Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym ache của sâm vũ diệp và tam thất hoang trên thực nghiệm

Hình 1.3 Các vị trí gắn của enzym AChE 13 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết cao giàu saponin từ Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ Hình 2.3 Sự đổi màu của dung dịch

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

LƯU THỊ HUYỀN TRANG

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA

VÀ ỨC CHẾ ENZYM AChE CỦA SÂM VŨ DIỆP

(Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax

stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

TRÊN THỰC NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

LƯU THỊ HUYỀN TRANG

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA

VÀ ỨC CHẾ ENZYM AChE CỦA SÂM VŨ DIỆP

(Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax

stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, ĐHQGHN, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã tạo điếu kiện giúp

em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Em xin chân thành cảm ơn các thầy

cô đã giảng dạy và giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Dương Thị Ly Hương

và PGS TS Bùi Thanh Tùng, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận này Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận

Em xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm

từ 2 loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) vùng Tây Bắc”, mã

số KHCN-TB.07C/13-18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung

nghiên cứu này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Dù đã rất cố gắng, nhưng là lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô

để khóa luận được thêm hoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Lưu Thị Huyền Trang

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Giải nghĩa

ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid

ACh Acetylcholin AChE Acetylcholinesterase ATCI Acetylthiocholine iodid DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1, 1-Diphenyl –2-picrylhydrazyl DTNB Acid 5-5’- dithiobis-2- nitrobenzoic

IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) MeOH Methanol

ROS Các chất hoạt động chứa oxy (Reactive Oxygen Species) RNS Các chất hoạt động chứa nito (Reactive Nitogen Species)

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem 5

Hình 1.2 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T

Hình 1.3 Các vị trí gắn của enzym AChE 13

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết cao giàu saponin từ

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ

Hình 2.3 Sự đổi màu của dung dịch thể hiện tác dụng

chống oxy hóa trong phương pháp DPPH 21

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo màu với thuốc thử

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa in

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính 8

Bảng 3.1 Kết quả chống oxy hóa in vitro của vitamin C 26

Bảng 3.2 Kết quả chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ

Bảng 3.3 Kết quả chống oxy hóa in vitro của Tam thất

Bảng 3.4

Giá trị IC50 chống oxy hóa in vitro của Sâm

vũ diệp, Tam thất hoang và vitamin C trong phương pháp DPPH

28

Bảng 3.5 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in

Bảng 3.6 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in

vitro của Sâm vũ diệp cao giàu saponin 30

Bảng 3.7 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in

vitro của Tam thất hoang cao giàu saponin 30

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về chi Panax L 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L 3

1.1.3 Phân bố 3

1.1.4 Thành phần hóa học chính của chi Panax L 4

1.1.5 Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L 4

1.1.6 Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) 5

1.2 Tổng quan về gốc tự do 8

1.2.1 Khái niệm 8

1.2.2 Các ROS và RNS 8

1.2.3 Stress oxy hóa 9

1.2.4 Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa 10

1.3 Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan 11

1.3.1 Acetylcholin 11

1.3.2 Enzym Acetylcholinesterase 12

1.3.3 Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer 13

1.3.4 Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Dung môi, hóa chất 20

2.3 Máy móc, dụng cụ 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 20

2.4.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 22

2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Kết quả thực nghiệm 26

3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang……… 26

3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 29

3.2 Bàn luận 31

3.2.1 Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 31

3.2.2 Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gốc tự do là một thuật ngữ đã trở lên quen thuộc với giới y khoa và ngày càng được quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn Bởi gốc tự do có nhiều tác hại với sức khỏe của con người Nó là nguồn gốc của sự lão hóa và hơn

100 bệnh tật nguy hiểm, bao gồm các bệnh về não, mắt, da, hệ miễn dịch, tim, mạch máu, phổi, thận, đa cơ quan và khớp Đồng thời, gốc tự do còn là nguyên nhân gây ung thư [22] Sau khi lấy đi điện tử, gốc tự do làm tổn thương màng tế bào, phản ứng mạnh với các phân tử protein, DNA và các acid béo, dẫn đến những biến đổi gây tổn hại, rối loạn và làm chết tế bào Số lượng gốc tự do tích lũy theo tuổi và tác hại ngày càng nghiêm trọng [1]

Gốc tự do tác động tới tất cả các cấu trúc tế bào trong cơ thể, trong đó

có các tế bào thần kinh Gốc tự do là nguyên nhân gây ra các bệnh thoái hóa

tế bào thần kinh và bệnh lý mạch máu não [1, 20] Một trong những bệnh thoái hóa tế bào thần kinh được quan tâm là bệnh Alzheimer

Thống kê ở châu Á cho thấy có khoảng 35 triệu người mắc bệnh Alzheimer, con số này được dự đoán sẽ tăng gấp đôi vào năm 2050, lên tới 62,8 triệu người Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là Alzheimer [3] Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ làm giảm khả năng xét đoán, định hướng không gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy nhận thức, hành động… ảnh hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượng cuộc sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh, cho gia đình và cộng đồng xã hội Các nhà khoa học đã đưa ra các nguyên nhân để giải thích cho bệnh Alzheimer Trong đó, giả thuyết cổ điển nhất là giả thuyết về hệ thống truyền đạt thần kinh bằng Acetylcholin (cholinergic) [21] Bệnh Alzheimer là do giảm tổng hợp của Acetylcholine (ACh) (một chất dẫn truyền thần kinh) Trong thực hành lâm sàng, các thuốc được dùng cho bệnh Alzheimer ức chế enzym Acetylcholinesterase duy trì được nồng độ của ACh bằng cách giảm tốc độ phân hủy ACh

Chi Panax L gồm nhiều loài cây thuốc quý như Nhâm sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng) đã được sử dụng từ lâu đời Các loài thuộc chi Panax L có thành phần hóa học chính là saponin Đây là hợp chất

cho nhiều tác dụng sinh học khác nhau Trong đó, tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của dịch chiết saponin từ các loài thuộc chi Panax ngày càng được quan tâm nghiên cứu nhiều Theo nghiên cứu của Cheng et al (2005), các ginsenosid Rg1, Rb1 giúp tăng độ bền các tế bào thần kinh [45] Nghiên cứu của Cheng et al (2016) cho thấy Nhân sâm và Ginsenosid Rg1, Rg3 và Re giảm Aβ trong não động vật [45] Ngoài ra, trong nghiên cứu của Zhong, Z

et al (2005), Saponin trong Tam thất giúp tăng nồng độ và hoạt tính của Cholin acetyltransferase, do đó giúp bảo vệ và cải thiện hệ thần kinh cholinergic [52] Saponin cho tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh theo nhiều cơ chế khác nhau, một trong số các cơ chế liên quan đến khả năng chống oxy hóa của hợp chất saponin [45]

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H Tsai et K M Feng) là 2 loài thuộc chi Panax L., họ Nhân sâm (Araliaceae), phân bố chủ yếu ở vùng Tây Bắc Trong dân gian, 2 loài

được sử dụng với công dụng là thuốc bổ, cầm máu, giảm đau… Tuy nhiên, các nghiên cứu về tác dụng sinh học của 2 loài này còn hạn chế Qua các nghiên cứu của Liang, Chun, et al (2010) và Nguyễn Hữu Tùng, et al (2011)

về thành phần hóa học của 2 loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cho thấy saponin khung drammaran và oleanan chiếm tỷ lệ cao trong rễ và lá Với tỷ lệ hàm lượng saponin cao trong Sâm vũ diệp và Tam thất hoang, liệu 2 loài này

có tác dụng chống oxy hóa và tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trong bệnh

Alzheimer không? Tôi đã thực hiện đề tài: “Bước đầu đánh giá tác dụng

chống oxy hóa và ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên thực nghiệm” với mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất

hoang trên in vitro

2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ

diệp và Tam thất hoang trên in vitro

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Panax L

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), chi Panax L

có vị trí phân loại như sau:

Giới Thực vật (Planta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Tuy nhiên, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về thực vật

của các loài thuộc chi Panax L

1.1.2 Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L

Cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ Thân rễ ngắn hoặc thon

dài, phân nhánh Các loài khác nhau của chi Panax L có sự khác nhau về độ bền của rễ (rễ các loài P japonicus C A Mayer, P vietnamensis Ha & Grushv., và P wangianus S C Sun dễ bị thủy phân hơn) và hình dạng của rễ

Lá kép chân vịt, mọc vòng từ 3 – 5 lá, mép lá có răng cưa hoặc xẻ thùy lông chim Cụm hoa tán đơn, hoa lưỡng tính có bầu dưới Hoa có 5 lá đài hàn liền

ở dưới, tràng 5, nhị 5 Bầu 2-3 có khi đến 5 ô Quả mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn [41]

Himalaya là nơi phân bố của nhiều loài khác nhau thuộc chi Panax L (Burkill

1902; Hara 1970; Hu 1976; Wen and Zimmer 1996) [32]

1.1.4 Thành phần hóa học chính của chi Panax L

Các hợp chất saponin hay còn được biết đến là các ginsenoside là thành

phần chính cho tác dụng sinh học trong các loài thuộc chi Panax L Ngoài ra,

nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp như các acid hữu cơ, ester, các polysaccarit, các amino acid, các sterol, flavonoid và các carben… cũng đã

được tìm thấy trong các loài thực vật thuộc chi Panax L

1.1.4.1 Hợp chất saponin

Hợp chất saponin hay ginsenosid là oligosaccarit của triterpenoid khung dammaran hoặc oleanan Các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc của ít nhất 289 saponin khác nhau Dựa vào cấu trúc của các sapogenin, các ginsenosid đã biết có thể được phân loại thành 6 nhóm khác nhau: saponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất của protopanaxatriol, saponin dẫn chất của octillol, saponin dẫn chất của acid oleanolic, saponin có chuỗi bên C17 biến đổi và các saponin khác Trong đó, sponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất của protopanaxatriol, saponin dẫn chất của octillol và saponin dẫn chất của acid oleanolic là phổ biến nhất [49]

1.1.4.2 Hợp chất polyacetylen

Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon

1.1.5 Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L

1.1.5.1 Nhâm sâm (Panax ginseng C.A Mey)

Nhâm sâm là một trong những vị thuốc quý, được sử dụng với nhiều tác dụng khác nhau, trong đó cho tác dụng chính là điều trị các bệnh tinh thần

và mệt mỏi Ngoài ra, nhân sâm cũng đã được nghiên cứu và cho thấy có nhiều tác dụng khác nhau Thành phần chính saponin trong Nhâm sâm có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư; giúp cải thiện chức năng của hệ tim mạch, hạ cholesterol và lipid máu; và chống kết tập tiểu cầu [29]

1.1.5.2 Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen) (Sanchi ginseng)

Tam thất cũng cho nhiều tác dụng sinh học khác nhau Dịch chiết saponin của Tam thất có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh trung ương và hệ tim

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

huyết, kích thích hệ miễn dịch, chống khối u, chống viêm, giảm đau, chống oxy hóa, chống huyết khối, phòng ngừa xơ vữa động mạch, giúp hạ huyết áp

và tăng hoạt động của tinh trùng [40]

1.1.5.3 Sâm Mỹ ( Panax quinquefolius)

Các nghiên cứu cho thấy Sâm Mỹ có tác dụng kích thích hệ miễn dịch, nhờ sự kích thích sản sinh tế bào lympho B, tăng (interleukin) IL-2, IL-10, interferon- γ và làm tăng tế bào diệt tự nhiên (NK) Sâm Mỹ cũng có tác dụng chống oxy hóa và tác dụng tốt trên hệ tim mạch, giúp làm giảm nhồi máu cơ tim và sự chết theo chương trình (apoptosis) của các tế bào cơ tim Tương tự như Nhâm sâm, Sâm Mỹ cũng có tác dụng chống huyết khối và chống kết tập tiểu cầu Ngoài ra, loài này cũng cho tác dụng hạ đường huyết [39]

1.1.6 Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng)

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) là 2 loài thuộc chi Panax L., họ Nhâm sâm (Araliaceae) Đây là 2 loài cây được tìm thấy mọc tự nhiên ở vùng núi phía bắc

Việt Nam, hiện nay đang được quan tâm phát triển trồng Các nghiên cứu nhiều

cả về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của 2 loài này còn hạn chế

Hình 1.1 Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem

Hình 1.2 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

và Rb3 [50] Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập

và xác định được cấu trúc của 10 saponin khung oleanan trong rễ của Sâm vũ diệp trong dịch chiết methanol Trong đó, xuất hiện 3 hợp chất mới là các bifinoside A—C và 7 hợp chất đã biết bao gồm narcissiflorine methyl ester, chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl ester, stipuleanosid R1, pseudoginsenosid RT1 methyl ester, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl ester [46]

Năm 2015, nhóm tác giả Viện Dược liệu (Trần Thanh Hà, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi) đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm vũ diệp và đã phân lập được một hỗn hợp saponin bao gồm stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid và β-sitosterol-3-O-βD-glucopyranosid, glycosphingolipid: 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-N(1,3,4-trihydroxytridec-8-en-2-yl)

heptacosanamid, dichaccarid: saccharose từ phân đoạn chiết ethyl acetat rễ

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

triterpenoide, tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, polyuronic và những nguyên tố vi lượng [5, 6] Lần đầu tiên hợp chất polyacetylen được nhận diện trong Sâm vũ diệp và Tam thất hoang [6]

b Tam thất hoang

Kết quả nghiên cứu cho thấy phần thân rễ Tam thất hoang chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [34]

Năm 1985, nhóm nghiên cứu Trung Quốc phân lập 2 saponin khung oleanan, stipuleanoside R1 và R2 từ dịch chiết methanol của rễ cây này [48] Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Toyama, Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran bao gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của Tam thất hoang được thu hái ở Trung Quốc [53] Năm

2010, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc công bố xác định được 15 hợp chất saponin khung oleanan trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester, 3 hợp chất polyme, một sesquitecpen và một acid béo [34]

Ngoài ra, Tam thất hoang cũng chứa các thành phần như triterpenoid, tinh dầu, đường khử tự do, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, các nguyên tố vi lƣợng, và polyuronic [5, 6]

Về tác dụng dược lý:

Trong dân gian, 2 loài được sử dụng với công dụng là thuốc bổ, cầm máu, giảm đau… Các hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định có trong Sâm vũ diệp có thể giải thích một phần cho các tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, chống mệt mỏi, chống bệnh tiểu đường, cải thiện chức năng sinh sản… của cây theo y học cổ truyền đã sử dụng [29, 39, 40]

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Liang, Chun, et al tiến hành đánh giá khả năng ức chế khối u của các hợp chất saponin phân lập từ Tam thất hoang Kết quả cho thấy các hợp chất trong dịch chiết cho tác dụng chống khối u trên các dòng tế bào ung thư của người HL-60 (bệnh bạch cầu ác tính) và HCT-116 (ung thư ruột kết) với các giá trị IC50 là khác nhau của từng hợp chất [34] Năm 2011, nhóm nghiên cứu tiếp tục đánh giá khả

năng ức chế NF – κB của các triterpenoid khung oleanan cho thấy một số hợp chất có tác dụng ức chế phụ thuộc liều đến khả năng phiên mã của TNF – α có ảnh bởi NF – kB [35]

1.2.2 Các ROS và RNS

Các gốc tự do hay nói chính xác là các chất hoạt động chứa oxy (Reactive Oxygen Species - ROS ) và các chất hoạt động chứa nito (Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải là gốc tự do (tiền thân của các gốc tự do) [18] (Bảng 1.6)

Bảng 1.1 Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính [18]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ROS được coi là một trong những nguyên nhân chính gây tổn thương

mô Tuy nhiên, sự cân bằng giữa sự sản sinh ROS và hoạt động của hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể sống giúp duy trì sự phá hủy của quá trình oxy hóa ở mức độ thấp Khi sự mất cân bằng xảy ra nghiêm trọng, sản sinh nhiều ROS sẽ gây ra stress oxy hóa ROS là nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, ung thư và rối loạn thần kinh [47]

Tương tự như ROS, RNS có vai trò kép, vừa cho tác dụng có lợi vừa có thể gây hại cho hệ thống sống Nitric oxid là chất được biết sớm nhất với vai trò là phân tử làm giãn nở mạch máu, kiểm soát lượng máu lưu thông đến các

bộ phận của cơ thể Đồng thời, nó có thể là trung gian gây độc tế bào do phá hủy các enzym chuyển hóa bằng phán ứng với superoxid, peroxynitrit [18]

Các ROS và RNS đươc tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động xấu, tốt đến cơ thể [1,18]

Ở nồng độ thấp, các ROS và các RNS là các tím hiệu làm nhiệm vụ: [1]

• Điều hòa phân ly tế bào

• Kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase,…) cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm

• Điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa

Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên: [1]

• Đột biến ở DNA

• Biến tính protein

• Oxy hóa lipid

1.2.3 Stress oxy hóa

1.2.3.1 Khái niệm

Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa sự sản xuất các gốc tự do và khả năng của cơ thể sống trong việc khử các chất trung gian hoạt tính cao hay sửa chữa các hư hại do những chất này gây ra Sự nhiễu loạn của trạng thái oxy hóa khử của các mô có thể gây ra các ảnh hưởng độc hại thông qua sự sản

sinh của các peroxid và gốc tự do làm hư hại tất cả các thành phần của tế bào, trong đó bao gồm protein, chất béo và DNA [13]

1.2.3.2 Ảnh hưởng của stress oxy hóa

Stress oxy hóa là nguyên nhân quan trọng trong các bệnh gây thoái triển thần kinh, bao gồm bệnh xơ cứng teo cơ một bên (Amyotrophic Lateral Sclerosis - ALS) hay bệnh Lou Gehrig, bệnh Parkinson và bệnh Alzheimer [30] Sự sản xuất ROS, RNS liên quan đến con đường bệnh sinh của các bệnh này Sự tích lũy quá trình stress oxy hóa cùng với sự rối loạn quá trình hô hấp của ty thể và sự phá hủy ty thể liên quan đến bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson

và các bệnh lý thần kinh khác [44]

Stress oxy hóa cũng được cho là có liên quan đến một số bệnh tim mạch, do sự oxy hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein - LDL) dẫn đến sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu nội mô, giai đoạn đầu tiên của bệnh huyết áp cao và nhiều bệnh tim mạch khác [1] Đồng thời, stress oxy hóa cũng là nguyên nhân gây đột quỵ, nhồi máu cơ tim, bệnh tiểu đường

Ngoài ra, stress oxy hóa cũng tham gia vào quá trình phát triển bệnh ung thư liên quan đến tuổi Các chất hoạt động ROS và RNS gây stress oxy hóa có thể phá hủy trực tiếp DNA, gây ra đột biến và có thể gây ngăn chặn quá trình phân ly tế bào; từ đó thúc đẩy quá trình phát triển, xâm lấn và di căn

của tế bào khối u [20] Nhiễm Helicobacter pylori làm tăng sự sản xuất của

ROS và RNS trong dạ dày của người, là nguyên nhân của sự phát triển ung thư dạ dày [23]

1.2.4 Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa

1.2.4.1 Phương pháp quét gốc tự do DPPH

Phân tử 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (α, α-diphenyl-β picrylhydrazyl; DPPH) có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa Khi cho các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do

sẽ có khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất So với các phương pháp khác, phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp nhanh, đơn giản và ít tốn kém hơn

1.2.4.2 Phương pháp đánh giá sự khử màu của ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS)

2,2'-azino-bis(3-Phương pháp đánh giá sự khử màu của ABTS được sử dụng để đánh giá cả chất oxy hóa thân nước và chất oxy hóa thân dầu

Phương pháp sử dụng quang phổ diod-array để đo sự mất màu khi thêm một chất chống oxy hóa gốc có màu xanh lam ABTS· + (2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) ABTS· + là một gốc tự do ổn định không tìm thấy trong cơ thể của người Chất chống oxy hóa sẽ làm chuyển ABTS· + thành ABTS và do đó làm mất màu [11]

1.2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính quét gốc tự do hydroxyl

Hydroxyl là một chất hoạt động chứa oxy phản ứng mạnh trong hệ thống sống Nó phản ứng với các acid béo không bão hòa trên màng phospholipid và do đó gây tổn thương tế bào Khả năng quét gốc tự do hydroxyl được đo bằng phương pháp của Kunchandy và Rao (1990) Hỗn hợp phản ứng gồm 100 µl 2-deoxy-Dribose (28 mM trong 20 mM đệm KH2PO4-KOH, pH 7.4), 500 µl dịch chiết 200 μl EDTA (1.04 mM) và 200 μM FeCl3 (1:1 v/v), 100 μl H2O2 (1.0 mM) và 100 μL ascorbic acid (1.0 mM), sau

đó ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng Thêm vào hỗn hợp 1 ml acid thiobarbituric

và 1 ml acid trichloroacetic (2,8%) sau đó ủ ở 100ºC trong 20 phút Đo độ hấp thụ quang của hỗn hợp cuối ở 532 nm [11]

1.3 Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan

tuyến thượng thận và ở các cơ quan được kiểm soát bởi hệ thần kinh tự chủ Tại hệ thần kinh trung ương, ACh được tìm thấy chủ yếu ở các tế bào thần kinh liên lạc

ACh được tổng hợp từ Cholin và Acetylcoezym A thông qua enzym Cholin acetyltransferase, rồi bị đóng gói vào các túi màng bi ̣ ràng buô ̣c Sau sự xuất hiện của mô ̣t tín hiê ̣u thần kinh ở đầu tận cùng của mô ̣t sợi tru ̣c, các túi

màng hợp nhất với màng tế bào sẽ giải phóng ra ACh vào khe synap Đối với

các tín hiê ̣u thần kinh để được dẫn truyền đi tiếp tu ̣c thì ACh phải khuyếch tán sang một tế bào thần kinh hoă ̣c tế bào cơ bắp ở gần ngay đó, nơi nó sẽ ràng buộc và kích hoa ̣t mô ̣t protein thu ̣ thể Sau khi ACh được giải phóng, nó sẽ gắn vào các thụ thể của ACh (thụ thể Nicotinic và Muscarinic) [15]

Trong hệ thố ng thần kinh trung ương, ACh đóng vai trò quan tro ̣ng trong việc dẫn truyền các xung đô ̣ng thần kinh, đảm bảo cho các hoa ̣t đô ̣ng cao cấp củ a vỏ não như các quá trình nhâ ̣n thức, quá trình trí nhớ, chú ý… Khi mức nồng độ ACh giảm xuống thấp, không đủ để gây khử cực, tín hiệu thần kinh sẽ không được truyền đi Vì vâ ̣y ACh có liên quan chă ̣t chẽ với

bệnh Alzheimer

1.3.2 Enzym Acetylcholinesterase

Enzym Acetylcholinesterase (AChE) hay acetylhydrolase, là cholinesterase chính trong cơ thể Nó là enzym xúc tác cho sự phân hủy của acetylcholin và của một vài ester cholin khác có chức năng là các chất dẫn truyền thần kinh AChE được tìm thấy chủ yếu ở các khớp nối thần kinh cơ và các khớp nối thần kinh của

hệ cholinergic [15]

Quá trình thủy phân của ACh diễn ra ở đáy hẻm, mặc dù sự kết hợp ban đầu của enzym AChE diễn ra ở rìa ngoài, ở vùng ngoại biên Ở vị trí trên cùng của hẻm, nơi mà quá trình thủy phân xảy ra, có 4 vị trí hoạt động chính của enzym, bao gồm vị trí ester hóa, hố oxyanion, vị trí anion và túi acyl Các

vị trí hoạt động được minh họa như trên hình 1.3 [24]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Hình 1.3 Các vị trí gắn của enzym AChE [24]

1.3.3 Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer là bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển phổ biến Bệnh Alzheimer liên quan đến việc mất các tế bào thần kinh cholinergic ở não và

sự giảm nồng độ của ACh [1] Bệnh này thường xuất hiện ở người trên 65 tuổi [3], tuy nhiên dạng Alzheimer sớm dù không phổ biến nhưng có thể xảy

ra sớm hơn rất nhiều Năm 2006 có 26,6 triệu người mắc bệnh Alzheimer trên toàn thế giới Dự đoán tỉ lệ mắc Alzheimer trên thế giới sẽ là 1 trên 85 vào năm 2050 [3]

Các nhà khoa học đã đưa ra một số nguyên nhân để giải thích cơ chế bệnh Alzheimer Giả thuyết cổ điển nhất là giả thuyết về hệ thống truyền đạt thần kinh bằng ACh (cholinergic) Trong đó, bệnh Alzheimer được cho là do giảm tổng hợp ACh Các chất ức chế Cholinesterase sẽ làm tăng chức năng của hệ cholinergic bởi nó ức chế enzym phân hủy ACh, do đó làm tăng nồng

độ của ACh, kích thích các receptor nicotinic và muscarinic trong não

Trong thực hành lâm sàng, các chất ức chế ChE vẫn là được sử dụng chính để điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer [20] Các thuốc được dùng cho bệnh Alzheimer ức chế AChE, giúp duy trì được nồng độ ACh bằng cách giảm tốc độ phân hủy ACh

Các loại thuốc hiện đang được các cơ quan quản lý: Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMA) chấp thuận để điều trị các biểu hiện về nhận thức của bệnh Alzheimer

và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân gồm: donepezil, rivastigmine

và galantamine là thuốc ức chế AChE thuận nghịch; memantine là một chất đối kháng thụ thể NMDA Tacrine là chất ức chế AChE đầu tiên được chấp thuận cho điều trị AD năm 1993, nhưng việc sử dụng nó đã bị bỏ vì có nhiều tác dụng phụ bao gồm gan nhiễm độc gan [15]

1.3.4 Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro

Đối với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

1.3.4.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

Trong số những phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây

dựng và ứng dụng sớm nhất Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng Trong đó, phương pháp đo quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng Phương pháp này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’-dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB)

❖ Phương pháp đo quang

Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412

nm Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế enzym AChE in vitro khác tiếp tục được thực hiện Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được

công bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau

đó đều có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng, nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng

❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng [10]

Một trong những hạn chế của phương pháp sắc ký lớp mỏng là có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng không phải do tác dụng ức chế AChE Để khắc phục hạn chế này, bên cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối chiếu) Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau

đó mới phun dung dịch AChE Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch AChE được phun sau Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả [9]

1.3.4.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử

dụng phương pháp này để đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn

chế Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double)

❖ Phương pháp đo quang

Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công

bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K vào năm 1962 Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải phóng chất α-naphthol Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo Hợp chất này được xác định bằng cách

đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm Tuy nhiên, sau đó không

có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di

Giovanni S [17] Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả này có một số thay đổi so với phương pháp của tác giả Van Asperen về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, hóa chất để bất hoạt enzym và nồng độ dung dịch cơ chất

❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym

AChE in vitro và được phát triển bởi Marston năm 2002 Ở phương pháp này,

sau khi bản mỏng được triển khai, dung dịch enzym được phun lên bản mỏng Sau đó, hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch thuốc thử muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng Những chất gây ức chế AChE

sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền màu tím sẫm [17]

Cũng giống phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B cũng có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả Để loại trừ các vết dương tính giả, một bản mỏng đối chiếu tương tự với bản mỏng thử được triển khai Sau đó, các dung dịch α-naphthol và muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng mà không có dung dịch enzym Nếu xuất hiện vết màu trắng thì vết đó là vết dương tính giả

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Ngoài việc sử dụng 2 phương pháp trên, để nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế AChE in vitro trong nghiên cứu, tác giả Tang Z M và cộng sự

đã sử dụng phương pháp điện di mao quản Tuy nhiên, mới chỉ có rất ít nghiên cứu sử dụng phương pháp này được công bố Lý do là phương pháp này đòi hỏi phải có trang thiết bị phù hợp với thao tác thử nghiệm tương đối phức tạp Ngoài ra, những hạn chế về số lượng mẫu thử được đánh giá ở mỗi lần thao tác máy cũng góp phần cản trở việc ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong nghiên cứu sàng lọc