Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và tỷ lệ nhiễm EBV của bệnh nhân u lympho không hodgkin ngoài hạch vùng đầu cổ

Năm 2008, u lympho tế bào B lớn lan tỏa EBVdương tính ở người già được phân loại là một dưới tuýp trong ULKH, nhiềunghiên cứu chỉ ra rằng ở những bệnh nhân này, tiên lượng và đáp ứng điề

ĐẶT VẤN ĐỀ

U lympho là một nhóm bệnh lý tăng sinh ác tính của tổ chức liên võng,bao gồm 2 nhóm bệnh chính: u lympho Hodgkin và u lympho không Hodgkin(ULKH) U lympho ác tính chiếm khoảng 4% trong tổng số các ung thư của

Mỹ, trong đó, ULKH thường gặp hơn u lympho Hodgkin [1]

Trên thế giới, ULKH là loại ung thư phổ biến hàng thứ 8 đối với nam vàthứ 11 đối với phụ nữ,chiếm khoảng 5,1% các ung thư và chiếm 2,7% nguyênnhân gây tử vong do ung thư Khu vực có tỷ lệ mắc ULKH cao bao gồm Bắc

Mỹ, châu Âu và các nước châu Phi [2]

Tại Việt Nam, ULKH đứng hàng thứ 13 trong các loại ung thư thườnggặp Tỷ lệ mắc bệnh là 5,2/100.000 dân Bệnh gặp ở nam nhiều hơn nữ, tuổitrung bình 50 - 60 [2] ULKH có thể biểu hiện ở hạch hoặc ngoài hạch, trong

đó ULKH ngoài hạch chiếm 25 - 40% [3] Vùng đầu cổ là vị trí phổ biến thứhai trong các ULKH ngoài hạch, sau đường tiêu hóa [1] ULKH ngoài hạchvùng đầu cổ có thể gặp ở bất cứ vị trí nào, tuy nhiên vị trí hay gặp nhất làamidan khẩu cái, vùng mũi xoang, các vị trí khác gặp với tỷ lệ thấp hơn [3].Nhiều yếu tố nguy cơ được xác định là có liên quan đến bệnh như virusEpstein - Barr (EBV), HIV, suy giảm miễn dịch, yếu tố di truyền…[4] NhiễmEBV liên quan đến nhiều thể của ULKH, bao gồm u lympho Burkitt’s, ulympho tế bào T/NK, bệnh lý rối loạn đời sống lympho, EBV có mặt ở 2/3trường hợp u lympho có liên quan đến AIDS, và người ta tin rằng chúng có 1vai trò trong cơ chế bệnh sinh Năm 2008, u lympho tế bào B lớn lan tỏa EBVdương tính ở người già được phân loại là một dưới tuýp trong ULKH, nhiềunghiên cứu chỉ ra rằng ở những bệnh nhân này, tiên lượng và đáp ứng điều trịhóa chất kém hơn so với nhóm EBV âm tính [5]

Trên thế giới có một số đề tài nghiên cứu về mối liên quan giữa EBV vớiULKH ngoài hạch vùng đầu cổ Tuy vậy người ta chưa biết rõ về mối liên quangiữa nhiễm EBV với tổn thương trên lâm sàng và đặc điểm mô bệnh học trong

ULKH ngoài hạch vùng đầu cổ Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và tỷ lệ nhiễm EBV của bệnh nhân u lympho không Hodgkin ngoài hạch vùng đầu cổ” với hai mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của u lympho không Hodgkin ngoài hạch vùng đầu cổ.

2 Xác định tỷ lệ EBV trong mô sinh thiết u lympho không Hodgkin vùng đầu cổ.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 U lympho không Hodgkin ngoài hạch vùng đầu cổ

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh U lympho không Hodgkin

1.1.1.1 Trên thế giới

Năm 1832, Thomas Hodgkin lần đầu tiên mô tả 7 trường hợp có hạch vàlách to Sau đó Samuel Wilkes mô tả thêm một số trường hợp và gọi là bệnhHodgkin

Sternberg K (1898) và Dorothy R (1902) đã lần lượt mô tả tế bào đặctrưng để chẩn đoán bệnh Hodgkin, sau này người ta gọi là tế bào Reed -Sternberg Năm 1871, Billroth đã đưa ra thuật ngữ "u lympho ác tính"(malignant lymphoma), thuật ngữ này hiện vẫn đang được sử dụng

Về phân loại, Rappaport (1956) đã sắp xếp các ULKH trước hết dựa vàocấu trúc u tạo thành nốt hoặc lan toả, sau đó chia thành các nhóm nhỏ theoloại tế bào (lympho bào, mô bào và hỗn hợp lympho - mô bào) với các mức

độ biệt hóa của tế bào Lukes và Collins phân chia các tuýp theo 2 dòng tế bào

T và tế bào B Năm 1975, các nhà bệnh học châu Âu đã thảo luận và thốngnhất đưa ra phân loại Kiel

Viện Ung thư quốc gia Mỹ (1982) đã đưa ra bảng công thức thực hànhdành cho lâm sàng Bảng này chia ULKH thành 3 nhóm lớn (nhóm có độ áctính thấp, trung bình và cao), phân loại này được sử dụng đến ngày nay và cógiá trị trong tiên lượng bệnh

Năm 1994, dựa trên các nghiên cứu về hình thái học, miễn dịch học, ditruyền tế bào, sinh học phân tử và lâm sàng, nhóm quốc tế nghiên cứu ulympho đã đưa ra phân loại Revised European American Lymphoma (REAL)

Năm 2001, Tổ chức Y tế thế giới đã công bố một bảng phân loại mới vềcác u của cơ quan tạo máu và lympho.Với những thành tựu về hóa mô miễndịch (HMMD), sinh học tế bào và sinh học phân tử, từ năm 2008 đến naybảng phân loại này được cập nhật, bổ sung những thể mô bệnh học mới trướcđây không phân loại được [6].

1.1.1.2 Tại Việt Nam

Ở nước ta đã có một số công trình nghiên cứu về ULKH

Nguyễn Bá Đức (1995) đã nghiên cứu chẩn đoán và điều trị ULKH tạiBệnh viện K Hà Nội

Lê Đình Hòe (1996) đã nghiên cứu áp dụng phân loại mô bệnh họcULKH trong chẩn đoán và phân loại bệnh

Lê Đình Roanh (2004) đã nghiên cứu phát triển kỹ thuật HMMD trongchẩn đoán một số bệnh ung thư, trong đó có ULKH [7]

Trần Thị Mai (2006) đã có bước đầu nghiên cứu về lâm sàng và các xétnghiệm có giá trị chẩn đoán đối với ULKH nguyên phát ngoài hạch vùng đầu

cổ Từ đó tác giả kiến nghị cần phải nhuộm HMMD để chẩn đoán và phânloại bệnh đã được đưa ra và đang được thực hiện tại bệnh viện [8]

Nguyễn Trần Lâm (2008) đã nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng, HMMD

và bước đầu đánh giá kết quả điều trị của ULKH nguyên phát ngoài hạchvùng đầu cổ [9]

Lê Minh Kỳ (2012) nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học và kếtquả điều trị đa hóa trị của ULKH ngoài hạch vùng đầu cổ [10]

Nguyễn Xuân Quang (2012) đã nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng vàmột số đặc điểm cận lâm sàng của ULKH vùng mũi xoang [11]

1.1.2 Cơ sở tế bào học

1.1.2.1 Lympho bào và quá trình biệt hóa [12]

Về mặt chức năng, lympho bào được chia làm hai dòng là lympho bào B

và lympho bào T Ngoài ra còn có tế bào không B, không T (tế bào NK)

Lympho bào T

Tế bào T có cùng nguồn gốc với mọi tế bào miễn dịch - huyết học khác,

đó là tủy xương Tế bào nguyên thủy của tủy xương sau một số lần biệt hóa

đã tách ra dòng lympho, sau đó tách ra 2 dòng T và B Tế bào lympho Tnhanh chóng được giữ lại ở tuyến ức Ở đây, tế bào lympho T được biệt hóathành các tế bào có chức năng miễn dịch nên còn được gọi là lympho bào phụthuộc tuyến ức Các lympho bào T trưởng thành thường xuyên di chuyển theocác mạch lympho đến các mô lympho, chúng cũng theo dòng máu và thoátmạch ở những tĩnh mạch hậu mao quản để vào vòng tuần hoàn và các tổ chứcbạch huyết ngoại vi: hạch, lách, amiđan, mô lympho ở đường hô hấp, đườngtiêu hóa đảm nhiệm chức năng miễn dịch qua trung gian tế bào Trong máu, tỷ

lệ tế bào T cao hơn hẳn tế bào B (60 - 70%), phù hợp với chức năng săn lùng

và nhận biết những kháng nguyên mới xâm nhập Khi tiếp xúc với khángnguyên, lympho bào T phù hợp với kháng nguyên đó tăng sản và từ đó dẫnđến việc hình thành các tuýp lympho bào khác nhau theo dòng máu, thoátmạch qua các mao mạch nhỏ để hoạt động trong các mô

Lympho bào T có nhiều dạng hoạt động:

- Lympho bào T hỗ trợ (T help - Th) có vai trò hỗ trợ tế bào B: Khi tiếpxúc với kháng nguyên tế bào Th hoạt hóa tiết ra các interleukin (IL) như IL4,IL5…, các IL này có vai trò hoạt hóa tế bào B thành tương bào, sinh ra khángthể đặc hiệu với kháng nguyên mà Th đã nhận biết trước đó Ngoài ra, Th còntác động lên chính Th, Tc, hoạt hóa những tế bào này

- Lympho bào T gây độc (Tc) tiết ra chất tiết gây độc cho tế bào: TNF,Perforin (chất gây thủng).

- Lympho bào T quá mẫn muộn (T Delayed Type Hypersentivity - Tdth )tham gia vào phản ứng quá mẫn muộn, có vai trò tạo ra ổ viêm Dưới tác độngcủa các phân tử hóa ứng động, các tế bào viêm sẽ tập trung đến ổ viêm nhằmkhu trú kháng nguyên lại và tiêu diệt tại chỗ Tdht cũng có vai trò nhận biếtkháng nguyên ngoại lai

Các tế bào lympho T còn có khả năng ghi nhớ miễn dịch Khi tế bào T ởhạch gần nhất gặp kháng nguyên lần đầu sẽ tăng sinh rất mạnh và trên bề mặt

sẽ hình thành các thụ thể đặc hiệu với nhóm quyết định kháng sinh tương ứng.Sau 6 ngày các tế bào này có thể nhận biết kháng nguyên, đồng thời tạo nênnhững tế bào lympho có trí nhớ, có tên là Th nhớ

Lympho bào B

Các tiền tế bào B ở người và động vật có vú là tủy xương và mô lympho

ở thành ruột Tại tủy xương, các tế bào B gốc biệt hóa thành lympho bào B1rồi biệt hóa thành nguyên tâm bào và nguyên bào miễn dịch Nguyên tâm bàobiệt hóa thành tâm bào rồi thành lympho bào B2 Nguyên bào miễn dịch biệthóa thành tế bào trung gian lympho bào dạng tương bào và sau đó biệt hóathành tương bào Lympho bào B2 và tương bào là các tế bào trưởng thành vàlưu thông trong máu ngoại vi Lympho bào B sau khi bị kích thích bởi khángnguyên sẽ chuyển dạng thành nguyên bào miễn dịch B rồi thành các tế bàodạng tương bào và tương bào chế tiết immunoglobin (Ig)

Mô lympho đường hô hấp và tiêu hóa chế tiết IgA và IgE, các mô

lympho khác chế tiết IgG và IgM Đơn vị căn bản của Ig gọi là đơn phân (Monomer) bao gồm 4 chuỗi peptid (hai chuỗi nặng - chuỗi H và hai chuỗi nhẹ - chuỗi L) Có 5 loại chuỗi nặng là alpha, gamma, delta, mega, và epsilon;hai chuỗi nhẹ là lamda và kappa

Mỗi phân tử Ig có 2 chuỗi nhẹ giống nhau (hoặc lambda hoặc kappa) vàmột chuỗi nặng alpha (IgA), gamma (IgG), delta (IgD), muy (IgM) và epsilon(IgE) Các tế bào B ác tính chỉ sản xuất ra các Ig với một chuỗi nặng và chỉmột loại chuỗi nhẹ hoặc lambda hoặc kappa, trong khi các tế bào phản ứngsản xuất ra Ig với chuỗi nhẹ kappa, một số khác với chuỗi nhẹ lamda Đây làmột đặc tính để phân biệt u lympho ác tính với quá sản hạch [13]

Tế bào NK (Natural Killer Cell)

Tế bào NK có khả năng tiêu hủy một số tế bào đích không cần có miễndịch ban đầu: tế bào u, tế bào vật chủ bị nhiễm virus Tế bào NK có vai tròquan trọng trong việc ngăn chặn sự di cư của tế bào u qua máu, bảo vệ cơ thểchống lại virus

1.1.2.2 Các kháng nguyên hữu ích trong bệnh học của các bệnh hệ tạo máu

Dựa vào hình thái người ta không thể phân biệt được các tế bào B, Thay T/NK Muốn phân biệt, người ta phải dùng các phương pháp hóa miễndịch tế bào hay HMMD Người ta dùng các kháng thể để xác địnhcác kháng nguyên hiện diện ở trên màng tế bào và qua đó biết tế bào thuộcdòng nào Trên màng tế bào lympho có các đám biệt hóa (viết tắt là CD), đó

là các kháng nguyên màng và được đánh số từ 1 đến 400 [14]

Các u lympho tế bào B: là các u lympho có tế bào u dương tính với cácdấu ấn CD20, CD79a

Các u lympho tế bào T: là các u lympho có tế bào u dương tính với các

dấu ấn chung tế bào T: CD3, CD5, CD43, CD45RO

1.1.3 Bệnh sinh

U lympho ác tính có thể xuất phát từ tế bào T hoặc tế bào B, đa sốtrường hợp thuộc dòng tế bào B [15] Nguyên nhân sinh bệnh của ULKH chưa

được chứng minh một cách rõ ràng, tuy nhiên cho đến nay, dựa trên những quansát dịch tễ học người ta nhận thấy bệnh có sự liên quan đến các yếu tố sau: [4]

- Những người bị suy giảm miễn dịch: Tỷ lệ mắc bệnh tăng ở nhữngngười nhiễm HIV, AIDS, những bệnh nhân phải dùng thuốc ức chế miễn dịchkéo dài [16]

- EBV: Có sự liên quan chặt chẽ giữa EBV và u lympho Burkitt, ulympho tế bào T/NK

- Retro virus gây Leukemia tế bào T ở người (Human T cell leukemiaretro virus - HTLV): Những nghiên cứu của Gallo và cộng sự đã xác lập đượcHTLV Người ta cũng đã phân lập được dưới nhóm của HTLV là HTLV-1 gâybệnh bạch cầu cấp và cũng là tác nhân liên quan đến u lympho tế bào T của da

- Yếu tố di truyền: Một số nghiên cứu cho thấy những đột biến nằm trên cácđoạn nhiễm sắc thể sau đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học bao gồm:6q22-23; 17p22-23; 13q14-34; 1p32-pter; Xp; và 8p2

- Các thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ như 2-4D, photphat hữu cơ, thuốc diệt

cỏ làm tăng cao nguy cơ mắc u lympho ác tính

- Hóa chất: Các nhóm ngành nghề như nghề hóa, in ấn, tẩy rửa là cácnghề có tiếp xúc nhiều với hóa chất như axit phenoxyacetic chlorophenol,benzene có tỷ lệ mắc bệnh tương đối cao

- Tia phóng xạ: Người ta thấy rằng sau vụ ném bom nguyên tử ở Hiroshima

và Nagasaki (Nhật Bản), tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp và u lympho tăng lên [17]

- Lối sống và chế độ dinh dưỡng: Nguy cơ mắc u lympho ác tính tăng ởnhững người ăn chế độ dinh dưỡng nhiều protein, mỡ và ít vitamin

1.1.4 Phân loại mô bệnh học

Thuật ngữ ULKH bao gồm tất cả các tổn thương ác tính có nguồn gốc từ

hệ thống lympho ngoại trừ u lympho Hodgkin ULKH thường gặp hơn bệnhHodgkin và là những u ác tính hơn bệnh Hodgkin Phần lớn ULKH là những

u dòng tế bào B, ít gặp hơn là dòng tế bào T, hiếm gặp những trường hợpkhông biểu hiện dấu ấn của dòng B hoặc dòng T và những dòng mô bào làcực kỳ hiếm gặp Việc phân tuýp thích hợp với lâm sàng cho đến nay chủ yếuvẫn dựa vào các đặc điểm về hình thái mô bệnh học

Phân loại Công thức thực hành [18]

Vì sự đa dạng và phức tạp của ULKH vùng đầu cổ, nhiều tác giả đã đưa

ra nhiều bảng phân loại mô bệnh học khác nhau Tuy nhiên, với giá trị địnhhướng cho điều trị và tiên lượng, bảng Công thức thực hành - WorkingFormulation (WF) nhanh chóng trở nên phổ biến với các nhà lâm sàng vàđược sử dụng trong nhiều trung tâm ở Mỹ trong các thử nghiệm lâm sàng Bảng phân loại này như sau :

a) Độ ác tính thấp:

WF1: U lympho ác tính, lympho bào nhỏ

WF2: U lympho ác tính, nang, ưu thế tế bào nhỏ nhân khía

WF3: U lympho ác tính, nang, hỗn hợp tế bào lớn và tế bào nhỏ nhân khía

b) Độ ác tính trung gian:

WF4: U lympho ác tính, nang, ưu thế tế bào lớn

WF5: U lympho ác tính, lan toả, tế bào nhỏ nhân khía

WF6: U lympho ác tính, lan toả, hỗn hợp tế bào lớn và tế bào nhỏ

WF7: U lympho ác tính, lan toả, tế bào lớn

c) Độ ác tính cao:

WF8: U lympho ác tính, tế bào lớn, nguyên bào miễn dịch

WF9: U lympho ác tính, nguyên bào lympho

WF10: U lympho ác tính, tế bào nhỏ nhân không khía

d) Các loại khác:

Loại mô bào thực sự

U lympho da, tế bào T.

Các loại khác

Theo phân loại này: nhóm độ ác tính thấp có tỷ lệ sống thêm 5 năm là 50

- 60%, nhóm có độ ác tính trung bình có tỷ lệ sống thêm 5 năm là 30 - 45% vànhóm có độ ác tính cao có tỷ lệ sống thêm 5 năm là 20 - 30%

Hạn chế của bảng phân loại này là một số thể bệnh mới được tìm ra saunày không được đưa vào Năm 1994, nhóm quốc tế nghiên cứu u lympho đãđưa ra phân loại REAL (Revised European American Lymphoma) dựa trêncác nghiên cứu về hình thái học, miễn dịch học, di truyền tế bào, di truyềnphân tử và lâm sàng

Phân loại các u lympho theo Tổ chức Y tế Thế giới năm 2016

Năm 2001, Tổ chức Y tế thế giới đã công bố một bảng phân loại mới vềULKH, cơ bản dựa trên phân loại REAL sau đó được cập nhật vào năm 2008,

2016 Bảng phân loại WHO 2016 như sau: [6]

Tế bào B

 U lympho/lơ xê mi tiền B, không phân loại

 U lympho/lơ xê mi tiền B với bất thường di truyền đặc thù

Tế bào B trưởng thành

 Lơ xê mi kinh dòng lympho/ u lympho tế bào nhỏ

 U lympho vùng rìa ngoài hạch của tổ chức lympho niêm mạc (MALY)

 U lympho vùng rìa tại hạch

 U lympho vùng rìa tại lách

 Lơ xê mi/ u lympho tại lách, không phân loại

 U lympho tế bào áo nang

 U lympho thể nang

 U lympho dạng lymphoplasmatic

 U lympho trung tâm nang ở da tiên phát

 U lympho tế bào B lớn lan tỏa, không đặc hiệu

 U lympho tế bào B lớn lan tỏa giàu tế bào T/mô bào

 U lympho tế bào B lớn lan tỏa tiên phát ở hệ thần kinh trung ương.

 U lympho tế bào B lớn lan tỏa tiên phát ở da, thể chân

 U lympho tế bào B lớn lan tỏa EBV dương tính ở người già

 U lympho tế bào B lớn lan tỏa liên quan đến viêm mãn tính

 U lympho tế bào B lớn ở trung thất nguyên phát

 U lympho tế bào B lớn nội mạch

 U lympho tế bào B lớn ALK +

 U lympho tế bào B lớn tăng sinh trong bệnh Casleman đa ổ liên quanHHV8

 U lympho lan tỏa tiên phát

 U lympho nguyên tương bào

 U lympho tế bào Burkitt

 U lympho tế bào B không phân loại với đặc trưng trung gian u lympho

tế bào B lớn lan tỏa và u lympho Burkitt

 U lympho tế bào B không phân loại với đặc trưng trung gian u lympho

tế bào B lớn lan tỏa và bệnh Hodgkin kinh điển

Tế bào T

 U lympho/ lơ xê mi lympho blast tiền T

Tế bào T/NK trưởng thành:

 U lympho dạng vaccine Hydroa

 Lơ xê mi/ U lympho tế bào T người lớn

 U lympho tế bào T/NK ngoài hạch, thể mũi

 U lympho tế bào T liên quan đến bệnh lý đường ruột

 U lympho tế bào T thể gan lách

 U lympho tế bào T dạng panniculitis dưới da

 Hội chứng Sezary.

 Mycosis fungoides

 U lympho tế bào T gamma/delta ở da tiên phát

 Rối loạn tăng sinh lympho T CD 30+, da tiên phát

 U lympho tế bào T ngoại vi, không đặc hiệu

 U lympho T nguyên bào miễn dịch mạch

 U lympho tế bào lớn kém biệt hóa, ALK +

 U lympho tế bào lớn kém biệt hóa, ALK +

Triệu chứng toàn thân

Bệnh biểu hiện toàn thân chủ yếu với các triệu chứng như:

- Sốt: Thường sốt trên 380C, sốt không có quy luật, kéo dài dai dẳng,không rõ nguyên nhân nhiễm trùng cụ thể

- Đổ mồ hôi về đêm, đổ mồ hôi không liên quan đến gắng sức

- Gầy sút cân: Thường gầy sút >10% trọng lượng cơ thể trong vòng 6tháng trước khi phát hiện bệnh

Khi có cả 3 triệu chứng trên bệnh nhân có hội chứng B, một biểu hiệngợi ý sự nặng lên của bệnh [19]

Giai đoạn muộn biểu hiện suy kiệt, nhiễm trùng nhiễm độc toàn thân

Triệu chứng cơ năng

Bệnh nhân có cảm giác đau tại vị trí xuất hiện u

Các rối loạn chức năng sinh lý tại chỗ

Vùng mũi xoang: ngạt mũi và kèm theo chảy máu mũi, giảm mất ngửi,đau nhức vùng mũi

Vùng hầu họng: nuốt vướng và đau, cảm giác có dị vật, khít hàm, thayđổi giọng nói

 Thanh quản: khàn tiếng và khó thở

 Mắt: sưng, giảm thị lực, nhìn đôi

Theo Assanasen và Hart, hơn 50% các trường hợp ULKH ngoài hạch vùngđầu cổ xuất phát ở vòng Waldayer trong đó Amiđan khẩu cái là vị trí hay gặpnhất với tỷ lệ dao động từ 34 - 54,55%, vùng mũi xoang đứng ở vị trí thứ 2với tỷ lệ tương ứng là 24,67% Các vị trí khác gặp với tỷ lệ ít hơn [20]

 U lympho ở đáy lưỡi: Tổn thương ở đáy lưỡi hoặc thành họng thường

là một khối phồng, sờ mềm ở dưới niêm mạc

 U lympho ở khoang miệng: bệnh nhân có khối sưng tại chỗ, đau và loét

 Vùng thanh quản: khàn tiếng và khó thở là các triệu chứng thường gặp

 U lympho tuyến nước bọt: phổ biến nhất là u lympho của tuyến mangtai, sau đó là tuyến dưới hàm Khoảng 15% các trường hợp có hội chứngSjogren Khi thâm nhiễm thần kinh VII sẽ gây liệt mặt, tuy nhiên hiếm gặp.Thường kèm theo hạch cổ

 U lympho tuyến giáp: Bệnh nhân thường xuất hiện một khối ở tuyếngiáp to nhanh hoặc có triệu chứng khàn tiếng hoặc nuốt vướng Hay gặp ởbệnh nhân nữ và thường có hạch dưới hàm.

Chẩn đoán giai đoạn bệnh theo Ann Arbor [21]

Đối với ULKH việc phân giai đoạn bệnh, ngoài giá trị tiên lượng nó còn cầnthiết để so sánh các phương thức điều trị khác nhau cho cùng một loại mô học.Giai đoạn I: tổn thương một vùng hạch (I) hoặc tổn thương khu trú ở một

vị trí hoặc một cơ quan ngoài hạch (IE)

Giai đoạn II: tổn thương hai vùng hạch trở lên ở cùng phía so với cơhoành (II) hoặc tổn thương khu trú ở một vị trí hay một cơ quan ngoài hạch vàhạch lympho vùng của nó, kèm theo hoặc không tổn thương vùng lymphokhác ở một phía cơ hoành (IIE)

Giai đoạn III: tổn thương nhiều vùng hạch lympho ở cả hai phía của cơhoành (III), có thể kèm theo tổn thương khu trú ở vị trí hoặc cơ quan ngoàihạch (IIIE), hoặc kèm tổn thương lách (IIIS) hoặc cả 2 (IIIES)

Giai đoạn IV: tổn thương lan toả nhiều ổ ở một hay nhiều cơ quan ngoàihạch kèm theo hoặc không hạch lympho phối hợp, hoặc tổn thương một cơquan ngoài hạch kèm với tổn thương hạch ở xa

Trong đó:

A: Không có triệu chứng toàn thân

B: Có ít nhất một trong các triệu chứng toàn thân kèm theo: sốt, sụt cân,

đổ mồ hôi

E (extranodal): Có tổn thương ít nhất một vị trí ngoài hạch

S (spleen): Có tổn thương lách

Thực tế lâm sàng, người ta đánh giá bệnh ở giai đoạn khu trú (giai đoạn

I, IE, II, IIE), không có u đường kính lớn hơn 10cm và bệnh nhân không cóhội chứng B

Phân loại Lugano [21]

Bảng 1.1 Phân loại Lugano

II Tổn thương hai vùng hạch trở lên

trên cùng một phía cơ hoành

Giai đoạn I hoặc II tổn thương hạch + tổn thương ngoài hạch tại vùng

II u lớn Giai đoạn II + “u lớn” Không áp dụng

 Mô bệnh học và HMMD

Đây là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh ULKH ngoài hạch vùng đầu cổ

Bảng phân loại mô bệnh học được dùng hiện nay là Bảng Công thứcthực hành (WF) Theo Lê Đình Roanh, ULKH tiên phát ngoài hạch ở vùngđầu và cổ phổ biến là tuýp lan tỏa, tế bào lớn (52,4%), sau đó là tuýp lan tỏa,hỗn hợp tế bào lớn và nhỏ (22,3%) Các tuýp khác chiếm tỷ lệ thấp [7]

Dựa vào hình thái người ta không thể phân biệt được các tế bào B, T hayT/NK Muốn phân biệt, người ta phải dùng các phương pháp HMMD Nghiêncứu HMMD trên các lớp cắt mô bệnh học giúp chúng ta chẩn đoán rõ ràng vềkiểu loại tế bào lympho là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định Các dấu ấnmiễn dịch chủ yếu của tế bào u là CD2, CD3 bào tương, CD56 Ngoài ra còn cóthể thấy biểu lộ các kháng nguyên CD7, CD30, CD43, CD45ro, HLA-DR, IL-2receptor, Fas (CD95), Fas ligant [14]

 Huyết tủy đồ

Đây là xét nghiệm cần thiết nhằm kiểm tra chức năng tạo huyết của tủyxương, giúp các nhà lâm sàng có phương hướng trong việc điều trị bệnh.Đồng thời nó còn đánh giá tình trạng thâm nhập của tế bào lympho non vàomáu ngoại vi và vào tuỷ

 Định lượng men LDH (Lactate dehydrogenase)

LDH là một enzym của quá trình đường phân yếm khí và có ở rất nhiều

mô, xúc tác phản ứng khử hydro của axit lactic thành axit pyruvic.LDH có trong hầu hết các tế bào đang chuyển hóa, trong bệnh lý khối u, quátrình đường phân yếm khí diễn ra mạnh hơn ở mô bình thường Đây khôngphải là đặc điểm đặc trưng của ULKH nhưng là một yếu tố giúp theo dõi kếtquả điều trị cũng như diễn biến bệnh Tiên lượng nặng lên khi LDH tăng caohơn mức giới hạn, chứng tỏ bệnh đang trong giai đoạn tiến triển [18]

 Xquang tim phổi thẳng

Đánh giá một cách sơ bộ các tổn thương của trung thất và phổi

1.1.5.2 Chẩn đoán phân biệt [15]

Chẩn đoán xác định bệnh Wegener cũng dựa trên kết quả nghiên cứu

mô bệnh học với cách lấy sinh thiết sâu, xa vùng hoại tử thì mới thấy đượchình ảnh các mao mạch bị tổn thương

Bệnh Wegener có tiên lượng tốt hơn so với ULKH

- Bệnh lý nhiễm trùng

Bệnh lao, giang mai, nấm cũng có thể có một số triệu chứng lâm sàngtương tự bệnh ULKH Hỏi kỹ tiền sử, thăm khám nội soi và nhất là xétnghiệm mô bệnh học giúp chẩn đoán phân biệt

- Các khối u vùng đầu cổ khác

Xét nghiệm mô bệnh học giúp phân biệt các nguyên nhân khối u ở vùngđầu cổ như ung thư biểu mô, adenocarcinome, tuyến nước bọt phụ,rhabdomyosarcome, chondrosarcome, melanome, adenocarcinome,

1.1.6 Điều trị

Nguyên tắc chung trong điều trị ULKH là dựa vào tuýp mô bệnh học vàgiai đoạn bệnh, trong đó tuýp mô bệnh học đóng vai trò quan trọng Xu hướngchung đang được áp dụng là kết hợp nhiều phương pháp, chủ yếu là tia xạ vàhóa chất [22]

Các phác đồ thường được áp dụng:

- Lựa chọn đầu tiên: CHOP và R - CHOP nếu có CD20+

- U lympho tế bào áo nang: Phác đồ hyper CVAD

- U lympho Burkitt: Hyper CVAD, EPOCH, CALGB

- U lympho tế bào T ngoại vi, không đặc hiệu: CHOP, CHOP - E

- Tế bào T/NK ngoài hạch, tuýp mũi: Hóa xạ, phác đồ SMILE

1.1.7 Tiên lượng

Việc tiên lượng bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố: giai đoạn bệnh, phân

độ ác tính của chẩn đoán mô bệnh học, các yếu tố nguy cơ và sự đáp ứng vớiđiều trị của bệnh nhân

Bảng điểm các yếu tố tiên lượng International Prognostic Index (IPI) baogồm: [22]

- Trên 60 tuổi

- Có ≥ 2 vị trí tổn thương ngoài hạch

- LDH trên mức bình thường

- Giai đoạn bệnh III, IV

- Có triệu chứng toàn thân

Nguy cơ thấp: Có 0 hoặc 1 yếu tố

Nguy cơ trung bình: Có 2 hoặc 3 yếu tố

Nguy cơ cao: Có 4 hoặc cả 5 yếu tố

Đại đa số các bệnh nhân ở giai đoạn I có thể chữa khỏi bệnh bằng hóachất Những bệnh nhân ở giai đoạn III và IV với thể chẩn đoán mô bệnh học

thuận lợi (độ ác tính thấp) sẽ có sự lui bệnh rất tốt nhưng cuối cùng cũng chỉ có

30 - 40% bệnh nhân đạt thời gian sống thêm toàn bộ trên 5 năm Có 30% bệnhnhân ở giai đoạn II, III hay IV với thể chẩn đoán mô bệnh học không thuận lợi(độ ác tính cao) có thể chữa khỏi nếu điều trị hóa chất mạnh có kết hợp tia [23]

1.2 Virus Epstein - Barr và phương pháp phát hiện Real - time PCR

1.2.1 Virus Epstein - Barr (EBV)

1.2.1.1 Lịch sử nghiên cứu EBV trong u lympho

EBV lần đầu tiên được mô tả bởi Denis Burkit khi ông nghiên cứu vềmột khối u xương hàm xảy ra ở trẻ em châu Phi Ngày nay người ta gọi là ulympho Burkitt Sau đó, loại virus này được phân lập từ mẫu bệnh phẩm khối

u lympho Burkit bằng kính hiển vi điện tử Năm 1970, Werner và GertrudeHenle công bố nghiên cứu về sự có mặt của EBV DNA trong mô sinh thiếtbệnh nhân u lympho Burkitt, cung cấp bằng chứng mạnh mẽ về mối liên quangiữa EBV với loại u lympho này [24]

Năm 1966, MacMahon cho rằng u lympho Hodgkin là do vi sinh vậttruyền nhiễm gây nên [25] Những nghiên cứu sau đó phát hiện ra lượngkháng thể kháng EBV đặc hiệu trong máu cao ở những bệnh nhân u lymphoHodgkin [26] Những nghiên cứu sau này dần làm sáng tỏ mối liên quan giữa

u lympho Hodgkin và EBV

Đối với u lympho tế bào T, EBV được cho là có liên quan đến nhiều thể

mô bệnh học EBV DNA đã được tìm thấy trong mô sinh thiết u lympho tếbào T mũi xoang ở bệnh nhân ở các khu vực trên thế giới như Peru [27], NhậtBản [28], Trung Quốc… Đặc biệt, u lympho tế bào T/NK ngoài hạch thể mũiđược coi là có mối liên quan mật thiết nhất với EBV [29] Một số nghiên cứuchỉ ra rằng EBV DNA được phát hiện trong mô sinh thiết u lympho tế bàoT/NK ngoài hạch, tuýp mũi với tỷ lệ 90 - 100% tùy nghiên cứu [30] [31]

1.2.1.2 Cấu trúc

Hình 1.1 Cấu trúc virus EBV (Szakonyi)[32]

EBV là loại virus DNA xoắn kép, được chứa đựng trong một vỏ Capsid.

- Capsid: Đối xứng hình khối, có vai trò bảo vệ DNA của virus vàmang tính kháng nguyên đặc trưng cho virus

+ Bao gồm 162 capsome, là những cấu trúc trên 5 đỉnh hay 6 đỉnh

+ Capsid được bao quanh bởi một vỏ bao ngoài khác là glycoprotein.Chiều dài bộ gen của EBV khoảng 172kb, nucleotid loại G - C chiếm 60%tổng số nucleotid EBV hình thành phân tử DNA dạng vòng ở tế bào bị nhiễm.EBV có thể tồn tại dạng không hoạt động trong các tế bào bị nhiễm Ởthể này, EBV biểu lộ 12 gen, nhưng chỉ có 10 gen trong số này được dịch mã

để tổng hợp protein, bao gồm 6 loại protein kháng nguyên nhân, ký hiệu làEBNA: 1, 2, 3A, 3B, 3C và EBNA - LP và 3 loại protein màng tiềm ẩn, kýhiệu là LMP: 1, 2A, 2B Các protein kháng nguyên nhân có liên quan đến vaitrò xâm nhập và nhân lên của virus trong tế bào lympho giai đoạn đầu, cácloại protein màng tiềm ẩn liên quan đến chu kỳ quan đến chu kỳ EBV trong tếbào lympho B đã chuyển đổi

Các kháng nguyên EBV của thể tiềm ẩn:

- Kháng nguyên EBNA1:

Protein màng

Vỏ

CapsidDNA

+ EBNA1 thuộc dòng tế bào B95 -8 có trọng lượng khoảng 66-95 kDa

và chiều dài 641 acid amin

+ Cấu trúc cơ bản của EBNA1 được chia làm 4 phần:

Vùng cơ bản đầu N gồm 89 acid amin

Vùng lặp lại Gly - Ala gồm 239 acid min

Vùng cơ bản ngắn

Vùng gắn DNA ở đầu C có chiều dài từ 64 - 459 acid amin

EBNA1 là protein biểu lộ hầu như ở tất cả các tế bào nhiễm EBV vàđóng vai trò quan trọng trong việc duy trì episom của EBV dạng vòng trongnhân tế bào chủ, cũng như chức năng phiên mã của tế bào chủ

EBNA2 là một trong những protein virus đầu tiên được biểu lộ ở các tếbào lympho B bị nhiễm EBV (sau 24 - 48h) Protein này đóng vai trò là chấtkích hoạt phiên mã một số gen của virus và tế bào, bao gồm cả những gennhư CD21, CD23, Bcl - 2 và c - myc, và là chất cần thiết cho sự bất tử của tếbào B trong in vitro

- Kháng nguyên EBNA3

Gồm 3 protein là EBNA 3A, 3B và 3C, trọng lượng phân tử 140 180kDa Các protein này có chức năng phiên mã và cũng có thể tương tác vớicác protein RBP - JK

EBNA LP:

Các protein EBNA - LP có kích thước khác nhau từ 20 - 130 kDa, là kếtquả của hoạt động promoter Wp Cùng với EBNA2, EBNA - LP là một trongnhững protein đầu tiên biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào lympho B in vitro

- LMP1 :

LMP1 là một protein màng, xấp xỉ 60 - 66 kDa

LMP1 tham gia ba chức năng chính là chuyển dạng, di căn và chống lạichết theo chương trình.

- LMP 2A/2B:

LMP 2A và LMP 2B có cấu trúc giống nhau, chỉ khác nhau là LMP 2A

có thêm đoạn 119 acid amin ở đầu tận N còn LMP 2B thì không

Mặc dù chưa biết được chức năng cụ thể của LMP 2B nhưng người tacho rằng nó đóng vai trò quan trọng trong sinh học EBV

1.2.1.4 Khả năng lây truyền

EBV là loại virus truyền nhiễm gây bệnh trên người và lây truyền quađường tiêu hóa, được phát hiện trong nước bọt, niêm dịch vùng họng EBVgây nhiễm trùng tiềm ẩn ở hơn 90% người trưởng thành trên thế giới và tồntại lâu dài trong cơ thể Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước bọt và ởlứa tuổi rất sớm của đời sống con người mà thường không có triệu chứng.Ngoài ra, EBV có thể lây truyền qua máu, tổ chức, qua sữa mẹ truyền sangcon thậm chí là thông qua quan hệ tình dục [33]

1.2.1.5 Cơ chế gây ác tính [34]

Nhiều công trình nghiên cứu về EBV đã nhận định rằng EBV là loạivirus ái tế bào biểu mô và lympho bào B EBV lây truyền chủ yếu qua nướcbọt, sau đó xâm nhập vào các tế bào lympho B, tế bào biểu mô vòm họng, liênbào tuyến nước bọt trực tiếp qua thụ thể CD21 và gián tiếp qua IgA nhờ cácphân tử gp350/250 của EBV Tại các tế bào, virus được lưu trữ, sao chép đồngthời thiết lập một quá trình nhiễm tiềm ẩn Nhiễm EBV gây ra 2 thể trong tếbào chủ:

+ Thể dung giải (nguyên phát): tạo ra một chu kỳ sao chép virus hoànchỉnh bao gồm việc tạo thành những hạt virus con và giải phóng chúng rangoài sau khi phá vỡ tế bào chủ Tiếp theo, virus con lại nhiễm vào tế bào mớinhờ recepter CD21

+ Thể tiềm ẩn: Sau khi virus con xâm nhập vào tế bào lành (tế bào mới)khác thì có một lượng nhất định gen virus được biểu lộ nhưng không sản xuấthạt virus hoàn chỉnh và không li giải tế bào đó được

Kiểu hình của nhiễm EBV ở thể tiềm ẩn được chia làm 3 tuýp (I, II, III)tùy theo sự biểu lộ của 10 gen tiềm ẩn

Theo nhiều tác giả, LMP1 đóng vai trò then chốt trong việc biến đổi áctính của lympho B in vitro Theo Gregory và CS, LMP1 hoạt hóa gen gây ungthư của tế bào là bcl - 2, có tác dụng chống lại hiện tượng chết theo chươngtrình trong tế bào B của người Vì vậy, sự cảm ứng của bcl - 2 thông quaLMP1 có thể góp phần cho sự sống sót của virus trong quần thể những tế bào

B trí nhớ sống dài ngày

Virus gây dung giải tế bào, giải phóng ra hàng loạt và thâm nhiễm vàocác tế bào lympho khác Nhờ sự trợ giúp của một số sản phẩm protein sớm(EBNA - 1) và muộn (LMP1), tế bào lympho B bị biến đổi, non hóa và biệthóa chúng tăng sinh và tiến triển ung thư

1.2.2 Phát hiện EBV bằng kỹ thuật Real - time PCR

Năm 1983, Karry Mullis và cộng sự đã phát minh ra PCR là một phươngpháp tổng hợp DNA in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào

PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quátrình sao chép DNA với sự tham gia của enzym DNA - polymerase chịu nhiệt,

có 2 đoạn ngắn DNA, một sợi làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làmkhuôn tổng hợp sợi mới bổ sung với nó

PCR là kỹ thuật nhằm tạo ra một số lượng lớn bản sao DNA mục tiêutrong ống nghiệm dựa vào những chu kỳ nhiệt Nguyên lý kỹ thuật PCR hoàntoàn dựa vào quy trình sao chép DNA trong tế bào, trong đó DNA được nhânlên theo cơ chế bán bảo tồn Mỗi chu kỳ nhiệt gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Bẻ gãy liên kết Hydro của mạch đôi DNA ở nhiệt độ 940

C , DNA sợi kép biến thành các mạch đơn

- Giai đoạn 2: Bắt cặp: Nhiệt độ 55 - 650C, các đoạn mồi đến bắt cặp bổsung vào DNA đích

- Giai đoạn 3: Nhiệt độ 720C, thích hợp cho hoạt động của enzym Taqpolymerase, kéo dài đoạn mồi

Như vậy, sau 1 chu kỳ nhiệt, 1 DNA tạo ra được 2 DNA mới

Cứ như vậy, sau n chu kỳ, số bản sao DNA được tạo ra là 2n

[35] Trong kỹ thuật PCR cổ điển, sau khi hoàn tất khuếch đại DNA đích,người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước thí nghiệm để đọc kếtquả xác định, người ta gọi là giai đoạn thí nghiệm sau PCR

Ngày nay người ta sử dụng kỹ thuật Real - time PCR là kỹ thuật mà kếtquả khuếch đại hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng nhiệt Có thểnói Real - time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thànhhàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ốngphản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làmthí nghiệm có thể thấy được [36]

Các vấn đề kỹ thuật cơ bản của Real - time PCR:

1.2.2.1 Máy Real - time PCR

Máy Real time PCR gồm 2 thành phần:

- Buồng ủ nhiệt chạy được chương trình luân nhiệt

- Thiết bị Real - time

Đây là thiết bị quang học gồm 2 chức năng:

+ Phát ra các tia sáng kích thích có bước sóng xác định lên các tube phảnứng Real - time PCR

+ Ghi nhận được các ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các tube phản ứngReal - time PCR khi các tube này được chiếu bằng các tia sáng kích thích

1.2.2.2 Biểu đồ khuếch đại của Real - time PCR

Kết quả khuếch đại được biểu diễn bởi 1 biểu đồ gọi là biểu đồ khuếch đại.Biểu đồ này gồm có trục tung là cường độ huỳnh quang phát ra từ cácống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, trục hoành là các chu kỳ nhiệt.Đường biểu diễn khuếch đại gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Giai đoạn ủ

Trong giai đoạn này, số lượng DNA đã được sao bản chưa đủ lớn để giúpchất phát huỳnh quang nhận được ánh sáng kích thích phát ra ánh sáng huỳnhquang đủ cường độ để máy ghi nhận

Giai đoạn 2: Giai đoạn lũy thừa

Khi số lượng bản sao của DNA đích tăng lên đến ngưỡng thì ánh sánghuỳnh quang sẽ phát ra đủ cường độ để máy ghi nhận được Từ đây, cường độhuỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt

Giai đoạn 3: Giai đoạn Bình nguyên

Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng lên đến một giai đoạn nào

đó thì tốc độ tăng trưởng sẽ chậm dần và đạt bình nguyên Nguyên nhân do cạnkiệt dần dNTP và enzym Tab Polymerase không hoạt động hiệu quả nữa, dẫn

đến các bản sao DNA không còn tăng lên theo cấp số nhân nữa

Hình 1.2 Biểu đồ khuếch đại Real-time PCR [37]

Lợi thế của Real-time PCR so với PCR cổ điển: đơn giản, nhanh chóng,

dễ phân tích kết quả; tránh được ngoại nhiễm vì không cần phân tích sauPCR; có thể định lượng được trong phạm vi lớn; có độ nhạy và độ đặc hiệucao Vì vậy, hiện nay để xác định sự xuất hiện các tác nhân virus hay vi khuẩnthông qua bộ gen của chúng, phương pháp Real-time PCR được coi là 1phương tiện chẩn đoán hiệu quả

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Các bệnh nhân được chẩn đoán xác định là ULKH nguyên phát ngoài hạchvùng đầu cổ bằng mô bệnh học, được theo dõi và điều trị ở khoa Ung bướuBệnh viện Tai mũi họng Trung Ương từ tháng 8 năm 2017 đến hết tháng 8năm 2018.

Tất cả các bệnh nhân có tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ như sau:

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

- Bệnh nhân được chẩn đoán ULKH nguyên phát ngoài hạch vùng đầu

cổ qua thăm khám lâm sàng và cận lâm sàng

- Có kết quả mô bệnh học và HMMD chẩn đoán xác định là ULKHngoài hạch vùng đầu cổ

Bệnh nhân được lấy mô sinh thiết tìm EBV bằng phương pháp Real time PCR

Có các xét nghiệm cần thiết giúp chẩn đoán giai đoạn bệnh và đánh giátheo dõi, tiên lượng bệnh

- Bệnh nhân không được dùng thuốc kháng virus trước đó

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân không được làm HMMD

- Bệnh nhân được dùng thuốc kháng virus trước đó

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo phương pháp mô tả cắt ngang

2.2.2 Cỡ mẫu

Cỡ mẫu thuận tiện: 30 bệnh nhân

2.2.3 Nội dung nghiên cứu

2.2.3.1 Đối với mục tiêu 1

Hội chứng B khi có đủ cả 3 triệu chứng trên

- Triệu chứng cơ năng:

+ Đau

+ Đối với khối u vùng mũi xoang

Ngạt tắc mũiChảy dịch mũiChảy máu mũiĐau nhức vùng mũiGiảm, mất ngửi, đau đầu

+ Vùng khoang miệng - hầu

Rối loạn nuốt: Nuốt đau, nuốt vướng Cảm giác có dị vật

 Cận lâm sàng

- Đặc điểm mô bệnh học thông thường (nhuôm HE)

- Đặc điểm nguồn gốc tế bào u theo kết quả nhuộm HMMD: T, B hay

T/NK

- Các thăm dò cận lâm sàng khác

+ Siêu âm vùng cổ, vùng bụng: xác định hạch quá phát (có, không), vị trí.+ Xquang phổi thẳng: thăm dò tổn thương phổi, trung thất (có, không).+ Định lượng LDH máu: bình thường, tăng, giảm

2.2.3.2 Đối với mục tiêu 2:

- Xét nghiệm Real-time PCR tìm EBV: Dương tính, âm tính

- Phân tích kết quả xét nghiêm Real-time PCR

- Phân tích mối liên quan giữa kết quả Real-time PCR với các đặc điểmcủa ULKH

2.2.4 Các bước tiến hành nghiên cứu

Tất cả bệnh nhân được thăm khám, chỉ định làm các thăm dò cận lâmsàng, thu thập thông tin theo quy trình sau:

Bệnh nhân đến khám phát hiện khối u vùng đầu cổ

Khám lâm sàng + làm cận lâm sàng

Sinh thiết u Nhuộm HMMD

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.2.4.1 Thăm khám lâm sàng

- Trực tiếp hỏi bệnh nhân về tiền sử, quá trình diễn biến của bệnh, triệuchứng toàn thân, triệu chứng cơ năng

- Thăm khám toàn thân phát hiện bệnh lý phối hợp và đánh giá hệ thốnghạch nông toàn thân (hạch cổ, hạch thượng đòn, hạch nách, hạch bẹn)

- Thăm khám tại chỗ : + Vị trí tổn thương

+ Tính chất tổn thương: mật độ, hình thái

- Khám nội soi Tai Mũi Họng bằng optic 00 và 700 có màn hình và chụp ảnh: Đánh giá tình trạng ống tai ngoài, màng nhĩ, kiểm tra tình trạng xẹpnhĩ, túi co kéo, ứ dịch hòm tai; đánh giá tình trạng hốc mũi, vị trí, tính chất

Chẩn đoán xác địnhULKH ngoài hạch vùng

đầu cổ

Lấy mẫu sinh thiết

Làm Real - time PCR tìm EBV – DNA

Thu thập số liệu

Xử lý số liệu

của tổn thương; tình trạng amidan khẩu cái, amidan đáy lưỡi, khẩu cái cứng,khẩu cái mềm, thành bên, thành sau họng, thanh quản

- Đánh giá khối u: mật độ, kích thước, tính chất u (sùi, loét, thâm nhiễm),

sơ bộ mức độ xâm lấn

2.2.4.2 Cận lâm sàng

- Tiến hành sinh thiết tổn thương nghi ngờ làm mô bệnh học thôngthường (nhuộm HE) Nếu có kết quả ULKH sẽ được hội chẩn tiêu bản vànhuộm HMMD tại Trung tâm Giải phẫu bệnh - Tế bào Bệnh viện Bạch Mai

 Nhuộm HMMD [38]

Hoá mô miễn dịch giúp chẩn đoán phân biệt về bản chất và nguồn gốccủa tế bào, bản chất của mô u thông qua sự hiện diện của một số khángnguyên đặc hiệu, đặc biệt trong trường hợp các mô kém biệt hoá hoặc khôngbiệt hoá trên mô học

- Lấy bệnh phẩm ở vị trí u nguyên phát ngoài hạch vùng đầu cổ.

- Cố định: Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong

dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố địnhnhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm Thời gian cố định thông thường từ2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ Sau cố định, bệnh phẩm đượcthực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

+ Nhúng nước cất : 5 phút

+ Khử peroxidaza nội sinh bằng dung dịch H2O2 3% : 5 phút

+ Rửa các phiến kính có lát cắt bằng nước cất : 5 phút

+ Bộc lộ kháng nguyên: bằng đun cách thuỷ trong nồi áp suất hoặctrong lò vi sóng hoặc sử dụng proteinaza K*

+ Rửa nước cất : 5 phút

+ Rửa các mảnh cắt bằng dung dịch tris buffer saline (TBS) : 6 phút (qua 2

bể, mỗi bể 3 phút)

+ Ủ với kháng thể thứ nhất (primary antibody) : 60 phút

+ Rửa bằng dung dịch TBS : 6 phút (qua 2 bể, mỗi bể 3 phút)

+ Ủ với kháng thể thứ hai có gắn với biotin : 30 phút (Biotinylatedsecondary antibody)

+ Rửa bằng dung dịch TBS : 6 phút (Qua 2 bể, mỗi bể 3 phút)

+ Ủ với phức hợp ABC hoặc streptavidin peroxidaza : 30 phút

+ Rửa phiến kính có lát cắt bằng dung dịch TBS : 6 phút (qua 2 bể,mỗi bể 3 phút)

+ Phủ dung dịch tạo màu diamino benzidin (DAB) hoặc ethylcarbazole (AEC) : 10 phút

3-amino-9-+ Rửa phiến kính có lát cắt bằng dung dịch TBS : 6 phút (Qua 2 bể,mỗi bể 3 phút)

+ Nhuộm nhân: bằng Hematoxylin : 1 phút

+ Rửa nước chảy:

* Nếu dùng DAB thì tiếp tục khử nước

+ Khử nước bằng cồn, rồi qua xylen

+ Gắn lá kính bằng Resin nếu dùng DAB hoặc Geltol nếu dùng EAC

Nhận định kết quả

+ Dương tính: có sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên - kháng

thể trên tế bào và mô, được hiển thị bằng màu vàng nâu (nếu dùng DAB) hoặcmàu đỏ (nếu dùng EAC)

+ Âm tính: không hiển thị bằng màu vàng nâu (nếu dùng DAB) hoặc

màu đỏ (nếu dùng EAC)

+ Nhân tế bào bắt màu xanh tím của Hematoxylin

Kiểm tra chất lượng: Phải có các mảnh cắt chứng dương tính và âm tính

được nhuộm kèm theo nhằm loại trừ âm tính giả và dương tính giả

Chẩn đoán u lympho tế bào B: là các u lympho có tế bào u dương tính

với các dấu ấn CD20, CD79a

Các u lympho tế bào T: tế bào u được xác định thuộc dòng tế bào T khi

dương tính với các dấu ấn chung tế bào T: CD3, CD5, CD43, CD45RO

 Xét nghiệm định tính EBV

- Lấy mẫu và bảo quản mẫu

Lấy mẫu bệnh phẩm sinh thiết từ tổ chức u trước phẫu thuật hoặc trongphẫu thuật đựng trong các ống nhựa chứa dung dịch TE lưu trong ngăn đá tủlạnh, nếu chưa thực hiện chiết tách ngay mẫu cần được bảo quản tại nhiệt độ4- 80C (tối đa 4 giờ); -200C (>4 giờ) cho đến khi được chiết tách DNA

Gửi bệnh phẩm đến bộ môn Y sinh học di truyền - Đại học Y Hà Nộilưu ở tủ đông ở nhiệt độ -20 độ

- Chiết tách DNA tổng số và kiểm tra độ tinh sạch của DNA

Sử dụng phương pháp Phenol/chloroform để chiết tách DNA tổng số(Quy trình của hãng Việt Á dùng cho chẩn đoán)

Nghiền mẫu mô trong dung dịch TE bằng phương pháp chuyên dụng

 Đánh dấu các tube 1,5ml vô trùng bằng kí hiệu mẫu

 Vortex ependorf chứa bệnh phẩm

 Phá vỡ màng tế bào: cho 100- 200µl mẫu vào 1 tube vô trùng cósẵn 900µl dung dịch Trizol pH8, vortex 30s, để yên 10 phút

 Loại bỏ protein: thêm vào 200µl dung dịch Chloroform, trộn đềusao cho toàn bộ dung dịch trong tube phải chuyển thành màu trắngđục Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút, thu 600µl dịch nổi

 Kết tủa DNA: Thu 600µl dịch nổi có chứa DNA vào 1 tube vôtrùng có sẵn 600µl dung dịch isopropanol Trộn đều, để yên trong

10 phút Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút Loại bỏ dịch nổi,thu cặn màu xanh (hoặc hồng) Cho từ từ 900 µl dung dịch ethanol70% vào Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút Loại bỏ dịch nổi,thu cặn Để khô ở 60ºC trong 10- 15 phút Cho vào 100 µl dungdịch TE 1X Trước khi sử dụng, dùng pipet trộn đều cho đến khiphần cặn tan hoàn toàn

 Bảo quản mẫu DNA ở -20ºC

 DNA được kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng bằng máy đoquang phổ Nano-Drop DNA gọi là tinh sạch khi tỷ sốOD260nm/280nm= 1,8 – 2

Hình 2.2 Máy đo quang phổ NanoDrop 2000

- Thực hiện phản ứng Real-time PCR định tính EBV

Hình 2.3 Máy Real-time PCR Bio-Rad CFX96

+ Chu trình luân nhiệt

 1 chu kỳ: 95°C trong 5 phút

 40 chu kỳ: 950C / 15 giây, 600C / 1 phút, 720C / 20 giây

+ Phiên giải kết quả Real-time PCR định tính EBV

Sau khi kết thúc quá trình Real-time PCR, chuyển sang chế độ

“Analysis” để phân tích kết quả

 Phân tích chứng dương và âm:

Chỉ chọn giếng chứng dương và âm, chọn màu FAM rồi đến màu HEX: Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyếntính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tínhiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệunền (đường biểu diễn âm tính); chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnhquang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEXdương tính.

Phân tích mẫu: Chọn màu FAM, chọn từng mẫu và phân tích ở chế độ

dữ liệu thô để có kết quả chính xác nhất Mẫu có đường biểu diễn dương tính

rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước, kết luận “Mẫu dương tính” Mẫu có đường biểu diễn âm tính, kết luận “Không tìm thấy virus trong mẫu” (Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu

âm tính thật sự)

Hình 2.4 Kết quả Real-time PCR mẫu nghiên cứu dương tính với EBV (a) và

âm tính với EBV (b) Chú thích: (1) chu kỳ ngưỡng; (2) chứng nội; (3) dương tính với EBV; (4) âm tính với EBV

(1)

Chỉ định làm một số thăm dò cận lâm sàng cần thiết khác: chụp xquangtim phổi, siêu âm vùng cổ, siêu âm vùng bụng, xét nghiệm công thức máu,định lượng LDH toàn phần trong huyết tương để phân loại và đánh giá giaiđoạn.

2.3 Bộ công cụ nghiên cứu

2.3.1 Phương tiện nghiên cứu

- Bộ dụng cụ khám nội soi Tai Mũi Họng Karl-storz có màn hình vàchụp ảnh

Hình 2.5 Bộ nội soi ống cứng gián tiếp - Optique

- Các dụng cụ cần thiết để tiến hành sinh thiết u hoặc phẫu thuật nếu cóchỉ định

- Máy ảnh

- Mô bệnh học: Máy cắt tiêu bản, hóa chất nhuộm HE, lam kính, kínhhiển vi

- Các hóa chất cần thiết xét nghiệm Real-time PCR

+ Hóa chất và vật tư tiêu hao

+ Hóa chất chiết tách DNA

+ Hóa chất làm xét nghiệm Real-time PCR

+ Bộ nồng độ chuẩn định lượng EBV: 104 copies, 106 copies, 108

copies

+ Vật tư tiêu hao làm kỹ thuật

- Phương tiện

+ Máy ủ nhiệt, máy vortex

+ Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml, 1ml

+ Tủ thao tác vô trùng, micropipettes các loại thể tích

+ Máy Real-time PCR Bio-Rad CFX96 và hệ thống máy vi tính

2.3.2 Địa điểm thực hiện nghiên cứu

- Khoa Ung Bướu - Bệnh viện Tai mũi họng Trung ương

- Bộ môn Y sinh học - Di truyền - Trường Đại học Y Hà Nội

2.3.3 Thời gian nghiên cứu

Các số liệu được tổng hợp và tính toán bằng Word và Excel 2010

- Xử lý, kiểm định các số liệu theo chương trình SPSS 20.0

- So sánh số liệu thu thập được với các kết quả nghiên cứu của các tácgiả trong và ngoài nước có liên quan

2.3.5 Đạo đức nghiên cứu

- Có cam kết, thỏa thuận với bệnh nhân

- Đối tượng nghiên cứu được thông báo rõ về mục đích nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu được giữ kín bí mật khi cung cấp thông tin

- Đối tượng nghiên cứu sẽ được phản hồi kết quả nghiên cứu

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng

3.1.1 Đặc điểm về tuổi và phân bố giới tính