Phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần thân rễ sâm lai châu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC LÊ THỊ THANH PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU PANAX VIETNAMENSIS VAR.. ĐẠI H

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

LÊ THỊ THANH

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN

ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU

(PANAX VIETNAMENSIS VAR FUSCIDISCUS K

KOMATSU, S ZHU & S.Q CAI)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

LÊ THỊ THANH

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ

SÂM LAI CHÂU (PANAX VIETNAMENSIS VAR FUSCIDISCUS K KOMATSU, S ZHU

& S.Q CAI)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa : QH.2013.Y Người hướng dẫn : 1 TS Nguyễn Thị Duyên

2 PGS.TS Dương Thị Ly Hương

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này là kết quả cho quá trình học tập, rèn luyện của tôi tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu

Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

TS Nguyễn Thị Duyên – Khoa Hóa Thực Vật – Viện Dược liệu, PGS.TS Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài khóa luận này

Lãnh đạo, thầy cô công tác tại Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được học tập, nghiên cứu tại khoa suốt 5 năm học qua

Cán bộ nghiên cứu khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, lãnh đạo Viện Dược liệu, đặc biệt PGS.TS Đỗ Thị Hà đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thực nghiệm

Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và trồng cây Sâm Lai

Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai)”, mã

số: KHCN-TB.16C/13-18, do ThS Phạm Quang Tuyến chủ nhiệm đã hỗ trợ kinh phí để thực hiện nghiên cứu

Gia đình, bạn bè những người luôn luôn tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

Dù nhận được nhiều hướng dẫn và giúp đỡ nhưng bài khóa luận này không tránh khỏi những thiết sót Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để bài khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 23 tháng 4 năm 2018

Sinh viên

Lê Thị Thanh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BLC Phân đoạn butanol Sâm Lai Châu

BuOH Butanol

CC Sắc ký cột (Column Chromatography)

DCM Dicloromethan

DCMLC Phân đoạn DCM Sâm Lai Châu

DL/DM Dược liệu/Dung môi

EtOH Ethanol

GLUT4 Protein màng tế bào ở cơ vân, cơ tim, mỡ và mô khác

(Glucose transporter type 4) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Mp Điểm nóng chảy (Melting Point)

MS Phổ khối (Mass Spectroscopy)

NF-κB Yếu tố nhân kappa B (Nuclear Factor- Kappa B)

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

PCA Phản ứng phản vệ thụ động (Passive Cutaneous

Anaphylaxis) PRT4 Pseudoginsenosid

Rf Hệ số lưu

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TLR4 Receptor của LPS (Tool-Like Receptor)

TLTK Tài liệu tham khảo

TNF-α Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor)

Treg Regulary T cells

UV-Vis Phổ tử ngoại (Ultra Violet – Visible)

v/v Thể tích/ Thể tích

VKH&CNVN Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

WLC Phân đoạn nước Sâm Lai Châu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam 5

Bảng 1.2 Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol trong Sâm Việt Nam 8

Bảng 1.3 Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic trong Sâm Việt Nam 9

Bảng 1.4 Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol trong Sâm Việt Nam 9

Bảng 1.5 Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol trong Sâm Việt Nam 10

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất LC05 và MR2 26

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ hợp chất LC07 và Rb1 30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình vẽ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 4

Hình 1.2 Hình ảnh của Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var fuscidiscus 13

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Sâm Lai Châu 20

Hình 3.2 Sắc ký đồ phân đoạn Sâm Lai Châu, Sâm Việt Nam, phát hiện bằng thuốc thử H2SO4 trong cồn tuyệt đối, hơ nóng 21

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao Sâm Lai Châu phân đoạn butanol 23

Hình 3.4 Sắc ký đồ của MR2 và LC05 25

Hình 3.5 Cấu trúc hợp chất LC05 (majonosid R2) 28

Hình 3.6 Kết quả TLC LC07 với phân đoạn butanol 29

Hình 3.7 Công thức hợp chất LC07 (ginsenosid Rb1) 32

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 2

1.1.1 Vài nét về chi Panax L 2

1.1.2 Vị trí phân loại Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 2

1.1.3 Đặc điểm thực vật Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 3

1.1.4 Phân bố Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 4

1.1.5 Thành phần hóa học Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 4

1.1.6 Tác dụng sinh học của các hợp chất có trong Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 10

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu – Sâm Lai Châu 11

1.2.1 Đặc điểm thực vật 12

1.2.2 Phân bố 13

1.2.3 Mối quan hệ di truyền giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam 13

1.2.4 Thành phần hóa học 14

1.2.5 Tác dụng sinh học 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng 15

2.2 Hoá chất, thiết bị 15

2.2.1 Hoá chất 15

2.2.2 Thiết bị 15

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập 16

2.3.2 Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Chiết các phân đoạn Sâm Lai Châu và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn butanol 20

3.1.1 Kết quả chiết phân đoạn Sâm Lai Châu 20

3.1.2 Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết 22

3.1.3 Hằng số phân lập các hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu 24

3.2 Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Sâm Lai Châu 25

3.2.1 Biện luận cấu trúc LC05 25

3.2.2 Biện luận cấu trúc LC07 28

3.3 Bàn luận 32

3.3.1 Về chiết xuất 32

3.3.2 Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc các hợp chất 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nền kinh tế - xã hội ngày càng phát triển và hiện đại hơn, kéo theo đó là nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho con người ngày càng tăng Một trong những sản phẩm chăm sóc sức khỏe con người đó là dược phẩm Với sự phát triển của khoa học công nghệ tiến bộ, các nhà khoa học luôn muốn tối ưu hóa công dụng của thuốc và hạn chế tối đa tác dụng phụ của thuốc đó Một trong các biện pháp hữu hiệu đang được áp dụng

đó là tạo ra các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên thân thiện với con người

“Sâm” là từ rất quen thuộc mà hay được dùng để nói về các loài dược liệu

quý hiếm thuộc chi Panax L Có lẽ khi nghe đến Sâm ai cũng biết đến những công

dụng tuyệt vời của nó như: thuốc bổ, tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sức lực bị suy giảm, kích thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc và bảo vệ gan, điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, hạ huyết áp, giảm đường huyết…[53] Cũng vì những công dụng đáng nể đó, các loài Sâm luôn được chú trọng tìm kiếm, nghiên cứu và phát triển

Việt Nam nổi tiếng với loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha &

Grushv), đây là một trong những loài Sâm có hàm lượng saponin rất cao Năm

2013, Phan Kế Long cùng cộng sự đã phát hiện ra một thứ Sâm mới được đặt tên là

Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus), bậc phân loại dưới loài của

Sâm Việt Nam ở huyện Mường Tè, tỉnh Lai Châu [38] Mặc dù các nghiên cứu sơ

bộ cho thấy Sâm Lai Châu cũng chứa hàm lượng saponin tương đối cao đem lại những hiệu quả đáng chú ý, song cho đến nay, còn khá ít những nghiên cứu chi tiết

về thứ Sâm này

Vì vậy, để làm sáng tỏ thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng của Sâm

Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus) chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân

lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần

thân rễ Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai)” với 2 mục tiêu cần đạt được:

1 Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn n-butanol

2 Xác định và nhận dạng cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv

1.1.1 Vài nét về chi Panax L

Chi Nhân Sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Toàn bộ chi Sâm (Panax L.) trên thế giới hiện đã biết chắc chắn có 14 loài và 1 dưới loài (thứ-var.) Sự phân bố của chi Panax L trên thế giới cho thấy chúng chỉ

xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc

Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và Tây-Nam Canada (có 2 loài P quinquefolius và P

trifoliatus) [6,32,33] Vùng Đông Bắc Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung

Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật Bản) có 2 loài là P ginseng và P japonica Trung tâm phân bố của chi Panax L có thể từ vùng Tây-Nam của Trung Quốc lan

tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam), ở đây đang có tới 7 loài và

dưới loài (thứ) mọc hoàn toàn tự nhiên, 2 loài trồng là P notoginseng (nhập từ Bắc Mỹ) và P pseudoginseng (không tìm thấy trong hoang dại, nhưng giả thiết có

nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi

nào đó) Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) trên thế giới

Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P notoginseng, P quinquefolius và P trifoliatus) Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L là loài Sâm Việt Nam (Panax

vietnamensis) ở Miền Trung của Việt Nam, tại 14o 15’ vĩ độ Bắc [6]

Ở Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5 loài, trong đó có 2 loài nhập trồng là Tam thất (P notoginseng) và Nhân Sâm (P

ginseng) [6] Ba loài mọc tự nhiên và đang cần phải bảo tồn là Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (P stipuleanatus Tsai & Feng) và đặc biệt là

Sâm Việt Nam (P vietnamensis Ha & Grushv) – loài đặc hữu hẹp của miền trung

là loài thứ 20 thuộc chi Panax được phát hiện trên thế giới và là loài thứ 3 của chi

Panax L được tìm thấy và công bố chính thức ở Việt Nam Đây là loài đặc hữu của

hệ thực vật Việt Nam (Theo Trung tâm Sâm Việt Nam - 1993) [54]

Về phân loại Sâm Việt Nam [53]:

- Loài: Panax vietnamensis Ha & Grushv

- Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu

- Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng

1.1.3 Đặc điểm thực vật Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv

Cây thân thảo sống nhiều năm, cao đến 1 m Thân rễ mập có đường kính 3,5

cm, không có rễ, có củ gần hình cầu, đường kính 5 cm Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1-4 thân Thân nhẵn cao 40-80 cm, rỗng, có 3 mặt hơi tròn, có những rãnh nhỏ dọc theo chiều dọc Lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5, 6) Lá kép chân vịt

có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7-12 cm (ít khi 15 cm) Lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8-14 cm, rộng 3-5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1,5-2 cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên 19 (ít khi 8-11) cập dọc theo gân chính và gân bên ở mặt trên của lá chét có nhiều lông cứng dạng gai dài đến 3 mm, mặt dưới ít hơn Cụm hoa dài 25 cm, gấp 1,5-2 lần chiều dài của cuống lá, thường mang tán đơn độc ở tận cùng, đôi khi có thêm 1-4 tán phụ hoặc một hoa đơn độc Tán hoa đường kính 2,5-4 cm, có 50-120 hoa Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3-4 mm Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi

có 2 ô, 2 vòi (chiếm 20%) Quả khi chín thường màu đỏ, thường có một chấm đen ở trên đỉnh quả Quả 1 hạt hình thân, quả 2 hạt có hình cầu hơi dẹt dài 7-10 mm, rộng 4-6 mm [4]

Sâm Việt Nam mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C Sâm Việt Nam có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân

rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây Sâm trưởng thành có 1 tán hoa Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả Tháng 7

lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ Sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng 12 Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta

có thể nhận biết cây Sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi, tức trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu Sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của Sâm [53]

Hình 1.1 Hình vẽ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv [55]

1.1.4 Phân bố Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv

Cây Sâm được phát hiện ở độ cao từ 1200 m trở lên, đạt mật độ cao nhất ở khoảng từ 1700-2000 m dưới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có hai tỉnh Kon Tum

và Quảng Nam là có Sâm này Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2578 m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50 m, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng [53]

1.1.5 Thành phần hóa học Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv

Thành phần chủ yếu trong các loài thuộc chi Panax L nói chung hay Sâm

Việt Nam nói riêng là saponin sâm hay còn gọi là ginsenosid Loại và tỷ lệ ginsenosid khác nhau giữa các loài và giữa các bộ phân của loài Theo nghiên cứu

tổng quan về Sâm Việt Nam – Panax vietnamensis đã công bố gần 50 hợp chất

saponin gồm các dẫn xuất của các dạng protopanaxadiol, ocotillol, oleanolic, panaxatriol và dammarenediol [20] Các cấu trúc saponin này có từ 2-6 phân tử đường, chủ yếu là đường 6 cạnh gồm glucose, xylose và rhamnose

Ngoài các ginsenosid, trong các bộ phận khác nhau của Sâm Việt Nam còn

có chứa polyacetylen, polysaccharid, flavonoid, daucosterin, chất nhầy, acid amin,

1.1.5.1 Cấu trúc các saponin Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv

a Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol

Bảng 1.1 Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam [20]

A

10 Yesanchinosid J -Glc2-1Glc

6|

Ac

21 Vina-ginsenosid R4 -Glc2-1Glc -H -Glc E

Bảng 1.1 Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam (tiếp)

b Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol

Bảng 1.2 Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol trong Sâm Việt Nam [20]

-H

38 Vina-ginsenosid R14 -Glc2-1Xyl -OH

c Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic

Bảng 1.3 Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic trong Sâm Việt Nam [20]

d Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol

Bảng 1.4 Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol trong Sâm Việt Nam [20]

42 Vina-ginsenosid R10 -Glc -OH

43 Vina-ginsenosid R11 -Glc2-1Xyl -OH

e Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol

Bảng 1.5 Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol trong Sâm Việt Nam [20]

1.1.6 Tác dụng sinh học của các hợp chất có trong Sâm Việt Nam Panax

vietnamensis Ha & Grushv

Do có thành phần chính gồm các ginsenosid cho nên các các dụng sinh học của Sâm hầu hết đều do ginsenosid đem lại

- Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương

Sâm Việt Nam liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động vận động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh [1]

- Tác dụng chống trầm cảm

Sâm Việt Nam có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200 mg/kg hoặc liều 50-100 mg/kg dùng luôn 7 ngày ở chuột nhắt trắng, majonosid R2 tiêm trong màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều 3,1; 6,2; 12,5 mg/kg [1]

- Tác dụng tăng sinh lực

Sâm Việt Nam có tác dụng tăng sinh lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm tăng sinh lực chống lại mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực [1]

- Tác dụng sinh thích ứng

+ Trong stress vật lý, cho chuột nhắt uống Sâm Việt Nam liều 100 mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng đối với nước nóng (37°C-42°C) và lạnh (-5°C) làm kéo dài thời gian sống thêm cả chuột thí nghiệm [1]

+ Trong stress cô lập, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuần, thời gian ngủ khi tiêm Natri barbital giảm đi 30% Sâm Việt Nam liều uống 50-100 mg/kg hoặc hoạt chất majonosid R2 tiêm trong màng bụng liều 3,2; 12,5 mg/kg làm thời gian ngủ trở lại gần bình thường [1]

- Tác dụng chống oxy hóa Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của mô não, gan và phân đoạn vi thể

gan của chuột nhắt trắng, saponin Sâm Việt Nam ở nồng độ 0,05-0,5 mg/ml có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (Malondialdehyd) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học [1]

- Tác dụng kích thích miễn dịch

Bột chiết Sâm Việt Nam liều uống 500 mg/kg và majonosid R2 tiêm trong

màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in vivo

ở chuột nhắt trắng [1]

Dùng liều Escherichia coli gây chết chuột nhắt trắng Nếu kết hợp dùng sâm

và majonosid R2 với liều trên sẽ làm tăng tỷ lệ số chuột sống sót Có lẽ do thuốc làm

tăng tác dụng thực bào với E coli [1]

vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai, bậc phân loại dưới

loài của Panax vietnamensis Thứ này được phát hiện tại vùng Jinping, phía nam

tỉnh Vân Nam, Trung Quốc Gần đây Phan Kế Long và cộng sự (2013) đã phát hiện

thứ Panax vietnamensis var fuscidiscus nói trên có phân bố ở tỉnh Lai Châu, Việt

Nam và được gọi tên là Sâm Lai Châu [38]

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Cây thảo, sống lâu năm Cây mang hoa cao khoảng 0,5-0,8 m Thân rễ nạc, dài 15-20 cm hoặc hơn Thân mọc thẳng, hình trụ, đường kính 5-8 mm, lõi thân xốp Lá kép chân vịt, mọc vòng (3)-4(5-6) lá ở ngọn thân với 5-(6-7) lá chét Các lá chét không đều nhau, lá ở giữa to và nhỏ dần sang hai bên Cuống lá dài 7-12 cm,

có khi lên tới 14 cm, không có lá kèm hoặc lá kèm nhỏ Cuống lá chét dài 1,4 cm, gốc có lông hình móc, dài khoảng 2 mm Lá hình bầu dục, kích thước 8-12

(0,3)-0,8-x 2,5-3 cm Mũi lá nhọn, dài 1,5-2 cm Gốc lá hình nêm, mép lá khía răng cưa Lá

có (6)-8-(10) cặp gân, gân chính và các gân bên đều phủ lông hình móc thưa, dài khoảng 2 mm Cụm hoa tán đơn hình cầu, đường kính 2,5-4 cm, mang khoảng 50-

120 hoa Cuống tán hoa dài 25-35 cm Cuống hoa dài 1,5-2 cm Hoa màu xanh nhạt hay vàng nhạt, mẫu 5, hiếm khi mẫu 6 Đài hoa hình tam giác, dài khoảng 0,2 mm Tràng thuôn, rời nhau, dài khoảng 2 mm Đế hoa lúc đầu hơi lồi, sau phẳng và sẫm màu dần Nhị hoa màu trắng, hơi thò Chỉ nhị hình sợi mảnh, dài khoảng 2,5 mm Bầu 2 ô, 2 vòi nhụy, phát triển thành quả, 1 ô thường tiêu biến Quả dẹt, kích thước

7 x 6 mm, màu nâu đỏ đến nâu tím với núm nhụy màu đen khi chín [38]

Sâm Lai Châu ra hoa vào tháng 6-7, quả trưởng thành vào tháng 10-11, quả chín vào tháng 5-6 năm sau [38]

Hình 1.2 Hình ảnh của Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var fuscidiscus [38]

1.2.2 Phân bố

Sâm Lai Châu xuất hiện trong giới hạn diện tích nhỏ của huyện Mường Tè, tỉnh Lai Châu Chúng được tìm thấy trong rừng rậm nguyên sinh mưa mùa nhiệt đới chưa bị tác động hoặc tác động nhẹ [38]

Sâm Lai Châu phân bố ở độ cao 1900 m, thuộc phần trên của đai núi thấp và phần dưới của đai núi cao Nơi đây có độ tàn che ít nhất 70%, bao gồm các loài cây phổ biến thuộc các họ: Orchidaceae, Rubiaceae, Euphorbiaceae, Moraceae, Fagaceae, Acanthaceae và Fabaceae Các loại đá mẹ ở đây là sa thạch rắn biến chất sâu sắc pha trộn với đá phiến sét [38]

1.2.3 Mối quan hệ di truyền giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam

Theo Phan Kế Long và cộng sự (2014), hai thứ Sâm Lai Châu (P

vietnamensis var fuscidiscus) và Sâm Việt Nam (hay Sâm Ngọc Linh, P vietnamensis Ha & Grushv var vietnamensis) của loài Sâm Việt (P vietnamensis

Ha & Grushv) có quan hệ chị em [3] Cụ thể khi so sánh khoảng cách di truyền giữa loài Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam (hay Sâm Ngọc Linh) thì khoảng cách di truyền

1.2.4 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Sâm Lai Châu còn rất hạn chế

Theo nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2004), phần thân rễ Sâm Lai Châu Panax

vietnamensis var fuscidiscus có chứa các hợp chất ginsenosid Rb1, ginsenosid Rc, ginsenosid Rd, ginsenosid Re, ginsenosid Rg1, notoginsenosid R2, majonosid R2, ginsenosid Ro [20,52] Ngoại trừ notoginsenosid R2, các ginsenosid Rb1, ginsenosid

Rc, ginsenosid Rd, ginsenosid Re, ginsenosid Rg1, ginsenosid Ro cũng là những thành phần hóa học có chứa trong Sâm Việt Nam (mục 1.1.5)

Bảng 1.6 Cấu trúc hóa học của notoginsenosid R 2

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

- Dược liệu nghiên cứu là thân rễ của Sâm Lai Châu được cung cấp bởi Chủ

nhiệm đề tài KHCN-TB.16C/13-18, ThS Phạm Quang Tuyến vào tháng 10/2016

Dược liệu thu về được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50oC đạt độ ẩm khoảng 5%, xay nhỏ và bảo quản trong túi nylon kín làm nguyên liệu nghiên cứu về mặt hóa học

2.2 Hoá chất, thiết bị

2.2.1 Hoá chất

Các dung môi hóa chất dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt

Nam IV: Cồn 70%, nước cất hai lần, dung môi n-butanol, methanol, aceton,

dicloromethan

Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), bột silica gel pha đảo

YMC (30-50 µm, FuJi Silisa Chemical Ltd.)

Chất hấp phụ SephadexTM LH-20 (Amersham Bioscience, Uppsala, Thụy Sỹ)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G

F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)

Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất

2.2.2 Thiết bị

- Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: cột sắc ký, bình cầu, bình nón, ống đong, ống nghiệm…

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI)

- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR

- Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV

- Máy siêu âm Power sonic 405

- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Phổ tử ngoại được ghi trên máy UV-VIS Cary, Khoa phân tích - Viện Dược liệu

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học Các hợp chất Thiên nhiên, VKH&CNVN

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, VKH&CNVN

2.3 Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết 2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập

Thân rễ Sâm Lai Châu được chiết xuất bằng phương pháp chiết ngấm kiệt với dung môi cồn 70% Tiến hành lọc loại bã dược liệu, gộp dịch lọc, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc Cao này được hòa lại với nước và

chiết phân đoạn lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần dicloromethan,

n-butanol thu được các phân đoạn tương ứng

Các hợp chất trong thân rễ Sâm Lai Châu được phân lập bằng phương pháp

sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck),

silica gel pha đảo YMC C18 (30-35 mm, FuJisilisa Chemical Ltd.)

Theo dõi, kiểm tra các phân đoạn của sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng, thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

Thu gom, tinh chế các chất phân lập được bằng dung môi thích hợp Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi phù hợp

Tiến hành:

+ Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để rửa giải: khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt

để làm dung môi rửa giải

+ Chuẩn bị cột: cột sắc ký rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định Lót một lớp bông xuống đáy cột Cân một lượng thích hợp chất nhồi cột vào cốc có

mỏ, thêm dung môi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí thu được hỗn dịch Mở khóa cột, từ từ rót hỗn dịch đã chuẩn bị lên cột, vừa rót vừa gõ nhẹ, đều và đối xứng quanh thân cột Sau khi đưa hết pha tĩnh lên cột, tiếp tục cho dung môi chảy liên tục qua cột đến khi cột hoàn toàn ổn định (có thể từ 5-10 giờ) Chú ý không được để cột

+ Nạp mẫu lên cột:

Nạp mẫu khô: trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, làm bay

hơi dung môi đến khi thu được bột tơi mịn thì đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều đặn trên mặt cột

Nạp mẫu ướt: dùng pipet hút dung dịch mẫu cần phân tích, rót từ từ, nhẹ

nhàng dọc quanh thành cột

Sau khi đưa mẫu lên cột, đặt một miếng bông lên để bảo vệ mặt cột

+ Rửa giải: sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải Dịch rửa giải được hứng vào bình nón hoặc ống nghiệm với thể tích phù hợp Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau Các phân đoạn chứa chất được tinh chế

2.3.2 Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc

Đối với các hợp chất tinh khiết được phân lập thường sử dụng các phương pháp phổ hiện đại kết hợp với các đặc trưng hóa lý và so sánh với các dữ liệu phổ

đã công bố của các chất đã biết để xác định cấu trúc

- Các đặc trưng hóa lý gồm: điểm chảy

- Các phổ: phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1H và 13C, DEPT, HSQC, HMBC, NOESY), phổ khối (MS),…

a Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra

từ phân tử Phổ khối lượng không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định

tỷ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z) Khi đó để xác định khối lượng phân tử (M) cần phải biết số điện tích của ion

Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định Các chất có cấu trúc tương tự nhau

sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất

đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [8]

b Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường) Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét Cách thứ hai là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT

- NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay [8]

Nguyên thuỷ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi theo từ trường ngoài B0 Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong số liệu phổ, người ta chia

sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với một chất chuẩn (thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số cộng hưởng của chất chuẩn đó Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu) nên người ta dùng ppm để thể hiện giá trị cộng hưởng của các hạt nhân Giá trị này thường được gọi là chuyển dịch hoá học Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton thường nằm trong khoảng 0-14 ppm, còn của carbon-13 là từ 0-240 ppm [8]

Như đã trình bày ở trên, tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz là theo tần số dùng để kích thích các proton [8]

Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay 13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [8]

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

proton trong phân tử Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ dịch chuyển hóa học khác nhau Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hóa học thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba… tới

7 đỉnh thành phần Diện tích mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton của đỉnh Dựa vào diện tích của đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó [8]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon Carbon lai hóa sp3

không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm Carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm Carbon lai hóa sp2 chuyển dịch trong khoảng 100-150 ppm, nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể dịch chuyển tới 240 ppm Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon (hơn 1 carbon nếu cũng có chung môi trường hóa học) của phân tử [8]

Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử Kỹ thuật hiện thường sử dụng là DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer) [8]

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận (thường sử dụng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn (long-range HETCOR, thường dùng hiện nay

là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY) [8]

Với các kỹ thuật phổ NMR, người ta có thể biết được mối liên hệ giữa các proton và carbon trong phân tử Kết hợp với phổ khối và các thông tin khác ta có thể xây dựng và nhận dạng được cấu trúc phân tử của hợp chất [8]

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Chiết các phân đoạn Sâm Lai Châu và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn butanol

3.1.1 Kết quả chiết phân đoạn Sâm Lai Châu

800 g Sâm Lai Châu được xay nhỏ chiết ngấm kiệt với cồn 70%, tại nhiệt độ phòng, với tỉ lệ DL/DM: 1/10, 3 lần, mỗi lần một tuần Sau đó, gộp dung môi và cô

áp suất giảm thu được cao tổng (365 g, hiệu suất chiết so với dược liệu khô là: 45,63%) Sau đó, chiết phân đoạn 3 lần 350 g cao tổng với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần: dicloromethan (DCM) và butanol (BuOH) Gộp dung môi và cô dưới

áp suất giảm thu được các phân đoạn tương ứng: phân đoạn DCM (DCMLC: 3,2 g), phân đoạn butanol (BLC: 150,2 g) và phân đoạn nước (WLC: 195,0 g) được biểu diễn như hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Sâm Lai Châu

Cao DCM (DCMLC: 3,2 g)

Cao nước (WLC: 195,0 g)

Cao BuOH (BLC: 150,2 g)

Hòa 350 g cao tổng với 2 lít nước Chiết phân lớp 3x với DM: DCM/ BuOH (1/1)

Gộp DM cô dưới áp suất giảm

Cao tổng (365 g)

Cồn 70%, DL/DM:1/10 Ngấm kiệt x 3,3 tuần, To phòng

Loại bỏ DCM

Bột Sâm Lai Châu (800 g)

Loại bỏ butanol

Sau khi chiết phân đoạn, tiến hành TLC (xem hình 3.2) để so sánh Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam Kết quả TLC và sơ đồ chiết cho một số kết quả sau:

+ Kết quả chiết cao phân đoạn cho thấy hàm lượng cao phân đoạn butanol có hàm lượng cao thứ hai và thấp hơn so với phân đoạn nước nhưng kết quả TLC (với

hệ dung môi đặc trưng để phát hiện các saponin trong Sâm) thì số lượng các vết chất nhiều nhất Mặt khác định hướng nghiên cứu phân lập các saponin chính nên nhóm đề tài hướng đến việc phân lập các hợp chất có trong phân đoạn butanol

+ Kết quả TLC cho thấy số lượng vết chất cũng như mức độ đậm của từng vết chất ở hai thứ Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam tuy có sự khác nhau nhất định nhưng có thể nhận thấy rằng, cả hai đều chứa một số vết có Rf tương đương

Hình 3.2 Sắc ký đồ phân đoạn Sâm Lai Châu, Sâm Việt Nam, phát hiện bằng

thuốc thử H 2 SO 4 trong cồn tuyệt đối, hơ nóng

Hệ dung môi: BuOH-acid acetic-Nước (5:4:1)

Trong đó:

Hình A: SKĐ phát hiện tại UV 366 nm Hình B: SKĐ phát hiện tại ánh sáng

thường 1: Cao phân đoạn nước Sâm Lai Châu

2: Cao tổng Sâm Lai Châu

3: Cao phân đoạn butanol Sâm Lai Châu

4: Cao phân đoạn dicloromethan Sâm Lai Châu

5: Cao phân đoạn butanol Sâm Việt

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

3.1.2 Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết

120 g cao phân đoạn butanol Sâm Lai Châu tiến hành sắc ký cột pha thường

silica gel với hệ dung môi gradient là: DCM-MeOH-H2O (100%-5:1:0,01-0:2:1) thu được 7 phân đoạn ký hiệu là: BLC1-7

Tiếp tục sắc ký cột pha thường phân đoạn BLC4 (5,2 g) với hệ dung môi DCM-MeOH-H2O (3:1:0,01) thu được 3 phân đoạn ký hiệu là: BLC4.1-4.3 Phân đoạn BLC4.1 được tiến hành sắc ký cột pha đảo C18 với hệ dung môi MeOH-H2O

(1:3) thu được hợp chất LC05 (7,8 mg)

Phân đoạn BLC7 (240 mg) được tiến hành tiến hành sắc ký cột mini với chất

hấp phụ silica gel RP-18, hệ dung môi rửa giải MeOH-H2O (3:1), kết tinh lại thu

được hợp chất LC07 (4,8 mg)