KHẢO sát một số đột BIẾN GEN LIÊN QUAN tới CHỨNG ưa HUYẾT KHỐI DI TRUYỀN ở PHỤ nữ sẩy THAI, THAI CHẾT lưu LIÊN TIẾP

hiện đề tài “Khảo sát một số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền ở phụ nữ sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp” với hai mục tiêu:1.. Mô tả một số đột biến gen liên quan

-*** -ĐÀO THỊ TRANG

KH¶O S¸T MéT Sè §éT BIÕN GEN

LI£N QUAN TíI CHøNG ¦A HUYÕT KHèI DI

LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS ĐOÀN THỊ KIM PHƯỢNG

2 PGS TS HOÀNG THỊ NGỌC LAN

Lời đầu tiên tôi muốn được bày tỏ là lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS BS Đoàn Thị Kim Phượng, giảng viên Bộ môn Y Sinh học - Di truyền, trường Đại học

Y Hà Nội, là người hướng dẫn khoa học Cô là người luôn định hướng cho tôi trong nghiên cứu, truyền dạy cho tôi kiến thức khoa học và cuộc sống Sự động viên, giúp

đỡ và dìu dắt của Cô đã giúp tôi có thêm nghị lực để vượt lên những khó khăn và hoàn thành nghiên cứu này

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Hoàng Thị Ngọc Lan, giáo viên đồng hướng dẫn, người đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn ngày hôm nay.

Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô và các Anh chị em trong Bộ môn Y Sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội và Trung tâm Chẩn đoán trước sinh, Bệnh viện Phụ sản Trung Ương đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình học tập

và thực hiện nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo Sau đại học trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thiện luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các đối tượng nghiên cứu đã tình nguyện hợp tác giúp tôi thực hiện được nghiên cứu này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn tới bố mẹ cùng sự ủng hộ, động viên, thương yêu chăm sóc, khích lệ của chồng, con và anh chị em trong gia đình, những người đã luôn ở bên tôi, là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận văn.

Hà Nội, tháng 09 năm 2017

Đào Thị Trang

Tôi là Đào Thị Trang, Bác sĩ nội trú khóa 39, chuyên ngành Y Sinh học

- Di truyền, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn

của TS.Đoàn Thị Kim Phượng và PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan.

2 Nghiên cứu này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,trung thực và khách quan

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này

Tác giả luận văn

Đào Thị Trang

APCR Activated protein C resistance Kháng protein C hoạt hóa

urokinase

PAI-1 Plasminogen activator inhibitor –

type1

Chất ức chế hoạt hóaplasminogen tuýp 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp 3

1.2 Chứng ưa huyết khối di truyền 7

1.2.1 Đại cương 7

1.2.2 Mối liên quan của chứng ưa huyết khối di truyền và mất thai tái diễn 8

1.2.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán và sàng lọc IT 11

1.2.4 Một số độ biến gen liên quan tới chứng ưa huyết khối di truyền 13

1.2.5 Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Địa điểm lấy mẫu và phân tích mẫu 23

2.3 Phương tiện nghiên cứu 24

2.3.1 Dụng cụ 24

2.3.2 Hóa chất 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 24

2.4.2 Cỡ mẫu 24

2.4.3 Phương pháp tiến hành nghiên cứu 24

1.4.5 Đọc kết quả 28

2.5 Xử lý số liệu 30

2.6 Cách khống chế sai số trong nghiên cứu 30

2.7 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 31

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 32

3.1.1 Tuổi 32

3.2 Hoàn thiện quy trình phát hiện một số đột biến gen liên quan đến

chứng ưa huyết khối di truyền bằng bộ kit CVD-T StripAssay 34

3.3 Mô tả một số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền ở phụ nữ sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp 37

3.3.1 Tỷ lệ các đột biến gen 37

3.3.2 Mối liên quan giữa một số đột biến gen và tiền sử sản khoa 39

Chương 4 BÀN LUẬN 41

4.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 41

4.2 Hoàn thiện quy trình phát hiện một số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền bằng bộ kit CVD-T StripAssay 42

4.3 Mô tả một số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền ở phụ nữ sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp 43

4.3.1 Đột biến yếu tố V Leiden và đột biến yếu tố V R2 43

4.3.2 Đột biến prothrombin G20210A 44

4.3.3 Đột biến MTHFR C677T và A1298C 45

4.3.4 Đột biến PAI - 1 4G/5G 47

4.3.5 Đột biến yếu tố XIII Val34Leu 48

4.3.6 Tổ hợp gen EPCR 48

4.3.7 Sự kết hợp giữa các đột biến 49

4.3.8 Mối liên quan của một số đột biến và tiền sử sản khoa 49

KẾT LUẬN 50

KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.2 Mối liên quan của một số đột biến gen liên quan tới chứng ưa

huyết khối di truyên và các biến chứng sản khoa 9

Bảng 1.3 Hoạt độ enzyme MTHFR tương ứng với các đột biến gen 17

Bảng 1.4 Một số gen liên quan đến IT được phát hiện với phương pháp lai bằng bộ kít CVD-T StripAssay 21

Bảng 3.1 Tuổi trung bình và phân bố theo tuổi 32

Bảng 3.2 Phân bố số lần sẩy thai, thai chết lưu theo ba quý của thai kì 33 Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân theo tiền sử các bệnh tắc mạch 34

Bảng 3.4 Kết quả (KQ) theo thời gian chạy điện di 34

Bảng 3.5 Phân bố hiệu quả lai các sản phẩm PCR đạt sau khi điện di 55 phút .36

Bảng 3.6 Tỷ lệ các đột biến gen được phát hiện 37

Bảng 3.7 Tần số đột biến gen MTHFR C677T và A1298C 37

Bảng 3.7 Tỷ lệ các dạng đột biến kép 38

Bảng 3.8 Tần số tổ hợp gen (haplotype) EPCR: A4600G và A4678G 39

Bảng 3.9 Tỷ lệ đột biến gen MTHFR và PAI-1 4G/5G ở hai nhóm bệnh nhân RPL quý 1 và quý 2 của thai kì 39

Bảng 3.10 Tỷ lệ đột biến gen MTHFR và PAI-1 4G/5G ở hai nhóm bệnh nhân RPL chưa có con và đã có một con 40

Bảng 3.11 Mối liên quan giữa số lần RPL với một số đột biến 40

Bảng 4.1 So sánh tỷ lệ các kiểu gen MTHFR C677T với các nghiên cứu trên phụ nữ RPL 45

Bảng 4.2 So sánh tỷ lệ các kiểu gen PAI-1 4G/5G với một số nghiên cứu trên phụ nữ RPL 47

Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân theo tình trạng con hiện có 32 Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh nhân theo số lần RPL 33

Biểu đồ 3.3 Phân bố kết quả lai sản phẩm PCR 35

Hình 1.1 Nguyên nhân của mất thai tái diễn 5

Hình 1.2 Con đường đông máu và hệ thống chống đông thông qua Protein C hoạt hóa 14

Hình 1.3 Chu trình methionin-homocystein 16

Hình 1.4 Tác động của PAI-1 và yếu tố XIII lên sự hình thành và ly giải fibrin 18

Hình 1.5 Minh họa nguyên lý phương pháp lai phân tử 20

Hình 2.1 Phương pháp tiến hành nghiên cứu 25

Hình 2.2 Thiết kế thanh lai mẫu 29

Hình 2.3 Các kết quả lai có thể gặp đối với mỗi đột biến 30

Hình 2.4 Cách đọc kết quả các Haplotype của gen EPCR 30

Hình 3.1 Hình ảnh điện di 35

Hình 3.2 Kết quả điện di và lai không thành công 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Mất thai tái diễn (Recurrent Pregnancy Loss – RPL) là tình trạng bệnh lý

ảnh hưởng lớn tới tâm lý và sức khỏe của người phụ nữ cũng như gia đình họ.RPL là khi có từ hai lần sẩy thai, thai chết lưu trở lên RPL ảnh hưởng tới 5%các cặp đôi mong muốn có con Có nhiều giả thuyết về cơ chế dẫn đến RPL,tuy nhiên vẫn còn nhiều điểm chưa rõ ràng Nhiều nguyên nhân của RPL đãđược xác định như bất thường nhiễm sắc thể ở bố mẹ, ở phôi thai, các bệnh lý

tự miễn, rối loạn nội tiết,…nhưng vẫn còn khoảng một nửa trường hợp chưaxác định được nguyên nhân Cùng với sự phát triển của lĩnh vực sinh họcphân tử, các nhà khoa học ngày càng tập trung tìm ra cơ chế thực sự dẫn tớiRPL bằng việc đi sâu nghiên cứu sự biểu hiện (đột biến hoặc tính đa hình) củacác gen khác nhau liên quan đến tình trạng RPL Trong xu hướng đó, cơ chếtăng đông máu nhận được sự quan tâm dựa trên giả thuyết về việc hình thànhhuyết khối trong hệ thống mạch máu tử cung – nhau thai dẫn đến gián đoạncấp máu cho thai nhi, gây ra sẩy thai hoặc thai chết lưu Hàng loạt nghiên cứu

đã được các tác giả thực hiện ở nhiều nước trên thế giới, nhằm xác định mốiliên quan giữa các đột biến/tính đa hình của gen với tình trạng RPL, cũng nhưtiến hành các thử nghiệm can thiệp lâm sàng bằng thuốc chống đông và acidfolic (hoặc các dẫn xuất của acid folic) nhằm cải thiện kết quả mang thai ở đốitượng RPL Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào khảo sát và đánh giá về cácđột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối/tình trạng tăng đông di truyền

(Inherited Thrombophilia – IT) ở đối tượng RPL Do đó, nhằm cung cấp

những dữ liệu ban đầu tại Việt Nam về vấn đề này, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Khảo sát một số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền ở phụ nữ sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp” với hai mục tiêu:

1 Hoàn thiện quy trình phát hiện một số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền bằng bộ kit CVD-T StripAssay (ViennaLab).

2 Mô tả một số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền ở phụ nữ sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp

Có nhiều quan niệm về sẩy thai khác nhau tùy theo từng nước, chủ yếukhác nhau về quy định đối với thời gian mang thai Theo Tổ chức Y tế thế

giới (World Health Organization - WHO, 2009), sẩy thai là hiện tượng kết

thúc thai nghén một cách tự nhiên trước khi thai đạt tới độ tuổi có thể sốngbên ngoài tử cung, đó là sự trục xuất hoặc tống phôi thai khi phôi/thai dưới 20tuần, nếu tuổi thai không rõ, thì xét trọng lượng phôi/thai < 400g Khái niệmnày không bao gồm chửa ngoài tử cung, thai trứng và thai sinh hóa Đây làhiện tượng khá phổ biến, xảy ra ở 15% – 25% thai kì và tỷ lệ tăng theo tuổi

mẹ Cũng như sẩy thai, thai chết lưu có nhiều định nghĩa khác nhau, tùy từngnước, chủ yếu khác nhau về quy định đối với thời gian mang thai và trọnglượng thai Theo WHO, thai chết lưu là tất cả những trường hợp thai bị chếttrong tử cung khi tuổi thai từ 20 tuần tuổi trở lên cho đến trước khi chuyển dạ

Mất thai tái diễn (Recurrent Pregnancy Loss – RPL, gọi chung cho sẩy

thai, thai chết lưu liên tiếp) là tình trạng bệnh lý ảnh hưởng nhiều tới tâm lý củangười phụ nữ và gia đình của họ Định nghĩa RPL chưa được thống nhất giữacác hiệp hội trên thế giới Theo Hiệp hội sinh sản và phôi thai Châu Âu(ESHERE) và Đại học Sản phụ khoa Hoàng gia (RCOG) , RPL là tình trạng mấtthai ba lần liên tiếp, bao gồm cả sẩy thai sinh hóa (chưa quan sát được) Tuynhiên, theo Hiệp hội Y học sinh sản Hoa Kì (ASRM), RPL được định nghĩa làmất thai lâm sàng từ hai lần trở lên (được ghi nhận bằng siêu âm hoặc kiểm tra

mô bệnh học) và không nhất thiết xảy ra “liên tiếp” Ngưỡng RPL từ ba lần mấtthai có thể được sử dụng trong những nghiên cứu dịch tễ học trong khi đó mấtthai từ hai lần trở lên cần được đánh giá về mặt lâm sàng (đặc biệt là với phụ nữ

> 35 tuổi) do tỷ lệ ngày càng tăng của các cặp đôi hiếm muộn, vô sinh Bêncạnh đó, một số nghiên cứu chỉ ra rằng nguy cơ sẩy thai, thai chết lưu tái diễnsau hai lần mất thai (là khoảng 24%-29%) tương tự hoặc thấp hơn đôi chút sovới nguy cơ sau ba lần mất thai (là khoảng 31%-33%) Nhằm mục đích đánhgiá và điều trị RPL cho phù hợp, những lần mất thai chỉ xác định trên thai kỳlâm sàng – nghĩa là có thai được xác định trên siêu âm hoặc mô bệnh học,không dựa trên xét nghiệm sinh hóa (định tính, định lượng beta hCG) RPL làvấn đề sức khỏe sinh sản quan trọng vì nó ảnh hưởng tới 2% - 5% các cặp vợchồng Tỷ lệ RPL thay đổi khá nhiều giữa các báo cáo bởi sự khác nhau vềđịnh nghĩa và tiêu chuẩn sử dụng cũng như đặc trưng về chủng tộc.

Nguyên nhân của RPL bao gồm các bất thường giải phẫu và bệnh lýcủa tử cung, cổ tử cung, yếu tố nội tiết, bệnh lý tự miễn, di truyền, nhiễmtrùng, Hội chứng kháng phospholipid (Antiphospholipid Syndrome - APS),yếu tố môi trường, thể chất, tâm lý và chất lượng tinh trùng (Bảng 1.1) Mặc

dù một số nguyên nhân của RPL đã được xác định, nhưng còn khoảng 38% 50% trường hợp vẫn chưa rõ nguyên nhân Chẩn đoán RPL chưa rõ nguyênnhân khi đánh giá lâm sàng và xét nghiệm về di truyền, giải phẫu, nội tiết,miễn dịch được thực hiện và kết quả trả lời bình thường (Bảng 1.1.)

đánh giá, đồng thời cân nhắc những biện pháp tư vấn, điều trị thích hợp Tuynhiên, các xét nghiệm di truyền trong thực hành lâm sàng vẫn còn thiếu và ítkhi bao gồm những phương pháp phân tử, điều hứa hẹn sẽ giúp tìm ra và loạitrừ những cơ chế dẫn tới RPL Bên cạnh các xét nghiệm, chẩn đoán hình ảnh

đã nêu, một số báo cáo, nghiên cứu khuyến cáo việc xét nghiệm thường quytrong y học lâm sàng đối với chứng ưa huyết khối di truyền

Hình 1.1 Nguyên nhân của mất thai tái diễn

Bảng 1.1 Nguyên nhân RPL và các xét nghiệm đánh giá

(2%-4%), đảo đoạn quanh tâm/ngoài tâm (hiếm gặp hơn)

Lệch bội ở phôi thai (trisomy, đa bội, monosomy X), bất thường NST giới tính, rối loạn đơn gen (Mendel),

di truyền đa nhân tố

NST đồ của bố mẹNST đồ của phôi, thai, rau (product of

conception)

Xét nghiệm di truyền phân tử (rối loạn đơn gen, đa gen…)

dịch đồng loại (truyền máu, ghéptạng,…)

Công thức máu, nhómmáu, Rh

tử cung (4,5%), polyp nội mạc tửcung (2%-3%), viêm nội mạc tử cungmạn tính

Siêu âm 3D, siêu âmbơm nước buồng tửcung, chụp tử cung-vòitrứng, nội soi buồng tử

Bất thường phát triển ống Muller(10%): vách ngăn, hở eo, tử cungmột sừng, tử cung hai sừng, tử cungđôi.

Cổ tử cung không toàn vẹn (sauphẫu thuật hoặc bẩm sinh)

cung, MRI, sinh thiếtnội mac tử cung

anticardiolipin (aCL), Anti-β2Glycoprotein 1,chống đông lupus (LA)

Nhiễm trùng Listeria monocytogenes,

Toxoplasma gondii, Rubella, Herpessimplex virus, sởi, Cytomegalo virus (CMV), Coxackie virus

buồng chứng đa nang, tiểu đường không kiểm soát, bất thường pha hoàng thể

Prolactin, TSH, Glucose máu hoặc HbA1c, progesterone giữa pha hoàng thể

trùngMôi trường

và yếu tố thể

chất, tâm lý

Béo phì (BMI>30kg/m2), trầm cảm, lo

âu Hút thuốc, nghiện rượu, cocaine,

sử dụng quá nhiều cafein (>300mg/ngày)

1.2 Chứng ưa huyết khối di truyền (Inherited Thrombophilia - IT)

ưa huyết khối có thể dẫn tới sự hình thành các cục máu đông trong lòng tĩnhmạch hoặc động mạch Triệu chứng có thể biểu hiện khi huyết khối hìnhthành tại chỗ hoặc di chuyển tới một bộ phận khác của cơ thể như phổi, não.Chứng ưa huyết khối ảnh hưởng tới nhiều người ở các độ tuổi khác nhau, tuynhiên thường được nhận biết khi trưởng thành do sự thay đổi mang tính chấtsinh lý ở hệ đông máu khi con người lớn lên và già hóa Cả nam giới và nữgiới đều có thể mắc chứng ưa huyết khối nhưng phụ nữ thường có xu hướngbiểu hiện các triệu chứng nhiều hơn do tình trạng mang thai và sử dụng cácthuốc tránh thai

Chứng ưa huyết khối có thể do di truyền và/hoặc do mắc phải Chứng

ưa huyết khối mắc phải thường gặp là APS, đặc trưng bởi sự hình thành huyếtkhối và sự hiện diện của chất chống đông lupus và kháng thể gắnphospholipid APS có tiêu chuẩn để chẩn đoán và việc sử dụng thuốc chốngđông để dự phòng và điều trị đã được nhiều nghiên cứu chứng minh tính hiệu

quả Chứng ưa huyết khối di truyền (Inherited thrombophilia – IT) bao

gồm một nhóm những bất thường về yếu tố tiền đông máu, yếu tố đông máudẫn tới tăng nguy cơ thuyên tắc tĩnh mạch, do các đột biến gen/đa hình gengây ra, bao gồm đột biến yếu tố V Leiden (Factor V Leiden - FVL), đột biếngen prothrombin (yếu tố II) G20210A, đột biến Methyltetrahydrofolatereductase (MTHFR), đột biến gen PAI – 1 4G/5G (SERPINE1), tăng yếu tốđông máu VIII trong huyết tương và thiếu những chất chống đông nội sinhnhư antithrombin (AT), protein C, protein S , thrombomodulin và annexin A5

1.2.2 Mối liên quan của chứng ưa huyết khối di truyền và mất thai tái diễn

Để có một thai kỳ thành công đòi hỏi sự cân bằng cả về tình trạng đôngmáu và ly giải fibin, nhằm tạo ra sự ổn định tại vị trí mà thai làm tổ cũng như

sự cấp máu đầy đủ cho nhau thai Mang thai là tình trạng tăng đông máu sinh

lý, thể hiện những thay đổi về con đường đông cầm máu: giảm các yếu tốchống đông máu như Protein S, giảm protein C hoạt hóa ở quý 3, giảm PAI-1(chất ức chế sự hoạt hóa plasminogen) và tăng các yếu chố tiền đông máu nhưtăng yếu tố II, V, VII, VIII, IX, X, tăng fibrinogen, tăng D-dimer, tăng hoạthóa tiểu cầu hệ thống ở giai đoạn muộn thai kì Tình trạng tăng đông này diễn

ra trong suốt thời kì có thai và đạt đỉnh lúc chuyển dạ Bản thân rau thai cũng

có đặc tính tiền đông máu với nồng độ cao của yếu tố mô (tissue factor) biểuhiện ở những tế bào lá nuôi (trophoblast) Tuy nhiên, cũng có những cơ chế

ức chế chống đông như thụ thể protein C biểu mô (EPCR), thrombomodulin,annexin V và chất ức chế con đường yếu tố mô, chất này tăng từ tuần thứ 10của thai kì Chứng tăng đông dẫn đến nguy cơ thuyên tắc tĩnh mạch, đây lànguyên nhân hàng đầu gây tử vong mẹ Bên cạnh đó, có thể dẫn tới rất nhiềubiến chứng sản khoa bao gồm thai chậm phát triển trong tử cung (Intrauterinegrowth restriction - IUGR), mất thai, tiền sản giật, bong rau, tổng cộng ảnhhưởng tới 15% các trường hợp có thai

Bảng 1.2 Mối liên quan của một số đột biến gen liên quan tới chứng ưa

huyết khối di truyên và các biến chứng sản khoa

Tiền sảngiật

Bongrau

(1,32-1,9 (0,4– 9,69)

1,87(0,44-7,88)

8,43(0,41 –171,2)

4,64(0,19 –115,68)

(1,09 –2,58)

2,06(1,1 –3,86)

2,19(1,46 –3,27)

4,7(1,13-19,59)

2,68(0,59 –12,13)

5.53)

2.54(1.52–

4.23)

7.71(3.01–

19.76)

2.92(0.62–13.70)Đòng hợp

MTHFR

C677T

5–25

1.40(0.77–

2.55)

1.31(0.89–

1.91)

1.37(1.07–

1.76)

1.47(0.40–

5.35)

1.24(0.84–1.82)

Lần đầu tiên giả thuyết chứng ưa huyết khối di truyền có thể liên quantới tình trạng mất thai tái diễn được kiểm định bằng nghiên cứu thuần tập tiếncứu về chứng ưa huyết khối ở người châu Âu (EPCOT) do Preston và cộng sựthực hiện năm 1996 Các tác giả quan sát thấy sự tăng nguy cơ mất thai ở phụ

nữ mắc chứng ưa huyết khối di truyền Cũng ở nghiên cứu này thấy rằng có

sự khác nhau về định nghĩa RPL (có nghiên cứu lấy ngưỡng RPL từ hai lầntrở lên, nghiên cứu khác sử dụng ngưỡng từ ba lần trở lên, một số tính cả sẩythai sinh hóa trong khi số khác chỉ tính những lần mất thai trước 20 tuần) vàphân nhóm tuổi thai bị sẩy giữa các nghiên cứu Mối liên quan chặt chẽ chỉđược xác định cho FVL, đột biến yếu tố II, và thiếu protein S ở những trườnghợp mất thai tái diễn hoặc đơn phát Thiếu protein C và thiếu antithrombin

không được xác định có mối liên quan với RPL Một phân tích tổng hợp gồm

37 nghiên cứu bệnh – chứng và 18 công bố liên quan tại Iran được khảo sát,thấy rằng những đột biến gen liên quan đến IT (FVL G1691A, ProthrombinG20210A, MTHFR C677T, MTHFR A1298C, PAI-1 4G/5G) dẫn tới nguy cơcao RPL ở người Iran

Cơ chế bệnh sinh đều liên quan tới bất thường hệ thống mạch máu củanhau thai và sự rối loạn về tình trạng đông – cầm máu dẫn tới tuần hoàn nhauthai – mẹ không đầy đủ Nghiên cứu cho thấy máu mẹ bắt đầu đi vào bêntrong khoang giữa các lông nhung của nhau thai lúc thai khoảng 10 tuần Điềunày cũng phù hợp khi mối liên kết giữa chứng ưa huyết khối và mất thai trên

10 tuần rõ ràng hơn so với trước 10 tuần Tuy nhiên, sự vận chuyển chất dinhdưỡng từ máu mẹ tới mô thai phụ thuộc vào dòng máu tử cung, và vì thế cóthể bị ảnh hưởng bởi hiện tượng cục máu đông hình thành tại đây, điều nàygợi ý vai trò của chứng ưa huyết khối đối với tình trạng mất thai không liênquan tới tuổi thai

Tỷ lệ của chứng ưa huyết khối di truyền ở người phương Tây nói chungước tính xấp xỉ 15% Tuy nhiên, tỷ lệ này có sự thay đổi đáng kể theo vùngđịa lý và dân tộc Việc phân tích và làm sáng tỏ nguyên nhân của RPL liênquan tới chứng ưa huyết khối có ý nghĩa quan trọng bởi vì tính sẵn có củanhững biện pháp điều trị sớm và có thể mang lại hiệu quả Trong một bàitổng hợp nghiên cứu (review) vào năm 2006, có 8 nghiên cứu cho thấy tínhhiệu quả của việc sử dụng aspinrin liều thấp và heparin trọng lượng phân tử

thấp (Low-Molecular-Weight Heparin - LMWH) trong việc dự phòng mất

thai ở thai phụ mắc chứng ưa huyết khối di truyền Liệu pháp chống đông cókhả năng cải thiện kết quả mang thai ở những phụ nữ IT Điều đó dẫn tới việc

mở rộng sàng lọc và điều trị cho phụ nữ IT Một số bác sĩ sản khoa ngày nayđưa ra liều chống đông dự phòng của LMWH cho những thai phụ có tiền sử

mắc một số biến chứng sản khoa, đăc biệt là sẩy thai liên tiếp hoặc tiền sử thaichết lưu Điều này dựa trên những bằng chứng xét nghiệm về bất thường tìnhtrạng đông máu hoặc những thay đổi đông máu của những mẫu nhau thaibệnh lý ở những lần mang thai bị tác động Có những bằng chứng rõ ràng vềlợi ích của việc sử dụng aspirin và LMWH ở những đối tượng APS và RPL,

nó làm tăng tỷ lệ con sinh sống Tuy nhiên, để có được lợi ích nhiều nhất từbiện pháp điều trị này, thuốc phải được sử dụng sớm, lý tưởng nhất là lúc 6tuần thai, trước khi sự xâm nhập của các tế bào lá nuôi nguyên thủy hoànthành, mặc dù liệu pháp vẫn có tác dụng tới tuần thứ 18 thai kì khi pha xâmnhập thứ cấp vào cơ tử cung hoàn chỉnh Việc điều trị cho phụ nữ RPL có ITcũng dựa trên cơ sở ấy Do đó, việc sàng lọc chứng ưa huyết khối (mắc phảivà/hoặc di truyền) ở đối tượng RPL là cần thiết trước khi sử dụng LMWH.Hiện nay, nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên (ALIFE-2) được thiết

kế chung cho các nhóm nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới cùng thực hiện,với hi vọng cung cấp thêm bằng chứng cũng như đưa ra khuyến cáo cụ thểcho việc sử dụng LMWH ở các đối tượng này Bênh cạnh đó, một số nghiêncứu về dinh dưỡng – di truyền học gợi ý việc sử dụng các dẫn xuất của acidfolic cho những đối tượng RPL có đa hình gen MTHFR

1.2.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán và sàng lọc IT

Hiện nay, chẩn đoán IT chủ yếu dựa vào xét nghiệm các đột biến/đahình gen bao gồm đột biến yếu tố V Leiden, đột biến yếu tố II G20210A, độtbiến MTHFR, đa hình gen PAI-1 4G/5G, định lượng yếu tố VIII, Protein C,Protein S, Antithrombin trong máu Sàng lọc chứng ưa huyết khối nên đượccân nhắc dựa vào tiền sử tắc mạch của bệnh nhân, gia đình và tiền sử sản khoa

IT được nghĩ đến khi một bệnh nhân có những lần tắc tĩnh mạch (VTE) tái diễnhoặc tắc mạch nặng đe dọa tính mạng, có tiền sử gia đình về tắc tĩnh mạch ở độ

tuổi dưới 45 mà không có những yếu tố nguy cơ mắc phải rõ ràng, hoặc phụ nữvới tiền sử nhiều lần sẩy thai, thai chết lưu

Một số nghiên cứu gợi ý việc sàng lọc FVL và đột biến yếu tố II cho tất

cả phụ nữ RPL Sergi và cộng sự tiến hành nghiên cứu phân tích gộp 9 nghiêncứu bệnh – chứng với nhóm bệnh (1305) là phụ nữ có từ hai lần sẩy thai quý Itrở lên và nhóm chứng (842) tương đương về tuổi và chủng tộc, có tiền sử sảnkhoa bình thường và có ít nhất một con, kết luận đột biến FVL làm tăng nguy

cơ RPL sớm (xảy ra ở quý 1 thai kì) và gợi ý việc sử dụng thuốc chống đông

dự phòng ở những đối tượng này Nghiên cứu của Isaoglu và cộng sự năm

2014 tại Thổ Nhĩ Kỳ cũng tìm thấy mối liên quan giữa FVL và đột biến yếu tố

II G20210A với RPL Nghiên cứu phân tích gộp (27 nghiên cứu) củaXiaoming Wu và cộng sự năm 2012 cũng chỉ ra mối liên quan của đột biếnMTHFR C677T với việc tăng nguy cơ RPL, ngoại trừ đối với người da trắng Trong khi đó, nghiên cứu của Salazar Garcia và cộng sự tại Trung tâm y họcsinh sản thuộc Bệnh viện Y khoa Chicago Mỹ năm 2016 thì chỉ ra tỷ lệ caohơn có ý nghĩa thống kê đột biến PAI-1 4G/3G ở đối tượng RPL do nhữngthay đổi về chuyển hóa và miễn dịch Với những kết quả nghiên cứu đã đượccông bố thì việc sàng lọc thiếu protein C, thiếu protein S và thiếu AT chỉ nênthực hiện ở những phụ nữ có tiền sử tắc tĩnh mạch sâu Sàng lọc toàn diệnchứng ưa huyết khối (bao gồm thiếu AT, protein C, protein S, đột biến gendẫn đến kháng protein C hoạt hóa (APC)), đột biến gen prothrombin, khángyếu tố lupus và kháng kháng thể cardiolipin) nên được thực hiện đối với phụ

nữ RPL có các đột biến FVL hoặc đột biến yếu tố II G20210A được chẩnđoán trước đó, bởi vì sự tồn tại đồng thời của những đột biến này và nhữngbất thường gen khác sẽ làm tăng đáng kể nguy cơ thuyên tắc tĩnh mạch sâu vàcác biến chứng sản khoa

1.2.4 Một số độ biến gen liên quan tới chứng ưa huyết khối di truyền

1.2.4.1 Đột biến yếu tố V

Gen quy định tổng hợp yếu tố đông máu V nằm trên NST 1q23 Kýhiệu gen là F5 Đột biến yếu tố V Leiden (FVL) là sự thay thế Guanin thànhAdenin ở vị trí 1691 trên gen F5 làm thay đổi 1 acid amin Arginin thànhGlutamin ở vị trí 506 trong yếu tố Va, khiến cho yếu tố Va khó phân mảnh ở

vị trí R506Q dưới tác động của protein C hoạt hóa (activated protein C –APC), đây được gọi là tình trạng kháng protein C hoạt hóa (APCR) Từ đó,dẫn tới kéo dài/ tăng cường sự hình thành của thrombin, gây ra nguy cơ caohuyết khối tĩnh mạch Dạng dị hợp làm tăng nguy cơ huyết khối tĩnh mạchlên 5-8 lần, dạng đồng hợp làm tăng nguy cơ tắc tĩnh mạch lên 50-80 lần Biểu hiện lâm sàng thay đổi tùy vào kiểu gen dị hợp hay đồng hợp, những rốiloạn di truyền khác kèm theo, những bệnh lý mắc phải và các yếu tố nguy cơ.FVL chiếm 40 – 50% chứng ưa huyết khối di truyền, với tỷ lê dị hợp là 3 –8% ở Mỹ và Châu Âu, lên tới 8,8% ở người Anh da trắng Đột biến này ditruyền trội trên nhiễm sắc thể thường với tính thấm không hoàn toàn FVL cómối liên quan chặt chẽ với với sẩy thai, thai chết lưu nhiều lần và đượckhuyến cáo sàng lọc ở phụ nữ RPL Bên cạnh đó, những cặp đôi RPL không

rõ nguyên nhân mà người nam mang đột biến FVL cũng sẽ làm tăng nguy cơRPL lên 6 lần Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng LMWH ở các phụ nữ cómang FVL và/hoặc đột biến yếu tố II G20210A giúp làm giảm nguy cơ gặpcác biến chứng xấu trong thai kỳ cũng như thuyên tắc tĩnh mạch

Hình 1.2 Con đường đông máu và hệ thống chống đông thông qua

Protein C hoạt hóa (APC)

Chú thích: TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor): chất ức chế con đường yếu tố mô;

TM: thombodulin; PC: protein C; PS: protein S; AT: antithrombin; Fbg: fibrinogen, Fb: fibrin EPCR (endothelial protein C receptor: thụ thể protein C trên tế bào nội mô).

Đột biến A4070G (hay H1299R; FVR2) ở exon 13 của gen F5, thay thếHistamin (alen R2) bởi Arginin tại vị trí 1299, thường được xem xét ở nhữngbệnh nhân mang kiểu gen dị hợp FVL nhằm đánh giá kỹ hơn về nguy cơhuyết khối và góp phần vào quyết định dùng thuốc chống đông ở những bệnhnhân này, bởi đột biến này liên quan tới việc làm gia tăng sự kháng APC cũngnhư nguy cơ huyết khối khi mang dị hợp tử kép hai đột biến này

1.2.4.2 Đột biến yếu tố II G20210A

Gen F2 mã hóa cho yếu tố đông máu II hay prothrombin, mộtglycoprotein phụ thuộc vitamin K, được tổng hợp ở gan ở dạng các hạtzymogen bất hoạt Gen này nằm trên NST 11p11 Prothrombin được hoạt hóathành thrombin nhờ yếu tố Xa cùng với sự hiện diện của phospholipid, calci

và yếu tố Va Thrombin hoạt hóa đóng vai trò quan trọng trong hệ đông

cầm-máu, nó chuyển fibrinogen thành fibrin để hình thành cục máu đông, kíchthích sự ngưng tập tiểu cầu, và hoạt hóa yếu tố V, VIII, XIII Thrombin cũng

ức chế đông máu bằng hoạt hóa protein C

Đột biến điểm G20210A ở vùng 3’ không phiên mã của genprothrombin liên quan tới sự tăng nồng độ prothrombin huyết tương (150 –200%), thúc đẩy sự hình thành thrombin và làm giảm sự bất hoạt yếu tố Vabởi APC Thể đồng hợp của đột biến gen prothrombin gây ra nguy cơ huyếtkhối tương đương với thể đồng hợp FVL Theo phân tích gộp 37 nghiên cứubệnh – chứng của Gao H và cộng sự năm 2015 thì thấy mỗi liên quan củaG20210A và RPL (với định nghĩa từ hai lần sẩy thai, thai chết lưu trở lên) làđáng kể với tỷ lệ gặp ở nhóm RPL cao gần gấp 2 lần so với nhóm chứng, đặcbiệt ở người châu Âu và phụ nữ trên 29 tuổi Đột biến này làm tăng nguy cơRPL và cũng được khuyến cáo nên sàng lọc ở đối tượng RPL

1.2.4.3 Đột biến gen MTHFR

MTHFR là ký hiệu gen tổng hợp enzyme Methylentetrahydrofolatreductase (tên thường gọi là NAD(P)H), gen này nằm trên đoạn cuối nhánh ngắnNST số 1 (1p36.3) gồm 11 exon với độ dài là 2220 cặp base MTHFR có vai tròquan trọng trong việc chuyển 5,10 MTHF thành 5-MTHF - chất nhận methylđầu tiên trong chu trình chuyển hóa homocystein - methinonin Enzyme này cóvai trò quan trọng trong chuyển hóa folat; thiếu acid folic hoặc bất thườngMTHFR đã cho thấy sự giảm methyl hóa DNA và những thay đổi bất thường

về sinh hóa và/hoặc kiểu hình ở thí nghiệm trên động vật, nuôi cấy tế bào vàtrên người

Hình 1.3 Chu trình methionin-homocystein

Hiện nay có khoảng 40 loại đột biến gen MTHFR đã được phát hiện.Trong đó, có hai loại đột biến gặp nhiều hơn cả và được nghiên cứu nhiềunhất là C677T và A1298C Đột biến MTHFR C677T xảy ra ở exon 4, dẫn tới

sự thay thế valine thành alanine tại codon 222 Đột biến MTHFR A1298C xảy

ra ở exon 7 dẫn đến thay thế glutamate thành alanine tại codon 429 Cả haiđột biến này đều làm giảm hoạt tính của enzyme (Bảng 1.3), từ đó làm giảmtổng hợp 5-MTHF, dẫn tới tăng nồng độ homocystein huyết tương – một yếu

tố nguy cơ của huyết khối mạch máu, liên quan đến các bệnh lý nhau thai,tiền sản giật và RPL Đồng hợp đột biến gen MTHFR C677T có nồng độhomocystein huyết tương cao hơn trong khi thể dị hợp chỉ làm tăng nhẹhomocystein so với nhóm bình thường, không đột biến

Bảng 1.3 Hoạt độ enzyme MTHFR tương ứng với các đột biến gen

A1298C và C677T

(Bình thường)

677CT(Dị hợp)

677TT(Đồng hợp)1298AA

(Bình thường)

100%

Hoạt độngenzyme

1298AC

1298CC

Khi cơ thể thiếu methylenetetrahydrofolate reductase, khả năng hấp thuacid folic bị ức chế Acid folic cần thiết cho sự phát triển và sự khỏe mạnh củathai nhi Do đó nếu mất chức năng của gen này có thể dẫn đến nhiều biếnchứng trong thai kỳ như bất thường bẩm sinh Đột biến MTHFR liên quan tớibệnh homocystein niệu, nguy cơ dị tật ống thần kinh, tật sứt môi, hở hàm ếch ởthai nhi Một số nghiên cứu chỉ ra mối liên quan của các đột biến này với việclàm tăng nguy cơ RPL , và việc xác định đột biến MTHFR C667T có một số ýnghĩa trong việc phòng RPL ở những đối tượng nguy cơ cao trong khi một sốnghiên cứu khác lại không tìm thấy mối liên quan này Bên cạnh đó, đột biếnMTHFR C677T còn liên quan tới nhiều bệnh lý khác như bệnh chuyển hóa,rối loạn tâm thần, ung thư và vô sinh nam Một số nghiên cứu khuyến cáo sửdụng dạng hoạt động 5-MTHF thay vì dùng acid folic để bổ sung cho nhữngngười mang đột biến gen MTHFR Hoặc gợi ý bổ sung vitamin B12 cho nhữngngười mang đột biến MTHFR C677T nhằm phòng RPL

1.2.4.4 PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor – 1/SERPINE1)

Chất ức chế hoạt hóa plasminogen loại 1 (Plasminogen activator

inhibitor-1/ PAI-1), là một glycoprotein 55kd được tổng hợp bởi tế bào biểu

mô, tế bào gan và mẫu tiểu cầu có hạt PAI-1 có tác dụng như một chất ức chếhoạt động ly giải fibrin nội sinh do khả năng ức chế chất hoạt hóaplasminogen mô (tPA) và chất hoạt hóa plasminogen dạng urokinase (uPA) Gen mã hóa cho PAI-1 nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q21.3-q22.1) và chứa 8intron và 9 exon Vùng promoter PAI-1 gồm ít nhất 2 alen tạo ra vùng cặpbase 4G hoặc 5G, định khu cách vị trí bắt đầu phiên mã -675bp Alen 5G bìnhthường cho phép gắn cả chất hoạt hóa phiên mã và những yếu tố ức chế saochép trong khi alen 4G quá nhỏ để gắn những yếu tố ức chế này, dẫn đếnnhững người mang dạng đồng hợp 4G/4G có nồng độ PAI-1 trong máu tănggấp 5 lần so với người mang alen 5G/5G hoặc 5G/4G Khi nồng độ PAI-1tăng sẽ làm giảm quá trình ly giải fibrin dẫn đến tăng nguy cơ huyết khốimạch máu PAI-1 cũng là yếu tố nguy cơ quan trọng đối với bệnh mạch vành,nhồi máu cơ tim và sẩy thai tái diễn

Hình 1.4 Tác động của PAI-1 và yếu tố XIII lên sự

hình thành và ly giải fibrin

Một số nghiên cứu báo cáo tần số cao hơn đáng kể của PAI-1 4G/5G ởnhững bệnh nhân RPL hoặc nguy cơ cao mất thai ở những bệnh nhân PAI-1

4G/4G và đưa ra khuyến cáo nên sàng lọc đột biến này ở phụ nữ RPL Thểđồng hợp tương đối phổ biến và làm tăng nguy cơ ở mức trung bình đối vớithuyên tắc mạch, sẩy thai, thai chết lưu, thai chậm phát triển trong tử cung,

mối liên quan của đột biến gen này với RPL hoặc chỉ có ý nghĩa đối vớingười da trắng

1.2.4.5 Đột biến Val34Leu yếu tố XIII

Yếu tố đông máu XIII được biết đến là yếu tố ổn định fibrin, đóng vaitrò quan trọng trong sự hình thành rau thai và điều hòa trạng thái đông – cầmmáu Yếu tố XIII được cấu tạo bởi 4 chuỗi A2B2, bao gồm 2A và 2B Phânđơn vị A có hoạt tính xúc tác với tác dụng kháng sự li giải fibrin thông qualiên kết chéo ban đầu trong mạng lưới fibrin và gen quy định tổng hợp phânđơn vị A nằm trên NST 6p24-p25 Phân đơn vị B không có hoạt tính xúc tác

và gen quy định tổng hợp phân đơn vị này nằm trên NST 1q31-32.1 Sự thaythế Guanin bởi Thymin trong exon 2 của gen mã hóa yếu tố XIII (FXIII) dẫnđến sự thay thế Leucin cho Valine tại amino acid 34 Đột biến yếu tố XIIIVal34Leu làm giảm nồng độ fibrinogen huyết tương và có thể ảnh hưởng tớicấu trúc mạng lưới fibrin cũng như ức chế quá trình ly giải fibrin Phân tíchgộp kết quả của 9 nghiên cứu khác do Li và cộng sự thực hiện vào tháng5/2015 ở Trung Quốc cho thấy FXIII Val34Leu có mối quan hệ chặt chẽ vớisẩy thai tái diễn Alen Val không đột biến có thể có tác dụng bảo vệ đối vớiRPL Tỷ lệ phụ nữ RPL mang kiểu gen đột biến FXIII và PAI-1, hoặc kết hợp

cả hai loại này cao hơn so với nhóm phụ nữ không bị RPL Tuy nhiên, cũng

có một số nghiên cứu không tìm thấy mối liên quan giữa đột biến này với sẩythai, thai chết lưu liên tiếp

1.2.4.6 Endothelial protein C receptor - EPCR

Một con đường đông máu khác liên quan tới thụ thể của protein C ở tếbào nội mô (endothelial protein C receptor - EPCR) có thể làm thay đổi nguy

cơ huyết khối khi đi kèm với những kiểu gen trên Một số tổ hợp gen(haplotype) EPCR làm tăng nồng độ protein C hoạt hóa, góp phần làm thayđổi sự bình thành của thrombin bằng con đường chống đông của protein C Trong đó đột biến 4678G>C (haplotype A1) làm giảm nguy cơ tạo huyếtkhối Tỷ lệ alen 4600A/G (haplotype A3) liên quan với sự tăng nồng độEPCR hòa tan (soluble EPCR – sEPCR) huyết tương, tuy nhiên mối liên quancủa nó với nguy cơ huyết khối vẫn còn chưa rõ ràng

1.2.5 Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết

khối di truyền

Có một số kít thương mại sẵn có trên thị trường giúp phát hiện một sốđột biến gen liên quan tới IT Các kỹ thuật được áp dụng như PCR – RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisms), lai phân tử (Hybridization),giải trình tự gen (Sequencing)

1.2.5.1 Kĩ thuật lai phân tử

Hình 1.5 Minh họa nguyên lý phương pháp lai phân tử

DNA sau khi được tách chiết sẽ được khuếch đại các trình tự đích vàgắn biotin qua phản ứng PCR đa mồi Sản phẩm PCR sẽ được lai có chọn lọc

trên thanh lai Trên thanh lai có các đoạn dò ologonucleotide (wide type vàđột biến) được cố định trên các đường kẻ song song (parallel lines) Các trình

tự gắn biotin được phát hiện nhờ streptavidine-alkaline phosphatase và cơ

chất màu Xét nghiệm lai phân tử cho phép phát hiện cả trình tự đột biến và

bình thường (wild type), từ đó xác định kiểu gen đồng hợp hoặc dị hợp củabệnh nhân

Bảng 1.4 Một số gen liên quan đến IT được phát hiện với phương pháp

lai bằng bộ kít CVD-T StripAssay (ViennaLab) STT Tên đột biến gen (ký hiệu) Mô tả về đột biến gen Vị trí trên NST

1 Đột biến yếu tố V Leiden

1.2.5.2 Kĩ thuật PCR – RFLP (Hiện tượng đa hình về chiều dài của các đoạn

DNA)

Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp này để xác định các đa hìnhgen như MTHFR, PAI-1 4G/5G DNA sau khi được tách chiết sẽ được thựchiện phản ứng PCR để khuếch đại trình tự đích Sau đó, sản phẩm PCR này sẽđược xử lý bằng enzyme cắt giới hạn Cuối cùng, sản phẩm PCR này sẽ đượcphân tích bằng điện di trên thạch agarose Phương pháp này đơn giản, ít tốnkém

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

72 phụ nữ có tiền sử sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp đến Trung tâmChẩn đoán trước sinh Bệnh viện Phụ Sản Trung ương và Trung tâm Tư vấn ditruyền – Bệnh viện đại học Y Hà Nội từ 01/9/2015 đến 31/8/2017

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân:

- Bệnh nhân có tiền sử sẩy thai, thai chết lưu (thai lâm sàng) liên tiếp từhai lần trở lên

- Các lần có thai là thai tự nhiên hoặc sau hỗ trợ sinh sản (IUI, IVF,…)

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân:

- Bệnh nhân đã phát hiện nguyên nhân dẫn tới tình trạng mất thai táidiễn:

 Bất thường nhiễm sắc thể vợ chồng dẫn tới RPL

 Bất thường tử cung: hở eo tử cung, tử cung đôi, tử cung một sừng,vách ngăn tử cung, hội chứng Asherman,…

 Bất thường nội tiết tố: suy tuyến yên, suy giáp, tăng prolactin máu,rối loạn pha hoàng thể

 Bệnh lý mạn tính: tiểu đường, béo phì

2.2 Địa điểm lấy mẫu và phân tích mẫu

Mẫu máu được thu thập và phân tích tại Trung tâm Chẩn đoán trướcsinh Bệnh viện Phụ Sản Trung ương và Trung tâm Tư vấn di truyền – Bệnhviện Đại học Y Hà Nội

2.3 Phương tiện nghiên cứu

2.3.1 Dụng cụ

- Các máy: Máy luân nhiệt, máy ủ lắc (Thermo-shaker), máy ủ(Incubator/heating block), máy lắc/trộn (Shaker), máy ly tâm với tốc độtối đa 14.000 vòng/phút, máy votex, máy điện di, máy đo nồng độ DNANanoDrop

giấy thấm Tủ lạnh âm sâu, tủ lạnh thường

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

Tiến cứu, mô tả cắt ngang

2.4.2 Cỡ mẫu

Cỡ mẫu thuận tiện (toàn thể) trong thời gian nghiên cứu từ 01/9/2015

2.4.3 Phương pháp tiến hành nghiên cứu

- Chọn bệnh nhân theo tiêu chuẩn và khai thác thông tin

- Thực hiện xét nghiệm

- Thu thập và xử lý số liệu, đưa ra kết quả và bàn luận

2 PCR lại

1.Điện di lại

Tạm dừng Tạm dừng Dừng

Chụp ảnh băng điện di trong buồng UV

FV G169A (Leiden),

FV H1299R (R2), Prothrombin G20210A, MTHFR C677T và A1298C FXIII V34L, PAI-1 4G/5G, EPCR A4600G

và G4678C.

Phản ứng chuỗipolymerase (PCR)

Tiếp tục chạy 10 phút

Gắn DNA vào màng lai

Rửa sạch sản phẩm DNA thừa & dung dịch lai thừa Gắn cơ chất

Hiện band và phân tích kết quả 9 đột biến

EDTA

- Bảo quản mẫu máu ở 0 - 4 độ C dưới 1 tuần trước khi tách chiết DNA

- Bảo quản mẫu máu ở - 20 độ C nếu tách chiết sau 1 tuần lấy mẫu

2.4.4.2 Tách chiết DNA bằng kít Promega (Quy trình chi tiết tại Phụ lục 1)

-Dùng Proteinase K để thủy phân protein

Lysis Buffer

-Trộn kỹ hỗn dịch trên, sau đó ủ ở 56 độ C trong 10 phút để làm tăng phảnứng thủy phân protein

cột lọc (Column), giúp làm tăng khả năng giữ lại DNA trên màng silicat củacột lọc

loại bỏ các thành phần không phải DNA

và bảo quản ở -4 độ C

2.4.4.3 Đo nồng độ và đánh giá độ tinh sạch của DNA sau tách chiết bằng

máy NanoDrop.

chứng trước khi đo DNA

đọc của máy và tiến hành đo sau khi đã ghi tên mẫu

-Đọc kết quả hiển thị trên màn hình

 Độ tinh sạch cần đạt: OD A260/280: 1,7 – 2,0; OD A260/230: 1,7

- 2,0

2.4.4.4 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) (Quy trình chi tiết tại Phụ lục 2)

- Mỗi bệnh nhân có một tuýp PCR bao gồm:

- Cho tuýp PCR vào máy luân nhiệt đã được cài đặt chương trình

- Bảo quản sản phẩm PCR ở nhiệt độ 2 – 8 độ C

2.4.4.5 Điện di đánh giá sản phẩm PCR

- Đây là bước quan trọng để xác định chất lượng sản phẩm PCR có đạtyêu cầu để tiến hành lai phát hiện đột biến Sản phẩm PCR đạt yêu cầu khi có

đủ các băng điện di tương ứng với các kích thước: 134, 165, 173, 202, 223,

254, 283, 324 cặp bazơ Sản phẩm PCR không đạt yêu cầu khi thiếu bất kìbăng điện di nào đã nêu ở trên

- Sản phẩm PCR là các đoạn DNA có kích thước nhỏ nên điện di đãđược thực hiện trên thạch Agarose đặc (3%) với cường độ 110mA và hiệuđiện thế 220V Để tối ưu chất lượng các băng xuất hiện, chúng tôi hoàn thiệnquy trình với 3 nhóm thời gian chạy điện di: 45 phút, 55 phút và 65 phút

- Để quan sát hình ảnh DNA khi điện di, chúng tôi nhuộm DNA bằngethidium bromide, dưới ánh sáng tử ngoại, DNA gắn với ethidium bromide sẽphát sáng Thời gian điện di tối ưu là thời gian cho hình ảnh sản phẩm PCRvới các băng rõ nét nhất, tách biệt các băng rõ ràng nhất

Các bước thực hiện:

- Chuẩn bị điện di:

- Rửa sạch buồng điện di và cho dung dịch TBE vào buồng điện di

- Đặt thạch Agarose 3% vào buồng điện di

- Nhỏ sản phẩm PCR đã được trộn với “loading dye” vào các giếngtheo thứ tự

- Cài đặt chế độ điện di:

 Cường độ: 110mA; Hiệu điện thế 220V

 Thời gian chạy điện di

2.4.4.6 Lai sản phẩm PCR để phát hiện đột biến (Hybridization) (Quy trình

chi tiết tại Phụ lục 2)

- Bước lai: Trộn DNA sau khi PCR (DNA đã được gắn biotyl) với DNAT(màu xanh) tại khay lai theo thứ tự mẫu đã được đánh dấu Cho dung dịch lai(Hybridization) đã được rã đông hoàn toàn vào, hỗn hợp trên sẽ chuyển thànhkhông màu Cho thanh lai vào mỗi khay lai Sau đó, khay lai được đặt vàomáy Thermo-shaker đã cài đặt nhiệt độ 45oC trong 30 phút

- Bước rửa:

Conjugate vào rồi để khay lai trên máy lắc 15 phút ở nhiệt độ phòng

 Rửa lần 2 với Wash Solution B (3 lần), ở nhiệt độ phòng

- Bước nhuộm: Cho dung dịch Color Developer vào, để khay lai trênmáy lắc 15 phút trong buồng tối tại nhiệt độ phòng Sau đó rửa thanh lai vớinước cất 2-3 lần và để khô trong buồng tối

1.4.5 Đọc kết quả

- Kết quả lai đạt là khi đáp ứng tất cả các tiêu chuẩn sau:

 Vạch xanh/Green Marker Line hiện màu (dương tính) cho thấy sảnphẩm PCR đạt (chỉ âm tính trong trường hợp “chứng âm” là nước)

 Vạch chứng/Control ngay bên dưới vạch đỏ/Red Marker Line, luôndương tính, cho thấy hiệu quả của phản ứng lai màu (hiệu quả của hóachất Conjugate Solution và Color Developer)

 Các băng lai lên màu tương đương (tính chất đậm nhạt có thể thay đổi)với màu của băng Control hoặc không lên màu

 Đối với mỗi đột biến thì luôn có ít nhất 1 băng lai lên màu (băng lai độtbiến (mutant) và băng lai bình thường (wild type))

-Đối với các kết quả lai đạt, xác định được 9 đột biến gen: FV G169A(Leiden), FV H1299R (R2), Prothrombin G20210A, MTHFR C677T,MTHFR A1298C, FXIII V34L, PAI-1 4G/5G, EPCR A4600G, EPCRG4678C.

vị trí các băng chuẩn trên Thanh lai mẫu (Hình 2.3)

Hình 2.2 Thiết kế thanh lai mẫu

-Dán thanh lai vào vị trí đã được thiết kế, với vạch đỏ phía trên và vạchxanh ở phía dưới, các băng thẳng hàng với các băng tương ứng trên thanh lai mẫu

hợp, đồng hợp (Hình 2.4.) Nếu cả hai băng lai “đột biến” và “bình thường”không lên là kết quả không đạt

Hình 2.3 Các kết quả lai có thể gặp đối với mỗi đột biến

Hình 2.4 Cách đọc kết quả các Haplotype của gen EPCR

2.5 Xử lý số liệu

- Xử lý số liệu theo chương trình SPSS 16.0

- Các số liệu định tính được biểu hiện dưới dạng tỷ lệ %

- Các số liệu định lượng được biểu hiện dưới dạng trung bình ± SD

2.6 Cách khống chế sai số trong nghiên cứu

Để tránh sai số khi thu thập thông tin: Các công cụ thu thập thông tinđược thiết kế thích hợp theo mục tiêu nghiên cứu

2.7 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu

- Các bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu

- Các thông tin của bệnh nhân được giữ kín và lưu hồ sơ