Tối ưu quy trình phân tích đa hình vùng promoter của gen UGT1A1 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Một trong các thuốc điều trị chính ở giai đoạn muộn là Irinotecan, nhưng việc điều trị còn gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là các tác dụng không mong muốn của thuốc.. Các nghiên cứu đã chỉ

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

NGUYỄN HUY HOÀNG

TỐI ƢU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH VÙNG

PROMOTER CỦA GEN UGT1A1 Ở BỆNH NHÂN UNG

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

NGUYỄN HUY HOÀNG

TỐI ƢU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH VÙNG

PROMOTER CỦA GEN UGT1A1 Ở BỆNH NHÂN UNG

Trang 3

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin đặc biệt gửi lời cám ơn đến ThS Phạm Thị Hồng Nhung đã trực

tiếp hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học và

hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Tôi xin gửi lời cảm tạ sâu sắc nhất tới TS BS

Trần Quốc Hùng, Khoa ung bướu Bệnh viện 198 Bộ Công an đã tạo điều kiện giúp

tôi thu thập số liệu nghiên cứu và cho tôi những góp ý chuyên môn vô cùng giá trị

Để thực hiện tốt khóa luận này, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Khoa Y

Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số CS.15.09 Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến các thầy cô và cán bộ nghiên cứu Bộ môn

Y dược học cơ sở, Khoa Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn ủng hộ và

nhiệt tình giúp đỡ cho tôi có điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu khoa học tại đây

Tôi xin cảm ơn các bạn sinh viên Bùi Xuân Nhật, Nguyễn Thùy Linh và

Kiều Hồng Nhung đã hỗ trợ tôi thực hiện các nghiên cứu và cho tôi những góp ý

chân thành khi viết khóa luận

Để có được sự thành công của khóa luận này, tôi xin cảm ơn gia đình đã

quan tâm động viên, khuyến khích giúp tôi vững vàng vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Trang 4

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit Deoxyribonucleic (Deoxyribo Nucleic Acid)

bp Cặp bazơ nitơ (Base pair)

CN1 Hội chứng Crigler – Najar type 1

CN2 Hội chứng Crigler – Najar type 1

dNTP Deoxyribo Nucleic triphosphat

DHPLC Sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high perfomance liquid

chromatography) EDTA Axit ethylene diamine tetraacetic (Ethylene Diamine Tetra Acetic

Acid) HRM Kĩ thuật phân tích phân giải cao nhiệt độ nóng chảy (High resolution

melt)

kb Kilobazơ (=1000 bp)

NCBI Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc Gia – Mỹ (National

Center for Biotechnology Information)

OD Mật độ quang học (Optical density)

PCR Phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction)

UDP Uridine 5’ diphosphat

UGT Enzym Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase

UGT1A1 Enzym Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase A1

UGT1A1 Gen mã hóa cho Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase A1 RFLP Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length

polymorphism) SNP Đa hình di truyền đơn nucleotit (Single nucleotide polymorphism)

SSCP Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (Single strand conformation

polymorphism) TAE Đệm Tris base/ axit acetic/ EDTA

Trang 5

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1 Các đa hình di truyền UGT1A1 phổ biến 4

Bảng 2 Nồng độ ADN tổng số tách từ mẫu mô đúc paraffin bằng phương pháp đo mật độ quang OD 22

Bảng 3 Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR 25

Bảng 4 Đa hình vùng promoter của UGT1A1 ở 38 bệnh nhân nghiên cứu 27

Bảng 5 Chỉ định xét nghiệm UGT1A1*28 khi sử dụng một số loại thuốc 30

Trang 6

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại các protein UGT 2

Hình 1.2 Phản ứng chuyển nhóm glycosyl nhờ UGT 3

Hình 1.3 Sơ đồ locus UGT1A1 ở người 3

Hình 1.4 Tỉ lệ mắc và tử vong của 10 ung thư phổ biến nhất năm 2012 9

Hình 1.5 Đa hình di truyền UGT1A1 và sự chuyển hóa irinotecan 10

Hình 1.6 Irinotecan và phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng liên quan đến kiểu gen UGT1A1 11

Hình 1.7 Biên độ nhiệt của các đa hình vùng promoter của gen UGT1A1 15

Hình 1.8 Kết quả điện di của kiểu gen (TA)6/(TA)7 và (TA)6/(TA)8 sử dụng gel agarose 3% 15

Hình 2.1 Quy trình tách chiết ADN bằng cột silica đơn giản 17

Hình 2.2 Quy trình PCR 19

Hình 3.1 Điện di trên gel agarose 0.7% sản phẩm tinh sạch ADN từ mẫu máu 21

Hình 3.2 Điện di trên gel agarose 1.5% của thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi PCR nhân vùng promoter của UGT1A1 23

Hình 3.3 Điện di trên gel agarose 1.5% của thí nghiệm tối ưu nồng độ ADN PCR nhân vùng promoter của UGT1A1 24

Hình 3.4 Điện di trên gel agarose 1.5% sử dụng quy trình PCR tối ưu nhân vùng promoter của UGT1A1 chạy với 10 mẫu bệnh nhân 24

Hình 3.5 Kết quả giải trình tự kiểu gen đồng hợp (TA)6/(TA)6 25

Hình 3.6 Kết quả giải trình tự kiểu gen (TA)5/(TA)6 26

Hình 3.7 Kết quả giải trình tự kiểu gen (TA)5/(TA)6 26

Hình 3.8 Tần số các alen UGT1A1*28, UGT1A1*36 và UGT1A1*6 ở một số quần thể 28

Trang 7

MỤC LỤC MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferases A1 2

1.2 Một số bệnh lý liên quan đến enzym UGT1A 5

1.2.1 Hội chứng Gilbert 5

1.2.2 Hội chứng Crigler – Najar 6

1.3 Đa hình di truyền UGT1A1*28 7

1.4 Ung thư đại trực tràng và mối liên quan giữa irinotecan với đa hình di truyền UGT1A1*28 8

1.5 Các phương pháp phân tích đa hình di truyền UGT1A1*28 11

1.5.1 Giải trình tự ADN 11

1.5.2 Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn ( Single-strand conformation polymorphism - SSCP): 12

1.5.3 Phân tích dị sợi kép (heteroduplex analysis): 13

1.5.4 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) 13

1.5.5 Real – time PCR 14

1.5.6 Phân giải cao nhiệt độ chảy 14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Hóa chất 16

2.3 Thiết bị và địa điểm nghiên cứu 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Tách chiết ADN tổng số 17

2.4.2 Đánh giá chất lượng của sản phẩm tách ADN tổng số 18

2.4.3 Phản ứng PCR nhân dòng vùng promoter của UGT1A1 18

2.4.4 Xác định kiểu gen UGT1A1*28 bằng phương pháp giải trình tự 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 21

3.3 Kết quả giải trình tự kiểu gen UGT1A1*28 25

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 8

MỞ ĐẦU

Ung thư hiện đang ảnh hưởng rất nhiều tới sức khỏe và chất lượng cuộc sống Theo tổ chức Y tế thế giới, ung thư đứng hàng thứ 2 trong các nguyên nhân tử vong, với khoảng 14 triệu người mắc mới vào năm 2012 và tiếp tục có xu hướng tăng lên Ung thư đại trực tràng là một trong những ung thư phổ biến nhất, với tỉ lệ mắc mới đứng hàng thứ tư và tỉ lệ tử vong cao thứ năm ở cả hai giới [33] Mặc dù

đã có các tiến bộ trong chẩn đoán sớm và điều trị, tuy nhiên tỉ lệ bệnh nhân ung thư đại trực tràng tiến triển đến giai đoạn muộn (giai đoạn IV) vẫn còn cao Một trong các thuốc điều trị chính ở giai đoạn muộn là Irinotecan, nhưng việc điều trị còn gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là các tác dụng không mong muốn của thuốc

Thời điểm hiện tại cá thể hóa điều trị đang là một xu hướng tất yếu và ngày càng ảnh hưởng sâu rộng đến quá trình điều trị ung thư đại trực tràng của các bác sĩ Một trong các công cụ rất hữu ích với các bác sĩ lâm sàng trong việc đối đầu với ung thư đại trực tràng chính là sinh học phân tử

Các nghiên cứu đã chỉ ra đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1

có ảnh hưởng lớn đến quá trình chuyển hóa của irinotecan, liên quan chặt chẽ đến hiệu quả điều trị và mức độ trầm trọng do các tác dụng không mong muốn của thuốc Năm 2005, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration, viết tắt là FDA) đã đưa ra khuyến cáo nên xét nghiệm gen

UGT1A1*28 khi dùng irinotecan và có hướng dẫn về điều trị tương ứng với từng

kiểu gen[23] Tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về gen UGT1A1 cũng như

đa hình di truyền UGT1A1*28 ở Việt Nam Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài

“Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1 ở

bệnh nhân ung thư đại trực tràng” Kết quả của đề tài sẽ cung cấp một công cụ hỗ

trợ đắc lực cho các bác sĩ không chỉ trong việc điều trị ung thư đại trực tràng mà còn trong việc chẩn đoán một số bệnh lý di truyền như hội chứng Gilbert hay hội chứng Crigler – Najar

Mục tiêu nghiên cứu: Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng

promoter của gen UGT1A1

Nội dung nghiên cứu:

1 Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1

trên mẫu mô bệnh phẩm đúc trong paraffin và mẫu máu

2 Áp dụng quy trình phân tích gen trên các mẫu bệnh phẩm thu từ Bệnh viện

198 Bước đầu xác minh tần số alen và tần số kiểu gen của đa hình di truyền

vùng promoter thuộc gen UGT1A1 trong nhóm mẫu nghiên cứu

Trang 9

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferases A1

Uridine 5’ diphosphat glucurosyltransferases A1 (viết tắt là UGT1A1) là một thành viên trong họ enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferase (viết tắt

là UGT), đóng vai trò xúc tác cho các hoạt động chuyển hóa cũng như giải độc của gan UGT là một họ lớn bao gồm 22 loại protein, được chia làm 5 họ và 6 phân

đoạn căn cứ vào cơ sở giải trình tự gen cấu trúc (Hình 1.1) [25]

Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại các protein UGT [25]

Các protein UGT chủ yếu xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm glucosyl của axit uridine 5’ diphosphat glucuronic đến một cơ chất phù hợp hình thành các chất hòa tan trong nước Các cơ chất được gắn nhóm glucosyl bao gồm các chất không phân cực kích thước phân tử nhỏ như các steroit, bilirubin, các hormon và các

thuốc Phản ứng chuyển hóa xúc tác bởi UGT được mô tả trong Hình 1.2 [25]

Trong các UGT, các protein thuộc phân họ UGT1A được quan tâm hơn cả, đóng vai trò then chốt trong việc chấm dứt các hoạt động sinh học và tăng cường việc đào thải các chất không phân cực của thận Chính vì vậy, chúng giúp duy trì nồng độ các chất và đảm bảo cân bằng nội môi [25] UGT1A tập trung chủ yếu ở gan và đường ống tiêu hóa (dạ dày, ruột non, đại tràng) Bên cạnh đó còn ghi nhận sự biểu hiện của UGT1A ở phổi, buồng trứng, tinh hoàn, tuyến vú và tuyến tiền liệt [17]

Trang 10

Hình 1.2 Phản ứng chuyển nhóm glycosyl nhờ UGT

UGT1A1 được mã hóa bởi gen UGT1A1 nằm trên nhiễm sắc thể số 2 (2q37),

gồm có 13 exon chia làm 2 nhóm Nhóm 1 bao gồm 9 exon được kí hiệu là A1, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10) Nhóm 2 gồm bốn exon, được kí hiệu từ 2 đến 5

(Hình 1.3) 9 exon nhóm 1 mã hóa cho vị trí liên kết với cơ chất với enzym và đều

có một promoter riêng Sau phiên mã tổng hợp mARN, mỗi exon nhóm 1 nối với 4 exon nhóm 2, tạo ra các chuỗi mARN khác nhau, từ đó tạo thành các polypeptit khác nhau [2]

Hình 1.3 Sơ đồ locus UGT1A1 ở người Mỗi gen UGT1A bao gồm một exon

nhóm 1 (A) và 4 exon nhóm 2 phía sau (exone 2-5) Các exon nhóm 1 luân phiên nối với 4 exon nhóm 2 phía sau tạo thành 9 loại protein khác nhau [25]

Nucleophin

Enzym UGT Uridine 5’ diphosphat glucuronic

Gốc glucuronyl

Uridine 5’ diphosphat

Trang 11

Trong số các exon này, gen UGT1A1 mã hóa cho enzym UGT1A1 được

quan tâm nhiều hơn cả vì những ảnh hưởng của nó với thực tiễn lâm sàng Hơn 100

đa hình di truyền của UGT1A1 đã được mô tả, một vài trong số chúng làm tăng,

giảm hoạt động hoặc bất hoạt enzym UGT1A1 (Bảng 1) [25]

Bảng 1 Các đa hình di truyền UGT1A1 phổ biến [25]

Alen Nucleotit bị

thay đổi

Protein bị thay đổi Loại đột biến Exon

Bệnh liên quan

UGT1A1*1 Kiểu dại

UGT1A1*2

877 T -> A / mất nu 878 –

890

Dịch khung/

mất acid amin

Mất đoạn 2 CN1

UGT1A1*3 1124 C -> T S375F Sai nghĩa 4 CN1

UGT1A1*4 1069 C -> T Q357X Vô nghĩa 3 CN1

UGT1A1*5 991 C -> T Q331X Mất đoạn 2 CN1

UGT1A1*6 221 G -> A G71R Sai nghĩa 1 Gilbert

UGT1A1*11 923 G -> A G308E Sai nghĩa 2 CN1

UGT1A1*12 524 T -> A L175Q Sai nghĩa 1 CN2

UGT1A1*13 508- 510 mất

nu

F170 mất acid amin Mất đoạn 1 CN1

UGT1A1*14 826 G -> C G276R Sai nghĩa 1 CN1

UGT1A1*15 529 T -> C C177R Sai nghĩa 1 CN2

UGT1A1*16 1070 A -> G O357R Sai nghĩa 3 CN1

UGT1A1*21 1223 thêm G Dịch khung Dịch khung 4 CN2

UGT1A1*22 875 C -> T A292V Sai nghĩa 2 CN1

UGT1A1*26 973 mất G Dịch khung Dịch khung 2 CN2

UGT1A1*27 686 C -> A P229Q Sai nghĩa 1 Gilbert

UGT1A1*28 TAA(TA)7 Thêm trình tự

ở vùng lặp lại Promoter Gilbert

UGT1A1*29 1099 C -> G R367G Sai nghĩa 4 Gilbert

Ghi chú : CN1: Hội chứng Crigler – Najar type 1

CN2: Hội chứng Crigler – Najar type 2 Gilbert: Hội chứng Gilbert

Trang 12

Như Bảng 1 thống kê, đa số các alen mới được phát sinh chủ yếu là các dạng

biến đổi do thay thế nucleotit (đa hình di truyền đơn nucleotit), thêm và mất một đoạn trình tự ADN Trong số các đa hình trên, phần lớn gây ảnh hưởng đến hoạt động của enzym UGT1A, dẫn đến các rối loạn bệnh lý như hội chứng Crigler – Najar type 1,2 hay hội chứng Gilbert

1.2 Một số bệnh lý liên quan đến enzym UGT1A 1.2.1 Hội chứng Gilbert

Hội chứng Gilbert là một tình trạng di truyền thường gặp, đặc trưng chủ yếu bởi tăng bilirubin không liên hợp trong máu, không có bệnh lý về tế bào gan hoặc huyết tán Hội chứng này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1901 bởi Augustin Gilbert và Pierre Lereboullet [10] Nguyên nhân của bệnh được xác định là do sự suy giảm hoạt động của enzym UGT1A, có liên quan mật thiết đến đa hình di

truyền UGT1A1*28

Những triệu chứng điển hình của hội chứng Gilbert có thể kể đến như vàng

da nhẹ liên tục ở thanh thiếu niên, billirubin gián tiếp tăng sau mất nước, tiêu chảy, kinh nguyệt Các triệu chứng không điển hình khác đau bụng, đau dạ dày, mệt mỏi, sụt cân [10]

Về vàng da, trong hội chứng Gilbert cơ thể sản xuất một lượng bilirubin tự

do cao hơn bình thường trong máu và không gây ra hậu quả nghiêm trọng Vàng da

có thể xuất hiện sau khi bệnh nhân bị stress, nhiễm trùng, gắng sức,…, nhưng thường là không có triệu chứng [26] Cũng đã có các báo cáo cho thấy hội chứng Gilbert góp phần thúc đẩy sự khởi đầu của bàng da sơ sinh, đặc biệt là trong trường hợp tăng tan máu như trong bệnh thiếu enzym G6PD Tình trạng này có thể trở nên đặc biệt nghiêm trọng nếu không nhanh chóng điều trị nồng độ bilirunbin tăng cao trong máu, gây ra ảnh hưởng về thần kinh không thể phục hồi trong bệnh vàng da nhân não [13]

Về khả năng chuyển hóa thuốc, những bất thường liên quan đến enzym UGT1A1 trong hội chứng Gilbert cũng ảnh hưởng đến vài khả năng của gan trong giải độc thuốc của gan Hội chứng Gilbert có liên quan đến tình trạng tiêu chảy nặng và sự giảm bạch cầu trung tính ở những bệnh nhân được điều trị với Irinotecan (một thuốc điều trị ung thư), là cơ chất của UGT1A1 Paracetamol không được chuyển hóa bởi UGT1A1 nhưng enzym chuyển hóa nó cũng có bất thường trong hội chứng Gilbert Nên các BN có hội chứng Gilbert có nguy cơ ngộ độc paracetamol cao hơn

Trang 13

Hội chứng Gilbert có ảnh hưởng đến hệ Tim mạch Bilirubin có đặc tính chống oxi hóa mạnh trong ống nghiệm, làm giảm quá trình oxy hóa huyết tương [8] Một vài phân tích cho thấy những người bị hội chứng Gilbert và đái tháo đường có nguy cơ bị các bệnh mạch vành thấp hơn người bình thường [16]

Hội chứng Gilbert là một tình trạng lành tính, do vậy không cần một chế độ quản lý, điều trị đặc biệt và không cần bất kỳ một chế độ ăn kiêng nào

1.2.2 Hội chứng Crigler – Najar

Hội chứng Crigler-Najjar (CNS) là một rối loạn di truyền hiếm gặp gây rối loạn chuyển hóa bilirubin Hội chứng Crigler-Najjar được phân thành 2 loại Type 1 được mô tả bởi Crigler và Najjar vào năm 1952 có liên quan đến tăng bilirubin gián tiếp ở trẻ sơ sinh sơ sinh và vàng da nhân Type 2 (còn gọi là hội chứng Arias) được Arias phát hiện vào năm 1962, với mức bilirubin trong máu thấp hơn và đáp ứng với điều trị phenobarbital [32]

Hội chứng CNS liên quan đến sự thiếu hụt enzym UGT do đột biến trong trình tự mã hóa enzym UGT Trong hội chứng Crigler-Najjar type 1, cơ thể gần như thiếu hụt hoàn toàn enzym UGT, dẫn đến nống độ bilirubin trong máu sau sinh rất cao (có thể lên đến 50 mg/dl) Trong khi đó, Crigler-Najjar type 2 có nồng độ bilirubin thấp hơn (khoảng 20 mg/dl) Đối với các trường hợp này, điều trị phenobarbital có thể thúc đẩy sự hoạt động của enzym UGT, làm giảm nồng độ bilirubin trong máu khoảng 25% [32]

Trong hội chứng Crigler-Najjar type 1, bệnh nhân sẽ có biểu hiện vàng da kéo dài sau sinh Đối với type 2, vàng da có thể không biểu hiện cho đến khi bệnh nhân đến độ tuổi thiếu niên Hậu quả nghiêm trọng nhất của tăng bilirubin máu là vàng da nhân và tình trạng này xảy ra ở hầu hết bệnh nhân type 1 không được điều trị, đặc biệt trong những ngày đầu sau sinh Biến chứng vàng da nhân não do tăng bilirubin hiếm gặp ở type 2, nhưng có thể bị thúc đẩy bởi các yếu tố nhiễm trùng, thuốc mê, hay sử dụng thuốc Biểu hiện lâm sàng của vàng da nhân gồm giảm trương lực cơ, điếc, liệt vận nhãn, hôn mê và tử vong

Với các bệnh nhân mắc hội chứng Crigler-Najjar type 2 có thể không cần điều trị hay được điều trị bằng phenobarbital Ngược lại, khi xuất hiện biến chứng vàng da nhân trên bệnh nhân type 1, cần được nhanh chóng điều trị nhằm hạn chế các di chứng thần kinh Các thuốc phenobarbital (luminal, barbita) được sử dụng để hạn chế các di chứng thần kinh trong bệnh nhân type 1và điều trị các triệu chứng thần kinh đối với type 2 [19]

Trang 14

Điều trị khẩn biến chứng não do tăng bilirubin bao gồm truyền huyết tương, nhằm loại bỏ albumin đã bão hòa bilirubun trong máu, đồng thởi cung cấp protein

tự do để gắn kết với bilirubin trong mô, giảm nồng độ bilirubun [15]

Truyền huyết tương cần điều trị kèm chiếu đèn trong thời gian dài, giúp chuyển đổi bilirubin gián tiếp sang bilirubin trực tiếp để có thể thải ra theo nước tiểu Sử dụng canxi photphat cũng có thể hỗ trợ cho liệu pháp chiếu đèn [15]

1.3 Đa hình di truyền UGT1A1*28

Trong số các đa hình di truyền của UGT1A1, đa hình di truyền UGT1A1*28 phổ biến và được quan tâm nhiều nhất UGT1A1*28 gây suy giảm hoạt tính của

enzym UGT1A1, dẫn đến các rối loạn về chuyển hóa cũng như chức năng giải độc

của gan với các thuốc UGT1A1*28 được ghi nhận có liên quan đến nhiều bệnh lý

chuyển hóa và sự gia tăng những tác dụng không mong muốn của các thuốc, đặc biệt là irinotecan trong điều trị ung thư đại trực tràng

UGT1A1*28 là đa hình di truyền với sự lặp lại 7 lần của trình tự

thymine-adenine (TA) ở vùng promoter của UGT1A1[17] Ở dạng kiểu dại trình tự (TA) chỉ lặp lại 6 lần và được kí hiệu là alen UGT1A1*1 Độ dài của trình tự TA ở vùng promoter của exon UGT1A1 liên quan chặt chẽ đến hoạt tính của enzym UGT1A1 Chính vì vậy đa hình UGT1A1*28 đã được ghi nhận gây giảm hoạt tính của enzym UGT1A1 Người mang 1 alen UGT1A1*28 có hoạt tính enzym UGT1A1 giảm 25%

và giảm đến 70% ở người có kiểu gen đồng hợp UGT1A1*28 (mang 2 alen

UGT1A1*28) [5],[6] Tần số xuất hiện của alen UGT1A1*28 dao động nhiều ở các

quần thể khác nhau: 26% đến 31% ở quần thể người da trắng, 42% đến 56% ở quần thể người Châu Phi và 9% đến 16% ở các quần thể người Châu Á

Ảnh hưởng lớn nhất của alen UGT1A1*28 liên quan đến quá trình chuyển

hóa của một số thuốc và tình trạng tăng nồng độ bilirubin không liên hợp (bilirubin gián tiếp) Bilirubin là sản phẩm thoái hóa của nhân hem trong hemoglobin của hồng cầu, chủ yếu được tạo ra ở hệ thống tổ chức liên võng, ngoài hệ thống tuần hoàn Đây là một chất không tan trong nước có ái lực cao với lipid và albumin của huyết thanh Do có ái lực cao với lipid của màng tế bào nên sự kết hợp với lipid màng của bilirubin gây hư hại chức năng màng tế bào đặc biệt của hệ thống thần kinh Bilirubin được vận chuyển vào máu và kết hợp với albumin của huyết thanh, sau đó được vận chuyển đến gan và được giải phóng nhanh chóng khỏi albumin Ở

tế bào gan, bilirubin được glucuronic hóa nhờ các UGT tạo thành bilirubin liên hợp,

là chất tan trong nước, dễ dàng đào thải qua phân và nước tiểu [2]

Trang 15

Hoạt tính của enym UGT, đặc biệt là UGT1A1 suy giảm sẽ làm tăng nồng độ

bilirubin không liên hợp trong máu, gây ra tình trạng vàng da Đột biến

UGT1A1*28 đã được quan sát thấy ở các bệnh nhân mắc hội chứng Crigler – Najar

type I và được ghi nhận là dấu hiệu của hội chứng Gilbert [12]

Nhiều thuốc khác đã được xác định là chất ức chế hoạt động của enzym UGT1A1 như Indinavir (kháng retrovirus, sử dụng trong điều trị HIV), Atazanavir (điều trị HIV), Sorafenib (điều trị ung thư gan và thận)…[17] Nhiều nghiên cứu

cho thấy xác định sự có mặt của alen UGT1A1*28 ở những bệnh nhân điều trị với

Atazanavir, Indinavir có thể giúp họ tránh bị tăng bilirubin không liên hợp [4], [24] Một số thuốc khác đã được xác định là cơ chất của UGT1A1 như raloxifene (điều trị loãng xương), raltegravir (ức chế virus, sử dụng trong điều trị HIV)… đặc biệt là irinotecan (thuốc điều trị ung thư đại trực tràng) được quan tâm nhất Ảnh hưởng

của alen UGT1A1*28 đến bệnh nhân điều trị bằng irnotecan sẽ được trình bày cụ thể hơn ở bên dưới Đến nay, mối tương quan giữa đa hình UGT1A1*28 và đáp ứng

của cơ thể với các thuốc khác nhau vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu

1.4 Ung thƣ đại trực tràng và mối liên quan giữa irinotecan với đa hình

di truyền UGT1A1*28

Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới cũng như ở Việt Nam Trong điều trị bệnh, irinotecan được sử dụng thường xuyên cho những bệnh nhân ở giai đoạn IV Tuy nhiên thuốc có nhiều tác dụng

không mong muốn như tiêu chảy nặng, suy tủy, xuất huyết… UGT1A1*28 được ghi

nhận có liên quan chặt chẽ đến các tác dụng không mong muốn này Do vậy trong

thực hành lâm sàng, các bác sĩ cần cân nhắc xét nghiệm UGT1A1*28 trước khi

quyết định điều trị bằng irinotecan và điều chỉnh liều lượng thuốc phù hợp cho bệnh nhân để tránh các tác dụng không mong muốn nặng

Theo tổ chức Y tế thế giới, ung thư là nguyên nhân tử vong đứng hàng thứ hai, với khoảng 14 triệu trường hợp mắc mới vào năm 2012 và sẽ tăng khoảng 70% trong vòng 2 thập kỷ tới Khoảng 70% số ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước

có thu nhập thấp và trung bình [16] Việt Nam cũng không phải ngoại lệ Theo thông tin được đưa ra tại hội thảo khoa học Ung bướu quốc gia lần thứ VII năm

2013, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150.000 người mới mắc ung thư và 75.000 người tử vong vì căn bệnh này, tức 205 người/ngày và con số này dự báo sẽ ngày càng tăng cao Tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong của các ung thư phổ biến được thể hiện

trong Hình 1.4

Trang 16

Trong số các ung thư phổ biến, ung thư đại trực tràng là một trong những dạng ung thư có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao nhất ở cả 2 giới Trên thế giới, ung thư đại trực tràng có tỉ lệ mắc cao thứ 4 (17,2%) và tỉ lệ tử vong cao thứ 5 (8,3%) Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng nằm trong số 5 bệnh ung thư thường gặp với tỉ

lệ mắc là 10,1% và tỉ lệ tử vong là 7,0% So với các ung thư đường tiêu hóa khác, ung thư đại trực tràng có tiên lượng tốt hơn Tỉ lệ sống 5 năm phụ thuộc vào giai đoạn bệnh: giai đoạn I >90%, giai đoạn II>60%, giai đoạn III > 30% và giai đoạn IV<5% [17] Tuy nhiên các chương trình sàng lọc ung thư đại trực tràng mới được triển khai trong những năm gần đây, hơn nữa sự tiếp cận của người dân với các phương pháp chẩn đoán sớm còn hạn chế nên tình trạng bệnh nhân phát hiện ra bệnh ở giai đoạn muộn vẫn còn cao

Hình 1.4 Tỉ lệ mắc và tử vong ở cả hai giới của 10 ung thư phổ biến nhất năm

2012 [33]

Irinotecan (CPT-11,7-ethyl-10-[4-(1-(piperidino)-1-piperidino] carbonyl camptothecin, Camptosar®) là thuốc điều trị chính để điều trị ung thư đại trực tràng giai đoạn muộn, khi ung thư di căn, tái phát hoặc tiến triển sau điều trị ban đầu Thuốc thường được sử dụng kết hợp với các thuốc khác trong các phác đồ Pháp đồ điều trị phối hợp irinotecan thông thường là FOLFIRI (FOLONIC acid, Fluoroucacil hoặc leucovorin, IRInotecan) [17]

Irinotecan là một dẫn xuất tổng hợp của thuốc chống ung thư camptothecin (lần đầu tiên được phân lập từ cây Camptotheca) Giống như camptothecin,

Trang 17

irinotecan ức chế enzym topoisomerase I (là một enzym trong nhân tế bào) Enzym này xúc tác cho một số quá trình trong nhân tế bào như điều hòa cấu trúc cuộn xoắn, quá trình sao chép và sửa chữa của ADN

Irinotecan là tiền chất của SN38 Dạng hoạt hóa SN38 có hoạt tính mạnh gấp

100 -1000 lần so với Irinotecan [18] SN-38 có tác dụng gây độc tế bào bằng cách liên kết với phức hợp topoisomerase-ADN, làm gián đoạn quá trình cắt sợi đơn, ngừng quá trình sao chép Việc quá trình sao chép bị ngừng đột ngột và sự tương tác của các enzym sao chép với phức hợp SN38-topoisomerase-ADN phá vỡ cấu trúc sợi kép của ADN, gây ra những tổn thương ADN không hồi phục, đưa các tế bào vào quá trình apotosis (chết theo chu trình) Chính vì tác dụng như vậy mà irinotecan ngăn cản sự phát triển và tiêu diệt các tế bào ung thư Nhưng cũng vì thế thuốc ảnh hưởng đến các mô, cơ quan có các tế bào có khả năng phân chia mạnh như đường tiêu hóa, tủy xương Hậu quả là thuốc thường gây nên các tác dụng không mong muốn có thể dẫn đến tử vong như tiêu chảy nặng, suy tủy, dễ chảy máu… do tích tụ sản phẩm chuyển hóa Tuy nhiên, nhờ có enzym UGT1A trong gan, SN-38 được glucuronyl hóa tạo thành sản phẩm không độc và đào thải được

(Hình 5)

Hình 1.5 Đa hình di truyền UGT1A1 và sự chuyển hóa irinotecan a) Sự chuyển

hóa của irinotecan nhờ enzym UGT1A1 ở gan b) Đa hình di truyền vùng promoter của alen UGT1A1*28 ảnh hưởng tới hoạt tính glucuronul hóa của enzym UGT1A1

Dưới sự xúc tác của enzym UGT1A1, SN-38 liên hợp với axit glucuronic hình thành SN-38 glucuronit không còn hoạt tính gây độc, được đào thải chủ yếu qua mật, khoảng 30% qua thận[14] Chính vì vậy, những bệnh nhân mang alen

UGT1A1*28 làm giảm biểu hiện của UGT1A1 sẽ gây tích tụ SN-38 trong cơ thể,

gây nguy cơ xuất hiện các tác dụng phụ ở mức độ nặng khi điều trị bằng irinotecan

Trang 18

[11] Năm 2005, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration, viết tắt là FDA) đã đưa ra khuyến cáo nên xét nghiệm gen

UGT1A1*28 khi dùng irinotecan và có hướng dẫn về điều trị tương ứng với từng

kiểu gen (Hình 1.6) [23]

Chưa có một liều lượng irinotecan cụ thể được thiết lập cho alen

UGT1A1*28 Tuy nhiên Innocenti và cộng sự năm 2006 đã đưa ra khuyến cáo giảm

20% liều cho bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp UGT1A1*28 Liều lượng thuốc có

thể điều chỉnh tăng hoặc giảm trong lần điều trị thứ 2 dựa trên các đáp ứng của khối

u với thuốc và quá trình theo dõi các tác dụng không mong muốn

Hình 1.6 Irinotecan và phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng liên quan đến

kiểu gen UGT1A1[16]

1.5 Các phương pháp phân tích đa hình di truyền UGT1A1*28

Hiện tại có rất nhiều phương pháp khác nhau để phân tích các đa hình di truyền Các phương pháp này dựa trên những nguyên lý khác nhau như trình bày bên dưới Tuy nhiên phương pháp giải trình tự theo nguyên lý của Sanger và PCR-

RFLP được ứng dụng trong phân tích đa hình di truyền UGT1A1*28 nhiều hơn cả

Với nhiều ưu điểm so với các phương pháp khác, phương pháp giải trình tự theo nguyên lý của Sanger được lựa chọn cho nghiên cứu này

1.5.1 Giải trình tự ADN

Phần lớn các phương pháp được nói phía dưới ứng dụng cho việc để sàng lọc bước đầu đột biến điểm/ các SNP Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm

Trang 19

1977, được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotit (gọi tắt là phương pháp dideoxy) [35] Nguyên lý cơ bản của phương pháp này dựa trên sự bổ sung các dẫn xuất tương ứng của các deoxynucleotit (dNTP) là 2’,3’-dideoxynucleotit (ddNTP) Các ddNTP thiếu nhóm 3’- OH, nên một khi được gắn vào mạch ADN đang tổng hợp thì quá trình tổng hợp ADN sẽ dừng lại Theo phản ứng tổng hợp ADN, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một đoạn oligonucleotit ngắn là đoạn ADN có trình tự xác định trước, thường được tổng hợp hóa học, có trình tự bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó Các mồi oligonucleotit được kéo dài nhờ tác dụng của enzym ADN polymerase Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại dNTP và ddNTP để ngắt phản ứng kéo dài chuỗi Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel polyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN [1], [27]

Ngày nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như trên Với

sự phát triển của các enzym ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phương pháp này cho phép sàng lọc các SNP hiệu quả rất cao khi so sánh với các kỹ thuật

đã miêu tả trên Cho đến nay, giải trình tự thế hệ mới và sử dụng chất huỳnh quang cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao Ưu điểm của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loại đột biến, vị trí và có thể tiến hành phân tích với nhiều đột biến điểm cùng lúc [2]

Tuy vậy hạn chế của phương pháp này là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền Thời gian cần thiết để tiến hành giải trình tự cũng kéo dài hơn so với các phương pháp như Real – time PCR và PCR - RFLP Tuy nhiên, giải trình tự vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định chính xác cùng lúc tất cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, phù hợp cho các nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm Bên cạnh đó, giải trình tự xác định được sự xuất hiện của đột biến, cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ của đối tượng tham gia nghiên cứu [1]

1.5.2 Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn ( Single-strand conformation polymorphism - SSCP):

Đây là một phương pháp đơn giản được sử dụng trong nghiên cứu đột biến điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN Cấu trúc

Trang 20

không gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn được xác định bởi trình tự và môi trường chứa chúng Do đó, trong trường hợp điều kiện môi trường không thay đổi, cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotit và bất cứ thay đổi nào trong

đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn Phương pháp này sử dụng PCR để khuếch đại đoạn gen mong muốn Sau đó sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamit không biến tính, các nucleotit trên phân tử ADN sợi đơn sẽ bắt cặp

bổ sung lại với nhau, dẫn đến hình thành cấu hình không gian khác nhau do sự khác biệt về trình tự nucleotit Các phân tử ADN sợi đơn này sẽ di chuyển với tốc độ không giống nhau và phân tách ra Những yếu tố khác ảnh hưởng đến cấu hình sợi đơn như nhiệt độ, pH, đệm chạy có thể được sử dụng để tăng khả năng phân tách Nhìn chung, nhiệt độ và pH thấp giúp duy trì cấu hình và dễ dàng phân biệt được các phân tử ADN có trình tự khác nhau [22], [29]

1.5.3 Phân tích dị sợi kép (heteroduplex analysis):

Cũng giống như phương pháp SSCP, nguyên lý của phương pháp phân tích

dị sợi kép dựa trên sự hình thành của ADN dị sợi kép Các ADN của một mẫu có kiểu dại đã được xác định trước được trộn lẫn với mẫu ADN cần phân tích Các phân tử ADN sợi kép được biến tính ở nhiệt độ cao để phân tách 2 mạch đơn Nếu mẫu cần phân tích có kiểu gen dị hợp thì trong mẫu trộn lẫn sau biến tính sẽ bao gồm các sợi bổ sung và các sợi có chứa một cặp basơ không bổ sung (tương ứng với

vị trí của SNP) Sau đó hạ nhiệt độ xuống chúng sẽ liên kết lại với nhau hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác Chính sự xuất hiện của cặp basơ ghép đôi không chính xác này làm giảm tốc độ di chuyển khi điện di của các phân tử ADN dị sợi kép so với các phân tử ADN đồng sợi kép Hiện nay phương pháp này đã được cải tiến bằng cách khuếch đại các đoạn ADN của mẫu kiểu gen hoang dại và kiểu gen cần phân tích [22], [29]

1.5.4 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism – RFLP)

Nguyên lí cơ bản của phương pháp này là dựa vào tính chất của enzym giới hạn, có thể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh nhỏ có chiều dài khác nhau Các mảnh giới hạn này sau đó được phân tách theo chiều dài của chúng bằng phương pháp điện di trên gel agarose/polyacrylamit và/hoặc được chuyển qua màng bằng phương pháp lai Southern blot Trên màng lai

có những đầu dò ADN để xác định những đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ

Trang 21

sung với chúng Phân tích RFLP thường được hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen cần phân tích Chính vì thế, kĩ thuật này thường được gọi là PCR-RFLP Tùy theo mục đích và dựa vào đặc điểm của gen cần nghiên cứu, người ta có thể thực hiện phương pháp PCR-RFLP theo các cách khác nhau, có thể đơn giản

hóa hoặc tiến hành cùng một số phương pháp khác [27], [29]

1.5.5 Real – time PCR

Trong kỹ thuật PCR, sau khi hoàn tất khuyếch đại đoạn ADN đích, người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước để đọc kết quả ví dụ như điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, acrylamide hay thí nghiệm lai với các đoạn dò đặc hiệu (trên màng, trên giếng hay phiến nhựa…) để xem sản phẩm khuếch đại có trình tự mong muốn hay không Kỹ thuật PCR cần phải có giai đoạn đọc kết quả sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại được gọi là PCR cổ điển

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà số lượng khuếch đại ADN đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Quá trình khuếch đại ADN của các ống được hiển thị dưới dạng một biểu đồ khuếch đại Các dNTP (nguyên liệu để tổng hợp ADN) được đánh dấu huỳnh quang Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của ADN đích tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ và được máy ghi lại để dựng thành biểu đồ Tuy nhiên cường độ huỳnh quang trong ống sẽ tăng trưởng đến một mức độ thì sẽ chậm dần và thành đường ngang do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzym Taq polymerase không hoạt động hiệu quả nữa, nên số lượng bản sao không còn gia tăng số lượng theo cấp số 2 nữa [27], [29]

1.5.6 Phân giải cao nhiệt độ chảy

V.Thomas và cộng sự năm 2013 đã phát triển quy trình phân tích đa hình di

truyền vùng promoter của gen UGT1A1 dựa trên kĩ thuật HRM (phân giải cao nhiệt

độ chảy) Phương pháp này có ưu điểm dễ ứng dụng, tiết kiệm chi phí và thời gian hơn so với phương pháp giải trình tự Tuy nhiên phương pháp này không phân tích được sự khác nhau giữa các kiểu gen dị hợp TA6/TA7 và TA6/TA8 và cần sử dụng phương pháp điện di tiếp sau để phân biệt 2 loại kiểu gen dị hợp này (thể hiện trong

Hình 1.7 và Hình 1.8) [30] Chính vì vậy, V.Thomas vẫn đưa ra khuyến cáo nên sử

dụng phương pháp giải trình tự để có được kết quả khách quan khi phân tích đa hình TA6/TA7 [30]

Trang 22

Hình 1.7 Biên độ nhiệt của các đa hình vùng promoter của gen UGT1A1 Tất cả

8 kiểu gen TA n đều được phân biệt rõ ràng với các kiểu gen khác, ngoại trừ kiểu gen TA 6 /TA 7 và TA 6 /TA 8 [30]

Hình 1.8 Kết quả điện di của kiểu gen TA 6 /TA 7 và TA 6 /TA 8 sử dụng gel agarose 3% Sau khi điện di tối thiểu 60 phút, bệnh nhân có kiểu gen dị hợp TA 6 /TA 7 chỉ thu được 1 băng ADN Ttrong khi đó, bệnh nhân có kiểu gen TA 6 /TA 8 sẽ thu được 2 băng ADN

TA5/TA5 TA5/TA8

TA 7 /TA 7

Trang 23

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

38 mẫu sinh phẩm thu được sau phẫu thuật tại Bệnh viện 198 Bộ Công an được cố định trong formalin và đúc trong paraffin, được bảo quản ở 4 o

C

8/38 bệnh nhân trên cung cấp thêm mẫu máu (1 ml) bảo quản trong EDTA lưu ở -20 oC đến khi sử dụng

2.2 Hóa chất

Nhóm hóa chất tách ADN tổng số: Kit ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep

System (Promega) dùng cho mẫu mô đúc trong paraffin; Kit E.Z.N.A blood DNA Mini kit (Omega-Biotek) dùng cho mẫu máu; Ethanol 100%; Isopropanol 100%

Nhóm hóa chất điện di: EDTA(Affymetrix); Tris base (Bio basic); agarose

(Lonza); GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific) dùng cho điện di sản phẩm PCR; Lamdba DNA/HindIII Ladder (Thermo Scientific) dùng cho điện di sản phẩm ADN tổng số; 6X ADN loading dye (Thermo Scientific)

Nhóm hóa chất phản ứng PCR: dNTPMix 2mM (Thermo Scientific); Q5

High-Fidelity ADN polymerase (NEB); Nước khử ion (Omega-Biotek); Cặp mồi đặt tổng hợp tại hãng IDT (Mỹ) với trình tự như sau:

F1: 5’ GCTCCACCTTCTTTATCTCTG 3’

R1: 5’ ATC AAC AGT ATC TTC CCA GCA 3’

Nhóm hóa chất giải trình tự: BigDye® Terminator v3.1 cycle sequencing (Applied

Biosystems); Dung dịch SAM (Applied Biosystems)

2.3 Thiết bị và địa điểm nghiên cứu

Bể ổn nhiệt; Tủ ấm; Máy lắc VELP Scientifica (Đức); Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ); Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ); Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh); Tủ lạnh sâu -20 ˚C (Nhật Bản); Máy phân tích phân đoạn ADN tự động (Applied Biosystems); Máy quang phổ NP80 Nanophotometer (Đức)

Nghiên cứu được thực hiện tại các phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội

Trang 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số cần được thu hồi từ mẫu sinh phẩm để thực hiện cho các phản ứng tiếp theo Với phản ứng PCR để nhân dòng một đoạn ADN xác định rất cần ADN được tinh sạch Các tạp chất còn lẫn trong mẫu ADN cần nhân dòng có thể ức chế hoặc làm giảm hiệu suất của quá trình PCR Để giải quyết vấn đề này, mẫu cần được xử lý qua một loạt quá trình ly giải để khử tạp chất Một trong số các phương pháp phổ biến nhất hiện nay và cũng được áp dụng trong nghiên cứu này là phương

pháp tinh sạch ADN bằng cột ly tâm chứa chất bám silica (mô tả trong Hình 2.1)

[9]

Hình 2.1 Quy trình tách chiết ADN bằng cột silica [35]

Để tiến hành tinh sạch ADN theo phương pháp này, người ta sử dụng đệm ly giải chứa nồng độ cao các muối hoạt động bề mặt cao Các chấp hoạt động bề mặt này sẽ làm mất ổn định liên kết hydro, lực Van der Walls và tương tác kị nước [9] Protein cũng bị mất ổn định và liên kết của chúng với axit nucleic bị phá vỡ tạo điều kiện chuyển ADN lên màng silica ADN được gắn lên màng ở lực ion cao và sau đó được giải phóng ở lực ion thấp Để tăng cường khả năng gắn cả acid nucleic lên màng, các alcohol cũng được thêm (ở nghiên cứu này sử dụng ethanol) Dung dịch

ly giải cần được ly tâm tiếp để có thể đi qua màng silica, sau ly tâm chỉ ADN hoặc ARN được giữ lại trên màng, còn các thành phần khác như protein, poysaccarit,

sẽ bị rửa trôi Sau đó cột silica được ly tâm để làm khô cột, loại bỏ ethanol Cuối cùng, đệm Tris 10mM hoặc nước được thêm vào màng để các acid nucleic sẽ bị hydrat hóa và được giải phóng nhanh chóng ra khỏi màng [9]

Chuẩn bị mẫu

Trang 25

2.4.2 Đánh giá chất lượng của sản phẩm tách ADN tổng số

Hai phương pháp để đánh giá chất lượng của sản phẩm tách ADN tổng số được sử dụng trong nghiên cứu này là điện di ADN và đo mật độ quang

Với phương pháp điện di ADN, nguyên tắc là dưới tác động của điện trường, các phân tử axit nucleic khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực

âm sang cực dương với tốc độ di chuyển khác nhau Vì vậy chúng dần tách nhau ra trên trường điện di; qua đó ta có thể thu thập và phân tích được từng phân đoạn ADN hoặc gen riêng rẽ Trên trường điện di, các phân đoạn ADN có kích thước càng nhỏ càng di chuyển nhanh Sau khi điện di kết thúc, các phân tử ADN có thể quan sát được nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang, như ethidium bromide Mỗi băng điện di thường phản ánh một tập hợp các phân tử ADN có cùng kích thước [1]

Có 2 loại gel được dùng phổ biến là gel agarose và polyacrylamide Gel polyacrylamid có độ phân giải cao, nhưng vùng kích thước ADN có thể phân tích hẹp, thường chỉ dùng để phân tích các đoạn ADN kích thước nhỏ (5 – 1000 bp) Trong khi đó gel agarose có độ phân giải thấp đối với các đoạn ADN có kích thước nhỏ, nhưng rất hiệu quả khi phân tách các đoạn ADN kích thước lớn (khoảng từ 200

bp đến 20 kb) Trường hợp kiểm tra độ tinh sạch ADN tổng số, tôi sử dụng gel agarose để kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm ADN tương ứng với kích thước khoảng 23 kb [1]

Với phương pháp đo mật độ quang, nguyên lý dựa trên cường độ hấp thụ tia

tử ngoại của các cấu trúc vòng thơm trong các nucleotit cấu tạo nên phân tử ADN Khi tia UV được chiếu qua dung dịch axit nucleic, mức độ hấp thụ tia UV (OD260) phụ thuộc vào nồng độ các axit nucleic Dựa trên nồng độ ADN hoặc ARN của các dung dịch chuẩn biết trước, các giá trị OD 260 tương ứng được dùng để vẽ đường tuyến tính chuẩn tương quan giữa nồng độ axit nucleic với chỉ số OD 260 Khác với axit nucleic, protein hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 280 nm (chủ yếu là do cấu trúc vòng thơm của axit amin tryptophan) Do vậy độ tinh sạch của dịch chiết ADN có thể xác định qua tỉ số OD 260/280 [1]

2.4.3 Phản ứng PCR nhân dòng vùng promoter của UGT1A1

Kỹ thuật PCR dùng ADN polymerase để tổng hợp phân tử ADN mới từ trình

tự của phân tử ADN làm khuôn với tiền chất là các dNTP Các ADN polymerase

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	1,77 MB