Định lượng eurycomanone trong rễ cây bá bệnh (eurycoma longifolia) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN THỊ THU PHƯƠNG ĐỊNH LƯỢNG EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY BÁ BỆNH Eurycoma Longifolia BẰNG SẮC KÝ L

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

TRẦN THỊ THU PHƯƠNG

ĐỊNH LƯỢNG EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma

Longifolia) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

TRẦN THỊ THU PHƯƠNG

ĐỊNH LƯỢNG EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma

Longifolia) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2013.Y

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Tùng

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Em xin phép bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Hữu Tùng đã nhiệt tình, tận tâm hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ em hoàn thành tốt nhất khóa luận này

Em cũng xin cảm ơn dược sỹ Nguyễn Thị Huệ (QH.2012.Y) và các bạn cùng nhóm nghiên cứu Thùy, Phượng, Chuyên và tập thể lớp Dược học khóa 2 (QH.2013.Y) đã luôn sát cánh, động viên, cổ vũ tinh thần giúp em hoàn thành khóa luận này một cách tốt nhất

Qua đây, em cũng cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận

Mặc dù đã nỗ lực, cố gắng hết sức mình để hoàn thành khóa luận, song do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên không thể tránh khỏi thiếu sót Em rất mong nhận được sự cảm thông và góp ý tận tình của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2018

Sinh viên Trần Thị Thu Phương

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitrile Acetonitril

DAD Diode array detector Detector mảng điốt

HPLC High performace liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IL Interleukin Interleukin LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

LPS Lipopolysaccharide MeOH Methanol Methanol

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

UV Ultra violete VIS Visible

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

ảng 1.1 Thành phần hóa học trong rễ và lá cây bá bệnh 5

ảng 3.1 hương trình chạy dung môi pha động phân tích dịch chiết rễ bá bệnh 20

ảng 3.2 Tính thích hợp hệ thống 23

ảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của eurycomanone 24

ảng 3.4 Kết quả độ lặp lại của phương pháp 25

ảng 3.5 Kết quả độ đúng của phương pháp 26

ảng 3.6 Kết quả định lượng eurycomanone trong rễ bá bệnh 27

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) 3

Hình 1.2 Cấu trúc chung nhóm quasinoid 9

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của eurycomanone 9

Hình 1.4 Mối quan hệ giữa các đại lƣợng thời gian của HPLC 13

Hình 2.1 Mẫu bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) 17

Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch eurycomanone chuẩn 21

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu) 22

Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone (đánh giá độ đặc hiệu) 22

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ eurycomanone 24

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

HƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY BÁ BỆNH 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Phân bố và sinh thái 4

1.1.3 Thu hái, chế biến 4

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.5 Tác dụng dược lý 6

1.1.6 Tính vị và công năng 7

1.1.7 Một số bài thuốc dân gian từ cây bá bệnh 8

1.2 Tổng quan về nhóm quassinoid 8

1.2.1 Khái quát chung và quassinoid 8

1.2.2 Cấu trúc chung và phân loại 8

1.3 Tổng quan về eurycomanone 9

1.3.1 Công thức hóa học 9

1.3.2 Tính chất lí hóa 10

1.3.3 Tác dụng sinh học của Eurycomanone 10

1.3.4 Một số nghiên cứu định lượng eurycomanone bằng HPLC 10

1.4 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao HPL 13

1.4.1 Nguyên tắc HPLC 13

1.4.2 Một số thông số đặc trưng 13

1.4.3 Thẩm định phương pháp HPL 15

HƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 17

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Dung môi, hóa chất 17

2.1.3 Máy móc, dụng cụ 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 17

2.2.1 Phương pháp chiết xuất eurycomanone từ rễ bá bệnh 18

2.2.2 Phương pháp phân tích bằng HPLC 18

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 19

HƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 KẾT QUẢ 20

3.1.1 Quy trình chiết rễ cây bá bệnh 20

3.1.2 Xây dựng quy trình định lượng 20

3.2 Thảo luận 28

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

3.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích eurycomanone bằng HPLC 28

3.2.3 Định lượng eurycomanone trong dược liệu bá bệnh 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30

KẾT LUẬN 30

KIẾN NGHỊ 30

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là đất nước nhiệt đới gió mùa với nguồn cây thuốc vô cùng phong phú Từ lâu nay nhân dân ta đã sử dụng rất nhiều cây cỏ trong tự nhiên để làm thuốc Ngày nay, với sự phát triển như vũ bão của khoa học, kĩ thuật nên có rất nhiều dược liệu tiềm năng đã, đang và sẽ được nghiên cứu rộng rãi Trong đó, cây bá bệnh

(Eurycoma longifolia Jack.), họ Thanh thất (Simaroubaceae) được nhân dân ta sử

dụng khá nhiều với một số công dụng như vỏ dùng chữa những trường hợp ăn uống không tiêu, đau lưng, quả dùng chữa lị Ở ampuchia, người ta dùng rễ chữa ngộ độc, say rượu, trị giun Lá còn được dùng để tắm trị ghẻ, lở ngứa Ngoài ra bá bệnh còn được biết đến với công dụng tăng cường sinh lực, hỗ trợ điều trị yếu sinh lí ở nam giới, kích thích ham muốn [14,15,32] Hơn nữa, bá bệnh đã được chứng minh

là có tính chống viêm, chống sốt rét, chống oxy hóa [11,21,22,28,32,45], điều trị tiểu đường [32], là một ứng cử viên tiềm năng điều trị ký sinh trùng đường ruột

Blastocystis [17] Trên thế giới, bá bệnh được được đánh giá là một dược liệu có

hiệu lực điều trị tốt và đem lại hiệu quả kinh tế rất cao Bá bệnh còn được gọi là Sâm Malaysia vì được sử dụng như một loại thuốc bổ sức khỏe và chống lão hóa [34,45]

Nhóm quassinoid, nhóm hợp chất chính trong bá bệnh bao gồm một số chất như eurycomanone, eurycomalactone, eurycomanol, eurycolactone… được báo cáo

là góp phần vào tính chất chữa bệnh tăng sức mạnh cơ bắp, sức bền, giảm lo lắng,

căng thẳng, diệt vi trùng sốt rét Plasmodium falcifarum đã kháng thuốc…

[1,2,21,32], phòng ngừa và điều trị loãng xương ở nam giới do thiếu androgen [19] Trong đó, eurycomanone là hợp chất chính mang lại hiệu quả cao trong tác dụng chữa bệnh của cây Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về eurycomanone – một marker chính của cây bá bệnh còn rất hạn chế Ngoài ra khả năng nhân giống kém cộng với tốc độ sinh trưởng chậm và việc khai thác rễ không hợp lí đã khiến cho nguồn dược liệu này cạn kiệt Ngoài ra, trong dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận định lượng eurycomanone trong bá bệnh Bên cạnh đó, việc kiểm nghiệm bá bệnh cũng như các chế phẩm bá bệnh chủ yếu là thực phẩm chức năng vẫn chưa được thực hiện

Trên cơ sở đó và cùng với những trang thiết bị hiện đại và cơ sở vật chất vốn

có của phòng thí nghiệm bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược,

Đại học Quốc gia Hà Nội đề tài “Định lượng eurycomanone trong cây bá bệnh

(Eurycoma longifoila) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC” đã được tiến hành

Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu bá bệnh cũng như việc quản lí các sản phẩm từ bá bệnh trên thị trường

Các mục tiêu của đề tài:

1 Xây dựng phương pháp định lượng eurycomanone bằng HPLC và thẩm định phương pháp phân tích

2 Xác định hàm lượng eurycomanone trong rễ cây bá bệnh

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack., họ Thanh thất Simaroubaceae) còn

được gọi là bách bệnh, mật nhơn, mật nhân, hậu phác nam, Tongkat Ali (Malaysia), Antong sar (Campuchia), Tho nan (Lào), Pasak Bumi hoặc Bedara Pahit (Indonesia) [45]

Hình 1.1 Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.)

[http://thaoduocquy.org/cay-mat-nhan-ba-benh]

Cây nhỡ, cao 2-8 m, cao nhất 15-18 m [39] ít phân cành, có lông ở nhiều bộ phận Lá kép hình lông chim lẻ, mọc so le, gồm 21-25 lá chét không cuống, mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu nhọn, mặt trên xanh sẫm bóng, mặt dưới có lông màu trắng xám, cuống lá màu nâu đỏ Lá non có lông mịn, lá trưởng thành

không có lông Cụm hoa mọc ở ngọn thành chùm kép hoặc chùy rộng, cuống hoa có lông màu gỉ sắt, hoa có màu đỏ nâu, đài hoa được chia thành năm thùy hình tam giác có tuyến ở lưng, tràng hoa năm cánh hình thoi cũng có tuyến, nhị năm có lông dày và hai vảy ở gốc, đầu nhụy rời Chỉ nhị màu đỏ và có lông Hoa và bao hoa phủ đầy lông Nụ hoa nhỏ, hình trứng Quả hạch, hình trứng, nhẵn, có rạch dọc, khi chín

có màu vàng đỏ, chứa một hạt Trên mặt hạt có nhiều lông ngắn Quả non màu xanh,

có lông sét nâu, quả già chuyển màu hồng nhạt, thịt quả mềm, ngọt, ăn được Quả chín màu đỏ tươi chuyển sang đỏ nâu, trơn nhẵn [1,2]

1.1.2 Phân bố và sinh thái

Bá bệnh gặp chủ yếu ở các nước Đông Nam Á: Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia…Loài này còn xuất hiện ở Nam Trung Quốc và Ấn

Độ Cây mọc phổ biến ở nước ta đặc biệt là miền Trung, Tây Nguyên [1,2] Cây thường mọc hoang trong các rừng thưa, dưới tán các cây gỗ lớn Cây có thể chịu được bỏng nên mọc ở những cánh rừng khá nguyên sinh, rừng thú sinh Cây mọc ở vùng đồi thì có khá thấp trong khi những cây mọc dưới tán rừng thì cao hơn 5-7 m

Bá bệnh ra nhiều hoa quả nhưng lượng cây con được tái sinh từ hạt thì không nhiều

do quả rụng vào mùa mưa lũ bị cuốn trôi Tuy nhiên, khả năng tái sinh cao vì dễ dàng bắt gặp chồi của nó sau khi bị chặt phá Dù vậy, nhưng bá bệnh là cây quý, cần được bảo tồn và phát triển

1.1.3 Thu hái, chế biến

Có thể dùng toàn cây để làm thuốc nhưng chủ yếu là rễ trụ của cây trên 5 tuổi Rễ càng đắng thì được coi là càng có giá trị Sau khi thu hoạch rễ, rửa sạch, thái lát, phơi khô thu được dạng gỗ màu vàng ngà, vị đắng đặc biệt

1.1.4 Thành phần hóa học

- Trong vỏ và gỗ bá bệnh, người ta đã chiết được một số hợp chất sau [1]:

 Các hợp chất quassinoid, có khoảng 150 loại:

Eurycomalactone, longilactone, eurycomanol, Eurycomanone, 5,6 – dehydro – eurycomalactone…

 Từ rễ đã phân lập được 3 quassinoid:

Eurycomanol, 2-O-β-D glucopyranosid và 13β,18-dihydroeurycomanol

 Các hợp chất triterpen: niloticin, dihydroniloticin, piscidinol A, melianon…



Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

 Ngoài ra còn có alkaloid carbolin

 Từ vỏ cây bách bệnh ở miền Đông Nam ộ Việt Nam đã xác định đƣợc thành phần 2 chất đắng: eurycomalacton (chiếm tỷ lệ cao nhất) và 2,6 dimethoxybenzoquinon (một sắc tố màu vàng) Ngoài ra còn campestrol

và β-sitosterol [1,2]

- Trong rễ và lá cây bá bệnh đã xác định đƣợc một số hợp chất sau [37]

ảng 1.1 Thành phần hóa học trong rễ và lá cây bá bệnh

12,15diacetyl-13α(21)-epoxyeurycomanone, 12-acetyl-13,21dihydroeurycomanone, 15-acetyl13α(21)-epoxyeurycomanone, 3,4εdihydroeurycomanone,

5,6dehydroeurycomalactone, eurycomanone, 13β,21-dihydroxyeurycomanol, 14,15β-dihydroxyklaineanone…

- Triterpenes: eurylene, hỗn hợp β-sitosterol và stigmasterol

Ethanol Quassinoids: eurycomanone, longilactone,

ở dòng tế bào của người THP-1 [12]

 Bá bệnh có tác dụng tăng dục, hoạt tính kích thích sinh dục nam và lượng nội tiết tố sinh dục nam trong huyết tương có một mối tương quan với nhau [1,15] Thân và rễ bá bệnh làm tăng lượng testosteron nhiều hơn thân cây [1]

 Bá bệnh còn có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus [20,22,32]

 Một chế phẩm thuốc gồm 3 dược liệu: bá bệnh, trâm bầu và xấu hổ có độc tính cao và độc tính trường diễn rất thấp Thuốc có tác dụng lợi mật

rõ rệt và không làm thay đổi thành phần của mật ở chuột lang Thuốc làm tăng thải trừ BSP của gan thỏ so với đối chứng [1] Chế phẩm thuốc này

có tác dụng làm chậm quá trình hư biến của gan chuột cống trắng gây nên

do carbon tetreclorid Nó cũng làm tăng tái tạo của tế bào gan chuột nhắt trắng trong mô hình gây thương tổn gan thực nghiệm [1]

 Áp dụng trên bệnh nhân có chỉ định điều trị lợi mật, chế phẩm gồm bá bệnh, trâm bầu và xấu hổ đã làm giảm bilirubin máu một cách có ý nghĩa [1]

 Một số quassinoid như eurycomanol, eurycomalactone có tác dụng làm giảm lipopolysaccharide gây ra sốt ở chuột sau 1 giờ và có khả năng

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

 Nghiên cứu in vitro và in vivo đều chứng minh bá bệnh có tác dụng chống ung thư tiền liệt tuyến ở người [13]

 Dịch chiết nước từ rễ cây mật nhân có khả năng kháng oxi hoá nhưng hoạt lực tương đối yếu [9,12,22]

 Trên cơ địa động vật giảm năng sinh dục cao rễ bách bệnh đều thể hiện tác dụng làm tăng hàm lượng testosteron huyết, tăng trọng lượng của cơ quan sinh dục đực và tác dụng này thể hiện rõ trên động vật bình thường

ở liều cao Trên hai mô hình chuột bình thường và chuột bị gây giảm năng sinh dục, hàm lượng protein toàn phần trong huyết tương tăng và có khuynh hướng làm tăng trọng lượng cơ nâng hậu môn, nhưng không làm tăng thể trọng cơ thể [10] Tác dụng tăng cường chức năng sinh dục cho nam giới là tác dụng chủ yếu nhất, được sử dụng nhiều nhất, được dùng sớm nhất, được nghiên cứu nhiều nhất Trong vòng 20 năm (1994-2014)

đã có trên 200 công trình nghiên cứu về tác dụng này của bá bệnh

 Ở Lào, bá bệnh được dùng để chữa bệnh cao huyết áp, dùng cho phụ nữ sau sinh [23]

 Shuid và cộng sự (2011) nghiên cứu trên mô hình chuột 12 tháng tuổi đã gây loãng xương Thực hiện đồng thời 2 nhóm Một nhóm cho uống

Eurycoma longifolia và một nhóm sử dụng testosterone thì thấy sau 6

tuần cả 2 nhóm đều cho hiệu quả ngăn chặn sự mất canxi ở chuột Vì thế

bá bệnh có tiềm năng điều trị loãng xương ở người thiếu hụt androgen [33]

 Năm 2006, Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu tác dụng dược lý cây bá bệnh Dương Thị Ly Hương, Trịnh Thị Kim Anh, Nguyễn Thị Hải Hà nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống trắng với dịch chiết nước

rễ cây bá bệnh Kết quả cho thấy với liều 10 mg/kg thể trọng thì trọng lượng các cơ quan sinh dục, tinh hoàn, túi tinh đều tăng

1.1.6 Tính vị và công năng

Theo y học cổ truyền, bá bệnh có tính mát, vị đắng, có tác dụng thanh nhiệt, tiêu viêm, lợi thấp, lợi tiểu, lương huyết, chỉ lỵ dùng để chữa tiểu tiện ra máu, ăn không tiêu, đầy hơi, chướng bụng…

Rễ chữa ngộ độc và tẩy giun Lá chữa ghẻ lở Theo kinh nghiệm dân gian, người dân còn lấy rễ cây làm thuốc hạ sốt, nhanh lên da non ở chỗ da bị nhiễm trùng, tổn thương Ở ampuchia, người ta dùng rễ để chữa vàng da Ở Malaysia và Indonesia thì bá bệnh được biết đến là thần dược kích dục nam giới, điều trị tăng

huyết áp, đau mỏi cơ bắp, nâng cao sức khỏe Theo kinh nghiệm dân gian Indonesia, nước sắc lá hoặc vỏ thân bá bệnh là vị thuốc cổ truyền tốt nhất chữa sốt rét Hiệu lực tương đương viên nén cloroquin trong điều trị sốt rét [1]

1.1.7 Một số bài thuốc dân gian từ cây bá bệnh [1]

Bài 1: Chữa phong tê, liệt nửa người

Bá bệnh 4 g, rễ xấu hổ 8 g, dây đau xương 8 g, đậu chiều 8 g, trâu cổ 8 g, rễ đinh lăng 8 g, hồ tiêu trắng 5 g, quế chi 5 g, gừng sống 3 g

Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400 ml nước còn 100 ml, uống 2 lần trong ngày

Bài 2: Tư bổ âm huyết thang, chữa âm huyết suy kém, tê bại nửa người bên phái,

nóng ran

Bách bệnh 6 g, đậu đen 12 g, hà thủ ô đỏ 12 g, dây gùi 8 g, huyết rồng 8 g, rau muống biển 8 g, rễ nhàu 8 g, rễ ô môi 8 g, rễ cỏ xước 8 g, tang chi 8 g, dây kí ninh 2 g Sắc nước uống

Bài 3: Bá ứng tiêu hạ tán, chữa đau bụng, ăn không tiêu, đầy hơi chướng bụng

Bá bệnh 50 g, vỏ quýt 100 g, hoắc hương 100 g, củ bồ bồ 100 g, dây mơ 100

g, dây rơm 100 g, cam thảo nam 100 g, hậu phác 100 g, củ sả 50 g, củ gấu 50 g, tiêu lốt 50 g

Các vị tán nhỏ, ngày uống 12 gam (người lớn), trẻ em thùy theo tháng tuổi

mà quy định liều

1.2 Tổng quan về nhóm quassinoid

1.2.1 Khái quát chung và quassinoid

Quassinoid là một triterpenoid thứ cấp, giàu oxy có vị đắng, là thành phần chính trong họ Thanh thất Simaroubaceae an đầu, chúng được gọi là Quassin Các nghiên cứu về quassinoid cho thấy đây là loại hợp chất giàu tiềm năng trong điều trị các bệnh như tác dụng kháng khối u, kháng virus, kháng viêm, kháng amib, sốt rét, kháng vi trùng lao, chán ăn [35,42]

Ngoài ra, trong một nghiên cứu, rất nhiều quassinoid có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư cổ tử cung [24] và bảo vệ dạ dày [36]

1.2.2 Cấu trúc chung và phân loại

Đến nay đã có khoảng 150 chất thuộc nhóm quassinoid được chiết xuất, phân lập và mô tả cấu trúc Có thể chia thành 5 khung chính như sau 18-, C19-, C20-, C22- và C25-quassinoid Có một số tác giả còn gọi tên các khung là khung laurycolactan (C18), khung cedrolidan (C19), khung quassolidan (C20), khung

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

nhóm chức chứa oxy nhƣ ceton, ester, lacton, hydroxy, methoxy Nhóm 20 thấy nhiều nhất với 76% nhóm chức chứa oxy Nhóm C19 chiếm 19%, C18 chiếm 3%, còn C22 và C25 chiếm rất ít, khoảng 1% [24]

Hình 1.2 Cấu trúc chung nhóm quasinoid

1.3 Tổng quan về eurycomanone

1.3.1 Công thức hóa học

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của eurycomanone

 Công thức phân tử: C20H24O9 [42]

 Vị trí: eurycomanone thuộc C20-quassinoid

 Tên khoa học: (1 β, 11 β, 12 α, 15 β) epoxypicrasa-3,13 (21)-diene-2,16-dion

-1,11,12,14,15-pentahydroxy-11,20- Phân tử lượng: 408,02 g/mol [42]

1.3.2 Tính chất lí hóa

Eurycomanone là chất rắn, màu trắng, không mùi, điểm cháy -20◦ , điểm nóng chảy 251-253oC [42] Tỉ trọng 1,6 g/cm3

1.3.3 Tác dụng sinh học của Eurycomanone

Eurycomanone là thành phần có hoạt tính góp phần vào tác dụng sinh học của bá bệnh

 Eurycomanone là một trong những quassinoid chính của rễ cây mật nhân, có khả năng làm tăng nội tiết tố testosterone và lượng tinh dịch ở chuột đực, có tác dụng chống lại estrogen trong cơ thế chuột trưởng thành Theo công bố vào năm 2008, eurycomanone còn có khả năng gây độc tế bào đối với các tế bào ung thư, có khả năng gây độc tế bào đối với dòng tế bào gây ung thư phổi 54, dòng tế bào K và có hoạt tính chống sốt rét khá mạnh [9]

 Trong một nghiên cứu tiến hành trên 126 người Nhật Bản ở độ tuổi trung niên được thực hiện trong 4 tuần Có 2 nhóm, 1 nhóm uống dịch chiết thân rễ

bá bệnh 200 mg/ngày, 1 nhóm dùng giả dược thì thấy uống dịch chiết đó giúp tăng cường hệ miễn dịch ở cả nam và nữ trong độ tuổi trung niên [25]

 Một thử nghiệm lâm sàng khác đã nhấn mạnh và chứng minh được vai trò của eurycomanone như một chất chống lại các rối loạn về sức khỏe tình dục của nam giới bao gồm rối loạn chức năng cương dương, vô sinh, ham muốn tình dục thấp hay những ảnh hưởng đến hormon nam Eurycomanone là một tiềm năng làm mới sức sống tình dục, tăng cường khả năng sinh dục cho nam giới [26]

 Eurycomanone ức chế sự biểu hiện của dấu hiệu khối u ung thư phổi bằng cách ức chế sự gia tăng tế bào ung thư phổi [27,46] và gây độc các dòng tế bào ung thư vú (M F-7) [45]

 Ngoài ra, eurycomanone còn có tác dụng sinh học là chống sốt rét

Plasmodium falciparum [28,41,42,45]

1.3.4 Một số nghiên cứu định lượng eurycomanone bằng HPLC

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu định lượng eurycomanone trong dược

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

là một trong những phương pháp hiện đại được sử dụng phổ biến hiện nay Dưới đây là một vài nghiên cứu định lượng eurycomanone

- Thời gian lưu có RSD < 2,5%, diện tích pic có RSD < 5%

- Pha động: 0,02% trifluoroacetic acid ( ) và acetonitrile ( )

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

1.4 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

1.4.1 Nguyên tắc HPLC

HPLC là một kĩ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hóa học vừa có tính chất lí học Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc kí giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan theo từng lớp qua chất nhồi cột từ đầu cột đến cuối cột Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào nhiều yếu tố, vì thế có những chất tan bị giữ lâu,

có chất bị lưu giữ ít Đây chính là cơ sở của sự tách các chất của phương pháp HPLC

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng detector Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc ký đồ

1.4.2 Một số thông số đặc trưng

a Thời gian lưu

Hình 1.4 Mối quan hệ giữa các đại lượng thời gian của HPLC

R là thời gian lưu của 1 cấu tử từ khi vào cột đến khi tách khỏi cột

t0 là thời gian chết là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột hay thời gian để một chất không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột

t’R là thời gian lưu thực của 1 cấu tử

Nếu k’ ~ 0 thì tR ~ t0, chất ra rất nhanh, cột không có khả năng tách chất

Nếu k’ càng lớn tức tR càng lớn thì chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích lâu

Khoảng k’ lí tưởng là 2-5 nhưng khi phân tích một hỗn hợp chất thì có thể chấp nhận k’ thuộc 1-20

d Hiệu năng (Số đĩa lí thuyết)

Hiệu năng của cột đặc trưng cho khả năng tách sắc kí của các cấu tử trên cột

và được tính theo công thức sau:

N = 16( )Với : W là chiều rộng ở đáy pic

W1/20 là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic

Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2 Giá trị của AF càng gần 1

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

1.4.3 Thẩm định phương pháp HPLC

Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra (fitness for the purpose) Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được

sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy Các thông số thẩm định bao gồm:

a Độ đặc hiệu

Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải

là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích

b Độ tuyến tính và khoảng nồng độ

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó

có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định

hệ số hồi quy tương quan

Đường chuẩn là yếu tố quyết định sự đúng đắn của kết quả phân tích, do đó nếu trong quá trình xây dựng đường chuẩn mắc những sai số lớn sẽ dẫn đến sự mất chính xác của kết quả Điều đầu tiên để kiểm soát được sự chính xác của các nồng

độ chuẩn khi xây dựng đường chuẩn là cần đảm bảo độ chính xác của chất chuẩn (chất chuẩn mua từ nhà sản xuất) về hàm lượng, độ tinh khiết

Một quy trình HPL thông thường dùng định lượng phải có hệ số tương quan tuyến tính của đường chuẩn R2 > 0,999

c Độ đúng và độ lặp lại

Độ lặp lại là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên Độ lặp lại càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn

Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng

Muốn xác định độ đúng cần phải tìm được giá trị đúng, có nhiều cách khác nhau để xác định độ đúng, bao gồm việc so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả thực hiện bởi một phương pháp đối chiếu hoặc sử dụng mẫu đã biết nồng độ (mẫu kiểm tra hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận) và phương pháp xác định độ thu hồi (độ tìm lại)

d Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Số lần phân tích lặp lại 3-4 lần Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền Thông thường lấy S/N=3

e Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn LOQ chỉ

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu nghiên cứu rễ cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) Mẫu được cung

cấp bởi PGS.TS Phương Thiện Thương, khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN

Hình 2.1 Mẫu bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.)

2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Chất chuẩn Eurycomanone (Wako chemical, Nhật Bản; độ tinh khiết 97%)

- Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC

- cid formic 0,1%/ nước được pha từ acid formic P (Merk, Đức)

- Methanol dùng cho HPL (Merk Đức)

- Nước cất hai lần đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

2.1.3 Máy móc, dụng cụ

- Hệ thống máy HPLC Agilent 1260 Technologies

- Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức

- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,2 μm

2.2.1 Phương pháp chiết xuất eurycomanone từ rễ bá bệnh

Để chiết xuất thành phần có hoạt tính sinh học eurycomanone từ rễ cây bá bệnh, chúng tôi đã tham khảo nhiều nguồn tài liệu Có thể chiết xuất eurycomanone bằng mathanol, ethanol và nước Chiết bằng methanol cho hiệu suất cao nhất [39]

Vì thế chúng tôi đã lựa chọn quy trình chiết xuất bá bệnh được tiến hành như sau:

- Phương pháp chiết: siêu âm

- Dung môi chiết: Methanol

- Cột sắc ký: Tiến hành trên cột sắc ký Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm)

- Pha động: Tham khảo từ nhiều nguồn tài liệu kết hợp với điều kiện thực tế phòng thí nghiệm, chúng tôi đã khảo sát thành phần dung môi với tỉ lệ và tốc

độ dòng khác nhau

- Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 2 loại detector UV,

D D để đảm bảo vừa phát hiện được được chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm

- Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất

Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn eurycomanone pha trong MeOH có nồng độ

từ 18,75–200 μg/ml Tiến hành phân tích các mẫu Xây dựng phương trình hồi quy

và xác định hệ số tương quan R

Tiến hành phân tích 6 mẫu dung dịch chuẩn eurycomanone, xác định kết quả định lượng theo đường chuẩn pha trong MeOH, tiến hành trong cùng điều kiện Xác

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng

2 Dung dịch thử: dung dịch dịch chiết rễ cây bá bệnh pha trong MeOH

3 Dung dịch thử thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử một lượng chính xác chất chuẩn bằng khoảng 40% lượng eurycomanone có trong mẫu thử, tiến hành xử

lý mẫu và chạy sắc ký theo quy trình đã xây dựng

Từ kết quả chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn sẽ tính được phần trăm tìm lại so với lượng chuẩn thêm vào mẫu thử

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ

3.1.1 Quy trình chiết rễ cây bá bệnh

Thực hiện đồng thời trên 6 mẫu độc lập, mỗi mẫu là 100 mg dược liệu rễ cây

bá bệnh phơi khô Với mỗi mẫu, cắt nhỏ vụn và thêm 5 ml MeOH rồi đem siêu âm trong 30 phút Gạn dịch chiết và lặp lại 2 lần như trên Gộp các dịch chiết với nhau, sau đó sấy ở 50o

C đến khối lượng không đổi

3.1.2 Xây dựng quy trình định lượng

a Điều kiện sắc ký

Trên cơ sở phân tích tài liệu tham khảo và khảo sát về thành phần pha động,

tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng

hệ thống HPL gilent 1260 Infinity như sau:

- Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250 mm, 5µm)

- Pha động: (acid formic 0,1%/nước): B (ACN)

- Detector D D: bước sóng 244 nm

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 10 μl

- Nhiệt độ buồng cột: 20 ± 0,8oC

- Dung môi pha mẫu: MeOH

ảng 3.1 Chương trình chạy dung môi pha động phân tích dịch chiết rễ bá bệnh

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Kết quả là chúng tôi thu được sắc ký đồ của dung dịch chuẩn eurycomanone với điều kiện sắc ký như trên

Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch eurycomanone chuẩn

b Thẩm định phương pháp phân tích

 Chuẩn bị dung dịch

+ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn eurycomanone,

hòa tan và định mức trong bình định mức 10 ml bằng MeOH được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 500 μg/ml (ppm)

Từ dung dịch chuẩn 1000 ppm tiến hành pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ 18,75 – 25 – 37,5 – 50 – 100 – 200 ppm

+ Dung dịch thử: Cắn chiết dược liệu eurycomanone được tiến hành như mục

3.1.1 pha trong MeOH

+ Dung dịch mẫu trắng: MeOH

 Độ đặc hiệu

Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng và mẫu phân tích eurycomanone theo chương trình khảo sát trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic eurycomanone trong sắc ký đồ Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của eurycomanone (tR = 10,117 phút) (hình 3.3) Vậy phương pháp phân tích eurycomanone xây dựng được có độ đặc hiệu cao

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu)

Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone (đánh giá độ đặc hiệu)

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ảng 3.2 Tính thích hợp hệ thống

Thí nghiệm

Thời gian lưu (phút)

Diện tích pic (mAU.s)

Hệ số bất đối

Số đĩa lý thuyết

mà chúng tôi sử dụng là thích hợp để định tính, định lượng eurycomanone

 Độ tuyến tính và khoảng nồng độ

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ 18,75 – 25 – 37,5 – 50 – 100 – 200 μg/ml Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần), ghi lại sắc

ký đồ và xác định diện tích pic tương ứng Lập phương trình hồi quy tuyến tính, hệ

số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu (bảng 3.3) Phương trình hồi quy tuyến tính thu được thể hiện trong (hình 3.4)