CÁC kỹ THUẬT SINH học PHÂN tử TRONG VIỆC xác ĐỊNH đột BIẾN GEN CDH1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ dạ dày LAN tỏa DI TRUYỀN

NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNGCÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CDH1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY LAN TỎA DI TRUYỀN Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn C

NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG

CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CDH1

TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY

LAN TỎA DI TRUYỀN

CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ

HÀ NỘI- 2018

NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG

CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CDH1

TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY

LAN TỎA DI TRUYỀN

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn

Cho đề tài: Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) trên

bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền

Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số: 62720112

CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ

HÀ NỘI – 2018

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU

Sinh học phân tử là một trong những lĩnh vực thu hút được nhiều sự chú

ý với khả năng áp dụng nhiều các phương pháp nghiên cứu từ các ngành khoahọc khác nhau để nghiên cứu và tìm ra các quy luật của cuộc sống Nhờ hiểubiết và các tiến bộ sinh học phân tử, con người đã nắm rõ hơn về cơ chế bệnhsinh ung thư cũng như xác định được các gen quan trọng trong cơ chế ungthư

Ung thư dạ dày là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất, với tỉ lệmắc và tử vong cao Có nhiều yếu tố gây ung thư dạ dày, trong đó yếu tố ditruyền là một trong những yếu tố nguy cơ quan trọng Hiện nay khoa học đãtìm ra đột biến dòng mầm của gen CDH1, một trong những gen hay gặp nhất,chiếm 30% số trường hợp mắc ung thư dạ dày di truyền

Bài chuyên đề sau đây sẽ hệ thống hóa các phương pháp sinh học phân

tử đã và đang được sự dụng để đánh giá đột biến gen CDH1 trong bệnh ungthư dạ dày di truyền

1 Tổng quan về sinh học phân tử

1.1 Định nghĩa

Sinh học phân tử là một ngành trong lĩnh vực sinh học tập trung nghiêncứu về các thành phần, cấu trúc và tương tác của các phân tử trong tế bào vàvai trò của các yếu tố này trong sinh lý bình thường của con người cũng nhưtrong các bệnh lý như ung thư

1.2 Lịch sử

Ngành sinh học phân tử (SHPT) bắt đầu phát triển ra từ những năm

1930 Nhưng chỉ đến những năm 1950 thì ngành SHPT mới thực sự bùng nổ.Trong khoảng 3 thập kỉ này, các nghiên cứu đều tập trung vào cơ chế tự nhânlên của DNA và giải thích các hoạt động như mã hóa thông tin Tuy ngànhnày đã phát triển từ trước đó, nhưng thuật ngữ này chỉ được chính thức sửdụng từ năm 1938 bởi nhà khoa học người Mỹ Warren Weaver, giám đốc của

Quỹ Rockefeller về khoa học tự nhiên [1] Ban đầu thuật ngữ sinh học phân

tử chỉ bắt nguồn từ ý tưởng là đưa vật lý và hóa học để giải thích về các hiệntượng cuộc sống Bằng việc định nghĩa cuộc sống qua cơ chế lý hóa học,ngành SHPT đã tập trung nguồn lực vào vấn đề liên quan đến đại phân tử

Để sinh học phân tử phát triển, rất nhiều các công cụ nghiên cứu của cáclĩnh vực khác được đưa vào như vật lý, toán học, hóa học cũng nhưg cácngành liên quan đến cuộc sống (gen, mô phôi, sinh lý, vi sinh…) Thực sự,sinh học phân tử là một cuộc cách mạng vì đã xóa bỏ ranh giới giữa cácngành khoa học, tạo ra một sự tương tác rộng lớn chưa từng có trong việc tìm

ra các quy luật của cuộc sống Hai trọng tâm nghiên cứu của SHPT là đạiphân tử - (1) acid nucleic (DNA) cấu thành nên gen và (2) protein

Hiện nay với sự đi lên của các kĩ thuật, hàng loạt những bộ gen đã đượcgiải mã trong thời gian ngắn hơn với giá thành ngày một giảm Nếu như đầuthế kỉ 21, khi dự án Giải mã bộ gen người đã phải tiêu tốn chục tỷ đô la Mỹ

và để giải mã toàn bộ hệ gen cần ít nhất 100 triệu đô la Mỹ thì hiện giờ, chiphí này đã chỉ còn 1000 đô la Mỹ [2]

Hình 1 Biểu đồ giá thành giải mã toàn bộ hệ gen qua các năm

Một ứng dụng quan trọng của SHPT ngày nay là liệu pháp gen, đặc biệt

là trong lĩnh vực ung thư và các bệnh di truyền phổ biến hoặc hiếm gặp Sinhhọc phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc giúp con người hiểu về các

hình thành, hoạt động và sự điều hòa của các cấu trúc trong tế bào Điều nàygiúp cho con người tìm ra những loại thuốc mới, chẩn đoán bệnh và sinh lýcủa tế bào Nhiều trung tâm biobank đã được thiết lập ở nhiều nước để cácnhà khoa học có thể tận dụng được lượng dữ liệu khổng lồ của các ngân hànggen này nghiên cứu và hiểu sâu sắc thêm về cơ chế sinh bệnh, từ đó đưa rađược những phương pháp điều trị trúng đích.

1.3 Một số cột mốc quan trọng trong ngành sinh học phân tử

Những năm 1940: Avery, MacLeod và McCarty tìm ra DNA

1953: Watson và Crick phát hiện ra cấu trúc xoắc kép của DNA

1972: Thực hiện được kĩ thuật tổng hợp gen

1980s: thực hiện tái tổ hợp gen và giải trình tự gen

1983: kĩ thuật PCR được Mullis phát triển, là kĩ thuật nền của shpt

2003: hoàn thành Dự án giải mã bản đồ gen người

2015: phương pháp giải trình tự gen mới (next gen sequencing) giúpgiảm giá thành giải mã toàn bộ hệ gen xuống dưới 1000 đô la Mỹ

1.4 Ứng dụng sinh học phân tử trong ngành ung thư

Ung thư là một trong những vấn đề được quan tâm và dồn rất nhiềunguồn lực để nghiên cứu trong những thập kỉ gần đây Với sự phát triển củaSHPT, con người đã hiểu được nhiều các vấn đề hơn và đã ứng dụng được sựtiến bộ của ngành SHPT trong đẩy lùi căn bệnh này SHPT đã đóng góp vàophát triển những các tiến cận mới trong dự phòng, chẩn đoán và điều trị Ví

dụ như trong ung thư biểu mô tuyến đại tràng, tỉ lệ sống sau 5 năm giảm từ90% khi khối u con khu trú xuống hơn 60% khi đã di căn vùng và chỉ cònkhoảng 5% khi đã di căn xa Nhờ có SHPT mà một số bệnh nhân có yếu tốgia đình được đánh giá và phát hiện đột biến gen ức chế hoặc sinh ung thư,giúp phát hiện sớm các trường hợp có nguy cơ cao và làm tăng thời gian sốngcủa bệnh nhân [3]

Hình 2 Tỉ lệ sống sau 5 năm của các giai đoạn trong ung thư đại tràng [3]

Các liệu pháp điều trị cũng được hưởng lợi từ sự phát triển của SHPT.Bên cạnh các biện pháp điều trị truyền thống như hóa trị, xạ trị và phẫu thuật,liệu pháp gen cũng là một xu hướng mới được xây dựng nhờ sự hiểu biết vềcác cơ chế sinh ung thư của các gen bất thường Một trong những thành tựunổi bật có thể kể đến là việc sử dụng trastuzumab, một chất kháng thể đơndòng gắn vào receptor HER2 - một yếu tố gặp ở 25% số bệnh nhân ung thư

vú, giúp cải thiện tiên lượng sống của bệnh nhân [4, 5]

Hình 3 Một số thành tựu được ứng dụng từ sinh học phân tử [6]

2 Ứng dụng của sinh học phân tử trong nghiên cứu gen CDH1 và HDGC

2.1 Tổng quan về các dạng đột biến gen CDH1 và bệnh HDGC

Ung thư dạ dày (UTDD) là một bệnh do nhiều yếu tố gây nên, trong đókhoảng 10-30% số trường hợp có tiền sử gia đình mắc bệnh ung thư và 1-3%

có đột biến gen mầm CDH1 [7] Năm 1998, Guildford là người đầu tiên chỉ rađột biến gen mầm CDH1 mã hóa cho protein E-cadherin trong cơ chế sinhung thư của một gia đình người Maori ở New Zealand [8] Công trình nghiêncứu của ông dựa trên kĩ thuật RT-PCR và phân tích đa hình sợi đơn (SSCP).Sau đó một loại các công trình nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra được kết quảnày Nhờ công sức và tiến bộ của các kĩ thuật trong SHPT, khả năng phát hiện racác đột biến gen CDH1 ngày càng cao Tính đến nay đã có khoảng 155 các dạngđột biến gây bệnh của gen mầm CDH1 đã được tìm thấy [9] Các dạng đột biếngen mầm CDH1 được cập nhật liên tục tại website

https://databases.lovd.nl/shared/genes /CDH1

Không phải cứ xuất hiện đột biện gen CDH1 sẽ biểu hiện bệnh Nguy cơmắc tích lũy UTDD tính đến 80 tuổi là 70% ở nam và 56% ở nữ Bên cạnh

đó, có thể các trường hợp có đột biến gen nhưng là lành tính, không có khảnăng gây bệnh [9] Các dạng đột biến thường gặp là cắt đoạn protein (baogồm đột biến dịch khung và đột biến vô nghĩa, đột biến chỗ nối) chiếm 75%.Còn lại 25% là đột biến sai nghĩa gây ảnh hưởng đến chức năng Phươngpháp phân tích cơ bản có thể phát hiện được phần lớn các dạng đột biến củagen CDH1 Tuy nhiên vẫn có tỉ lệ nhất định trường hợp không phát hiện đượcđột biến khi sử dụng các phương pháp phân tích phổ thông mà cần nhữngphương pháp phân tích khác bên cạnh PCR thông thường để phát hiện rabệnh

2.2 Tổng quan các phương pháp phân tích, cách tiếp cận chẩn đoán gen CDH1

Bên cạnh yếu tố lâm sàng, các công cụ sinh học phân tử là điều rất cầnthiết để xác định chính xác các bất thường của hệ gen Phát hiện đột biến genCDH1 và nguyên nhân gây bệnh CDH1 cần cách tiếp cận đa mô thức và vẫnchưa có giải pháp tối ưu để đánh giá tổng thể [10, 11] Mỗi phương pháp có

ưu nhược điểm riêng, tùy từng trường hợp mà có thể đánh giá lựa chọnphương pháp phù hợp Các yếu tố cần được cân nhắc để đánh giá là khả năng

áp dụng và hạn chế của các phương pháp phân tích, khả năng kinh tế, tínhchất của nghiên cứu Ngoài ra, do yêu cầu của từng cách tiếp cận và đặcđiểm của từng nghiên cứu mà ngay từ khâu lựa chọn mô bệnh học đã cónhững lưu ý nhất định để có thể nghiên cứu các đột biến

Cách tiếp cận cơ bản để phát hiện các trường hợp có thể có đột biến genCDH1 có thể tham khảo biểu đồ 1 Đối tượng là những người thân của bệnhnhân và chính những bệnh nhân được chẩn đoán HDGC bằng Hướng dẫnđồng thuận của tổ chức International Gastric Cancer Linkage Consortium

(IGCLC) [12] Những đối tượng này sẽ được tiến hành tư vấn và sàng lọc genCDH1 Các phương pháp có thể sử dụng có thể chỉ là PCR và sequencingthông thường, nhưng cũng có thể cần thêm các phương pháp khác mới hơnnhư MLPA, quatitative PCR (qPCR), RT-PCR, multiplex sequencing,pyrosequencing, bisulfite sequencing … Những trường hợp phát hiện đột biếngen sẽ cần phải đánh giá loại đột biến là sai nghĩa hay mất đoạn Các trườnghợp gây đột biến mất đoạn thì đều là những người có nguy cơ cao mắc bệnh

và cần những biện pháp theo dõi và điều trị dự phòng dựa theo khuyến cáo[12] Những người có đột biến sai nghĩa thì cần xác định khả năng gây bệnh củađột biến theo phân độ của trường Cao đẳng về Gen và hệ Gen Hoa Kỳ và Hiệphội Bệnh học phân tử [13]

Biểu đồ 1 Các tiếp cận cơ bản với các trường hợp UTDD gia đình [14]

Dựa theo bảng 1 về giá trị của các phương pháp phân tích, có thể thấynhững phương pháp thông thường chỉ xác định được 30% số trường hợp, 4-

5% còn lại cần những phương pháp chuyên sâu hơn để có thể tìm ra các độtbiến gây bệnh Tuy vậy vẫn còn đến 50-70% số trường hợp được chẩn đoán làHDGC nhưng chưa phát hiện được các gen gây bệnh Đây là khoảng trống màkhoa học vẫn chưa tìm ra Vì vậy các nhà nghiên cứu vẫn cần tiếp tục tìm racác cơ chế mới và xác định được các gen gây bệnh

Bảng 1 Ý nghĩa của các phương pháp đánh giá đột biến gen CDH1 [9]

gen được phát hiện

CDH1 Giải trình tự gen thông thường 30%-50%

Phân tích đột biến mất/thêm đoạn gene 4%

đã được đúc trong khối nến parafin (từ mảnh sinh thiết tại vị trí tổn thươnghoặc biểu mô dạ dày bình thường), mẫu máu (có thể là mẫu mới hoặc đã đượclưu trữ) và nước bọt [15-18] Các mẫu mô này sau đó sẽ tiến hành qua cácbước như phá màng tế bào, màng nhân; loại protein và tủa acid nucleic để lấy

ra vật chất di truyền dùng cho quá trình phân tích Các mẫu mô thu thập đượcnên được tiếp tục lưu trữ nhằm phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn về sau

Hình 4 Mẫu mô được bảo quản bằng paraffin

Ưu điểm của mẫu máu là dễ dàng thu thập, lưu trữ lâu dài và có thể táchDNA cũng như RNA để phân tích [19, 20]… Tuy nhiên mô tươi được xử lýngâm parafin và cố định bằng formalin là phương pháp thiết thực hơn để cóthể tiến hành nhiều nghiên cứu Trước đây khi chưa có kĩ thuật bảo quản thìcác mô thu thập được dễ bị thoái hóa sau một thời gian Với việc ứng dụngcác hóa chất để xử lý mẫu mô thì hiện nay đã cải thiện chất lượng mẫu và thờigian bảo quản có thể lên đến hàng thập kỉ Chất lượng và số lượng DNA đượctách ra phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: loại và số lượng mẫu, cách cố địnhmẫu, thời gian cố định, cách bảo quản… Trong đó, bước loại bỏ paraffin làquan trọng nhất để có thể có được mẫu ưng ý sử dụng cho nghiên cứu [21]

3.2 Khuyếch đại gen

3.2.1 Kĩ thuật PCR thông thường

PCR là một kĩ thuật kinh điển, một trong những phương pháp quan trọngnhất trong lĩnh vực SHPT để khuyếch đại DNA Chỉ từ một lượng DNA rất ítban đầu, có thể ra hàng triệu bản sao để phục vụ phân tích, giải trình tự vànhiều kĩ thuật khác trên gen [22] Kĩ thuật cần sử dụng 2 đoạn mồi cho mỗi

đầu của đoạn DNA cần nhân lên, các nucleotid tự do và enzym DNApolymerase bền với nhiệt để khuếch đại đoạn gen… Nếu chỉ khuếch đại mộtlượng nhỏ DNA mẫu thì phương pháp này có độ chính xác rất cao Ngoài rathời gian thực hiện nhanh, giá thành rẻ, dễ áp dụng rộng rãi cho nhiều nghiêncứu nên được sử dụng trong việc phát hiện đột biến gen CDH1 [15, 23-25].Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số nhược điểm như cần có đoạn mồiđặc trưng và dễ bị ngoại nhiễm Một lưu ý nữa trong nghiên cứu gen CDH1 làphương pháp này cũng không thể dùng được để phát hiện các đột biến mấtđoạn/nhân đoạn lớn, gặp trong 4-5% số trường hợp được chẩn đoán HDGC.

Hình 5 Quá trình nhân đoạn gen trong kĩ thuật PCR

3.2.2 RT-qPCR

Bên cạnh kĩ thuật PCR thông thường, RT-qPCR cũng là một phươngpháp hay được sử dụng trong các nghiên cứu về gen CDH1 Chúng thườngđược sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của E-cadherin – protein do gen

CDH1 mã hóa [20, 26] Người mang đột biến gen CDH1 có sự giảm mức độbiểu hiện của E-cadherin và sinh ra ung thư Trong kĩ thuật này, vật chất ditruyền được sử dụng là mRNA, thường lấy từ mẫu máu/ mô ngấm parafin củabệnh nhân Sau đó mẫu bệnh phẩm được xử lý, sử dụng enzym sao chépngược (reverse transcriptase) để tạo cDNA, nhân đoạn cDNA mới tạo, gắnhuỳnh quang hoặc đầu dò đặc hiệu và tiến hành phân tích định lượng (hình 6).

Có thể tham khảo kết quả phân tích của một nghiên cứu trong biểu đồ 2 Theo

đó, những người mang đột biến gen mầm có mức độ biểu hiện thấp hơnkhoảng 3 lần so với những người bình thường, sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê Ngoài ứng dụng trên, RT-qPCR cũng được một nghiên cứu sử dụng để đánhgiá giá trị của đột biến sai nghĩa, đột biến vị trí cắt và đột biến vùng intron trongquá trình phiên mã [11, 18]

Hình 6 Mô tả quy trình của kĩ thuật RT-qPCR

Biểu đồ 2 Mức độ biểu hiện của E-cadherin [20]

3.2.3 Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

30-35% số bệnh nhân được chẩn đoán HDGC có thể phát hiện đột biếngen CDH1 bằng phương pháp PCR thông thường Tuy nhiên, nhược điểm củacác phương pháp này là không phát hiện được các đột biến xóa/thêm đoạn lớntrong các exon, tạo ra các biến thể số lượng bản sao (Copy number variant -CNV) vốn chiếm 4-5% số trường hợp HDGC Vì vậy, với những trường hợpkhông phát hiện được các đột biến có ý nghĩa, cần tiến hành phương phápMLPA [17]

Hình 7 Các dạng biến thể số lượng bản sao (CNV) [27]

Để thực hiện kĩ thuật này, đầu tiên cần biến tính DNA thành dạng sợiđơn, lai với đoạn dò MLPA ở vị trí nhất định của cấu trúc exon cần nghiêncứu Đoạn dò là 2 đoạn oligonucleotid riêng biệt ở 2 đầu 5’ và 3’ có gắnhuỳnh quang của các đoạn cần nghiên cứu Sau đó hiện tượng gắn xảy ra giữa

2 đoạn dò khi chúng có thể lai được với đoạn gen cần giải mã (hình 8) Phảnứng PCR sau đó được tiến hành và sản phẩm được tạo ra sẽ được đánh giádựa trên lượng huỳnh quang đo được sau khi thực hiện PCR Kết quả này cầnđược đối chứng với một nhóm chứng để phân tích [28]

Hình 8 Quy trình của một phản ứng MLPA

Biểu đồ 3 thể hiện kết quả nghiên cứu về mất đoạn gen CDH1 của tácgiả Olivera Khi đối chiếu với nhóm chứng, kết quả cho thấy ở bệnh nhân này

đã có mất đoạn gen ở exon 14,15 và 16

Biểu đồ 3 Kết quả phân tích MLPA [29]

Ưu điểm của kĩ thuật này là có thể so sánh với nhóm chứng và phát hiệnđược hiện tượng xóa/thêm đoạn lớn Tuy nhiên do tính chất của kĩ thuật này

mà việc phát hiện chính xác điểm gây đột biến khó chính xác Ngoài ra kếtquả của phương pháp cũng không giúp khẳng định nguyên nhân gây hiệntượng lặp đoạn nằm ở cấu trúc nào của DNA [28]

3.2.4 Multiplex PCR

Multiplex PCR là kĩ thuật chuyên sâu với đặc trưng là khả năng nhân lênnhiều đoạn gen cùng một lúc với chỉ một lượng mẫu bệnh phẩm ban đầu(hình 8) Nếu như PCR thông thường thì chỉ có thể nhân từng đoạn gen trongmột lần thực hiện kĩ thuật thì Multiplex PCR có thể nhân rất nhiều đoạn genphục vụ cho nghiên cứu lớn Nhờ kĩ thuật này mà chi phí phân tích hệ gengiảm đi đáng kể so với việc PCR từng đoạn gen đơn lẻ Ngoài ra, những ưuđiểm quan trọng khác là giảm thời gian thao tác bằng tay, khả năng đối chứngnội kiểm nhằm đánh giá chất lượng của PCR, xác định được chất lượngmẫu… Tuy nhiên nhược điểm là phụ thuộc nhiều vào chất lượng của PCRmastermix, khả năng nhân lên kém hơn và phụ thuộc vào chất lượng DNA.Thông thường phương pháp này ít được sử dụng đại trà Ứng dụng quan trọngnhất của Multiplex PCR là giúp cho các nghiên cứu quy mô lớn cần phân tíchnhiều gen một lúc