TỔNG QUAN về GEN CDH1 và các DẠNG đột BIẾN GEN CDH1

Gen CDH1 mã hóa protein E-cadherin, mộtchất đóng vai trò quan trọng trong việc kết dính tế bào và duy trì sự toàn vẹncủa biểu mô.. Vai trò của E-cadherin trong tế bào bình thườngE-cadher

NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG

TỔNG QUAN VỀ GEN CDH1 VÀ CÁC DẠNG ĐỘT BIẾN GEN CDH1

CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ

HÀ NỘI- 2018

NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG

TỔNG QUAN VỀ GEN CDH1 VÀ CÁC DẠNG ĐỘT BIẾN GEN CDH1

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thiện Ngọc

Cho đề tài: Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) trên

bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền

Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số: 62720112

CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ

HÀ NỘI– 2018

MỞ ĐẦU

Việc xác định gen gây ung thư dạ dày có tính chất gia đình là một bướcquan trọng hướng tới sự hiểu biết về cơ chế phân tử cơ bản của ung thư, và làyếu tố quan trọng cho việc quản lý lâm sàng đối với các gia đình bị ảnhhưởng Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh giảm, nhưng ung thư dạ dày (UTDD) vẫn lànguyên nhân gây tử vong hàng đầu do ung thư trên toàn thế giới và khoảng10% các trường hợp UTDD có liên quan đến yếu tố gia đình, nhưng chỉ có 1– 3% các trường hợp là có tính chất di truyền Năm 1998, Guilford và cộng sự

đã lần đầu tiên xác định đột biến gen CDH1 là nguyên nhân gây ung thư dạdày lan tỏa di truyền (HDGC) [1] Gen CDH1 mã hóa protein E-cadherin, mộtchất đóng vai trò quan trọng trong việc kết dính tế bào và duy trì sự toàn vẹncủa biểu mô Trong một nghiên cứu, tỉ lệ phát hiện đột biến gen CDH1 là 26%

ở gia đình có từ 2 trường hợp UTDD với ít nhất một trường hợp UTDD lantỏa và một trường hợp chẩn đoán trước 50 tuổi [2] Tuy nhiên chỉ có 5% độtbiến gen CDH1 được chẩn đoán với UTDD lan tỏa trước 40 tuổi trong khi17% đột biến gen này được tìm thấy ở cá nhân trong gia đình bị UTDD lantỏa và ung thư vú thùy với một trường hợp dưới 50 tuổi Các loại đột biến haygặp nhất là thêm hoặc mất đoạn nhỏ (chiếm 35%), đột biến sai nghĩa (28%),đột biến vô nghĩa và đột biến chỗ nối exon-intron (16%) Đột biến mất exonlớn khá hiếm (chỉ chiếm 5% số trường hợp) [3]

1 Một vài khái niệm về gen

Gen là một đơn vị thông tin di truyền, chiếm một vị trí cố định trên NST

Số lượng gen trong bộ gen ở các loài sinh vật khác nhau thì khác nhau, bộ genngười chứa khoảng 20.000 đến 25.000 gen

Gen bao gồm các acid deoxyribonucleic (DNA) Phân tử DNA có cấutrúc xoắn kép, gồm hai chuỗi polynucleotid xoắn vặn xung quanh một trụctheo hai chiều ngược nhau Cấu trúc xoắn vặn của hai chuỗi polynucleotid tạocho DNA có một cấu trúc bền vững Trục xoắn là các base, các base của chuỗinày liên kết với chuỗi kia bằng liên kết hydro theo nguyên tắc bổ sung Trong

đó guanin và cytosin liên kết với nhau bằng 3 liên kết hydro, adenin vàthymin liên kết với nhau bằng 2 liên kết hydro Do vậy trật tự các base ởchuỗi thứ nhất bổ sung với trật tự các base ở chuỗi thứ hai Quá trình này dẫnđến việc tạo ra hai phân tử DNA giống nhau từ một bản gốc và thông tin ditruyền di truyền từ thế hệ này sang thế hệ tiếp theo

Gen cấu trúc quy định tổng hợp một loại protein xác định Gen cấu trúcgồm các exon và intron, exon là những đoạn DNA có khả năng phiên mã đểtổng hợp protein trong khi intron là những đoạn DNA có khả năng phiên mãnhưng không tham gia mã hóa tổng hợp protein Tại vị trí đầu tiên của exon 1

là mã mở đầu ATG, tại vị trí cuối của exon cuối cùng là một trong ba mã kếtthúc TAA, TGA hoặc TAG Phía trước exon đầu tiên và phía sau exon cuốicùng có vùng không dịch mã Các exon và intron sẽ phiên mã thành mRNAtiền thân, mRNA tiền thân trải qua quá trình cắt intron đã được phiên mã từDNA và nối các exon đã được phiên mã từ DNA lại với nhau để tạo thànhmRNA trưởng thành

Đột biến gen là những biến đổi trong cấu trúc của gen Đột biến gen xảy

ra khi số lượng hoặc thứ tự các base trong gen bị gián đoạn Các nucleotidhoặc đoạn nucleotid có thể bị mất, nhân đôi, sắp xếp lại hoặc thay thế, mỗithay đổi sẽ có biểu hiện khác nhau Đột biến thường ít hoặc không gây biếnđổi, tuy nhiên nếu là đột biến gây bệnh, nó có thể dẫn đến tử vong

2 Đặc điểm gen CDH1 và protein E-cadherin

CDH1 là một gen mã hóa cho E-cadherin, một loại cadherin cổ điển.Việc phân cắt có chọn lọc gen này tạo ra những bản dịch mã khác nhau E-cadherin là một protein gắn tế bào-tế bào phụ thuộc Canxi Mất chức năngcủa gen CDH1 là nguyên nhân gây tăng sinh, xâm lấn và di căn khối u Một

số bệnh ung thư có liên quan đến đột biến gen CDH1 là ung thư dạ dày, vú,đại trực tràng, tuyến giáp và buồng trứng

2.1 Lịch sử phát hiện gen CDH1

Đột biến dòng mầm CDH1 được phát hiện đầu tiên bởi nhà khoa họcGuilford qua phân tích về đột biến và mối liên hệ ở 3 gia đình người Maori(New Zealand) mắc UTDD lan tỏa khởi phát sớm và sau đó được phát hiện ởcác gia đình thuộc các chủng tộc khác [4] Phân tích di truyền cho thấy có sự liênquan đáng kể với E – cadherin (protein mã hoá bởi gen CDH1), có vai trò quantrọng trong việc bám dính của tế bào Phát hiện này đã giúp xác định nguyênnhân gây bệnh ở các gia đình có nhiều thành viên bị UTDD lan tỏa [5]

2.2 Cấu trúc của gen CDH1

Gen CDH1 nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể (NST) 16, tại vị trí16q22.1 Gen CDH1 mà hóa cho E-cadherin, một glycoprotein có trọng lượngphân tử 120 kD, với 16 exon trải rộng một khu vực khoảng 100kb Các exondao động từ 114 đến 2251 bp, và có 15 intron

Hình 1: Vị trí gen CDH1

Bảng 1: Kích thước 16 exon của gen CDH1 Exon Bắt đầu Kết thúc Kích thước (bp)

2.3 Cấu trúc sinh hóa của E-cadherin và β-catenin

E-cadherin là một loại cadherin cổ điển, được phát hiện lần đầu tiên ởtủy sống bởi nhà khoa học Takeichi [6, 7] Cấu trúc của E-cadherin gồm 3phần: đầu tận amino ngoại bào, vùng xuyên màng và đầu tận carboxy nội bào.Vùng ngoại bào là sự lặp lại liên tục của các chuỗi acid amin với 110 đơnphân, mỗi cấu trúc này tương ứng với 1 tiểu phần ngoại bào (1 EC) Mỗi EClại chia thành 7 chuỗi beta được sắp xếp đối nhau sao cho các cấu trúc nàyđược xếp chồng hiệu quả nhất Protein xuyên bào chứa một đoạn tín hiệu vàvùng tiền protein đứng trước EC1 Trong khi đó miền nội bào là nơi là E-cadherin gắn với β-catenin E-cadherin thường không biểu hiện cấu trúc chứcnăng cuối cùng của mình nếu không bắt cặp cùng cấu trúc gắn của nó [8].Cấu trúc cơ bản của β-catenin gắn với E-cadherin bao gồm 1 đầu tậnamino gồm 149 acid amin, tiếp nối bởi một vùng trung tâm gồm 515 acidamin chia thành 12 vùng armadillo lặp lại và đầu tận C gồm 108 acid amin

Trong đó vùng lặp lại là nơi điều hòa sự liên kết giữa β-catenin và cadherin.Cấu trúc tinh thể của vùng lặp lại này gồm 3 chuỗi H1, H2 và H3 Các cấutrúc lặp đối nhau tạo ra dạng siêu chuỗi có rãnh tích điện dương Sàn của rãnh

là chuỗi H3 và các cạnh được tạo bởi vòng lặp (hình 2) [9]

Hình 2 Cấu trúc của phân tử E-cadherin.

5 vùng của E-cadherin được kí hiệu bằng số trên hình Chuỗi β-catenin được

hiển thị bằng màu xám (chuỗi H1, H2 và vòng lặp) và xanh (H3)

2.4 Chức năng của gen CDH1 và E-cadherin

CDH1 mã hóa một glycoprotein xuyên màng là E-cadherin E-cadherin

là thành viên của gia đình Cadherin, gồm các gen mã hóa cho các phân tửbám dính tế bào phụ thuộc canxi, chúng đều là các glycoprotein xuyên màng[10] E-cadherin gồm một miền ngoại bào lớn gồm 5 tiểu phần đi đôi cùngnhau, một miền tế bào chất ngắn và một phân đoạn xuyên màng đơn, tươngtác với actin cytoskeleton thông qua các phân tử α-, β- và γ- catenins [3, 11]

Ở phía tế bào chất của màng tế bào, một bó sợi actin được liên kết với cácphân tử E-cadherin thông qua một phức hợp protein, phức hợp này gồm: α-catenin và β- hoặc γ- catenins β- và γ- catenins chia sẻ tương đồng đáng kể

và liên kết với một miền cụ thể tại E-cadherin C α- catenin liên kết với βhoặc γ- catenin và actin cytoskeleton (hình 3).

Hình 3: Vị trí của E-cadherin và vai trò trong kết dính tế bào [ 12 ]

CM: Màng tế bào; ED: Miền ngoại bào; ID: Miền nội bào;

AC: Actin cytoskeleton; AJ: Nối tiếp; 1: β- catenin; 2: α- catenin; 3: p120

Trong ung thư dạ dày, E-cadherin đóng vai trò quan trọng trong nhiềuchức năng của tế bào như biệt hóa, tăng sinh, phát triển, di động và chết của tếbào (hình 4) [13] Các chức năng này được thể hiện thông qua các con đườngnhư WNT, Rho GTPases, EGFR…

Hình 4: Các con đường sinh ung thư liên quan đến E-cadherin [ 13 ] 2.4.1 Vai trò của E-cadherin trong tế bào bình thường

E-cadherin là một trong những phân tử quan trọng trong sự kết dính tếbào với tế bào biểu mô E-cadherin được biết đến như là một thành phầnchính của chỗ nối tiếp xúc (AJ), là trung gian kết dính homotypic mạnh mẽgiữa các tế bào biểu mô cạnh nhau, qua đó bảo vệ tính toàn vẹn của hàng rào

tế bào biểu mô Sự bám dính tế bào với tế bào chủ yếu được thực hiện bởi sựhình thành các chất chuyển hóa E-cadherin Phân tử E-cadherin chứa mộtmiền ngoại bào (ectodo main - EC) bao gồm 5 tiểu phần (EC 1 – 5), một vùngxuyên màng và đuôi tế bào chất [14] Cấu trúc thứ cấp có thể được phân loạithành một miền liên kết β- catenin (CBD) và một miền bảo vệ tế bào chất gầnvới màng tế bào (MPCD) rất quan trọng cho sự gắn kết p120- catenin, dẫn đến

sự ổn định của phức hợp E-cadherin/catenin tại bề mặt tế bào [15] Việc duy trìhàng rào biểu mô là một chức năng khác của E-cadherin, ngăn chặn các tác nhânđộc hại xâm nhập vào nội bào

Bên cạnh vai trò trong việc bám dính tế bào, E-cadherin và liên quan của

nó là catenin được biết đến là một trong những con đường truyền tín hiệu Cóbằng chứng cho thấy cadherin không chỉ là mục tiêu báo hiệu đường dẫn điềuchỉnh độ bám dính mà còn có thể gửi tín hiệu điều chỉnh một số quá trình của

tế bào như xâm nhập, sinh sôi và biệt hóa tế bào [10] Con đường truyền tínhiệu WNT (còn được gọi là Wingless) được phát hiện gần đây, có thể đượccoi là một trong những loại chuyển tải tín hiệu đáng chú ý nhất liên quan đếnquá trình bám dính của tế bào Trong các tế bào của động vật có xương sống,

nó điều hòa sự tương tác giữa tế bào với tế bào trong quá trình tạo phôi Cóthể hiểu protein WNT liên kết với thụ thể trên bề mặt tế bào, thông qua một sốthành phần trong bào tương, tín hiệu được chuyển thành β- catenin, sau đó đivào hạt nhân và trở thành một phức hợp với TCF để kích hoạt phiên mã genmục tiêu của WNT [10] Các gen mục tiêu của WNT, cùng với các thành phầnkhác nhau của con đường truyền tín hiệu WNT đều đã được chứng minh cóliên quan đến ung thư [16]

2.4.2 Vai trò điều chỉnh tế bào của E-cadherin trong ung thư

Việc kiểm soát độ bám dính và tính di động của tế bào là một trong những

cơ chế quan trọng trong quá trình tạo thành và tiến triển của khối u Suy giảmchức năng của E-cadherin gây giảm khả năng bám dính của tế bào, con đườngtruyền tín hiệu tăng sinh gây nên những hình thái bất thường về cấu trúc của biểu

mô, mất phân cực tế bào dẫn dến sự xâm lấn ra các mô xung quanh

E-cadherin là một protein ức chế khối u nổi bật, việc mất biểu hiện của

nó trong các tế bào khối u, kết hợp với quá trình chuyển đổi biểu mô – trung

mô (EMT), xảy ra thường xuyên trong quá trình phát triển và di căn của khối

u [17] Mất E-cadherin gây mất kết dính tế bào - tế bào, cho phép các tế bàotách khỏi khối u chính, xâm nhập vào các mô xung quanh và di chuyển đếncác tổ chức ở xa Tuy nhiên, một số ung thư biểu mô vẫn di căn xa mặc dùmức độ biểu hiện của E-cadherin hầu như bình thường và quá trình biến đổi

biểu mô – trung mô không bắt buộc là do di căn gây nên Trên thực tế đã pháthiện các cụm tế bào khối u di căn tự do trong máu với tiền thân là khối ungthư vú [18] Hơn nữa, E-cadherin tham gia vào quá trình di chuyển của tế bàobất thường cùng các tế bào khác, tạo thuận lợi cho quá trình xâm lấn và di căn

xa Những thay đổi trong chức năng của E-cadherin bên cạnh mất hoàn toànbiểu hiện của gen, có thể quan trọng đối với các quá trình này

2.4.3 Vai trò của E-cadherin ở trạng thái hoạt động trong di căn

Con đường Rho GTPase, đặc biệt là thông qua protein Cdc42, Rac1 và Rho

A, là con đường quan trọng trong cơ chế di căn của tế bào ung thư (hình 5,6)

Hình 5 Mối liên quan giữa Rho-GTPase và [ 19 ]

Protein Cdc42 có liên quan với filopodia, một cấu trúc giàu actin, có khảnăng cảm nhận tín hiệu và quyết định hướng di chuyển của tế bào ProteinRac gắn vào cấu trúc giàu actin khác là lamellipodia trong khi Protein Rhogây mất phân cực biểu mô ở tế bào u lành và đóng vai trò quan trọng trongquá trình chuyển đổi biểu mô – trung mô (EMT) ở những ung thư ác tính hơn(hình 6) Ba protein này tạo ra liên kết giữa tế bào và cấu trúc ngoài tế bàoqua integrin [19] Sự thay đổi của tín hiệu điều hòa hệ Rho GTPase có thể tácđộng đến khả năng di chuyển, xâm lấn và di căn, thậm chí là cả tăng sinh tếbào [20] Tuy nhiên, cơ chế kết nối giữa hệ này và E-cadherin vẫn cần nghiêncứu thêm [19-21]

Hình 6 Cấu trúc di động của tế bào [ 22 ]

Trong một nghiên cứu của Yuliyal và cộng sự [23], đã tiến hành nghiêncứu để chứng minh giả thuyết: Vai trò của E-cadherin trong quá trình di căn là

do sự điều hòa của E-cadherin trên bề mặt ở trạng thái hoạt động, không liênquan đến số lượng E-cadherin Để làm được như vậy, nhóm nghiên cứu đã sửdụng một kháng thể đơn dòng kích hoạt (mAb) cho E-cadherin mà đã được sửdụng trong các nghiên cứu trước [23], xác định xem liệu nó có ảnh hưởng đếnmức độ di căn không và sự ảnh hưởng của nó có liên quan đến cơ chế điềuchỉnh bề mặt tế bào hay không Đột biến gen CDH1(E-cadherin) được biết làyếu tố quan trọng trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền (HDGC), với tỷ lệxấp xỉ khoảng 30% [24] Các đột biến gen này cũng được cho là góp phần gây

ra khuyết tật sứt môi hở hàm ếch [25] Các đột biến gây ra HDGC và sứt môi

– hở hàm ếch xảy ra trên khắp các vùng khác nhau của miền ngoại bào và cũng

có trong miền tế bào chất Qua nghiên cứu trên của Yuliyal cho thấy kích thíchtrạng thái hoạt động của E-cadherin trên bề mặt tế bào sẽ ức chế sự tiến triển dicăn Bên cạnh đó, chỉ cần điều chỉnh độ bám dính của các tế bào khối u cũnggóp phần gây di căn kể cả khi số lượng E-cadherin cao [23] Nhiều nghiên cứu

đã chỉ ra rằng việc mất sự bám dính giữa các tế bào tế bào là điều kiện tiên quyếttrong việc xâm nhập tế bào ung thư và hình thành di căn [26]

Gần đây, các nhà nghiên cứu đang chú ý tới sự tương tác giữa phức hợpE-cadherin/catenin và EGFR như một trục tín hiệu trong quá trình sinh ungthư E-cadherin ức chế tín hiệu của EGFR, một chất bình thường gây mất kếtdính tế bào làm tăng khả năng di động và xâm lấn Nếu được hoạt hóa, EGFR

sẽ phosphoryl hóa E-cadherin gắn với β-catenin, γ-catenin và δ-catenin 1, gâymất ổn định cấu trúc này Đột biến sai nghĩa ở gen CDH1 làm ảnh hưởng đếnvùng ngoại bào của E-cadherin, gây mất ức chế EGFR và xuất hiện di căn

Hình 7 Tương tác giữa E-cadherin/catenin–EGFR ở biểu mô Mất tương tác giữa E-cadherin–EGFR tăng hoạt hóa con đường PI3K, c-Src và MAPK

kinase và làm bất ổn định phức hợp [ 27 ]

2.4.4 Vai trò của E-cadherin trong quá trình sinh ung thư

Gần đây, các nghiên cứu đã chứng minh vai trò của E-cadherin trong ungthư không chỉ giới hạn ở việc hình thành và di căn, mà nó còn có vai trò trongviệc điều chỉnh tín hiệu nội bào và do đó thúc đẩy sự phát triển của khối u Sựkết dính tế bào với tế bào qua trung gian có thể ảnh hưởng đến đường dẫn tínhiệu Wnt [28] β-catenin (cũng như γ-catenin) thường được hấp thụ bởi cáccadherin trong phức hợp catherin cadherin Khi mất chức năng của E-cadherin, β-catenin tự do thường được phosphoryl hóa bởi glycogen synthasekinase 3β (GSK-3β) trong phức hợp polyposis coli adenomatous (APC) –axin – GSK-3β và sau đó bị phân hủy bởi con đường ubiquitin–proteasome,con đường này góp phần hạn chế hậu quả của đột biến gen CDH1, phần nàogiảm khả năng sinh ung thư Các khối u có thể hình thành khi gen ức chế khối

u APC bị mất chức năng, đột biến trong β-catenin hoặc ức chế GSK-3β quacon đường Wnt dẫn đến β-catenin xuất hiện ổn định trong tế bào chất β-catenin sau đó chuyển thành hạt nhân, liên kết với các thành viên của họTcf/Lef-1 của các nhân tố phiên mã và điều chỉnh sự biểu hiện của các genTcf/Lef-1-target, bao gồm proto – oncogene c – myc và cyclin D1