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%

- Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp là mức độ đồng nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất Ở đây sẽ bao gồm 2 khái niệm là độ chụm và độ đúng