Chọn tạo các dòng đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng đột biến EMS trên hai giống ĐX208 và Taichung

1.1 Tính cấp thiết của đề tài Đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là cây họ đậu quan trọng, chiếm gần 10 diện tích và 5 sản lượng các loài họ đậu ăn hạt ở các nước nhiệt đới và á nhiệt đới. Đậu xanh chứa rất ít hàm lượng oligosaccharides – loại đường gây chứng đầy hơi, nhưng rất giàu đạm, khoáng chất, vitamin và là nguồn sắt chất lượng cao, đặc biệt tốt đối với phụ nữ và trẻ em thiếu máu, (Kim et al., 2015). Với thành phần dinh dưỡng như trên, đậu xanh đã trở thành một loại thực phẩm linh hoạt trong khẩu phần ăn của con người, là nguồn dược liệu được ưa chuộng (Myers, 2000). Ngoài ra, đậu xanh còn là nguồn thức ăn gia súc tốt để sản xuất thịt và sữa chất lượng cao (Boelt et al., 2014). Thêm vào đó, cây đậu xanh rất thích hợp cho việc xen canh và luân canh với nhiều loại cây trồng khác do có chu kỳ sinh trưởng ngắn, kỹ thuật canh tác đơn giản, thích ứng rộng với môi trường. Hơn nữa, với khả năng cố định đạm ở nốt rễ khi kết hợp với vi khuẩn Rhizobium trong đất cho phép đậu xanh phát triển mạnh trong đất thiếu đạm và có thể cải tạo được kết cấu đất (War et al., 2017). Trước tình hình biến đổi khí hậu hiện nay, hạn mặn đang là vấn đề nghiêm trọng, với khả năng chịu hạn khá, đậu xanh được xem như một cây trồng có tiềm năng đáp ứng được nhu cầu cấp thiết này (Rao, 2016). Ở Việt Nam, đậu xanh được trồng nhiều ở vùng Duyên hải Nam Trung Bộ và Tây nguyên. Hiện nay, chưa có một thống kê chính thức về cây trồng này, tuy nhiên theo số liệu thu thập được thì đậu xanh có năng suất bình quân khoảng 0,7 tấn/ha, và biến động lớn giữa các vùng miền (Nguyễn Văn Chương và ctv., 2014). Nguyên nhân cơ bản dẫn đến năng suất đậu xanh thấp có thể là do đậu xanh thường được trồng trên đất xấu, nông dân sử dụng giống cũ của địa phương không được chọn lọc, kiểu trái chín không đồng loạt. Nghiên cứu cho thấy chỉ có khoảng 65 trái đậu xanh được thu hoạch trong vòng 70-75 ngày sau khi gieo (NSKG), 18% trong lần thu hoạch thứ hai 75-80 NSKG và 17% trong lần thu hoạch thứ ba 90-95 NSKG (Rahman, 1991). Để rút ngắn thời gian và giảm chi phí thu hoạch thì việc chọn tạo giống đậu xanh mới năng suất cao, mang kiểu gen trái chín đồng loạt là tiêu chí quan trọng trong công tác chọn tạo và cải thiện giống đậu xanh hiện nay. Trong những năm gần đây, đột biến cảm ứng đã được chứng minh là một công nghệ khả thi, bền vững, hiệu quả cao, được chấp nhận về mặt môi trường, linh hoạt và chi phí thấp để tăng cường cải thiện giống cây trồng. Đột biến cảm ứng cho phép thoát được bế tắc của tính bất thụ bằng cách tạo các biến dị hữu ích và đem lại bước tiến đáng kể cho công tác chọn giống đậu xanh (Lagoda, 2009). Hóa chất Ethyl Methane Sulphonate (EMS) là tác nhân gây đột biến hiệu quả về phổ biểu hiện và được sử dụng phổ biến (Auti and Apparao, 2009). Trên thế giới, EMS đã được sử dụng thành công trong việc tạo ra giống mới có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng kháng sâu, bệnh, chống chịu được các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh trên một số giống cây trồng như: lúa (Singh et al., 1998; Talebi et al., 2012), đậu trắng (Girija and Dhanavel, 2009), đậu nành (Song et al., 2010; Satpute and Fultambkar, 2012), đậu xanh (Sandhu et al., 2003; Roychowdhury et al., 2012; Mishra and Singh, 2014). Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu tạo giống đột biến bằng hóa chất EMS rất ít, số lượng của những nghiên cứu này còn giới hạn, hầu hết các giống đột biến đã được công bố đều sử dụng tác nhân vật lý để gây đột biến. Hiện nay, phân tích kiểu gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử DNA đã và đang được phát triển mạnh, là một trong những kỹ thuật giúp cho phương pháp chọn giống đột biến cảm ứng trở nên nhanh chóng và có hiệu quả hơn. Việc phối hợp giữa phương pháp chọn giống bằng đột biến cảm ứng và kỹ thuật sinh học phân tử sẽ rút ngắn thời gian chọn tạo từ 3-4 thế hệ so với phương pháp chọn giống truyền thống (Điêu Thị Mai Hoa, 2006), đồng thời định hướng nhanh kiểu gen mong muốn và gia tăng hiệu quả của các giống đột biến. Xuất phát từ yêu cầu thực tế sản xuất đậu xanh và nhằm cung cấp thêm cơ sở khoa học, vật liệu cho công tác chọn tạo giống cũng như giống đậu xanh mới luận án “Chọn tạo các dòng đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng đột biến EMS trên hai giống ĐX208 và Taichung” đã được thực hiện.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP

TRẦN THỊ THANH THỦY

CHỌN TẠO CÁC DÒNG ĐẬU XANH (Vigna radiata L.) BẰNG ĐỘT BIẾN EMS TRÊN

HAI GIỐNG ĐX208 VÀ TAICHUNG

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG

MÃ NGÀNH 9620110

2019

MỤC LỤC

Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Abstract iii

Mục lục v

Danh sách bảng x

Danh sách hình xiii

Danh mục từ viết tắt xv

Chương 1: Giới thiệu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 3

1.4 Thời gian thực hiện 4

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 4

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 4

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

1.6 Những điểm mới của luận án 4

Chương 2: Tổng quan tài liệu 6

2.1 Nguồn gốc, phân loại và bộ gen cây đậu xanh 6

2.1.1 Nguồn gốc 6

2.1.2 Phân loại thực vật 6

2.1.3 Bộ gen cây đậu xanh 6

2.2 Đặc điểm nông học của cây đậu xanh 7

2.2.1 Hệ rễ 7

2.2.2 Thân và cành 7

2.2.3 Lá 7

2.2.4 Hoa 8

2.2.5 Trái 8

2.2.6 Hạt 9

2.3 Sâu và bệnh gây hại trên đậu xanh 9

2.4 Thời gian sinh trưởng và mùa vụ canh tác 10

2.4.1 Thời gian sinh trưởng 10

2.4.2 Mùa vụ canh tác 11

2.5 Tình hình sản xuất và nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh 11

2.5.1 Vai trò của giống và việc cải thiện giống 11

2.5.2 Trên thế giới 11

2.5.3 Ở Việt Nam 13

2.6 Ý nghĩa của đột biến cảm ứng trong chọn tạo giống cây trồng 15

2.7 Cơ sở khoa học và vai trò của chọn giống đột biến cảm ứng 16

2.7.1 Cơ sở khoa học của chọn giống đột biến cảm ứng 16

2.7.2 Vai trò của đột biến cảm ứng 16

2.7.3 Mục tiêu của phương pháp chọn giống đột biến cảm ứng 17

2.8 Cơ sở di truyền của đột biến 18

2.9 Các tác nhân gây đột biến 19

2.9.1 Cơ chế gây đột biến của tác nhân phóng xạ 20

2.9.2 Cơ chế gây đột biến của tác nhân hóa học 21

2.9.3 Cơ chế tác động của Ethyl Methane Sulphonate 22

2.10 Sự biểu hiện của các kiểu đột biến 24

2.10.1 Các loại đột biến 24

2.10.2 Những biểu hiện của đột biến 24

2.11 Quá trình phát sinh đột biến và cách nghiên cứu chúng 24

2.11.1 Chuẩn bị vật liệu đối với cây sinh sản bằng hạt 24

2.11.2 Chọn tác nhân gây đột biến và liều lượng xử lý 25

2.11.3 Theo dõi và chọn lọc đột biến 26

2.12 Các biểu hiện hình thái ở cây đột biến 32

2.12.1 Đột biến liên quan đến diệp lục 32

2.12.2 Đột biến về hình dạng và kích thước lá 35

2.12.3 Đột biến về hoa 35

2.12.4 Đột biến dạng trái 36

2.12.5 Đột biến về đặc tính trổ hoa sớm và trổ hoa muộn 37

2.12.6 Đột biến đặc tính chín sớm và chín muộn 37

2.13 Tình hình phát triển giống cây trồng đột biến 38

2.14 Hệ số di truyền và hệ số phương sai 40

2.15 So sánh kiểu gen của dòng đột biến và giống gốc 42

2.16 Các nghiên cứu về tạo giống cây trồng bằng xử lý EMS 42

2.16.1 Trên thế giới 42

2.16.2 Ở Việt Nam 44

2.17 Giải trình tự DNA và kỹ thuật SSR 45

2.17.1 Giải trình tự DNA 45

2.17.2 Kỹ thuật SSR 45

Chương 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 47

3.1 Thời gian và địa điểm 47

3.2 Vật liệu nghiên cứu 47

3.2.1 Vật liệu 47

3.2.2 Thiết bị vật tư và hóa chất 48

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 51

3.3.1 Gây tạo đột biến bằng hóa chất EMS 51

3.3.2 Nghiên cứu các quần thể đậu xanh đột biến ở thế hệ M1 51

3.3.3 Khảo sát các quần thể đậu xanh đột biến ở thế hệ M2 và M3 52

3.3.4 Khảo nghiệm các dòng đậu xanh đột biến từ M4 đến M5 53

3.3.5 Khảo nghiệm các dòng đậu xanh đột biến ở thế hệ M6 53

3.3.6 Kỹ thuật canh tác 54

3.3.7 Phương pháp thu thập các chỉ tiêu ngoài đồng 54

3.3.8 Phương pháp ước lược các thông số biến dị di truyền 58

3.3.9 Đánh giá mức độ nhiễm sâu bệnh và đổ ngã 60

3.3.10 Phương pháp dấu phân tử ở thế hệ M6 61

3.3.11 Phương pháp đánh giá độ thuần 65

3.3.12 Phân tích khoảng cách di truyền 66

3.3.13 Phương pháp tính chỉ số Pi và chỉ số Theta 66

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 67

Chương 4: Kết quả và thảo luận 68

4.1 Ghi nhận tổng quát 68

4.2 Sức sống của các quần thể đậu xanh ở M1, vụ Thu Đông 2013 69

4.2.1 Tỉ lệ sống ở các quần thể đậu xanh ở thời điểm 15 NSKG 70

4.2.2 Tỉ lệ sống của cây lúc trổ 70

4.2.3 Tỉ lệ gây chết so với đối chứng 71

4.3 Hiệu quả và hiệu suất đột biến 72

4.3.1 Tần số đột biến 72

4.3.2 Hiệu quả đột biến (Mutagenic Effectiveness) 72

4.3.3 Hiệu suất đột biến (Mutagenic Efficiency) 73

4.4 Kết quả nghiên cứu các quần thể đậu xanh từ M1 đến M3 73

4.4.1 Đặc tính sinh trưởng của các quần thể đậu xanh từ M1 đến M3 73

4.4.2 Biến dị hình thái lá ở các quần thể đậu xanh đột biến từ M1-M3 75

4.4.3 Đặc tính nông học của các quần thể đậu xanh ở M1, M2 và M3 81

4.5 Nhận xét về kết quả nghiên cứu các quần thể đậu xanh ở M1, M2 và M3 89 4.6 Ước lược thông số di truyền các quần thể đậu xanh ở M3 89

4.7 Kết quả khảo sát các đặc tính sinh trưởng, hình thái và nông học ở các dòng đột biến ở M4, M5 và M6 93

4.7.1 Đặc tính sinh trưởng của các giống/dòng đậu xanh ở M4 – M6 94

4.7.2 Đặc tính hình thái của các giống/dòng đậu xanh ở M4 – M6 99

4.7.3 Đặc tính nông học ở các giống/dòng đậu xanh từ M4 đến M6 101

4.7.4 Thành phần năng suất và năng suất của các giống/dòng đậu xanh từ thế hệ M4 đến M6 112

4.8 Phân tích kiểu gen bằng dấu SSR 120

4.8.1 Kết quả ly trích và kiểm tra DNA từ lá đậu xanh 120

4.8.2 Kết quả kiểm tra kiểu gen của các dòng đậu xanh đột biến 124

4.8.3 Mối quan hệ di truyền giữa các giống/dòng đậu xanh dựa trên phân tích SSR 126

4.9 Kết quả giải trình tự gen liên quan đến khối lượng 1.000 hạt 130

4.9.1 Kết quả khuếch đại gen 131

4.9.2 Kết quả giải trình tự gen 131

Chương 5 Kết luận và đề xuất 136

5.1 Kết luận 136

5.2 Đề xuất 136

Danh mục liệt kê các bài báo đã công bố 138

Tài liệu tham khảo 139

Phụ chương 148

2.4 Số giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp đột biến ở

một số quốc gia tính đến năm 2007

40

3.1 Trình tự 17 đoạn mồi SSR, kích thước (KT) và nhóm liên kết

(NLK) được sử dụng trong thí nghiệm

50

4.1 Sức sống ở các quần thể đậu xanh đột biến giai đoạn 15

NSKG và trổ hoa vụ Thu Đông 2013

70

4.2 Tần số đột biến, hiệu quả và hiệu suất đột biến ở các quần thể

đậu xanh đột biến thế hệ M1, vụ Thu Đông 2013

4.6 Chiều cao cây lúc chín (cm) và số trái trên cây của các quần

thể đậu xanh trong 2 thí nghiệm ở M1, M2 và M3, vụ Thu

Đông 2013, Đông Xuân 2013-2014 và Xuân Hè 2014

82

4.7 Chiều dài trái và số hạt trên trái của các quần thể đậu xanh

trong 2 thí nghiệm ở M1, M2 và M3, vụ Thu Đông 2013, Đông

Xuân 2013-2014 và Xuân Hè 2014

84

4.8 Khối lượng 1.000 hạt và năng suất hạt (g/cây) của các quần

thể đậu xanh trong 2 thí nghiệm ở M1, M2 và M3, vụ Thu

86

Đông 2013, Đông Xuân 2013-2014 và Xuân Hè 2014

4.9 Tỉ lệ cá thể cho trái chín đồng loạt và không đồng loạt ở các

quần thể đậu xanh đột biến thế hệ M3 vụ Xuân Hè 2014

4.12 Thông số di truyền ở 4 tính trạng số lượng của 4 quần thể

Taichung đột biến và quần thể Taichung (ĐC)

91

4.13 Đặc tính sinh trưởng của các dòng đậu xanh đột biến ở M4 và

2 giống đối chứng (ĐX208 và Taichung) vụ Thu Đông 2014

95

4.14 Đặc tính sinh trưởng của các dòng đậu xanh đột biến ở M5 và

2 giống đối chứng (ĐX208 và Taichung) vụ Thu Đông 2015

96

4.15 Đặc tính sinh trưởng của các dòng đậu xanh đột biến ở M6 và

giống đối chứng ĐX208 vụ Đông Xuân 2016

97

4.16 Chiều cao cây lúc chín, số lóng và số cành của các giống/dòng

đậu xanh thế hệ M4 vụ Thu Đông 2014

102

4.17 Chiều cao cây lúc chín, số lóng và số cành của các giống/dòng

đậu xanh ở thế hệ M5 vụ Thu Đông 2015

103

4.18 Chiều cao cây lúc chín, số lóng và số cành của các giống/dòng

đậu xanh ở thế hệ M6 vụ Đông Xuân 2015-2016

104

4.19 Số trái/cây, chiều dài trái, số hạt/trái của các giống/dòng đậu

xanh ở thế hệ M4 vụ Thu Đông 2014

108

4.20 Số trái/cây, chiều dài trái, số hạt/trái của các giống/dòng đậu

xanh ở thế hệ M5 vụ Thu Đông 2015

110

4.21 Số trái/cây, chiều dài trái, số hạt/trái của các giống/dòng đậu

xanh ở thế hệ M6 vụ Đông Xuân 2015-2016

111

4.22 Thành phần năng suất và năng suất của các giống/dòng đậu

xanh ở thế hệ M4 vụ Thu Đông 2014

114

4.23 Thành phần năng suất và năng suất của các giống/dòng đậu

xanh ở thế hệ M5 vụ Thu Đông 2015

115

4.24 Thành phần năng suất và năng suất của các giống/dòng đậu

xanh ở thế hệ M6 vụ Đông Xuân 2015-2016

116

4.25 Danh sách các dòng đậu xanh đột biến ưu tú ở M6 được tuyển 119

chọn trong vụ Đông Xuân 2015-2016

4.26 Danh sách 35 giống/dòng đậu xanh được sử dụng để phân tích

4.28 Danh sách 6 dòng đậu xanh đột biến ở M6 và 2 giống gốc

(ĐX208 và Taichung) sử dụng để giải trình tự gen

130

4.29 Sự sai khác trong trình tự nucleotide ở đoạn gen từ vị trí

461-500 nucleotide của 3 dòng ĐX208 đột biến và giống ĐX208

134

4.30 Sự sai khác trong trình tự nucleotide ở đoạn gen từ vị trí

461-500 nucleotide của 3 dòng Taichung đột biến và giống

Taichung

135

2.4 Số lượng giống cây trồng đột biến trên thế giới năm

1969-2014

39

4.9 Màu vỏ trái, dạng trái, màu hoa, màu vỏ hạt và dạng hạt của

dòng ĐX8-1-28-8A và dòng ĐX4-6-1-1

101

4.10 Kiểu chín đồng loạt của dòng TC8-4-3-5B (A) và kiểu chín

đồng loạt từng phần của giống Taichung (ĐC) (B)

119

4.11 Màu sắc hạt và cỡ hạt của 11 dòng đậu xanh đột biến triển

vọng ở M6 được tuyển chọn trong vụ Đông Xuân 2015-2016

4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR 13 dòng ĐX208 đột biến và

giống gốc (ĐX208) với cặp mồi MBSSR039

124

4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR 20 dòng Taichung đột biến và

giống gốc (Taichung) với cặp mồi MBSSR039

125

4.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 20 dòng Taichung đột

biến và giống Taichung (ĐC) với cặp mồi CEDAAG002

126

4.17 Mối quan hệ di truyền của 13 dòng ĐX208 đột biến và giống

ĐX208 (giống gốc)

128

4.18 Mối quan hệ di truyền của 20 dòng Taichung đột biến và

giống Taichung (giống gốc)

129

4.20 Sự khác biệt vị trí các nucleotide của 3 dòng đậu xanh đột

biến so với giống gốc ĐX208

131

4.21 Sự sai khác vị trí các nucleotide của 3 dòng đậu xanh

Taichung đột biến so với giống gốc Taichung

132

4.22 Mức độ biến dị vị trí các nucleotide ở 3 dòng ĐX208 đột biến

(A) và 3 dòng Taichung đột biến (B) so với giống gốc ĐX208

và Taichung tương ứng

133

DAFF Department of Agriculture, Fisheries and Forestry

h2b Heritability in broad sense

IBPGR International Board for Plant Genetic Resources

NCBI National Center for Biotechnology Information

PCV Phenotypic Coefficient of Variance

TEMED Tetra methyl ethylene diamine

UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là cây họ đậu quan trọng, chiếm

gần 10 diện tích và 5 sản lượng các loài họ đậu ăn hạt ở các nước nhiệt đới

và á nhiệt đới Đậu xanh chứa rất ít hàm lượng oligosaccharides – loại đường gây chứng đầy hơi, nhưng rất giàu đạm, khoáng chất, vitamin và là nguồn sắt

chất lượng cao, đặc biệt tốt đối với phụ nữ và trẻ em thiếu máu, (Kim et al.,

2015) Với thành phần dinh dưỡng như trên, đậu xanh đã trở thành một loại thực phẩm linh hoạt trong khẩu phần ăn của con người, là nguồn dược liệu được ưa chuộng (Myers, 2000) Ngoài ra, đậu xanh còn là nguồn thức ăn gia

súc tốt để sản xuất thịt và sữa chất lượng cao (Boelt et al., 2014) Thêm vào

đó, cây đậu xanh rất thích hợp cho việc xen canh và luân canh với nhiều loại cây trồng khác do có chu kỳ sinh trưởng ngắn, kỹ thuật canh tác đơn giản, thích ứng rộng với môi trường Hơn nữa, với khả năng cố định đạm ở nốt rễ

khi kết hợp với vi khuẩn Rhizobium trong đất cho phép đậu xanh phát triển

mạnh trong đất thiếu đạm và có thể cải tạo được kết cấu đất (Waret al., 2017)

Trước tình hình biến đổi khí hậu hiện nay, hạn mặn đang là vấn đề nghiêm trọng, với khả năng chịu hạn khá, đậu xanh được xem như một cây trồng có tiềm năng đáp ứng được nhu cầu cấp thiết này (Rao, 2016)

Ở Việt Nam, đậu xanh được trồng nhiều ở vùng Duyên hải Nam Trung

Bộ và Tây nguyên Hiện nay, chưa có một thống kê chính thức về cây trồng này, tuy nhiên theo số liệu thu thập được thì đậu xanh có năng suất bình quân khoảng 0,7 tấn/ha, và biến động lớn giữa các vùng miền (Nguyễn Văn

Chương và ctv., 2014) Nguyên nhân cơ bản dẫn đến năng suất đậu xanh thấp

có thể là do đậu xanh thường được trồng trên đất xấu, nông dân sử dụng giống

cũ của địa phương không được chọn lọc, kiểu trái chín không đồng loạt Nghiên cứu cho thấy chỉ có khoảng 65 trái đậu xanh được thu hoạch trong vòng 70-75 ngày sau khi gieo (NSKG), 18% trong lần thu hoạch thứ hai 75-80 NSKG và 17% trong lần thu hoạch thứ ba 90-95 NSKG (Rahman, 1991) Để rút ngắn thời gian và giảm chi phí thu hoạch thì việc chọn tạo giống đậu xanh mới năng suất cao, mang kiểu gen trái chín đồng loạt là tiêu chí quan trọng trong công tác chọn tạo và cải thiện giống đậu xanh hiện nay

Trong những năm gần đây, đột biến cảm ứng đã được chứng minh là một công nghệ khả thi, bền vững, hiệu quả cao, được chấp nhận về mặt môi trường, linh hoạt và chi phí thấp để tăng cường cải thiện giống cây trồng Đột biến cảm ứng cho phép thoát được bế tắc của tính bất thụ bằng cách tạo các

biến dị hữu ích và đem lại bước tiến đáng kể cho công tác chọn giống đậu xanh (Lagoda, 2009) Hóa chất Ethyl Methane Sulphonate (EMS) là tác nhân gây đột biến hiệu quả về phổ biểu hiện và được sử dụng phổ biến (Auti and Apparao, 2009) Trên thế giới, EMS đã được sử dụng thành công trong việc tạo ra giống mới có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng kháng sâu, bệnh, chống chịu được các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh trên một số giống

cây trồng như: lúa (Singh et al., 1998; Talebi et al., 2012), đậu trắng (Girija

and Dhanavel, 2009), đậu nành (Song et al., 2010; Satpute and Fultambkar,

2012), đậu xanh (Sandhu et al., 2003; Roychowdhury et al., 2012;Mishra and Singh, 2014) Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu tạo giống đột biến bằng hóa chất EMS rất ít, số lượng của những nghiên cứu này còn giới hạn, hầu hết các giống đột biến đã được công bố đều sử dụng tác nhân vật lý để gây đột biến

Hiện nay, phân tích kiểu gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử DNA đã

và đang được phát triển mạnh, là một trong những kỹ thuật giúp cho phương pháp chọn giống đột biến cảm ứng trở nên nhanh chóng và có hiệu quả hơn Việc phối hợp giữa phương pháp chọn giống bằng đột biến cảm ứng và kỹ thuật sinh học phân tử sẽ rút ngắn thời gian chọn tạo từ 3-4 thế hệ so với phương pháp chọn giống truyền thống (Điêu Thị Mai Hoa, 2006), đồng thời định hướng nhanh kiểu gen mong muốn và gia tăng hiệu quả của các giống đột biến

Xuất phát từ yêu cầu thực tế sản xuất đậu xanh và nhằm cung cấp thêm

cơ sở khoa học, vật liệu cho công tác chọn tạo giống cũng như giống đậu xanh

mới luận án “Chọn tạo các dòng đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng đột biến

EMS trên hai giống ĐX208 và Taichung” đã được thực hiện

1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu

1.2.2 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

1.2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu

- Hai giống đậu xanh dùng làm vật liệu gây đột biến bởi EMS (Ethyl Methane Sulphonate), trong đó (i) giống Taichung (tên gốc là Tainan 5) có

nguồn gốc từ tổ hợp lai VC2750A x VC2768A, được phóng thích vào năm

1989 và được nhập vào trường Đại học Cần Thơ năm 2009; (ii) giống ĐX208

có nguồn gốc từ dòng VC4111A của AVRDC, do bộ môn Di truyền và chọn giống Cây trồng – ĐHCT tuyển chọn

- Một số dòng đậu xanh đột biến cảm ứng có triển vọng đã được chọn tạo bằng phương pháp đột biến

1.2.2.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu trên cây đậu xanh Vigna radiata (L.) Cụ thể là trên 2 giống

ĐX208 và Taichung Xử lý EMS lên hạt của 2 giống này, ở 4 mức nồng độ 0,2; 0,4; 06; 0,8 EMS Sau đó (i) Trồng, quan sát và tuyển chọn các thế hệ đột biến từ M1 đến M6 trong điều kiện ngoài đồng (ii) Xác định độ thuần liên quan đến gen ngày trổ hoa và khối lượng 1.000 của các dòng được tuyển chọn bằng dấu phân tử SSR Giải trình tự gen khối lượng 1.000 hạt của 6 dòng đột biến và 2 giống gốc (ĐX208 và Taichung) bằng dấu SNPs

1.3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với 6 nội dung

Nội dung 1: Gây đột biến cảm ứng bằng hóa chất EMS lên 2 giống đậu

xanh ĐX208 và Taichung ở bốn mức nồng độ 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8% EMS nhằm tạo nguồn vật liệu khởi đầu mới

Nội dung 2: Ở thế hệ M1 trồng và quan sát sức sống của cây con và cây trưởng thành và tỉ lệ gây chết so với đối chứng (LOC)

Nội dung 3: Ở thế hệ M2 và M3 trồng và đánh giá các đột biến diệp lục, đột biến hình thái trên lá, xác định biến dị di truyền ở các tính trạng như chiều cao cây lúc chín (cm), số trái trên cây (trái), khối lượng 1.000 hạt (g), năng suất hạt trên cây (g) và tuyển chọn các dòng đậu xanh đột biến có đặc tính tốt

Nội dung 4: Ở thế hệ M4 và M5 trồng và đánh giá sơ khởi thành phần năng suất và năng suất, khả năng cho trái chín đồng loạt ở các dòng đậu xanh đột biến và tuyển chọn các dòng đột biến ưu tú nhất

Nội dung 5: Ở thế hệ M6 trồng và so sánh các dòng đậu xanh đột biến triển vọng với giống ĐX208 hiện canh tác phổ biến tại địa phương

Nội dung 6: Ở thế hệ M6,kiểm tra độ thuần của các dòng đột biến ưu tú bằng dấu SSR ở tính trạng khối lượng 1.000 hạt và ngày trổ hoa và giải trình

tự gen của 6 dòng đột biến và 2 giống gốc (ĐX208 và Taichung) bằng dấu SNPs

1.4 Thời gian thực hiện

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 08/2013 đến tháng 05/2017

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống trên cây đậu xanh, kết hợp giữa phương pháp chọn giống truyền thống với phương pháp hiện đại nhằm tạo nguồn vật liệu di truyền mới (có tính trạng quý) và rút ngắn thời gian chọn tạo giống Ứng dụng dấu phân tử SSR để xác định dòng thuần dựa vào việc phân tích kiểu gen khối lượng 1.000 hạt và ngày trổ hoa Giải trình tự vùng gen khối lượng 1.000 hạt của 6 dòng đột biến và các giống đối chứng (ĐX208

và Taichung) để xác định sự khác biệt di truyền của chúng với nhau bằng dấu SNPs

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về phương pháp tạo giống mới thông qua xử lý đột biến, đồng thời là tư liệu có giá trị cho việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng

Các kết quả của đề tài là cơ sở để tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu tạo dòng đột biến mới làm nguồn nguyên liệu di truyền cho việc chọn tạo giống bằng xử lý đột biến EMS không chỉ đối với cây đậu xanh mà còn có thể

mở rộng với nhiều đối tượng cây trồng khác

Các số liệu công bố trong luận án có thể sử dụng làm minh chứng phục

vụ cho công tác giảng dạy và nghiên cứu về phương pháp chọn tạo giống đậu xanh đột biến ở các trường đại học và cơ quan nghiên cứu nông nghiệp

Đã ứng dụng thành công phương pháp xử lý đột biến cho cây đậu xanh bằng tác nhân EMS

1.6 Những điểm mới của luận án

Đã tạo được nguồn vật liệu khởi đầu có tính đa dạng, mang ưu điểm về tiềm năng năng suất cao và là nguồn vật liệu lai tạo mới

Đã tạo ra 11 dòng đột biến có tiềm năng và đánh giá được đặc điểm sinh trưởng, hình thái, nông học, năng suất và thành phần năng suất trong điều kiện

tự nhiên

Điểm mới nhất trong luận án là việc đánh giá kiểu hình kết hợp với phân tích kiểu gen cũng như đánh giá sự sai khác di truyền bằng dấu SSR Đồng thời xác định trình tự nucleotide của một số gen liên quan đến vùng gen khối lượng 1.000 hạt của 6 dòng đột biến và 2 giống đối chứng bằng dấu SNPs

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc, phân loại và bộ gen cây đậu xanh

và Lê Khả Tường, 1998)

2.1.2 Phân loại thực vật

Cây đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) thuộc ngành Magnolyophyta, lớp Magnolyopsida, bộ Fabales, họ Fabaceae, chi Vigna Chi Vigna là một

trong những chi lớn trong họ đậu, bao gồm khoảng 150 loài thuộc 7 chi phụ là

Vigna; Plectotropis; Ceratotropis; Lasionspron; Sigmoidotropis; Haydonia; Macrohynchus Đậu xanh bao gồm các loài thuộc hai chi phụ là Vigna và Ceratotropis Trong đó, chi phụ Ceratotropis được gọi là nhóm đậu Châu Á,

bao gồm 16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt phổ biến rộng rãi ở châu Á như

đậu xanh (Vigna radiata), đậu mười (Vigna mungo), đậu bướm (Vigna

aconitifolia), đậu đỏ (Vigna angularis), đậu nho nhe (Vigna umbellate) Dạng

hoang dại thuộc chi Vigna radiata cũng được tìm thấy ở Madagasca bên bờ

Ấn Độ Dương và Đông Phi (Nguyễn Đăng Khôi, 1997; Trần Đình Long và Lê

Khả Tường, 1998; Aitawade et al., 2012)

2.1.3 Bộ gen cây đậu xanh

Đậu xanh có bộ nhiễm sắc thể (NST) lưỡng bội 2n=2x=22 (Somta et al.,

2009) Kích thước bộ gen tương đối nhỏ, ước tính khoảng 579 Mbp (Arumuganathan and Earle, 1991) và tương tự như kích thước của các loài

khác trong chi Vigna (Somta and Srinives, 2007) Chiều dài của các cặp NST

biến đổi từ 28,2 đến 73,3 µm (Krishnan and De, 1965) Ngoài ra kích thước

DNA trong lạp thể ở đậu xanh là 151 kbp (Tangphatsornruang et al., 2010) và kích thước DNA trong ty thể là 401 kbp (Alverson et al., 2011) Mới đây nhất Kang et al (2014) đã nghiên cứu thành công trình tự gen đậu xanh và những dấu hiệu tiến hóa trong các loài thuộc chi Vigna bằng phương pháp de novo

assemply sử dụng kỹ thuật đánh giá kiểu gen bằng cách giải trình tự Tuy nhiên, việc nghiên cứu về bộ gen của cây đậu xanh vẫn còn rất ít và đi sau các cây họ đậu khác

2.2 Đặc điểm nông học của cây đậu xanh

Cây đậu xanh là loại cây trồng cạn, thu trái và hạt, bao gồm các bộ phận

rễ, thân, lá, hoa, trái, hạt

2.2.1 Hệ rễ

Hệ rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ Rễ chính thường ăn sâu khoảng 20-30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn sâu tới 70-100 cm Rễ phụ thường gồm 30-40 cái, dài khoảng 20-25 cm (Trần Văn

Lài và ctv., 1993)

Trên rễ cây họ đậu có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm

Rhizobium Các nốt sần trên rễ bắt đầu hình thành khi cây có 2-3 lá thật và đạt

tối đa khi cây ra hoa rộ Trên mỗi cây có khoảng 10-20 nốt sần, tập trung chủ yếu ở cổ rễ Kích thước của các nốt sần không giống nhau, đường kính dao động từ 4-5 mm Trên các loại rễ thì lớp rễ đầu tiên có nhiều nốt sần, còn các lớp rễ mọc ra từ cổ rễ về sau ít nốt sần hơn Những nốt sần hình thành sau khi cây ra hoa được gọi là nốt sần thứ cấp hoạt động mạnh hơn loại nốt sần sinh ra

ở nửa đầu thời kỳ sinh trưởng Trung bình mỗi vụ, một héc ta đậu xanh có thể

bù lại cho đất tương ứng 85-107 kg nitơ làm cho đất tơi xốp hơn (Phạm Văn Thiều, 1999)

2.2.2 Thân và cành

Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo, phân đốt, mọc thẳng đứng có khi hơi nghiêng Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có màu xanh hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâu sáng bao bọc, lớp lông này dày hay mỏng là tùy thuộc vào giống Thân cây yếu, dễ đổ ngã khi mưa to gió lớn Trên thân chia 7-8 đốt, các đốt thứ 4, 5, 6 thường mọc ra các chùm hoa, giữa hai đốt gọi là lóng Độ dài của các lóng thay đổi tùy theo vị trí lóng trên cây và điều kiện khác Các lóng dài khoảng từ 8-10 cm, các lóng ngắn chỉ 3-4

cm Từ các đốt mọc ra các cành, trung bình có 1-5 cành Các cành mọc ra từ các nách lá thứ 2, 3 phát triển mạnh gọi là cành cấp I, trên mỗi cành này lại có trung bình 2-3 mắt, từ các mắt này mọc ra các chùm hoa Cũng có trường hợp cây không phân cành, trường hợp này thường thấy khi trồng với mật độ quá dày (Hà Thị Hiến, 2004)

2.2.3 Lá

Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách Các lá chét

có nhiều dạng hình khác nhau từ ô van, thuôn tròn, thuôn dài, lưỡi mác Sau khi gieo 7-8 ngày thì cây mới hình thành các lá thật Lá thật hoàn chỉnh gồm có: lá kèm, cuống lá và phiến lá Cuống lá dài từ 8-10 cm, hình lòng máng Cả

hai mặt trên và dưới của lá đều có lông bao phủ, gân lá nổi rõ lên ở phía dưới mặt lá Màu lá xanh đậm hoặc xanh vàng Số lượng lá, kích thước, hình dạng

và chỉ số diện tích lá thay đổi tuỳ thuộc vào giống, đất trồng và thời vụ

Hoa đậu xanh thường nở rải rác, các hoa ở thân nở trước, các hoa ở cành

nở sau, chậm hơn, có khi còn chậm hơn các chùm hoa cuối cùng ở ngọn cây Hoa nở được 24 giờ là tàn, sau khi nở hoa và thụ tinh khoảng 20 ngày là trái chín Số lượng hoa dao động rất lớn, từ 30 đến 280 hoa trên một cây Dựa vào thời gian nở hoa có thể chia thành 3 nhóm:

- Nhóm ra hoa tập trung: hoa nở kéo dài  16 ngày

- Nhóm ra hoa không tập trung: hoa nở liên tiếp  30 ngày

- Nhóm ra hoa trung gian: hoa nở từ 16 đến 30 ngày

Các trái của những lứa hoa đầu lại thường chín chậm hơn các trái ra lứa sau đó, nhưng trái to và hạt mẩy hơn Các trái của những đợt hoa ra sau thường ngắn, ít hạt, hạt không mẩy, màu hạt cũng nhạt và bé hơn Các trái sinh

ra từ các chùm hoa trên thân nhiều trái và trái to, dài hơn trái của các chùm hoa ở cành Trái đậu xanh chín rải rác, có khi kéo dài đến 20 ngày (Phạm Văn Thiều, 1999)

2.2.6 Hạt

Hạt đậu xanh có dạng hình tròn, hình trụ, thuôn hoặc tròn đều và có nhiều màu sắc khác nhau như: màu xanh bóng, xanh xám, vàng, nâu hoặc đen xám, nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp của trái Ruột hạt có màu vàng, xanh hoặc xanh nhạt

Mỗi trái có từ 8-15 hạt Hạt của những trái trên thân thường to, mẩy hơn hạt của các trái ở cành Hạt của các trái lứa đầu cũng to và mẩy hơn các trái lứa sau Số lượng hạt trung bình trong một trái là một trong những yếu tố chủ yếu tạo thành năng suất của đậu xanh Khối lượng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20-90 gam, khối lượng 1.000 hạt từ 35-80 gam tùy giống, thời vụ và chế độ canh tác (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996)

2.3 Sâu và bệnh gây hại trên đậu xanh

- Giòi đục thân (Melanesgromyza sojae)

Phân bố trên một vùng rộng lớn ở cả châu Á, châu Úc và châu Âu Giòi xuất hiện trên hầu hết các giống đậu Thành trùng là loại ruồi nhỏ, dài từ 1,6 đến 2,0 mm, bụng có màu đen bóng hơi ngả xanh, mắt màu đỏ và phần trán giữa hai mắt kép hơi nhô cao lên Đời sống thành trùng từ 35 đến 38 ngày, một ruồi cái có thể đẻ đến 200 trứng Ấu trùng có hai ống thở ở cuối bụng có dạng chẻ đôi thành 2 nhánh và 6 lỗ thở tập trung ở phần cuối cùng Thời gian phát triển của ấu trùng từ 7 đến 10 ngày Nhộng hình bầu dục, dài 2,0-2,4 mm, ngang 0,7-1,0 mm lúc mới hình thành màu vàng, sau chuyển thành màu nâu, cuối đuôi có 2 ống thở nhọn, màu nâu đen

Cách gây hại: thành trùng ăn mặt trên của lá và các vết chích tập trung gần gốc, các gân chính, hình tròn và đẻ trứng vào vết chích đó Sau khi nở, ấu trùng đục ở mặt dưới lá khoảng 2 ngày, sau đó đục vào gân gần nhất, qua biểu

bì cuống, xuống vỏ thân và tiếp tục đục xuống gốc, gây hại phần thân dưới lớp biểu bì, ngay phía trên cổ rễ Ruồi làm nhộng giữa phần da và gỗ của thân cây đậu, ngay dưới mặt đất Trên cây đậu còn nhỏ giòi thường gây hại phần gốc và một số có thể đục đến rễ cái của cây đậu và làm nhộng ở lớp biểu bì thân, gần gốc hoặc trên mặt đất Trên cây đậu già, giòi thường làm hại các nhánh và làm nhộng ở cuống lá Chỗ cây có dòi làm rễ bị sưng, thối hoặc khô và nứt (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2013)

- Bệnh héo cây con (Rhizoctonia solani)

Theo Nguyễn Danh Vàn (2008) bệnh có thể gây hại cả ở giai đoạn cây đang tăng trưởng làm cho lá rụng, nhưng chủ yếu vẫn là thời kỳ cây con (một đến hai tuần tuổi), nếu bệnh nặng cây con có thể chết hàng loạt, làm cho

khiếm khuyết nhiều cây trên ruộng Ban đầu vết bệnh chỉ là những chấm nhỏ xuất hiện trên rễ, cổ rễ hoặc phần gốc sát với mặt đất, sau đó phát triển lan rộng dần ra xung quanh Làm cho cổ rễ, gốc cây bị hư thối mục, chuyển dần sang màu thâm đen, ủng nước hoặc hơi khô, tóp nhỏ lại không đủ sức giữ cây đứng vững, cây bị đổ ngã, tuy bộ lá vẫn còn xanh nhưng toàn thân đã bị héo

rũ Nếu ẩm độ ở dưới gốc cao, ở gốc sẽ bao phủ một lớp nấm màu trắng, sau chuyển dần sang màu xám, hoặc các hạch nấm tròn nhỏ trông giống như một hột cải, lúc đầu màu vàng sau chuyển dần sang màu nâu nhạt, nâu đen

Nấm gây bệnh tồn tại lâu dài trong đất trồng, chúng có thể sống hoại sinh trên tàn dư cây trồng trong nhiều năm không chết Bệnh thường phát sinh, phát triển mạnh trong điều kiện mưa ẩm nhiều, nhiệt độ không khí khoảng 20-25°C, đất thịt nặng, đất chặt, bí dễ đóng váng sau khi mưa, sau khi tưới, đất trũng, đọng nước, đất chuyên canh cây đậu xanh hoặc các loại đậu đỗ khác Ngoài cây đậu, nấm bệnh còn gây hại trên nhiều loại cây trồng khác như lúa, mía, bắp, đay và cây thuộc họ đậu

- Bệnh đốm lá (Cercospora canescens)

Bệnh thường tấn công cây đậu xanh ở vùng nhiệt đới, bệnh gây hại trên

lá Cây bị nhiễm từ sau ra hoa và có thể làm thiệt hại năng suất 20-58% Vết bệnh có hình tròn hoặc hình dạng không đồng đều ở giữa có màu trắng xám và xung quanh viền màu nâu xám đến nâu sẫm, trồng với mật độ dày sẽ làm tăng nguy cơ mắc bệnh (DAFF, 2010)

2.4 Thời gian sinh trưởng và mùa vụ canh tác

2.4.1 Thời gian sinh trưởng

Giai đoạn sinh trưởng kéo dài hoặc giảm đi có thể tạo ra sự mất cân bằng trong giai đoạn sinh dưỡng và sinh sản làm ảnh hưởng đến năng suất cây trồng (Dhingra and Sekhon, 1988) TGST của đậu xanh thay đổi tùy vào giống, mùa

vụ và biện pháp canh tác (Chu Thị Thơm và ctv., 2005) Trồng mùa nắng, cây

bắt đầu cho thu hoạch lúc 56-63 ngày và chấm dứt lúc 63-72 ngày Trồng mùa mưa, thu hoạch trái khi cây được 65-70 ngày tuổi và chấm dứt vào 68-80 ngày TGST chia thành 5 thời kỳ:

- Thời kỳ mọc mầm: bắt đầu từ lúc gieo đến khi cây mọc 2 lá đơn

- Thời kỳ cây con: từ khi cây mọc mầm đến khi cây có lá kép

- Thời kỳ tăng trưởng chậm: từ cây con đến khi cây có nụ hoa lớn Đây là thời kỳ hoàn thiện hệ thống rễ và hình thành nụ hoa

- Thời kỳ trổ hoa: Thời kỳ nằm gối lên thời kỳ sau, vì cây trổ hoa 2-3 đợt

- Thời kỳ phát triển trái (tạo hạt): Bắt đầu khi đậu trái (2 ngày sau khi hoa nở) đến khi chấm dứt thu hoạch

2.4.2 Mùa vụ canh tác

Đậu xanh được trồng chủ yếu ở các vụ sau:

- Vụ Đông Xuân: gieo tháng 12-1 dương lịch (DL), thu hoạch tháng 2-3 (DL) Đây là thời vụ trồng chính, cây phát triển tốt và ít sâu bệnh

- Vụ Xuân Hè: gieo tháng 2-3 (DL), thu hoạch tháng 5-6 (DL) Trái chín vào mùa mưa nên phải hái lúc vừa chín để hạt không giảm phẩm chất

- Vụ Hè Thu: gieo tháng 4-5 (DL) thu hoạch tháng 7-8 (DL) Vụ này dễ bị sâu bệnh tấn công (sâu xanh, đốm lá, khảm vàng), sự ra hoa và thu hoạch trùng với mùa mưa gió làm giảm số trái, kích thước và phẩm chất hạt dẫn đến năng suất bị tổn thất nặng nề (Hà Thị Hiến, 2004)

2.5 Tình hình sản xuất và nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh

2.5.1 Vai trò của giống và việc cải thiện giống

Giống là một quần thể cây trồng có những đặc điểm sinh học giống nhau trong một chừng mực nhất định được tạo ra để gieo trồng trong điều kiện tự nhiên và sản xuất nhất định (Trần Thượng Tuấn, 1992) Giống là tư liệu sản xuất quan trọng, là biện pháp hiệu quả để nâng cao năng suất và phẩm chất

của cây trồng (Trần Khắc Thi, 2003)

Việc cải thiện giống làm gia tăng đáng kể năng suất, giống mới giúp cho sản xuất nông nghiệp phát triển Việc sử dụng giống mới đã qua chọn lọc làm cho năng suất tăng cao gấp rưởi đến gấp đôi so với các giống cổ truyền (Phạm Văn Thiều, 1999) Cải thiện giống rất có hiệu quả trong việc nâng cao năng suất và tính kháng sâu bệnh Các giống đậu xanh cải thiện đã góp phần đa dạng hóa trên đồng ruộng và mang lại hiệu quả kinh tế cao (Nguyễn Văn Hiển, 2000)

2.5.2 Trên thế giới

Đậu xanh đóng vai trò là chất xúc tác, đa dạng hoá các mô hình trồng trọt, làm giảm thiệt hại đối với tài nguyên nước và đất, giúp cải thiện đất hiệu quả hơn (Chadha, 2010) Cây đậu xanh được trồng trải rộng trên nhiều vĩ độ

từ 40° Nam đến 40°Bắc, ở các khu vực có nhiệt độ ban ngày lớn hơn 20°C

(Lawn and Ahn, 1985) Ở các nước nhiệt đới và á nhiệt đới, đậu xanh chiếm

10 diện tích và 5 sản lượng các loại đỗ đậu ăn hạt Diện tích trồng đậu xanh lớn ở các nước Nam, Đông và Đông Nam Á bao gồm Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan và Pakistan, chiếm khoảng 90 sản lượng thế giới (Lambrides and Godwin, 2007) Sản lượng đậu xanh ở Châu Á tăng 12 từ 2,3 triệu tấn năm 1985 lên 3,1 triệu tấn vào năm 2000 (Weinberger, 2003) Ấn

Độ là nước sản xuất đậu xanh lớn nhất thế giới với 3,5 triệu ha trồng và sản

xuất 1,2 triệu tấn hạt chiếm khoảng 65 diện tích và 54 sản lượng trên thế giới (IIPR, 2011) Tiêu thụ toàn cầu đã tăng từ 22 đến 66 từ năm 1984 đến

năm 2006 (Shanmugasundaram et al., 2009) Ở Mỹ, hàng năm đậu xanh được

tiêu thụ từ 7-9 ngàn tấn và gần 75 số này được nhập khẩu (DAFF, 2010) Trong những năm gần đây, đậu xanh là loại cây trồng có diện tích và sản

lượng khá cao với gần 3 triệu tấn từ hơn 6 triệu héc ta trên thế giới (Nair et al.,

biệt (Munir et al., 2012) Điều này cho thấy, chọn giống đậu xanh ngày càng

đầy hứa hẹn và trở thành nhu cầu thiết yếu đáp ứng với mô hình trồng trọt

hiện tại (Monjuru et al., 2013)

Công tác chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới được tiến hành theo một

số hướng chính như: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống chất lượng cao, tạo giống có khả năng chống chịu tốt và tạo giống có khả năng kháng sâu bệnh

Trung tâm Nghiên cứu và phát triển rau hoa Châu Á - Asian Vegetable Research and Development Center (AVRDC) dẫn đầu trên thế giới về nghiên cứu đậu xanh, đóng vai trò trong việc phát triển cải tiến nguồn gen đậu xanh ở Châu Á, và đã đạt được những thành tựu đáng kể với một ngân hàng gen gồm

11.000 giống Vigna spp có đặc điểm tốt Con đường tạo giống đậu xanh chủ

yếu là lai hữu tính và gây đột biến Các giống mới có TGST ngắn (55-65 ngày), năng suất cao (2 tấn/ha), chín đồng loạt, hạt to (5-6 g/100 hạt) và khả năng chống chịu bệnh cao (Chadha, 2010) Vỏ trái dày phù hợp mong muốn,

vì chúng ít bị tổn hại do mưa và rạn nứt khi chín (Bains et al., 2007) Các

giống đậu xanh cải tiến chiếm gần 90 diện tích trồng ở Pakistan, tăng từ 100-200 ngàn héc ta (Shanmugasundaram, 2007) Một số giống đậu xanh cao sản đã được phát triển cho vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, đó là các giống Chainat 60 (Thái Lan), PBIMg7 (Philippines) và Merpati (Indonesia) (Somta

et al., 2009)

Dự án nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh ở trường Đại học Nông nghiệp Punjab Ludhiana (Ấn Độ) đã phóng thích rất nhiều giống đậu xanh

mới Các giống này có các đặc tính như có loại hình sinh trưởng trung bình, cây khỏe, phát triển nhanh, chống chịu tốt với các điều kiện khó khăn (chống

đổ ngã, chịu hạn) và có tiềm năng năng suất cao, ổn định, hàm lượng protein

cao, ngắn ngày, phục vụ sản xuất (Nair et al., 2012)

Thái Lan, quốc gia thành công trong công tác chọn tạo giống đậu xanh Các dòng đậu xanh triển vọng từ AVRDC tiếp tục được nghiên cứu đánh giá tại Thái Lan Các giống đậu xanh có nguồn gốc từ AVRDC cho năng suất cao hơn giống địa phương 37 và kháng bệnh được đưa vào sản xuất như KPS2, Chainat 60 và đang phủ kín hầu hết diện tích trồng đậu xanh tại Thái Lan

(Shanmugasundaram et al., 2009)

2.5.3 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây đậu xanh cũng đã được trồng từ lâu đời ở bảy vùng sinh thái khác nhau suốt từ Bắc đến Nam Tuy vậy, cây đậu xanh vẫn được xem là một cây trồng phụ nhằm tận dụng đất đai, lao động, nên năng suất rất thấp (Phạm Văn Thiều, 2005) Tính đến năm 2015 diện tích đậu xanh ở nước ta khoảng 91 ngàn héc ta, năng suất khoảng 1,1 tấn/ha (Bảng 2.1) Sản lượng đậu xanh không đủ để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước mà hàng năm phải nhập khẩu một lượng không nhỏ từ Trung Quốc và Campuchia

Bảng 2.1: Diện tích và năng suất đậu xanh ở Việt Nam từ 2012-2015

2012 2013 2014 2015 2012 2013 2014 2015

ĐB sông Hồng 4,10 4,80 4,51 4,88 1,46 1,46 1,45 1,51 TD&MNPB 9,50 8,30 7,62 7,03 1,10 1,06 1,00 1,02 Bắc Trung Bộ 20,70 20,50 18,65 18,47 0,87 0,82 0,97 0,94 DHNTB 19,00 18,80 17,55 18,09 1,13 1,16 1,17 1,17 Tây Nguyên 27,00 26,20 24,57 25,12 0,84 0,85 0,86 0,86 Đông Nam Bộ 9,60 8,60 8,00 9,61 1,08 1,08 1,19 1,24

Cả nước 98,20 93,80 88,18 90,95 1,03 1,03 1,08 1,10

Nguồn: Viện Quy hoạch Thiết kế Nông nghiệp, 2016

ĐB: Đồng bằng; TD&MNPB: Trung du & Miền núi phía Bắc; DHNTB: Duyên hải Nam Trung Bộ

Từ năm 1980 đến nay có nhiều cơ sở nghiên cứu về đậu xanh như Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam cùng nhiều cơ sở nghiên cứu khác

Trong giai đoạn 2001-2005 Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tiến hành đánh giá 2.024 mẫu giống đậu xanh trong đó có 150 mẫu giống địa

phương Kết quả đã xác định được 9 mẫu giống đạt năng suất cao từ 1,8 đến 2,2 tấn/ha, thời gian sinh trưởng 70-75 ngày như đậu xanh Quảng Bạ, mở Hải Dương, Chianat 36, Chianat 56, Chianat 72 Trong đó giống Chianat 36 và Chianat 72 có nguồn gốc từ Thái Lan có thể sử dụng trực tiếp để nghiên cứu

các biện pháp kỹ thuật và mở rộng sản xuất (Trần Đình Long và ctv., 2005)

Trung tâm Tài nguyên Thực vật là nơi lưu giữ nguồn gen cây trồng quốc gia, trong đó có rất nhiều nguồn gen đậu xanh Các nguồn gen này được thu thập trong cả nước và nhập nội Từ năm 2003-2005, Trung tâm đã tiến hành

mô tả đánh giá 172 mẫu giống đậu xanh và chọn lọc được 3 mẫu giống có tiềm năng có số đăng ký là 4.461, 6.492 và 6.694 có thể tiến hành thí nghiệm

so sánh giống, khảo nghiệm và giới thiệu ra sản xuất (Bùi Phương Mỹ Dung

Nghiên cứu chọn tạo giống đậu nành, đậu xanh và biện pháp kỹ thuật trong hệ thống canh tác với cây bắp giai đoạn 2006-2008 đã chọn tạo được hai giống đậu xanh ĐXVN4 và ĐXVN5 có tiềm năng năng suất cao, chống chịu sâu bệnh khá (Nguyễn Thị Thanh, 2009) Giống đậu xanh mới được giới thiệu vào sản xuất gần đây nhất là ĐX11 được nhập nội từ Thái Lan (Luân Thị Đẹp

và ctv., 2013)

Giống đậu xanh HLĐX10 thích hợp với điều kiện sinh thái vùng Đồng bằng sông Cửu Long có thời gian sinh trưởng 62-65 ngày, chín tập trung, tỉ lệ chín lần 1 đạt 75-85 năng suất, nhiễm nhẹ bệnh đốm nâu Năng suất đạt từ 1.820 – 2.200 kg/ha vượt so với đối chứng từ 23-34% (Nguyễn Văn Chương

và ctv., 2014)

Tính đến 2015, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã chọn tạo và giới thiệu cho các tỉnh phía Nam 11 giống đậu xanh ưu tú (Nguyễn Văn Chương, 2015) Nhờ việc khám phá ra nhiều công dụng và chọn tạo ra nhiều giống đậu xanh mới vượt trội, những năm gần đây diện tích trồng đậu xanh đã tăng đáng kể Một số giống đậu xanh cải tiến phổ biến ở Việt Nam như số 9, ĐX-92-1, HL89-E3, V87-13, G87-1, ĐX044 sinh trưởng khỏe, thu hoạch tập trung 2-3 đợt, chống đổ ngã sâu bệnh hại đã được tạo ra từ các phương pháp chọn lọc cá thể từ các giống đậu xanh nhập nội của AVRDC (Trương Đích, 2000 và Nguyễn Mạnh Chinh, 2007)

Tại trường Đại học Cần Thơ việc nghiên cứu các giống đậu xanh nhập nội đã được thực hiện trong thập niên 1990, chủ yếu là đánh giá và so sánh các giống đậu xanh nhập từ AVRDC và Thái Lan Trong những năm kế tiếp, đã

tuyển chọn được giống ĐX208 (Dương Minh và ctv., 1998)

2.6 Ý nghĩa của đột biến cảm ứng trong chọn tạo giống cây trồng

Ý nghĩa của chọn giống bằng phương pháp đột biến ngày một tăng với

sự tiến bộ của chọn giống vì nguồn biến dị di truyền dự trữ của các loài cây trồng dần cạn kiệt Trong một số trường hợp, sử dụng biến dị di truyền cảm

ứng thậm chí có hiệu quả hơn (Vũ Đình Hòa và ctv., 2005)

Đột biến cảm ứng đã được chứng minh là một công nghệ khả thi, bền vững, hiệu quả cao, được chấp nhận về mặt môi trường, linh hoạt, không nguy hại và chi phí thấp để tăng cường cải thiện giống cây trồng (Lagoda, 2009) Đột biến gen có ý nghĩa rất lớn trong công tác chọn giống, nhằm tăng tỉ

lệ các biến dị của sinh vật từ hàng ngàn đến hàng vạn lần, có nhiều biến dị không có trong tự nhiên (Nguyễn Văn Hiển, 2001)

Chọn lọc là phương pháp cơ bản của chọn giống Tuy nhiên, phương pháp chọn lọc chỉ đưa lại kết quả tốt khi quần thể ban đầu đa dạng về kiểu gen Kết quả của các phương pháp chọn lọc chỉ là thừa hưởng những kho tàng biến dị có sẵn trong tự nhiên chứ không phải là tạo ra được những biến dị mới Lai giống nhân tạo dù có tiềm năng lớn trong việc tạo ra các tổ hợp có đặc tính mới mà có thể được chọn lọc trong quần thể phân ly nhưng đây chỉ là sự phân bổ lại và tái tổ hợp nguồn gen sẵn có Ưu thế lai biểu hiện ở thế hệ F1 là hiệu ứng đặc biệt nhận được trong quá trình lai giống Tuy nhiên do đặc điểm cấu trúc hoa và hệ thống sinh sản ở cây trồng gây cản trở cho việc áp dụng tạo giống ưu thế lai (tính bất dung hợp khi lai, F1 không có khả năng sống, F1 bất dục, sự suy thoái của con lai) Bằng các phương pháp này các nhà khoa học cũng chỉ mới sử dụng một số ít gen trong bộ gen của cơ thể thực vật, trong đó quá trình chọn lọc và lai tạo cũng

phải mất một khoảng thời gian khá dài (Phạm Thành Hổ, 2010)

Các biện pháp lai tạo và gây đa bội thể đã làm phong phú thêm nguồn biến dị trong tự nhiên Đột biến là cơ sở của tiến hoá hình thành nên các giống cây trồng, vật nuôi mới Đột biến là một con đường quan trọng làm tăng sự biến dị trong cơ thể sinh vật, là sự biến đổi bất thường về vật chất di truyền dẫn đến sự biến đổi một hoặc nhiều tính trạng và có thể được di truyền cho thế

hệ sau Phương pháp gây đột biến có thể cải tiến được ở những tính trạng đơn

mà không gây ra sự tổn thương sâu trong bộ gen, đồng thời làm tăng nguồn biến dị di truyền dùng cho lai giống nhân tạo và chính các nguồn biến dị di truyền mới này sẽ có khả năng thích ứng tốt

Ngày nay, các nhà khoa học không chỉ gây đột biến để cải tiến giống cây trồng, khám phá gen kiểm soát những tính trạng quan trọng, tăng sự hiểu biết chức năng và cơ chế hoạt động của chúng, mà còn giải mã bản chất sinh học của những biến đổi trong trình tự chuỗi DNA, sự tự sửa sai các đột biến Những nghiên cứu về đột biến đã có những thay đổi về lượng và cả về chất, nghiên cứu tìm hiểu tận gốc những thay đổi trong chuỗi DNA do những tác nhân đột biến gây nên Bên cạnh đó, người ta có thể nghĩ đến gây bất hoạt gen nhờ đột biến nhằm ức chế hoặc tạo ra một loại sản phẩm protein mới dẫn đến thay đổi chất lượng của cây trồng

2.7 Cơ sở khoa học và vai trò của chọn giống đột biến cảm ứng

Đột biến gồm có hai loại là đột biến ngẫu nhiên và đột biến cảm ứng

Đột biến ngẫu nhiên là dạng đột biến xảy ra một cách tự nhiên do những biến đổi thời tiết, khí hậu, do những thay đổi về yếu tố địa lý Trong tự nhiên những biến đổi đột ngột do những biến động này làm cho sinh vật mới thích nghi hơn với điều kiện sống qua quá trình tiến hoá, những giống cây trồng, vật nuôi mới này hình thành những đặc tính khác biệt so với giống

cũ Đột biến ngẫu nhiên có tần số rất thấp thường 10-5-10-8 và không phải đột

biến nào cũng có ý nghĩa cho con người (Phạm Thành Hổ, 2010)

Đột biến cảm ứng là đột biến do con người thực hiện vì mục tiêu chọn giống Nhờ sử dụng các tác nhân gây đột biến, mà chỉ trong một khoảng thời gian ngắn, các nhà khoa học có thể tạo được các giống cây trồng mới Gây đột biến là một phương pháp bổ sung nguồn gen trong chọn giống cây trồng (Phạm Thành Hổ, 2010)

2.7.1 Cơ sở khoa học của chọn giống đột biến cảm ứng

Tác nhân vật lý hoặc hoá học tác động vào tế bào làm biến đổi cấu trúc hoặc ion hoá phân tử DNA hoặc protein, chất vô cơ, nước làm thay đổi phản ứng sinh lý, sinh hoá trong tế bào, thay đổi cấu trúc, thành phần hoá học của DNA gây đột biến và sai khác kiểu hình Chọn giữ lại những cá thể hoặc tập hợp cây con tốt thoả mãn yêu cầu chọn giống để làm giống đồng thời loại bỏ những cá thể không thoả mãn yêu cầu (Phạm Văn Duệ, 2006)

2.7.2 Vai trò của đột biến cảm ứng

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp chọn tạo giống đã và đang được quan tâm Bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo hay chọn lọc, để tạo ra một giống cây trồng năng suất cao, ổn định cần ít nhất từ 6-10 thế hệ Trong khi đó chọn giống bằng phương pháp đột biến cảm ứng chỉ cần 3 – 6 thế hệ (Điêu Thị Mai Hoa,

2006) Đồng thời sử dụng phương pháp này có thể giải quyết những vấn đề mà nhiều phương pháp khác không thể thực hiện được như khi biến dị tự nhiên về một đặc tính mong muốn không có sẳn trong nguồn vật liệu di truyền, khi có sẳn một gen cần thiết song do mối liên kết chặt chẽ với các gen khác làm cho gen đó không sử dụng được; khi tạo các đặc tính mong muốn không thể thực hiện được bằng phương pháp lai; khi muốn thay đổi một hoặc một số tính trạng riêng biệt nhằm khắc phục nhược điểm của giống mà không làm thay đổi

những tính trạng khác của giống (Nguyễn Quang Thạch và ctv., 2005). Đột biến cảm ứng cho phép thoát được bế tắc của tính bất thụ bằng cách tạo các biến dị hữu ích (Lagoda, 2009)

Phương pháp đột biến cảm ứng làm tăng sự sai khác di truyền trong quần thể Xử lý đột biến có thể tạo ra những đột biến mang tính nhảy vọt đáng kể, tạo ra giống mới khác xa so với giống cũ (Đường Hồng Dật, 2006) Nhiều nhà khoa học trên thế giới đánh giá rằng một trong những thành tựu xuất sắc của thế kỷ 20 là khám phá ra phương pháp tạo giống bằng cách gây đột biến Đột biến cảm ứng đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện giống đậu

xanh (Pandey et al., 2005) Chọn giống đột biến là phương pháp hiệu quả

trong việc gây ra những đột biến nông học quan trọng ở đậu xanh (Auti and Apparao, 2009), giúp đậu xanh trở thành loại cây chính ở các nước châu Á mà không phải cạnh tranh trực tiếp với các loại cây trồng chính như lúa mì, bắp và bông (Tah and Saxena, 2009) Có thể nghiên cứu các đột biến tiềm năng về chín đồng loạt trong đậu xanh thông qua đột biến cảm ứng (Tah, 2009)

2.7.3 Mục tiêu của phương pháp chọn giống đột biến cảm ứng

Lê Duy Thành (2000) cho rằng phương pháp chọn giống đột biến cảm ứng trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau đã mở ra nhiều hướng và đáp ứng được các mục tiêu như:

- Tạo ra được các dạng cây chống chịu sâu bệnh

- Tạo ra được các dạng cây có năng suất và thành phần dinh dưỡng cao

- Tạo ra được các dạng cây có tính trạng quý như chín sớm, có quang chu kỳ thay đổi, phản ứng với phân bón thay đổi và có nhiều tính trạng có lợi cho việc áp dụng cơ giới trong canh tác

- Tạo dạng cây theo thị hiếu người tiêu dùng (hoa mới, màu sắc lá trong cây cảnh, màu sắc vỏ trái, thịt trái, màu sắc trong củ, cây ăn quả và mùi thơm)

- Tạo ra được các cây chống chịu đổ và không gảy bông

- Thay đổi các đặc tính sinh hóa, nâng cao hàm lượng protein, lipid, glucid, và giảm hàm lượng alkaloid

- Cải thiện chất lượng chế biến và giá trị của sản phẩm

- Tạo ra được các đột biến soma ở các cây sinh sản sinh dưỡng

2.8 Cơ sở di truyền của đột biến

Đột biến xảy ra ở bất kỳ giai đoạn sinh trưởng nào và ở bất kỳ tế bào nào của cây Các tác động lên kiểu hình có thể là những biến đổi nhỏ nhất mà chỉ

có thể phát hiện bằng các phương pháp phân tích phân tử đến những biến đổi lớn làm thay đổi những quá trình cơ bản của tế bào dẫn đến làm chết tế bào

hoặc cả cá thể

Đột biến được phân biệt theo nhiều cách khác nhau Ở các sinh vật đa bào, dựa trên các dạng tế bào đầu tiên xảy ra đột biến Đột biến xuất hiện ở các tế bào hình thành giao tử được gọi là đột biến gen ở tế bào sinh dục (germ-line mutations) Đột biến xảy ra ở tế bào sinh dưỡng được gọi là đột biến tế bào sinh dưỡng (somatic mutations) hay còn gọi là đột biến soma Đột biến soma có thể tạo ra một sinh vật vừa có các mô tế bào đột biến vừa có các mô bình thường, hiện tượng này còn được gọi là đột biến khảm Đột biến tế bào sinh dưỡng không được di truyền cho thế hệ sau Đối với các loại cây nhân giống vô tính thì tùy vào vị trí và phần trăm của mô sinh dưỡng mà phân lập được hai hoặc ba loại đột biến khác nhau Ở các loài thực vật bậc cao các đột biến soma được nhân giống vô tính do đó các đột biến này vẫn có thể được giữ

lại

Dựa vào sự thay đổi cấu trúc di truyền, đột biến được phân thành hai loại

đó là đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen Đột biến nhiễm sắc thể (NST) là

sự biến đổi về cấu trúc hoặc số lượng nhiễm sắc thể Đột biến có thể xảy ra ở một cặp NST nào đó hoặc ở toàn bộ các cặp NST Loại đột biến này phát sinh

là do các tác nhân của ngoại cảnh (chất phóng xạ, hoá chất, sự biến đổi đột ngột của nhiệt độ) hoặc những rối loạn của quá trình trao đổi chất của nội bào dẫn đến sự phân ly không bình thường của các cặp NST Trường hợp NST trong tế bào sinh dưỡng tăng lên thành bội số của n được gọi là thể đa bội Tế bào đa bội có lượng DNA tăng gấp bội, quá trình tổng hợp các chất hữu cơ diễn ra mạnh mẽ do đó kích thước tế bào lớn hơn Cơ thể đa bội thường có cơ quan sinh dưỡng to, phát triển khoẻ, chống chịu tốt Hiện tượng đa bội khá phổ biến ở thực vật và đã được ứng dụng hiệu quả trong chọn giống cây trồng Đột biến NST có các dạng mất đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn (Lê

Duy Thành, 2000)

Đột biến gen là những biến đổi về số lượng, thành phần, trật tự các cặp nucleotide xảy ra tại một điểm nào đó trên phân tử DNA Sự biến đổi về cấu trúc phân tử của gen có thể làm biến đổi cấu trúc của một loại protein do gen

đó mã hoá và cuối cùng dẫn đến biến đổi ở kiểu hình Ngoài những đột biến

gen xảy ra trên DNA của các NST trong nhân tế bào, còn xảy ra đột biến DNA

ở ty thể, lạp thể có thể gây ra những biến dị di truyền theo dòng mẹ (Phạm

Thành Hổ, 2010)

2.9 Các tác nhân gây đột biến

Bằng chứng về các tác nhân ngoại cảnh có thể làm tăng tỉ lệ đột biến được công bố vào năm 1927 bởi Hermann Muller Kể từ đó một số lượng lớn các tác nhân gây đột biến được khám phá và được phân thành hai loại đó là tác nhân vật lý và tác nhân hoá học (Divan and Royds, 2013)

Tác nhân gây đột biến vật lý là những dạng tia phóng xạ Muller và Xapeghin là những người đầu tiên sử dụng tia phóng xạ để nâng cao tần số đột biến ở cây trồng Sau đó phương pháp chọn giống mới này thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học, đặc biệt là các nhà di truyền chọn giống của Liên Xô, Đức, Nhật, Thụy Điển Có rất nhiều dạng tia phóng xạ và nguồn phóng xạ cho các nhà chọn giống lựa chọn Bên cạnh tia cực tím một số các tia phóng xạ ion hoá như tia X, tia gamma, hạt alpha, beta, hạt proton, neutron

có thể giải phóng nguồn năng lượng dưới dạng hạt hoặc sóng điện từ gây tổn thương sinh học cho tế bào (Griffiths and Anthony, 2000)

Ngay từ những năm 1940 Auerbach và Robson đã khẳng định một số hóa chất có khả năng gây đột biến Cho đến nay đã phát hiện được hơn 400 chất hóa học gây đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen Tương tự như tác dụng của các tia phóng xạ, các tác nhân hóa học có hiệu ứng đặc thù khi gây biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể, thường gây đứt ở vùng dị nhiễm sắc chất (heterochromatin) ngoài tâm động hoặc vùng eo thứ cấp Phần lớn các tác nhân hóa học gây cấu trúc lại nhiễm sắc thể ở mức độ nhiễm sắc chất (chromatin) hơn là mức độ nhiễm sắc thể (Lê Duy Thành, 2000)

Tại Nhật đóng góp của các tác nhân bức xạ trong tạo giống mới chiếm 77,7 Trong đó, tia gamma chiếm đến 60,3 , phương pháp gây tạo đột biến

bằng nuôi cấy in vitro đóng góp 15,7 , sau đó là tia X chiếm 9,5% (IAEA,

2008) Tác nhân hóa học mặc dù được sử dụng từ rất lâu nhưng tỉ lệ đóng góp chỉ khoảng 6,6%, trong khi đó tia ion mới được sử dụng gần đây nhưng đã đóng góp tỉ lệ 5,8% (Nakagawa, 2008)

Hình 2.1: Tỉ lệ đóng góp của các tác nhân đột biến trong tạo giống cây trồng tại Nhật năm 2008

Nguồn: Nakagawa, 2008

2.9.1 Cơ chế gây đột biến của tác nhân phóng xạ

Tia gamma và tia X là 2 tác nhân chiếu xạ cơ bản trong gây tạo đột biến Được dùng phổ biến nhất là tia gamma với nguồn Co60

và Cs137 do có bước sóng rất ngắn và vận tốc rất lớn, không có khối lượng và điện tích, không bị lệch trong điện trường và có sức xuyên khá lớn Theo Kuzin và Yurov (1968)

cơ chế của quá trình tương tác gây đột biến gồm 3 giai đoạn chính:

Giai đoạn 1: Có tính chất vật lý, sự tương tác của các bức xạ tạo ra các

quá trình ion hoá và sự biến đổi các hợp chất ở mức phân tử và dưới phân tử

Giai đoạn 2: Có tính chất hoá học, giai đoạn này diễn ra các phản ứng

tương tác của các sản phẩm sơ cấp do kết quả tương tác của bức xạ với các đại phân tử chưa bị biến tính của các cấu trúc sinh học Tạo ra các peroxit hữu cơ, đồng thời diễn ra các phản ứng oxy hoá dẫn tới sự tạo thành các hợp chất mới

Giai đoạn 3: Có tính chất sinh học, là giai đoạn phát huy tác dụng của

các phản ứng lên hoạt động của các tế bào sống Tức là các biến đổi hoá học gây nên do bức xạ dưới mức tế bào, chẳng hạn như làm thay đổi cấu trúc và tính thấm của màng tế bào

Quá trình tác động qua nhiều giai đoạn như trên gọi là tác động gián tiếp của bức xạ lên tế bào sống Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy các tia bức xạ còn gây ra tác động trực tiếp lên một số cấu trúc dưới tế bào Gây ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tổng hợp DNA và tổng hợp protid trong tế bào sống, đặc biệt là các biến đổi trong cấu trúc DNA, làm phát sinh đột biến di truyền (Phạm Thành Hổ, 2010)

Quá trình phát sinh đột biến rất phức tạp, liên quan và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý học của loại tia phóng xạ; liều lượng, cường độ phóng xạ; sự phục hồi các biến dị tiềm năng và các yếu tố khác như: dưỡng

khí, nhiệt độ, lượng nước trong mô, một số chất hoạt hoá, điều kiện sinh thái, giai đoạn phát triển, kiểu gen của vật liệu xử lý

Để tạo ra các giống cây đột biến bằng công nghệ này, tùy theo từng đối tượng cây trồng, có thể chiếu xạ trực tiếp các bộ phận của cây như mầm, chồi, hạt phấn, nhụy, hạt giống hay toàn bộ cây ở những giai đoạn khác nhau Bên cạnh đó, có thể kết hợp chiếu xạ với phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

để tạo callus, sau đó chiếu xạ (Chakrabarty et al; 2010) Tùy vào liều lượng và

thời gian xử lý chiếu xạ sẽ tạo ra những đứt gẫy nhiễm thể hoặc những thay đổi về cấu trúc gen Những mẫu sau khi chiếu xạ có thể được gieo trồng trực

tiếp hoặc được nhân lên và tái sinh cây in vitro Sau đó trồng ra ngoài đồng

ruộng và đánh giá, chọn lọc qua nhiều thế hệ Những dòng, giống ưu việt sẽ được nhân lên để sản xuất đại trà

2.9.2 Cơ chế gây đột biến của tác nhân hóa học

Một số tác nhân hóa học, đặc biệt là các chất có khả năng oxy hóa, ethyl hoặc methyl hóa cao tác động lên cơ thể sinh vật gây ra hiện tượng oxy hóa, ethyl hóa các bazơ có đạm chứa trong nucleotide, làm thay đổi cấu tạo hóa học của chúng và gây nên đột biến gen Một số khác có khả năng gây đột biến rất cao làm cho 100% hoặc hầu hết số cây ở thế hệ thứ 2 phát sinh đột biến được gọi là siêu tác nhân đột biến Các tác nhân hóa học có khả năng thẩm thấu cao

và có thể làm thay đổi keo nguyên sinh (Lê Duy Thành, 2000)

Xét theo phương thức tác dụng, tác nhân hóa học được chia thành năm nhóm (Lê Duy Thành, 2000)

Nhóm 1: Các chất oxy hóa khử và các gốc tự do như peroxide, H2O2, HNO2 formaldehyde HCOH, các nhóm chức aldehyde và các muối kim loại nặng gây đột biến liên quan đến sự dezamin hoá các gốc purin và pyrimidine của DNA và RNA

Nhóm 2: Các chất đồng phân với bazơ tham gia trong thành phần DNA

ở vị trí Thymine, thay thế nucleotide này bằng nucleotide khác và gây đột biến như: Caphein, 5-bromuracil (đồng đẳng của Thymine), 2-aminopurin (đồng đẳng của Adenin) và một số dẫn xuất của Uracil tham gia vào thành phần của DNA

Nhóm 3: Các chất cảm ứng với các bazơ trong DNA như Ethyluretan;

5-aminouracil, các chất này có tác dụng kiềm hãm sự tổng hợp Guanine và Thymine tạo ra các nucleotide không bình thường trong thành phần của DNA gây nên hiện tượng đột biến

(DMS), Diethyl sunphat (DE), Ethyl enimin (EI), Ethyl methane sulphonate (EMS), Nitrozo methyl ure (NMU) Các chất này có tác dụng alkyl hóa các

nhóm phosphate trong phân tử DNA, cũng như các bazơ purin hay pyrimidine dẫn đến đứt mạch DNA hoặc làm sai lệch trật tự các bazơ trong mạch gây ra đột biến

Acridin C13H9N Các chất này khi tác động lên DNA thì tạo thành một phức

hệ làm rối loạn quá trình tái sinh bình thường của DNA, gây ra việc thiếu hoặc thừa nucleotide trong phân tử DNA dẫn đến đột biến

2.9.3 Cơ chế tác động của Ethyl Methane Sulphonate

Ethyl methane sulphonate (EMS) có công thức hóa học là

CH3OSO2C2H5, khối lượng phân tử 124,16 gmol-1, tỉ trọng 1,1452 (22°C) Điểm nóng chảy 25°C Nhiệt độ sôi 85,86°C/100 mmHg EMS là chất lỏng

không màu, tan trong nước (Gardner et al., 1984)

EMS gây ra đột biến gen, đột biến điểm và mất đoạn nhỏ DNA EMS gây đột biến theo 3 cách: (1) thêm nhóm methyl (- CH3) hay ethyl (- C2H5) vào Guanine (G) tạo base đồng đẳng của Adenine (A) dẫn đến bắt cặp bổ sung sai; (2) làm mất Guanine do đã bị alkyl hoá (mất purine) tạo lỗ hổng trên DNA, khi sao chép có thể làm đứt mạch; (3) liên kết chéo giữa các mạch của một hoặc các phân tử DNA khác nhau làm mất nucleotide (Lê Duy Thành, 2000)

EMS có thể gắn nhóm alkyl vào nhiều vị trí ở 4 loại base Đột biến thường xảy ra với trường hợp thêm ethyl (CH3-CH2-) vào vị trí thứ 6 của Guanine → O-6-Ethyl-guanine→Bắt cặp sai với Thymine tạo ra đột biến đồng

hoán (G-C→A-T) trong sao chép kế tiếp (Gardner et al., 1984), (Hình 2.2)

Hình 2.2: Hiện tượng alkyl hóa Guanine gây ra đồng hoán GC →AT

(Nguồn: http://www.sivabio.50webs.com/dam.ht39.gif)

Hình 2.3: Hiện tượng alkyl hóa Thymine gây ra đồng hoán TA → CG

Trong các tác nhân hóa học gây đột biến, EMS là chất được sử dụng phổ biến và cho hiệu quả cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007) Dung dịch EMS phải được chuẩn bị trước khi dùng và được tồn trữ như dung dịch gốc Tốc độ thủy phân của hợp chất này được đo bằng phương pháp bán thời gian (half life) Qua các kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ thủy phân của EMS phụ thuộc rất lớn vào nhiệt độ Trong nước cất (pH = 7) ở nhiệt độ 20°C, half life của EMS là 93 giờ, ở 30°C là 26 giờ và ở 37°C là 10 giờ (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007) Vì vậy, để đảm bảo hoạt tính của chất gây đột biến chỉ nên chuẩn bị dung dịch trước khi xử lý không quá 30 phút và giữ

trong bóng tối trong suốt thời gian xử lý (Đào Thị Thanh Bằng và ctv., 1997)

Để gây đột biến cho cây trồng có thể xử lý EMS trên các bộ phận như hạt, chồi, củ, phôi trong thời gian đang phát triển Tuy nhiên, đối với mỗi giống, bộ phận của cây trồng có sự cảm ứng khác nhau với hoá chất gây đột biến Các kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tăng nồng độ của tác nhân đến mức

độ nhất định thì khả năng sống của cây cũng tăng, sau đó nếu tiếp tục tăng thì khả năng sống của đối tượng lại bị giảm xuống Vì vậy, đối với từng giống, từng bộ phận cây trồng cần phải xác định nồng độ, thời gian tác động hợp lý mới có thể mong muốn đem lại hiệu quả di truyền cao (Lê Duy Thành, 2000) Khuất Hữu Thanh (2006) cho rằng tác nhân gây đột biến hóa học có hiệu quả hơn tác nhân lý học Nếu dưới ảnh hưởng của việc chiếu tia ở các cây

nông nghiệp xuất hiện 10 – 15% biến đổi di truyền có khả năng sống thì tác nhân hóa học cho phép thu nhận từ 30 – 60 Hơn nữa tác nhân gây đột biến hóa học thường làm xuất hiện những biến dị đặc biệt hơn

2.10 Sự biểu hiện của các kiểu đột biến

2.10.1 Các loại đột biến

Phạm Thành Hổ (2010) cho rằng đột biến thường có các loại: (i) Đột biến điểm (đột biến gen) gây ra sự biến đổi, cấu trúc phân tử của gen ở mức độ nucleotide Đột biến này không liên quan đến biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể và phá hoại quá trình bắt chéo; (ii) Đột biến làm thay đổi cấu trúc của nhiễm sắc thể như đứt đoạn, đảo đoạn… bất kể sự biến đổi nào đều kèm theo

sự biểu hiện các tính trạng và đặc tính mới; (iii) Đột biến về số lượng nhiễm sắc thể (đa bội thể)

2.10.2 Những biểu hiện của đột biến

Đột biến có thể xuất hiện ở bất kỳ tế bào nào của cơ thể

Ở thực vật sinh sản bằng hạt, các đột biến này di truyền cho đời sau, sau khi đột biến xảy ra ở phôi hoặc có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tế bào sinh dục

Ở cây sinh sản sinh dưỡng, các đột biến xuất hiện ở tế bào có thể được truyền cho đời sau bằng con đường sinh sản sinh dưỡng

Không phải là tất cả các dạng đột biến đều tìm thấy ngay ở thế hệ sau: đó

là các đột biến lặn Hiện tượng này kéo dài cho đến khi hình thành hợp tử mà mỗi giao tử trong hợp tử đều mang gen đột biến Đột biến trội có thể xuất hiện ngay ở thế hệ sau

Đột biến gen về các tính trạng số lượng do được quy định cùng ảnh hưởng của một số gen mà mỗi gen có tác dụng yếu, đó là các đột biến trội và nữa trội Đột biến này cũng khó phát hiện ra ở đời sau

2.11 Quá trình phát sinh đột biến và cách nghiên cứu chúng

2.11.1 Chuẩn bị vật liệu đối với cây sinh sản bằng hạt

Vật liệu được chọn nên là những giống tốt nhất, thích nghi với điều kiện địa phương và có ít nhất các tính trạng cần phải cải tiến Giống càng tốt thì càng tích lũy nhiều gen trội và càng có khả năng cho nhiều dạng đột biến có giá trị Cũng có thể dùng các dạng con lai F1 Ưu điểm của việc sử dụng con lai F1 là ở chỗ cả hai bộ gen khác nhau khi đồng thời chịu tác động của tác nhân gây đột biến thì khả năng tái tổ hợp gen sẽ tăng lên và phổ đột biến sẽ

rộng hơn Đối với hạt lai phải dùng nồng độ và liều lượng tác nhân gây đột biến thấp hơn khoảng 2 lần so với mức bình thường (Lê Duy Thành, 2000) Đối với cây sinh sản bằng hạt thì việc dùng các tác nhân gây đột biến vật

lý hay hóa học đều tiện lợi và thích hợp Tuy nhiên, hạt là một tổ chức đa bào

mà đột biến thì chỉ xảy ra ở một hay một số tế bào nào đó, nên thường có hiện tượng khảm xảy ra ở cây M1 Một đột biến gen thực sự thường ở trạng thái dị hợp tử và không tác động đến chức năng sơ cấp của tế bào như sự tái bản DNA và sự sinh trưởng của tế bào Trong khi đó, những đột biến lớn về nhiễm sắc thể sẽ tác động đến sự cạnh tranh tế bào và gây ra sự ―chọn lọc lưỡng bội‖ Một đột biến muốn được duy trì qua các thế hệ phải có sức cạnh tranh lớn và phải có khả năng sinh ra các giao tử Các đột biến có thể mất đi ở pha đơn bội (do sự cạnh tranh ống phấn) hoặc ở thế hệ M2, thế hệ này bắt đầu bằng sự phát triển hợp tử hoặc phôi chứa các đột biến ở trạng thái đồng hợp tử Xử lý đột biến đối với giao tử hoặc hợp tử vào trước lúc phân chia lần thứ nhất của hợp

tử dẫn đến việc xuất hiện những cây đột biến (Lê Duy Thành, 2000)

Các dạng vật liệu ban đầu nên phong phú để có khả năng làm tăng tính

đa dạng của biến dị xuất hiện ở M2 Thời gian sau lúc xử lý và gieo không nên

xa cách nhau nhiều để tránh việc làm tăng của hiệu quả hủy hoại của các tác nhân gây đột biến

2.11.2 Chọn tác nhân gây đột biến và liều lƣợng xử lý

Việc lựa chọn tác nhân gây đột biến không đơn thuần chỉ là dựa trên tần

số gây ra các kiểu đột biến mong muốn của các tác nhân đó, mà còn phải xem xét đến các vật liệu cần được xử lý

Tần số và phổ đột biến phụ thuộc ít nhiều vào loại tác nhân và liều lượng tác nhân gây đột biến Các tác nhân vật lý như tia X và gamma được sử dụng rất rộng rãi, chúng có ưu điểm về khả năng xuyên thấu và việc tính liều lượng chính xác Tia UV có khả năng xuyên thấu thấp, nên chỉ thích hợp dùng cho

hạt phấn hoặc mô nuôi cấy in vitro với một lớp mỏng Neutron nóng hoặc

neutron nhanh thường gây ra các đột biến nhiễm sắc thể

Các tác nhân hóa học có khả năng gây ra các đột biến gen với tần số cao, nhưng có đặc điểm là tính thẩm thấu không được xác định chính xác cho từng loại đối tượng, tính không ổn định, sự biến chất và cuối cùng là tính không an toàn trong sử dụng Bảng 2.2 liệt kê một số tác nhân gây đột biến và liều lượng sử dụng của chúng cho một số cây trồng sinh sản bằng hạt (Lê Duy Thành, 2000)

Bảng 2.2: Liều lượng và nồng độ của các tác nhân gây đột biến được sử dụng

cho một số cây trồng

Nguồn: Lê Duy Thành (2000)

2.11.3 Theo dõi và chọn lọc đột biến

Việc phát hiện một cách có hiệu quả các đột biến mong muốn mà lại chỉ với chi phí thấp là điều quan trọng và phụ thuộc vào quy mô xử lý đột biến cũng như phương pháp chọn giống được áp dụng Điều chú ý là khối lượng công việc sẽ tăng lên hay giảm đi một cách đáng kể, tùy thuộc vào phương pháp thu hoạch ở M1 và gieo trồng ở M2: thu tất cả các hạt ở M1 hoặc mỗi cây thu 1 hạt hoặc thu mỗi cây 1 bông hay một số bông (hay quả) Như vậy ở M2

sẽ phải gieo hạt của một cây thành 1 dòng (hàng) hay hạt của một bông thành

1 dòng (Lê Duy Thành, 2000)

Ở thế hệ kế tiếp, nếu như có sự phân ly đột biến thì việc nhận dạng đột biến sẽ dễ hơn Ở cây lưỡng bội và lưỡng tính tự thụ phấn, t ở M2 sẽ xuất hiện những cá thể đồng hợp tử Vì thế việc gieo trồng cách ly hay sử dụng túi cách

ly ở M1 là một điều cần thiết Đối với cây 2n, ở M2 mỗi hàng chỉ cần gieo 20 cây là đủ để phát hiện những cây đột biến đồng hợp tử (Lê Duy Thành, 2000)

Nếu cho các cây M1 giao phấn với nhau, thì có sự kết hợp giữa các giao

tử được sinh ra từ các phần có đột biến và các phần không có đột biến

Aa x AA

(phần có đột biến) ↓ (phần không đột biến)

AA : Aa

Trong trường hợp nếu xử lý đột biến đối với hạt phấn và dùng phấn đó thụ cho cây không bị xử lý thì ở M1 sẽ thu được những cây không khảm và dị hợp tử Những cây này sau khi được tự thụ phấn sẽ cho ra các cây đột biến đồng hợp tử, nên xem xét kỹ nội dung nghiên cứu ở từng thế hệ đột biến khác nhau (Lê Duy Thành, 2001)

Ở M1 phải gieo từ 700 đến 1500 hạt trong mỗi công thức thí nghiệm để đảm bảo cho việc thu được từ 250 đến 500 cây ra hoa kết hạt đối với mỗi liều lượng hay nồng độ Hạt sau khi xử lý bằng các tác nhân vật lý hoặc hóa học sẽ

có một số biểu hiện khác nhau, tùy theo phương thức tác dụng của mỗi loại tác nhân gây nên

Khi dùng các tác nhân vật lý ở những liều lượng rất cao (liều lượng gây chết) hạt vẫn nảy mầm bình thường, tức không mất khả năng nảy mầm, còn những hạt ấy nếu xử lý ở những nồng độ gây chết của các tác nhân hóa học thì chúng không nảy mầm

Khi chiếu xạ với liều lượng gần gây chết, thường thấy có hiện tượng cây con sinh trưởng đến một pha nhất định (đối với cây 2 lá mầm thì đến pha mở

lá mầm, đối với cây 1 lá mầm thì đến pha vở bao phôi mầm) vẫn chưa có gì thay đổi, nhưng sau đó cây chết đi từng phần Sự sinh trưởng xảy ra trước đó của cây chỉ nhờ kết quả của sự kéo dài tế bào có sẳn trong phôi Từ đấy có thể thấy muốn tính tỉ lệ sống sót để xác định tính mẫn cảm của cây đối với các tác nhân gây đột biến, chỉ nên làm sau khi chồi mầm đã xuất hiện được một thời gian Đối với các tác nhân vật lý hay hóa học, thời gian đó là khoảng 2 tuần

Do kết quả tác động của tác nhân đột biến mà không phải toàn bộ hạt đều nảy mầm Trong những cây được sống sót, một số cây có quá trình sinh trưởng

bị ức chế, một số khác thì chết dần, một số nữa thì quá trình giảm phân bị rối loạn, về sau đưa đến hiện tượng bị bất thụ Tất cả những hiện tượng này đều liên quan đến cơ chế tác dụng và liều lượng của tác nhân gây đột biến

Nói chung, liều lượng hay nồng độ của tác nhân gây đột biến tăng thì tính bất thụ tăng Mức độ về hiệu quả hủy hoại do tác nhân gây đột biến gây ra

ở M1 được tính theo các chỉ tiêu sau:

- Số lượng nhiễm sắc thể được sắp xếp lại trong kỳ giữa và kỳ sau của nguyên phân

- Sự giảm sức nảy chồi ở đồng ruộng

- Sự kiềm hãm sinh trưởng ở giai đoạn đầu (trước phân cành)