Nhận xét tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại bệnh viện bạch mai

TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN GEN KRAS, NRAS, BRAF CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .... MỐI LIÊN QUAN GIỮA TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN GEN KRAS, NRAS, BRAF VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG – CẬN LÂM SÀN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thuận Lợi và ThS Huỳnh Thị Nhung là người hướng dẫn đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Trong quá trình nghiên cứu, các thầy cô đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em thực hiện tốt đề tài và khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô đang công tác tại Khoa Y – Dược, đặc biệt em xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Thị Luyến là chủ nhiệm bộ môn liên chuyên khoa và Ban lãnh đạo Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, đặc biệt GS

TS Mai Trọng Khoa, PGS TS Trần Đình Hà và PGS TS Phạm Cẩm Phương cùng toàn thể các bác sĩ và điều dưỡng trong Trung tâm, đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện luận án

Em cũng xin cảm ơn toàn thể thầy cô, anh chị, các nghiên cứu viên của Đơn vị Gen - Trung Tâm YHHN và Ung bướu Bệnh Viện Bạch Mai đã giúp đỡ em trong quá trình thu thập số liệu phụ vụ cho nghiên cứu

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn vè và người thân đã quan tâm, động viên tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Tuy nhiên, vì kiến thức chuyên môn còn hạn chế và bản thân còn thiếu nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung của khóa luận không tránh khỏi thiếu xót, em rất mong nhận sự góp ý để khóa luận này được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2018

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ của ung thư đại trực tràng 3

1.1.3 Chẩn đoán giai đoạn ung thư đại trực tràng 5

1.1.4 Chẩn đoán mô bệnh học ung thư đại trực tràng 8

1.1.5 Các chất chỉ điểm u thường dùng 9

1.1.6 Điều trị trong ung thư đại trực tràng 10

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC GEN KRAS, NRAS, BRAF TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 13

1.2.1 Con đường tín hiệu MAPK (Mitogen activated protein kinase) trong ung thư đại trực tràng 13

1.2.2 Đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF trong ung thư đại trực tràng 14

1.2.3 Tình hình nghiên cứu đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF ở Việt Nam 15

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 17

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 17

2.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu 17

2.2.3 Nội dung nghiên cứu 18

2.2.4 Phương pháp thu thập số liệu 23

2.2.5 Xử lý số liệu 23

2.2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 23

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG – CẬN LÂM SÀNG CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 24

3.1.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 24

3.1.2 Vị trí khối u nguyên phát 25

3.1.3 Lý do vào viện 25

3.1.4 Đặc điểm cận lâm sàng 26

3.1.5 Giai đoạn bệnh và tình trạng di căn xa 27

3.2 TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN GEN KRAS, NRAS, BRAF CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 28

3.2.1 Tỷ lệ đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF 28

3.2.2 Tỷ lệ các dạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF 29

3.3 MỐI LIÊN QUAN GIỮA TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN GEN KRAS, NRAS, BRAF VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG – CẬN LÂM SÀNG CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 31

3.3.1 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với đặc điểm về tuổi và giới tính 31

3.3.2 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với đặc điểm khối u đại trực tràng 32

3.3.3 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với xét nghiệm CEA và CA19-9 trong huyết thanh 33

3.3.4 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với giai đoạn bệnh và tình trạng di căn xa 34

CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN 35

4.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG – CẬN LÂM SÀNG CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 35

4.1.1 Đặc điểm phân bố nhóm tuổi và giới tính 35

4.1.2 Vị trí khối u nguyên phát 36

4.1.3 Lý do vào viện 36

4.1.4 Đặc điểm cận lâm sàng 37

4.1.5 Giai đoạn bệnh và tình trạng di căn xa 38

4.2 TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN GEN KRAS, NRAS, BRAF CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 39

4.3 MỐI LIÊN QUAN GIỮA TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN GEN KRAS, NRAS, BRAF VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG – CẬN LÂM SÀNG CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 40

4.3.1 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với đặc điểm

tuổi và giới tính 41

4.3.2 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với đặc

điểm khối u đại trực tràng 42

4.3.3 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với xét

nghiệm CEA và CA19-9 trong huyết thanh 43

4.3.4 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với giai

đoạn bệnh và tình trạng di căn 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1 MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU

PHỤC LỤC 2 DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) và con đường tín hiệu MAPK 14

Hình 2 Vị trí khối u đại trực tràng nguyên phát 25

Hình 3 Lý do vào viện của bệnh nhân 25

Hình 4 Phân loại giai đoạn bệnh ung thư đại trực tràng 27

Hình 5 Tỷ lệ các dạng đột biến gen KRAS theo vị trí phát hiện 29

Hình 6 Tỷ lệ các dạng đột biến gen NRAS theo vị trí phát hiện 29

Hình 7 Tỷ lệ các dạng đột biến gen BRAF theo vị trí phát hiện 30

DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Phân loại của Dukes cải tiến (Astler – Coller) 6

Bảng 2 Phân chia giai đoạn theo hệ thống TNM của AJCC 7

Bảng 3 Phân tích kết quả đột biến gen KRAS 20

Bảng 4 Phân tích kết quả đột biến gen NRAS 22

Bảng 5 Phân tích kết quả đột biến gen BRAF 23

Bảng 6 Đặc điểm chung của bệnh nhân 24

Bảng 7 Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh nhân 26

Bảng 8 Các vị trí di căn xa của ung thư đại trực tràng 28

Bảng 9 Tỷ lệ phát hiện đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF 28

Bảng 10 Các loại đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF theo vị trí phát hiện 30

Bảng 11 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với tuổi và giới tính 31

Bảng 12 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với đặc điểm khối u đại trực tràng 32

Bảng 13 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với xét nghiệm CEA và CA19-9 trong huyết thanh 33

Bảng 14 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với giai đoạn bệnh và di căn xa 34

4 DNA Deoxyribonucleic Acid

5 EGF Epidermal Growth Factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì

6 EGFR Epidermal Growth Factor

8 FFPE Formalin-Fixed

10 MRI Magnetic resonance imaging Chụp cộng hưởng t

11 mTOR Mammalian Target of

Rapamycin

12 PET/CT

Positron Emission Tomography/ Computed Tomography

Chụp xạ hình c t lớp Positron

13 PI3K Phosphotidylinositol–3 Kinase

14 PTEN Phosphatase And Tensin

Homolog

15 TNM Tumor - Nodule - Metastasis

Khối u - Hạch vùng – Di căn

xa

17 VEGF Vascular Endothelial Growth

Factor

Yếu tố phát triển nội mô mạch máu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư đại trực tràng là một trong những ung thư phổ biến trên thế giới Hàng năm, hơn một triệu người được chẩn đoán ung thư đại trực tràng và đây là nguyên nhân xếp thứ tư gây ra tử vong do ung thư trên thế giới [48] Theo GLOBOCAN 2012, Việt Nam có khoảng 8800 trường hợp mới m c và dự kiến đến năm 2020 có khoảng hơn

11000 trường hợp/ năm [49] Chẩn đoán sớm và lựa chọn phác đồ điều trị đúng sẽ giúp tăng khả năng sống sót của bệnh nhân Hiện nay, các phương pháp điều trị ung thư đại trực tràng bao gồm phẫu thuật, xạ trị, hóa chất và điều trị đích Tuy nhiên, phẫu thuật, điều trị hóa chất và xạ trị đơn thuần có hiệu quả ở giai đoạn sớm của bệnh nhưng lại kém hiệu quả hơn ở những giai đoạn tiến triển

Trong những năm gần đây, phương pháp điều trị đích sinh học bao gồm các kháng thể đơn dòng g n với yếu tố phát triển nội mô mạch máu (VEGF - vascular endothelial growth factor) và thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR - epidermal growth factor receptor) đã cải thiện đáng kể kết quả điều trị ở những bệnh nhân m c ung thư đại trực tràng [34] Các thuốc điều trị đích ức chế thụ thể EGFR (cetuximab, panituximab) ra đời đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị ung thư đại trực tràng Sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp những thuốc này với các phác đồ hóa trị chuẩn đã cải thiện thời gian sống sót trung bình ở những bệnh nhân ung thư đại trực tràng [97, 98] Sự kích hoạt EGFR bằng các chất g n đóng vai trò chủ chốt gây ra sự tăng sinh tế bào, tăng sinh mạch máu, di căn và ức chế sự chết theo chương trình (apotosis) thông qua các hệ thống tín hiệu RAS/RAF/MAPK và PI3K/AKT/m-TOR Các đột biến các

gen KRAS, NRAS, BRAF ở hạ lưu thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì sẽ hoạt hóa các

con đường tín hiệu độc lập với thụ thể Do đó, các đột biến gen này sẽ làm cho khối u kém hoặc không đáp ứng với các thuốc ức chế EGFR Như vậy, xét nghiệm đột biến

gen KRAS, NRAS, BRAF có vai trò rất quan trọng và cần thiết để lựa chọn phác đồ điều

trị ban đầu phù hợp nhất cho bệnh nhân, t đó nâng cao hiệu quả điều trị, chất lượng sống của bệnh nhân và tránh chi phí điều trị không cần thiết

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu các đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF Tuy nhiên, tại Việt Nam, gen KRAS và BRAF đã được triển khai thực hiện thường quy ở một số bệnh viện lớn, gen NRAS bước đầu được triển khai và mới có tác

giả Trịnh Lê Huy nghiên cứu trên 39 bệnh nhân UTĐT được điều trị tại khoa Ung

bướu và Chăm sóc giảm nhẹ Bệnh viện Đại học Y Hà Nội nhưng không phát hiện được

trường hợp nào có đột biến NRAS

Qua tìm hiểu và phân tích tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam,

chúng tôi thấy các gen KRAS, NRAS, BRAF là những dấu ấn sinh học rất có ý nghĩa

trong điều trị ung thư đại trực tràng Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nhận xét tình

trạn đột bi n gen KRAS, NRAS, BRAF trên b n n ân un ƣ đại trực tràng tại

B nh vi n Bạch Mai” với hai mục tiêu sau:

1 Mô tả một số đặc điểm lâm sàng – cận lâm sàng và tình trạng đột biến gen

KRAS, NRAS, BRAF trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện Bạch Mai

2 Mô tả mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF với

một số đặc điểm lâm sàng – cận lâm sàng trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện Bạch Mai

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Giới thi u chung

Ung thư đại trực tràng là ung thư nguyên phát t đại tràng hoặc trực tràng và được gọi tên tùy thuộc vào vị trí xuất hiện của ung thư Tùy thuộc vào vị trí khối u trên khung đại tràng hay trực tràng cùng mức độ lan rộng của khối u sang các tạng hay các

cơ quan khác (di căn) sẽ biểu hiện những triệu chứng khác nhau Các triệu chứng thường gặp nhất là có máu trong phân, thay đổi thói quen đại tiện, thay đổi khuôn phân, đau vùng hạ vị, cảm giác đi ngoài không hết phân, mệt mỏi, sút cân Tuy nhiên, các triệu trứng này không đặc hiệu, có thể gặp trong nhiều bệnh khác nhau

Ung thư đại trực tràng là loại ung thư phổ biến thứ ba ở nam giới (sau ung thư phổi, ung thư tiền liệt tuyến) và đứng thứ hai ở nữ giới (chỉ sau ung thư vú) [31] Hàng năm, hơn một triệu người được chẩn đoán ung thư đại trực tràng và đây là nguyên nhân xếp thứ tư gây ra tử vong do ung thư trên thế giới [48] Ở những nước phát triển, bệnh khá phổ biến (chiếm 55% trường hợp), nhưng lệ m c và tỷ lệ tử vong giữ ổn định và có

xu hướng giảm nhẹ, tuy nhiên ở những nước có thu nhập thấp và trung bình tỷ lệ này ngày càng tăng nhanh chóng Theo dữ liệu của GLOBOCAN 2012, Việt Nam có khoảng 8800 trường hợp mới m c, gần 6000 trường hợp tử vong và dự kiến đến năm

2020 có khoảng hơn 11000 trường hợp mới m c/ năm [49]

1.1.2 Các y u tố n uy cơ của un ư đại trực tràng

Hiện nay, vẫn còn nhiều tranh cãi về nguyên nhân chính xác gây ra bệnh ung thư đại trực tràng, tuy nhiên có một số yếu tố làm tăng khả năng hình thành và phát triển bệnh đã được nghiên cứu trong nhiều thập kỉ qua

1.1.2.1 Yếu tố lối sống và dinh dưỡng

Hơn 75 – 95% người m c ung thư đại trực tràng có rất ít hoặc gần như không liên quan đến những nguy cơ về di truyền [41, 104] Các yếu tố nguy cơ bao gồm tuổi cao, giới tính nam [41] và các yếu tố khác liên quan tới lối sống và chế độ dinh dưỡng như ăn nhiều chất béo, ăn thịt đỏ, thực phẩm đóng hộp, uống rượi, hút thuốc lá, ít hoạt động thể chất [39, 104] Thực phẩm nhiều mỡ, thịt động vật làm tăng hàm lượng acid mật và thúc đẩy các vi khuẩn trong lòng ruột phát triển, đặc biệt là các vi khuẩn yếm khí như Clostridia Acid mật dưới tác dụng của các vi khuẩn này sẽ biến đổi thành các

chất chuyển hóa có khả năng tác động tới sự phân chia và sinh sản của các tế bào ruột Những người uống rượu nhiều có nguy cơ ung thư đại trực tràng cao hơn 60% so với những người không uống rượu hoặc uống rất ít [58] Và khoảng 10% trường hợp m c bệnh liên quan đến việc thiếu hoạt động thể lực hằng ngày [68]

1.1.2.2 Tuổi

Tuổi là một yếu tố quan trọng làm phát triển ung thư đại trực tràng Khoảng 90% các trường hợp mới m c được chẩn đoán ở những bệnh nhân trên 50 tuổi với độ tuổi trung bình là 69 tuổi [56], ngoài ra, tỷ lệ m c bệnh cũng tăng dần theo độ tuổi ở bất kì giới tính hay chủng tộc nào và tỷ lệ này gần gấp đôi ở độ tuổi t 40 dến 80 [84]

Vì vậy, các biện pháp sàng lọc được khuyến cáo b t đầu t độ tuổi 50 đến 75 có thể đem lại nhiều lợi ích đáng kể [30]

1.1.2.3 Các tổn thương tiền ung thư

Các polyp đại trực tràng là tiền thân của ung thư đại trực tràng [102] Có nhiều loại polyp như polyp tuyến, polyp tăng sản, polyp loạn sản phôi Trong đó, các polyp tuyến được chia làm ba loại dựa theo đặc tính mô học: polyp tuyến thường là những polyp có cuống, vi thể có những cấu trúc nhung mao <25%; polyp nhung mao có >50% cấu trúc nhung mao; polyp tuyến ống nhung mao có 25-50% nhung mao Khả năng ác tính hóa phụ thuộc vào kích thước và bản chất mô bệnh học của polyp, các polyp có kích thước dưới 1cm hiếm khi ung thư hóa [14, 92] Trong các loại polyp tiền ung thư, polyp tuyến và những polyp tuyến tiến triển (advanced adenomatous polyps – là những polyp có kích thước trên 1cm có thể có cấu trúc nhung mao hoặc loạn sản nặng làm tăng tỷ lệ m c ung thư đại trực tràng ở những người cao tuổi [70, 80] Thực tế, so với những người trong độ tuổi 40 – 49 tuổi, polyp tuyến và polyp tuyến tiến triển ở người trong độ tuổi 70 – 75 có tỷ lệ gần gấp đôi [59, 70, 94]

Viêm loét đại trực tràng và bệnh Crohn cũng là những tổn thương tiền ung thư được nghiên cứu trong nhiều năm Ung thư đại trực tràng được Crohn và Rosenberg công nhận lần đầu tiên là một biến chứng của viêm loét đại tràng vào năm 1925 [40] Bệnh Crohn cũng được nghiên cứu, xác định là một yếu tố nguy cơ làm tăng tỷ lệ m c ung thư đại trực tràng [33] Weedon và cộng sự [105] đã báo cáo có 8 bệnh nhân m c ung thư đại trực tràng trong số 449 bệnh nhân bị bệnh Crohn, khoảng 1,2% (tức là nguy cơ cao hơn 20 lần so với nhóm chứng) Tương tự, Gyde và cộng sự [51] đã mô tả nguy cơ m c bệnh tăng xấp xỉ 4 lần ở bệnh nhân bị bệnh Crohn Ở châu Á, bệnh Crohn

ngày càng tăng lên thì ung thư đại trực tràng được phát hiện với tỷ lệ cao, đặc biệt là vùng trực tràng và hậu môn [54]

1.1.2.4 Yếu tố di truyền

Yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng đối với sự phát sinh và phát triển ung thư đại trực tràng Với những người có t hai người trở lên trong gia đình thuộc họ hàng đời thứ nhất (first-degree relatives – như cha mẹ, anh chị em ruột hoặc con) có nguy cơ m c bệnh cao gấp 2 – 3 lần so với người không có tiền sử gia đình và nhóm này chiếm khoảng 20% các trường hợp [77] Một số hội chứng di truyền liên quan đến nguy cơ m c bệnh, trong đó phổ biến nhất là ung thư đại trực tràng di truyền không có polyp (HNPCC: hereditary nonpolyposis colorectal cancer hay Hội chứng Lynch) xuất hiện ở khoảng 3% người bị ung thư đại trực tràng [41] Các hội chứng khác liên quan chặt chẽ đến ung thư đại trực tràng bao gồm hội chứng Gardner và đa polyp đại trực tràng gia đình (FAP: familial adenomatous polyposis) [62] Nếu m c các hội chứng này thì khả năng cao sẽ m c bệnh và chiếm khoảng 1% các trường hợp [52]

1.1.3 Chẩn đoán a đoạn un ƣ đại trực tràng

Xác định sớm và chính xác giai đoạn bệnh rất quan trọng và cần thiết, t đó có thể phương hướng điều trị thích hợp và tiên lượng bệnh Chẩn đoán giai đoạn dựa vào các phương tiện chẩn đoán hình ảnh như chụp X-quang ngực, siêu âm ổ bụng, chụp c t lớp vi tính ổ bụng và lồng ngực, chụp cộng hưởng t , xạ hình xương… và gần đây nhất

là PET/CT với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn hẳn các phương pháp chẩn đoán như

CT và MRI [43]

 Phân loạ a đoạn của Dukes

Năm 1932, Cuthbert Esquire Dukes lần đầu tiên đưa ra hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thư trực tràng bao gồm 4 giai đoạn:

- Giai đoạn A: khối u xâm lấn tới lớp cơ, còn giới hạn ở thành trực tràng, chưa

di căn hạch

- Giai đoạn B: khối u xâm lấn thanh mạc tới tổ chức xung quanh nhưng chưa di căn hạch

- Giai đoạn C: có di căn hạch

- Giai đoạn D: có di căn xa

Tiếp đó, hệ thống phân loại này đã được áp dụng rộng rãi và được nhiều tác giả cải tiến Năm 1967 Turnbull R.B.D cải tiên phân loại Dukes thành 4 giai đoạn, áp dụng

cho cả ung thư trực tràng và đại tràng [96] Năm 1954 Astler V.B và Coller F.A cải tiến Hệ thống phân loại Dukes chi tiết hơn [25]

ng 1 Phân loại của Dukes c i tiến (Astler – Coller)[25]

G a đoạn Tình trạng khối u

A Khối u còn giới hạn ở niêm mạc ruột

B1 Khối u xâm lấn tới lớp cơ nhưng chưa qua lớp thanh mạc,

chưa di căn hạch

B2 Khối u xâm lấn qua lớp thanh mạc, chưa di căn hạch

C1 Khối u giai đoạn B1, có di căn hạch

C2 Khối u giai đoạn B2, có di căn hạch

D Có di căn xa

Hệ thống phân chia giai đoạn phổ biến nhất là hệ thống TMN của hiệp hội ung thư Hoa ỳ năm 2010 (AJCC) dựa trên 3 yếu tố: T (tumor) – khối u, N (node) – hạch,

M (metastasis) - di căn xa

T - K ố u n uy n p á

Tx: Không thể đánh giá khối u nguyên phát

T0: Không có bằng chứng của khối u nguyên phát

Tis: Ung thư tại chỗ Tế bào ung thư chỉ được tìm thấy trong lớp niêm mạc và lớp hạ niêm mạc

T1: Khối u xâm nhập vào lớp dưới niêm mạc

T2: Khối u đã phát triển đến lớp cơ nằm phía dưới của lớp dưới niêm mạc

T3: Khối u đã phát triển xuyên qua lớp cơ vào trong lớp thanh mạc

T4: Khối u xâm lấn trực tiếp vào cơ quan khác hoặc cấu trúc kế cận và/hoặc thủng phúc mạc tạng

T4a: Khối u đã phát triển vào trong bề mặt của phúc mạc tạng

T4b: Khối u đã xâm lấn trực tiếp hoặc dính trực tiếp vào cơ quan kê cận

N - Hạch vùng

N2a: Di căn được tìm thấy trong 4-6 hạch vùng

N2b: Di căn được tìm thấy ≥ 7 hạch vùng

M - D căn xa

Mx: Không thể đánh giá được di căn xa

M0: hông có di căn xa M1: Di căn xa:

M1a: di căn đến 1 cơ quan hay 1 vùng M1b: di căn đến nhiều hơn 1 cơ quan hay 1 vùng hoặc di căn lan tràn phúc mạc

ng 2 Phân chia giai đoạn theo hệ thống TNM của AJCC [26]

Kết hợp các thông số T, N, M sẽ xác định được giai đoạn của bệnh t giai đoạn

I đến giai đoạn IV với mức độ tiến triển khối u và tiên lượng bệnh càng xấu hơn

1.1.4 Chẩn đoán mô b nh học un ƣ đại trực tràng

Theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2000 ung thư đại trực tràng gồm các loại sau [55]:

+ Ung thư biểu mô tuyến biệt hoá thấp: tổn thương là các tuyến không rõ ràng với các tế bào biểu mô kém biệt hoá

- Ung thư biểu mô tuyến nhày: các tế bào u sản xuất nhiều chất nhầy ra ngoài tế bào tạo thành các nốt hay các hồ chứa đầy chất nhầy

- Ung thư biểu mô tế bào nhẫn: các tế bào có dạng hình vòng nhẫn chứa nhiều chất nhầy, ít có khuynh hướng tạo thành tuyến hay ống

- Ung thư biểu mô tế bào nhỏ

- Ung thư biểu mô tế bào vảy

- Ung thư biểu mô tuyến vảy

- Ung thư biểu mô tuỷ

- Ung thư biểu mô không biệt hoá

Các loại u khác: carcinoide, ung thư biểu mô tuyến hỗn hợp, ung thư cơ trơn,

ung thư hạch, u lympho ác tính

1.1.5 Các chất chỉ đ ểm u ƣờng dùng

CEA (Carcinoembryonic antigen – k án n uy n un ƣ b ểu mô phôi): là

một nhóm glycoprotein được sản xuất ở tế bào ruột trong quá trình phát triển của thai nhi và ng ng sản xuất trước khi sinh, do đó, CEA thường chỉ có trong huyết thanh của người khỏe mạnh với nồng độ rất thấp CEA tăng trong các bệnh ung thư, đặc biệt là trong ung thư đại trực tràng [83] Giá trị CEA được coi là tăng khi trên 5 ng/ml Với mỗi bệnh nhân, giá trị CEA ban đầu được xác định làm nền để theo dõi diễn biến bệnh, sau phẫu thuật c t khối u đại trực tràng, giá trị này sẽ giảm xuống dần và trở về mức bình thường sau 4-6 tuần, nếu kéo dài dai dẳng trên 2 tháng có khả năng ung thư bị tái phát [28] Xét nghiệm CEA trong huyết thanh được sử dụng chủ yếu để theo dõi đáp ứng điều trị, phát hiện tái phát và tiên lượng bệnh ung thư đại trực tràng

Xét nghiệm CEA có thể tăng lên ở một số bệnh ung thư khác như ung thư biểu

mô dạ dày, ung thư tụy, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư tuyến giáp… cũng như một

số bệnh lành tính như trong bệnh phổi (viêm phổi, khí phế thũng), bệnh gan (viêm gan,

xơ gan), bệnh đường tiêu hóa (viêm loét dạ dày tá tràng, viêm loét đại tràng, polyp trực tràng), các bệnh vú lành tính gây nên hiện tượng dương tính giả [73] Ngoài ra, CEA huyết thanh cũng có thể tăng ở những người hút thuốc lá [45] Vì vậy xét nghiệm CEA không đủ độ tin cậy để chẩn đoán ung thư hay xét nghiệm sàng lọc phát hiện sớm ung thư [46]

CA 19 – 9 (Cancer Antigen 19-9 hay Carbohydrate Antigen 19-9): Giá trị

CA 19 -9 được sử dụng làm chất chỉ điểm ung thư bổ sung để theo dõi quá trình diến biến bệnh ở những người m c ung thư đại trực tràng không có tăng CEA [93] Ngoài

ra, chất chỉ điểm u này cũng được dùng để tiên lượng bệnh Với những bệnh nhân có tăng nồng độ CA 19 – 9 trước phẫu thuật có tỷ lệ sống sót sau 5 năm thấp hơn so với

ung thư của đường tiêu hóa như ung thư đại trực tràng, ung thư thực quản, ung thư biểu

mô tế bào gan cũng như một số bệnh không phải ung thư như viêm tụy, xơ gan, bệnh đường mật (t c nghẽn đường mật) [50, 82]

1.1.6 Đ ều trị ron un ƣ đại trực tràng

1.1.6.1 Điều trị phẫu thuật ung thư đại trực tràng

- Phẫu thuật là phương pháp điều trị chủ yếu UTĐTT bao gồm phẫu thuật triệt căn cho những ung thư mổ được, phẫu thuật tạm thời như làm hậu môn nhân tạo hoặc nối t t cho những ung thư giai đoạn muộn, để chống t c ruột, và trong một số trường hợp đặc biệt như ung thư tái phát tại chỗ, mổ c t tổ chức tái phát, ung thư có di căn đơn độc, mổ c t khối di căn Phẫu thuật với mục đích dự phòng ung thư, áp dụng cho những thương tổn tiền ung thư như polyp

- Nguyên t c chính trong phẫu thuật UTĐTT triệt căn là phẫu thuật rộng rãi đạt mục đích lấy bỏ triệt để khối ung thư, kể cả các khối di căn C t bỏ triệt để khối ung thư phẫu thuật phải đảm bảo c t đoạn đại tràng có u với khoảng cách an toàn trên, dưới

u 5cm và các tổ chức bị xâm lấn, di căn C t bỏ mạc treo chứa các mạch máu nuôi dưỡng đoạn ruột chứa u và các hệ thống, hạch bạch huyết tương ứng một cách rộng rãi Lập lại lưu thông tiêu hoá, giảm thiểu các hậu quả tâm sinh lý cho người bệnh

1.1.6.2 Xạ trị trong ung thư đại trực tràng

tỉ lệ bảo tồn cơ tròn trong ung thư trực tràng trung bình hoặc thấp Theo dõi lâu dài của

Tổ chức điều trị ung thư Châu Âu (EORTC) thấy rằng xạ trị trước mổ làm giảm tỉ lệ tái phát tại chỗ một cách có ý nghĩa [79]

- Xạ trị hậu phẫu được chỉ định cho các trường hợp khối u đã vượt qua thanh mạc và/hoặc di căn hạch trong ung thư trực tràng [79]

 Nguyên tắc xạ trị

- Trường chiếu xạ bao gồm: Khối u, với 2-5 cm rìa khối u, mặt trước xương cùng và hạch chậu trong

- Xạ trị nhiều trường chiếu: Có thể sử dụng 3-4 trường chiếu

- Đối với các trường hợp đã được phẫu thuật c t bỏ trực tràng qua đường tầng sinh môn (phẫu thuật Miles), trường chiếu phải bao gồm tầng sinh môn

bụng Liều xạ + 45-50 Gy trong 25-28 buổi, chiếu cho toàn khung chậu + Các trường hợp c t bỏ được, xạ trị hậu phẫu 45 Gy, nâng liều vào diện u 6-10

Gy Khối u nhỏ có thể xạ trị liều tối thiểu 45 Gy

- Các trường hợp không c t bỏ được: Xạ trị liều cao trên 54 Gy

- Hoá trị 5-FU đồng thời với xạ trị

1.1.6.3 Điều trị nội khoa ung thư đại trực tràng

 Điều trị hoá chất bổ trợ trong ung thư đại trực tràng

Hoá trị có vai trò trong điều trị bổ trợ UTĐTT giai đoạn II nhóm nguy cơ cao và

UT đã có di căn hạch cải thiện t 2-8% tỉ lệ sống thêm toàn bộ 5 năm tùy theo giai đoạn bệnh Một số phác đồ điều trị UTĐTT:

- P ác đồ 2LV5FU: cho tới nay phác đồ 2LV5FU được coi là một phác đồ chủ

yếu trong điều trị bổ trợ UTĐTT[53]

- Fluoropyrimidine uống

Capecitabine:

So với phác đồ 5-FU/LV (Mayo clinic), kết quả thời gian sống thêm 3 năm không bệnh và toàn bộ so sánh giữa 2 nhóm lần lượt là (64% so với 61%, p = 0,05); (81% so với 78%, p = 0,07) [107] Tuy nhiên tác dụng phụ của capecitabine nhẹ hơn so với 5-FU/LV, nhưng hội chứng tay chân của capecitabine nặng nề, thận trọng khi sử dụng capecitabine cho người già [53]

- P ác đồ có oxaliplatin

Thử nghiệm MOSAIC (FOLFOX 4), thử nghiệm NSABP C-07 (FLOX) đều cho thấy vai trò của oxaliplatin trong điều trị bổ trợ giúp cải thiện thời gian sống thêm không bệnh ở nhóm BN giai đoạn II, III đã phẫu thuật triệt căn [107]

Hiện nay người ta vẫn ưu tiên lựa chọn phác đồ FOLFOX hơn FLOX, do tính tiện lợi, dễ sử dụng, ít độc tính hơn

Phác đồ XELOX (CAPOX) gồm oxaliplatin và capecitabine được xem là một lựa chọn thay thế cho phác đồ FOLFOX, do dễ sử dụng nhƣng độc tính nặng nề hơn

 Vai trò của thuốc điều trị trúng đích trong ung thư đại trực tràng

- Bevaxizumab: là một kháng thể đơn dòng người g n vào thụ thể yếu tố phát

triển nội mô mạch máu (VEGF), qua đó nó ngăn chặn sự hình thành các mạch máu mới, do vậy bevacizumab ngăn cản sự phát triển của khối u Bevacizumab đã được chứng minh có giá trị khi thêm vào các phác đồ 5-FU, LV và irinotecan hoặc oxaliplatin trong UTĐTT giai đoạn muộn, cho kết quả cải thiện tỉ lệ đáp ứng cũng như thời gian sống thêm qua thử nghiệm NSABP C-08 [87]

- Li u p áp đ ều trị ức ch EGFR

Trong những năm gần đây với sự thành công trong nghiên cứu của chuyên ngành sinh học phân tử đối với bệnh lý ung thư đã mở ra những phương pháp điều trị mang lại nhiều hy vọng cho người bệnh ung thư nói chung và UTĐTT nói riêng Sự phát hiện ra EGFR và các con đường tín hiệu tế bào đã giúp cho các nhà khoa học làm sáng tỏ các cơ chế phát sinh và phát triển của tế bào ung thư Những thành tựu khoa học này đã thúc đẩy quá trình tìm ra các loại thuốc chống ung thư mới Có hai loại thuốc cetuximab (Erbitux) và panitumumab (Vectibix) được cơ quan quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ chấp nhận để điều trị cho người bệnh UTĐTT vào năm 2009 [101]

+ Cetuximab là một kháng thể đơn dòng có thành phần một phần ở người và

một phần ở chuột, nó g n vào thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR), qua đó ngăn chặn sự truyền thông tin vào trong tế bào cho sự sao chép của nhân tế bào, vì vậy tế bào không gián phân, và chết theo chương trình Cetuximab (Erbitux) được sử dụng lần đầu năm 2004 và được FDA chấp thuận 2009 [53] Cetuximab được chứng minh có hiệu quả trong điều trị UTĐTT giai đoạn di căn, có gen RAS wild-type [101]

+ Panitumumab là một kháng thể đơn dòng có nguồn gốc hoàn toàn t người,

đặc hiệu cho phần ngoài màng của thụ thể EGFR, được phê duyệt bởi cơ quan dược phẩm Châu âu (EMA) tháng 12 năm 2007, Cơ quan y tế Canada năm 2008 và FDA năm 2009, chỉ định cho UTĐTT giai đoạn tiến triển, di căn không có đột biến gen KRAS

Lợi ích của cetuximab hoặc panitumumab kết hợp với hoá trị giúp cải thiện tỉ lệ đáp ứng, thời gian sống thêm bệnh không tiến triển thời gian sống thêm toàn bộ Đặc

biệt đối với những bệnh nhân có gen KRAS wild type cho tỉ lệ đáp ứng cao hơn nhóm bệnh nhân có gen KRAS (17% so với 0%) [43]

Sự không đáp ứng với các thuốc ức chế EGFR của những người bệnh UTĐTT

có gen KRAS đột biến đã đặt ra cho thấy những vấn đề cần phải được nghiên cứu làm

làm bất hoạt các gen ức chế khối u (như APC, TP53, STK11(LKB1), PTEN…) gây ức

chế sự chết theo chương trình (apoptosis) và dẫn đến sự phát triển bất thường của tế bào bình thường Bên cạnh đó, sự hoạt hóa các con đường sinh ung thư, trong đó, con đường tín hiệu MAPK là một trong những con đường tín hiệu quan trọng nhất trong sự phát triển tế bào

EGFR là một protein tyrosin kinase có cấu trúc gồm 3 phần: phần ngoại bào có khả năng g n kết với các phối tử, vùng xuyên màng đặc hiệu và phần nội bào là protein kinase có khả năng tự phosphoryl hóa tyrosin của protein (hoạt tính tyrosin kinase) Yếu tố tăng trưởng biểu bì EGF có ái lực cao với thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì EGFR trên bề mặt tế bào sẽ g n với thụ thể này, làm kích hoạt phần nội bào của thụ thể

có hoạt tính tyrosin kinase Sự hoạt hóa thụ thể bằng các phổi tử đặc biệt này sẽ khởi động dòng thác tín hiệu là một chuỗi các phản ứng của con đường tín hiệu RAS/RAF/MAP và con đường PI3K/AKT/m-TOR, đóng vai trò quan trọng gây ra sự tăng sinh tế bào, tăng sinh mạch máu, di căn và ức chế sự chết theo chương trình (apoptosis) [37] Cetuximab và panituximab là những kháng thể đơn dòng kháng EGFR có tác dụng cạnh tranh với EGF làm phối tử này không g n được vào vùng ngoại bào của thụ thể, ức chế dòng tín hiệu của thụ thể vào trong tế bào, t đó sẽ ức chế quá trình tăng trưởng của tế bào

Hình 1 Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) và con đường tín hiệu MAPK

[66]

Con đường MAPK nằm ở hạ lưu thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì EGFR, hoạt động thông qua các protein trung gian truyền tín hiệu gồm EGFR, RAS, RAF và MEK

Khi các gen RAS hoặc RAF bị đột biến làm cho các protein được quy định bới các gen

này bị thay đổi cấu trúc, thúc đẩy sự tăng sinh quá mức của tế bào Do đó, các thuốc

kháng EGFR không còn tác dụng khi bệnh nhân xuất hiện những đột biến gen RAS, RAF

1.2.2 Đột bi n gen KRAS, NRAS, BRAF ron un ƣ đại trực tràng

 Đột biến gen KRAS, NRAS

Họ gen ung thư RAS ở người bao gồm KRAS, NRAS, HRAS mã hóa cho protein

RAS Các protein này có hoạt tính kinase, chức năng truyền tín hiệu nội bào xuôi dòng

t các thụ thể bề mặt đến các tín hiệu tiếp theo trong con đường MAPK Khi protein RAS g n với phân tử GTP, nó sẽ được hoạt hóa, truyền thông tin đến nhân tế bào làm

tế bào tăng sinh Quá trình truyền tín hiệu của protein RAS bị bất hoạt nhờ protein

GAPs (GTPase-activating proteins) có chức năng hoạt hóa GTPase, chuyển GTP thành

GDP Khi các gen KRAS và NRAS bị đột biến sẽ tạo ra các protein RAS biến đổi có

khả năng làm mất hoạt tính GTPase của GAPs, GTP g n với protein RAS bị biến đổi không bị thủy phân Do đó, các protein RAS tạo ra do gen đột biến giữ nguyên trạng thái hoạt hóa, kích hoạt con đường tín hiệu xuôi dòng với nó dù có sự hoạt hóa của thụ

thể yếu tố tăng trưởng biểu bì hay không Trong các đột biến gen RAS, đột biến gen KRAS phổ biến, chiếm 30-45% các trường hợp ung thư đại trực tràng [106] và đột biến NRAS xuất hiện khoảng 2-10% [61, 78, 89]

 Đột biến gen BRAF

Gen BRAF mã hóa cho protein BRAF có hoạt tính kinase, là một protein trung

gian với chức năng truyền tín hiệu xuôi dòng t sau protein RAS của con đường

MAP Đột biến gen BRAF làm tăng hoạt tính kinase t protein BRAF đến nhân tế

bào, kích hoạt sự tăng sinh tế bào dù không có những tín hiệu hoạt hóa t phía trước BRAF, do đó làm tăng khả năng kháng thuốc ức chế EGFR của tế bào ung thư [74, 75] Dạng đột biến thường gặp nhất là 1799T>A (p V600E) chuyển acid amin Valin thành acid amin Glycin

 Đặc điểm các gen KRAS, NRAS, BRAF:

- Gen KRAS: là gen mã hóa cho protein KRAS (ở người gồm 2 isoform là

KRAS4A và KRAS4B), nằm trên cánh ng n của nhiễm s c thể số 12, độ dài khoảng 46Kb, gồm 8 exon Trong UTĐTT, vùng dễ biến đổi là vị trí codon 12 - 13 - 61 và 146 (exon 2, 3 và 4)

- Gen NRAS: là gen mã hóa cho protein NRAS, nằm trên cánh ng n của nhiễm

s c thể số 1, độ dài khoảng 12Kb, gồm 9 exon Trong UTĐTT, vùng dễ biến đổi là vị trí codon 12 - 13 và 61(exon 2, 3)

- Gen BRAF: là gen mã hóa cho protein BRAF, nằm trên cánh dài của nhiễm s c

thể số 7, độ dài khoảng 208Kb, gồm 34 exon Trong UTĐTT, vùng dễ biến đổi là vị trí codon 600 (exon 15)

1.2.3 Tình hình nghiên cứu đột bi n gen KRAS, NRAS, BRAF ở Vi t Nam

Hiện nay, xét nghiệm đột biến gen KRAS và BRAF là những xét nghiệm thường

quy được thực hiện trong các phòng xét nghiệm sinh học phân tử tại nhiều bệnh viện trong cả nước Một số công trình nghiên cứu gần dây đã đưa ra các kết quả về đột biến hai gen này Năm 2013, nghiên cứu của Lê Văn Thiệu và cộng sự trên 79 bệnh nhân

ung thư đại trực tràng được phẫu thuật tại Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng xét nghiệm

đột biến gen KRAS bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp cho kết quả: tỷ lệ đột biến gen KRAS là 58,2%, phát hiện 2 dạng đột biến gen KRAS tại codon 12 là GGT thành

GAT (93,5%) và GGT thành GTT (6,5%), không có sự khác biệt về tỷ lệ đột biến gen

KRAS ở bệnh nhân nam và nữ [15] Năm 2017, Nguyễn Kiến Dụ và cộng sự nghiên cứu 145 bệnh nhân ung thư đại trực tràng xét nghiệm gen KRAS và BRAF bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp: tỷ lệ đột biến gen KRAS là 33,7% (44/145), tỷ lệ đột biến gen BRAF là 3,4% (5/145) và chiếm 4,9% (5/101) số bệnh nhân không đột biến gen KRAS, không phát hiện bệnh nhân nào đột biến đồng thời cả hai gen KRAS và BRAF [5] Đột biến gen NRAS đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới nhưng tại Việt Nam mới có tác giả Trịnh Lê Huy nghiên cứu về đột biến gen NRAS trên 39 bệnh nhân

UTĐT được điều trị tại khoa Ung bướu và Chăm sóc giảm nhẹ Bệnh viện Đại học Y

Hà Nội nhưng không phát hiện được trường hợp nào có đột biến NRAS [11]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đố ượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu gồm 73 bệnh nhân được chẩn đoán xác định bằng kết quả

mô bệnh học là ung thư đại trực tràng và được chỉ định xét nghiệm đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF

 Tiêu chuẩn lựa chọn

- Bệnh nhân đồng ý xét nghiệm cả 3 gen KRAS, NRAS, BRAF

- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

- Được chẩn đoán xác định là ung thư đại tràng hoặc trực tràng bằng xét nghiệm

mô bệnh học

- Có đầy đủ hồ sơ bệnh án lưu trữ

 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân bị ung thư t cơ quan khác di căn đến đại tràng hoặc trực tràng

- Bệnh nhân không làm đủ cả 3 xét nghiệm đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF

- Bệnh nhân không tự nguyện tham gia nghiên cứu

- hông có đầy đủ hồ sơ bệnh án lưu trữ

2.1.2 Địa đ ểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại Đơn vị Gen – Tế bào gốc, Trung tâm Y học hạt

nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu thực hiện t tháng 1 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017

2.2.1 Thi t k nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu mô tả c t ngang

2.2.2 Cỡ mẫu à p ươn p áp c ọn mẫu

- Cỡ mẫu: 73 bệnh nhân

- Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện: chọn tất cả các bệnh nhân được chẩn đoán xác định là ung thư đại trực tràng bằng kết quả mô bệnh học thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn tại bệnh viện Bạch Mai và được chỉ định xét nghiệm đột biến gen

2.2.3 Nội dung nghiên cứu

2.2.2.1 Một số đặc điểm lâm sàng – cận lâm sàng

Vị trí khối u chia theo 3 vị trí:

- Đại tràng phải: t manh tràng đến giữa đại tràng ngang

- Đại tràng trái: t giữa đại tràng ngang đến hết đại tràng sigma

- Trực tràng: t đại tràng sigma đến rìa ống hậu môn

c Xét nghiệm CEA

CEA bình thường: < 4,3 ng/ml CEA tăng: ≥ 4,3 ng/ml

d Xét nghiệm CA19-9

CA19-9 bình thường: < 27 U/ml

CA19-9 tăng: ≥ 27 U/ml

+ Biệt hóa cao: Trên 95% có cấu trúc tuyến

+ Biệt hóa v a: t 50% đến 95% có cấu trúc tuyến

+ Biệt hóa kém: dưới 50% có cấu trúc tuyến

+ Không biệt hóa: không thấy cấu trúc tuyến

- Ung thư biểu mô tuyến nhày

- Ung thư biểu mô tế bào nhẫn

- Ung thư biểu mô tế bào nhỏ

- Ung thư biểu mô tế bào vảy

- Ung thư biểu mô tuyến vảy

- Ung thư biểu mô tuỷ

- Ung thư biểu mô không biệt hoá

f Hình ảnh nội soi

Bệnh nhân được nội soi toàn bộ đại trực tràng bằng ống soi mềm, các tổn thương được ghi nhận về kích thước khối u và dạng tổn thương trên nội soi:

- ích thước khối u so với chu vi đại trực tràng: chia làm 04 loại:

+ ích thước khối u dưới 1/4 chu vi đại trực tràng

+ ích thước khối u t 1/4 đến dưới 1/2 chu vi đại trực tràng

+ ích thước khối u t 1/2 đến dưới 3/4 chu vi đại trực tràng

+ ích thước khối u t 3/4 chu vi đại trực tràng trở lên

- Dạng tổn thương khối u trên nội soi: gồm 6 loại theo phân loại Pari 2002 [78]: + Type 0: Tổn thương dạng ung thư dạng nhú lồi, phẳng;

+ Type 1: Tổn thương ung thư dạng sùi;

+ Type 2: Tổn thương ung thư dạng loét;

+ Type 3: Tổn thương ung thư dạng dạng loét và sùi kết hợp;

+ Type 4: Tổn thương ung thư dạng thâm nhiễm;

+ Type 5: Tổn thương ung thư dạng không thể phân loại được

g Giai đoạn bệnh

Giai đoạn bệnh dựa trên 3 yếu tố: T (tumor) – khối u, N (node) – hạch, M

(metastasis) - di căn xa được xác định bằng kết quả xét nghiệm mô bệnh học, siêu âm, chụp c t lớp vi tính, xạ hình xương, SPECT, PET/CT

h Di căn

Di căn xa đến các tạng khác xác định dựa vào phẫu thuật, siêu âm ổ bụng, chụp

c t lớp vi tính, chụp PET/CT Di căn tới các tạng gan, phổi, buồng trứng, phúc mạc, bàng quang, niệu quản, xương

2.2.2.2 Xét nghiệm đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF

a Phương pháp thu thập mẫu

Mẫu mô để phân tích được lấy t tổ chức khối u trong phẫu thuật hoặc qua sinh thiết bằng nội soi, được bảo quản bằng cố định formalin – vùi paraffin (FFPE) cho đến khi được đưa ra phân tích

b Quy trình xét nghiệm đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF

Quy trình thực hiện của kỹ thuật gồm 4 giai đoạn chính:

- Tách DNA t mô cố định formalin – vùi paraffin (FFPE)

- Khuếch đại đoạn gen quan tâm bằng phản ứng PCR theo kit KRAS XL StripAssay®, NRAS XL StripAssay® và BRAF600/601 StripAssay® – ViennaLab

- Lai sản phẩm khuếch đại với đầu dò đặc hiệu được phân bố trên Test strip theo kit KRAS XL StripAssay®, NRAS XL StripAssay® và BRAF600/601 StripAssay® – ViennaLab

- Phân tích kết quả bằng cách so sánh cách vạch trên tetstrip với thang chuẩn

Tách DNA

1 Thu mẫu: Dùng dao c t phần mô chứa nhiều tế bào u, chuyển vào ống ly tâm 1,7 ml

2 Loại paraffin: Thêm 200 μl Deparaffinization Solution, vortex trong 10 giây

và ủ 56oC trong 3 phút (có thể sử dụng xylen thay thế deparaffinization solution)

3 Ly giải tế bào: Thêm 180 μl dung dịch đệm phân tách mô, bổ sung 20 μl proteinase K, vortex trong 10 giây Ủ 56oC trong 1 giờ hoặc đến khi tế bào bị ly giải hoàn toàn, ủ tiếp 90oC trong 1 giờ

4 Cố định DNA lên cột và loại tạp chất: Thêm 200 μl dung dịch đệm phá màng tế bào, bổ sung 200 μl ethanol 96–100% và trộn đều bằng vortex Chuyển toàn

bộ dịch ly giải tế bào lên cột thu DNA, ly tâm 6.000 ×g trong 1 phút, chuyển cột lên ống 2 ml sạch khác

5 Rửa cột: Thêm 500 μl đệm rửa, đậy n p và ly tâm 6.000 ×g trong 1 phút, chuyển cột lên ống 2 ml sạch khác Lặp lại bước rửa Ly tâm 20.000 ×g trong 3 phút để làm khô màng của cột

6 Rửa giải cột và thu DNA: Chuyển cột lên ống ly tâm 1,7 ml sạch, mở n p cẩn thận và thêm 20–100 μl đệm thu DNA vào chính giữa màng, ủ 1-5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm 20.000 ×g trong 1 phút

7 Xác định hàm lượng DNA: Định lượng DNA theo phương pháp huỳnh quang Nồng độ DNA sử dụng cho phản ứng PCR là 1–10 μg/ml

Khu c đại gen bằng PCR: sử dụng theo kit KRAS XL StripAssay®, NRAS

XL StripAssay® và BRAF600/601 StripAssay® – ViennaLab

1 Chuẩn bị enzyme Taq DNA Polymerase: Pha Taq DNA Polymerase trong Taq Dilution Buffer theo tỷ lệ thể tích tương ứng là 1:25 (nồng độ sử dụng 0.25 U/ul)

2 Chuẩn bị phản ứng: Chuẩn bị ống PCR cho mỗi phản ứng, đặt lên đá, lấy hoá chất cho mỗi phản ứng khuếch đại:

15 μl Amplification Mix

5 μl Taq DNA polymerase v a chuẩn bị

5 μl DNA khuôn tổng hợp

3 Chuyển ống vào máy PCR và chạy theo chế độ sau:

Trước chu kỳ đầu tiên: 37oC – 10 phút

94oC – 2 phút Chu kỳ nhiệt (35 chu kỳ): 94oC – 60 giây

70oC – 50 giây

58oC – 50 giây

60oC – 60 giây Sau chu kỳ cuối cùng: 60oC – 3 phút Giữ trên đá hoặc lưu ở 2–8oC

4 Điện di kiểm tra khả năng khuếch đại của phản ứng trên gel agarose 3%

Lai vớ đầu dò đặc hi u (theo kit KRAS XL StripAssay®, NRAS XL

StripAssay® và BRAF600/601 StripAssay® – ViennaLab)

1 Biến tính sản phẩm PCR: Mix 10 μl DNAT với 10 μl sản phẩm PCR trong giếng trên Typing Tray, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng

2 Lai với đầu dò trên Teststrip: Thêm 1ml Hybridization Bufer, đưa Teststrip vào giếng, ủ 30 phút ở 45oC, loại dịch Rửa qua Wash Solution A, ủ l c cùng 1ml Wash Solution A ở 45oC trong 15 phút, loại dịch (x2 lần)

3 Phản ứng enzyme: Thêm 1ml Conjugate Solution, ủ l c ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, loại dịch Rửa qua Wash Solution B, ủ l c cùng 1ml Wash Solution B ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, loại dịch (x2 lần)

4 Phát triển màu: Thêm 1ml Color Deverloper, ủ l c 15 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối Rửa Test strip vài lần bằng nước sạch, để khô trong bóng tối

Phân tích k t quả

Sau quá trình lai, các test strip được so sánh với thang chuẩn để đánh giá kết quả Vạch tương ứng trên thang chuẩn cho phép xác định mẫu phân tích có đột biến hay không, nếu có thì ở những vị trí nào

Việc nhận định kết quả cũng có thể được xác định thông qua phần mềm StripAssay Evaluator® được cung cấp bởi ViennaLab

ng 3 Phân tích kết qu đột biến gen KRAS [100]

Độ b n en KRAS

( ạc 1 – 29)

Đố c ứn âm ( ạc 30 – 33)

Âm tính hoặc dương

Âm tính hoặc dương

xét nghiệm lỗi

ng 5 Phân tích kết qu đột biến gen BRAF [99]

Độ b n en BRAF

( ạc 1 – 9)

Đố c ứn âm ( ạc 10)

Đố c ứn dươn

1 hoặc nhiều vạch dương tính Âm tính Dương tính Có đột biến gen

tương ứng

Âm tính hoặc dương tính Dương tính Dương tính Độ nhạy giảm

xét nghiệm lỗi

2.2.4 P ươn p áp u ập số li u

Thông tin chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu, đặc điểm khối u, tình trạng đột biến được thu thập theo mẫu thống nhất bằng phỏng vấn trực tiếp bệnh nhân/người nhà bệnh nhân và khai thác hồ sơ bệnh án lưu trữ

2.2.5 Xử lý số li u

- Số liệu được nhập trên phần mềm Epi data 3.1

- Dữ liệu được phân tích trên phần mềm STATA 12.0 với các test thống kê y học

Các Test thống kê được sử dụng trong nghiên cứu:

- Phép kiểm định Chi bình phương (Chi-squared test): để khảo sát mối liên quan

giữa các yếu tố liên quan với đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF

- Phép kiểm định chính xác Fisher (Fisher’s exact test): để khảo sát các yếu tố liên

quan với đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF

- Các yếu tố được xem như có mối liên quan với đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF

có ý nghĩa khi giá trị p <0,05

2.2.6 Đạo đức trong nghiên cứu

- Nghiên cứu được tiến hành khi có sự chấp nhận nghiên cứu của lãnh đạo Trung tâm y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai

- Nghiên cứu không làm ảnh hưởng tới uy tín của bệnh viện hay nhân viên y tế, không gây khó khăn cho bệnh nhân, tất cả các thông tin chỉ phục vụ mục đích nghiên cứu

- Số liệu thu thập một cách khách quan, trung thực, kết quả đảm bảo tính khoa học, tin cậy và chính xác

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tổng số 73 bệnh nhân ung thư đại trực tràng điều trị tại Trung tâm Y học hạt

nhân và Ung bướu và được thực hiện xét nghiệm đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF tại

đơn vị Gen – Tế bào gốc t tháng 01 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017 đủ tiêu chuẩn chọn mẫu

NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

3.1.1 Đặc đ ểm chung của đố ượng nghiên cứu

ng 6 Đặc điểm chung của bệnh nhân

3.1.2 Vị trí khối u nguyên phát

Hình 2 Vị trí khối u đại trực tràng nguyên phát

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy khối u tại đại tràng chiếm tỷ lệ cao hơn khối

u tại trực tràng: ung thư đại tràng là 69,9% (51/73), ung thư trực tràng là 30,1% (22/73)

3.1.3 Lý do vào vi n

Hình 3 Lý do vào viện của bệnh nhân

Đau bụng là lý do vào viện phổ biến nhất với 64,4% (47/73), sau đó là triệu chứng về tiêu hóa: đi ngoài phân máu (43,8%) và rối loạn đại tiện (42,5%)

Đạ ràn

p ả 31,5%

Đạ ràn trái 38,4%

Trực ràn 30,1%

Đau bụn Đ n oà p ân máu Rố loạn đạ n Tr u c ứn oàn

thân

Đạ ràn Trực ràn

Đau bụng là triệu chứng hay gặp nhất của ung thư đại tràng (74,5%), trong khi

đi ngoài phân máu là triệu chứng hay gặp nhất của ung thư trực tràng (81,8%)

3.1.4 Đặc đ ểm cận lâm sàng

ng 7 Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh nhân

Đặc đ ểm b nh nhân

Đại tràng phải

n (%)

Đại tràng trái

n (%)

Trực tràng

tuyến nhày 4 (17,4%) 2 (7,1%) 2 (9,1%) 8 (10,9%) Ung thư biểu mô