NGHIÊN cứu TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUS VIÊM GAN c (HCV) ở BỆNH NHÂN đến KHÁM và điều TRỊ tại BỆNH VIỆN BNĐTƯ từ 62012 đến 62016

Viêm gan do virus viêm gan C là một trong nhữngbệnh nguy hiểm và là một vấn đề đang được quan tâm đối với sức khỏe cộngđồng bởi số lượng người nhiễm bệnh, cũng như các biến chứng nguy hi

HOÀNG QUỲNH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUS VIÊM GAN C (HCV) Ở BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM

VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN BNĐTƯ

TỪ 6/2012 ĐẾN 6/2016

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI – 2015

HOÀNG QUỲNH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUS

VIÊM GAN C (HCV) Ở BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM

VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN BNĐTƯ

TỪ 6/2012 ĐẾN 6/2016

Chuyên ngành : Vi sinh

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Nguyễn Vũ Trung

HÀ NỘI – 2015

ADN Acid deoxyribonucleic

ARN Acid ribonucleic

BVBNĐTW Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

ELISA Enzyme -Linked Immunosorbent Assay

(Xét nghiệm miễn dịch gắn enzyme)

HBV Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)

HCV Hepatitis C virus (Virus viêm gan C)

HIV Human Immunodeficiency Virus

(Virus gây suy giảm miễn dịch ở người)

LiPA Line Probe Assay (Thử nghiệm line đầu dò)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) QHTD Quan hệ tình dục

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng chuỗi trùng hợp sao chép ngược)

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình nhiễm viêm gan C 3

1.1.1 Tình hình nhiễm viêm gan C trên thế giới 3

1.1.2.Tình hình nhiễm viêm gan C ở Việt Nam 4

1.2 Đặc điểm của virus gây bệnh viêm gan c 5

1.2.1 Đặc điểm sinh học của HCV 5

1.2.2 Cấu trúc bộ gen của HCV 6

1.2.3 Cơ chế gây bệnh 7

1.3 Triệu chứng lâm sàng 9

1.3.1 Giai đoạn cấp tính 9

1.3.2 Giai đoạn mãn tính 9

1.4 Chẩn đoán 10

1.4.1 Phương pháp gián tiếp tìm kháng thể anti-HCV 10

1.4.2 Phương pháp trực tiếp tìm HCV RNA 11

1.4.3 Phương pháp định lượng RNA- HCV trong huyết thanh 11

1.4.4 Các phương pháp xác định kiểu gen 14

1.5 Đường lây truyền, các biện pháp phòng và điều trị bệnh viêm gan c 16

1.5.1 Đường lây bệnh 16

1.5.2 Các biện pháp phòng bệnh 16

1.5.3 Điều trị 17

1.6 Tình hình nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm, tải lượng virus và genotype của HCV trên thế giới và ở Việt Nam 18

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Vật liệu nghiên cứu 20

2.2.1 Sinh phẩm, hóa chất 20

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 21

2.3 Thiết kế nghiên cứu 22

2.4 Kỹ thuật nghiên cứu 23

2.4.1 Kỹ thuật thu thập số liệu 24

2.4.2 Kỹ thuật lấy mẫu xét nghiệm 24

2.4.3.Kỹ thuật xét nghiệm 24

2.5 Các biến số nghiên cứu 31

2.6 Quản lý và phân tích số liệu 33

2.7 Địa điểm nghiên cứu và thời gian nghiên cứu 33

2.8 Đạo đức nghiên cứu 33

Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 34

3.1 Tỷ lệ nhiễm HCV 34

3.2 Tải lượng virus 37

3.3 Phân bố genotype của HCV của các đối tượng nghiên cứu 40

Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 44

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 45

DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm HCV trong số các bệnh nhân vào viện 34

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm HCV trong số các bệnh nhân viêm gan 34

Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm HCV theo tuổi 34

Bảng 3.4 Tỷ lệ nhiễm HCV theo giới 35

Bảng 3.5 Tỷ lệ nhiễm HCV theo nghề nghiệp 35

Bảng 3.6 Tỷ lệ nhiễm HCV theo tiền sử phơi nhiễm 36

Bảng 3.7 Tỷ lệ đồng nhiễm HCV và HIV 36

Bảng 3.8 Tỷ lệ đồng nhiễm HCV và HBV 36

Bảng 3.9 Tải lượng virus theo nghề ngiệp bệnh nhân 37

Bảng 3.10 Tải lượng virus theo giới 38

Bảng 3.11 Tải lượng virus theo tuổi 38

Bảng 3.12 Tải lượng virus theo tiền sử phơi nhiễm 39

Bảng 3.13 Phân bố genotype của HCV theo tuổi 40

Bảng 3.14 Phân bố genotype của HCV theo giới 40

Bảng 3.15 Phân bố genotype của HCV theo nghề nghiệp 41

Bảng 3.16 Phân bố genotype của HCV theo tiền sử phơi nhiễm 42

Bảng 3.17 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và tải lượng virus 43

Hình 1.1 Phân bố tỷ lệ nhiễm HCV trên thế giới 4

Hình 1.2 Virus viêm gan C 5

Hình 1.3 Cấu trúc genome virus 7

Hình 1.4 Chu kỳ sống của HCV 8

Hình 1.5 Sơ đồ tiến triển bệnh nhân nhiễm HCV 10

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan virus là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm Đây là một tháchthức với y tế toàn cầu Bệnh gây tử vong cho 1,4 triệu người mỗi năm với 500triệu người trên thế giới đang sống với căn bệnh này [1] Bệnh viêm gan virus

do năm loại virus viêm gan gây nên gồm A, B, C, D, E Nhiễm virus viêmgan A và E chỉ gây ra bệnh lý cấp tính và thường tự giới hạn, ít để lại hậu quảnghiêm trọng Ngược lại, viêm gan virus B, C và D có thể dẫn đến nhữngnhiễm trùng mãn tính với nguy cơ tiến triển thành xơ gan, ung thư gan và tửvong Bệnh viêm gan C gây ra bởi HCV (Hepatitis C virus), được xác địnhlần đầu tiên vào năm 1989 Viêm gan do virus viêm gan C là một trong nhữngbệnh nguy hiểm và là một vấn đề đang được quan tâm đối với sức khỏe cộngđồng bởi số lượng người nhiễm bệnh, cũng như các biến chứng nguy hiểmđến sức khỏe (50% - 80% chuyển qua mạn tính, 20%- 25% bệnh nhân mạntính diễn tiến qua xơ gan và ung thư gan [2], [3], [4] Theo Tổ chức Y tế Thếgiới (WHO) năm 2014, trên thế giới có hơn 185 triệu người nhiễm HCV với350.000 người chết mỗi năm [5] Ở Việt Nam, khoảng 5 - 10% dân số nhiễmHCV [6] Ðể xác định nhiễm HCV, ngoài xét nghiệm phát hiện kháng thể(anti HCV) người ta còn sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiệnRNA của HCV trong máu của bệnh nhân Mặc dù việc điều trị HCV rất tốnkém nhưng với tiến bộ của y học, hiện nay có một số thuốc điều trị khá hiệuquả Tuy nhiên, để có thể chỉ định điều trị cũng như theo dõi quá trình điềutrị, người ta phải xác định số lượng virus trong máu (tải lượng virus) cũngnhư xác định kiểu gen (genotype) của HCV

Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương là cơ sở đầu ngành về chẩnđoán, điều trị các bệnh truyền nhiễm nói chung, đặc biệt là các bệnh viêmgan, trong đó có viêm gan C Hàng năm, tại bệnh viện có khoảng 10.000 lượt

người đến khám và điều trị đến từ các tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tâynguyên Trong số đó, có những bệnh nhân bị nhiễm HCV Nhưng chưa cómột nghiên cứu nào đánh giá tỷ lệ nhiễm HCV trong số các bệnh nhân đếnkhám và điều trị tại Bệnh viện, cũng như xác định tải lượng virus, phân bốgenotype của các chủng HCV Vì vậy, để góp phần vào việc chẩn đoán, điều

trị viêm gan do HCV, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tình hình

nhiễm virus viêm gan C (HCV) ở bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện BNĐTƯ từ 6/2012 đến 6/2016” với 2 mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm HCV ở bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ tháng 6/2012 đến tháng 6/2016.

2 Mô tả đặc điểm Genotype và tải lượng của HCV trên đối tượng nghiên cứu.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình nhiễm viêm gan C

1.1.1 Tình hình nhiễm viêm gan C trên thế giới

Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới WHO, trung bình 3% dân sốthế giới nhiễm HCV, tương đương với khoảng gần 200 triệu người với sốnhiễm mới 3- 4 triệu người mỗi năm [5], [7] Trong đó, Đông Nam Á cókhoảng 32,3 triệu người bị nhiễm, chiếm 2.15% dân số khu vực này [8] Con

số này cũng đã gia tăng trong những năm gần đây Virus viêm gan C đượcxem như là kẻ giết người thầm lặng vì bệnh nhân khi mắc phải virus này cóthể không có các triệu chứng gì trong khoảng hơn 10 năm trước khi phát triểnthành viêm gan mãn tính và ung thư gan

Tỷ lệ nhiễm HCV ở các khu vực trên thế giới có khác nhau Trong đócác nước châu Phi và châu Á có tỷ lệ nhiễm cao nhất, có khu vực lên tới

>10% dân số (hình1.1) Theo kết quả điều tra về y tế và dinh dưỡng quốc giacủa Mỹ, từ năm 1988 đến năm 1994 cho thấy số lượng nhiễm HCV là 3,9triệu người Trong đó, 2,7 triệu người Mỹ mắc HCV mạn tính Tuy nhiên đa

số người bệnh có HCV dương tính có độ tuổi dưới 50 [9] Virus viêm gan Cđược chia thành 6 kiểu gen (genotype) ký hiệu bằng số từ 1 đến 6 và chia tiếp

ra các kiểu gen phụ ký hiệu bằng chữ a,b,c,…[10] Trong các genotype củaHCV, genotype 1 chiếm tỷ lệ cao nhất trên thế giới Trong đó, 1a phân bố toànthế giới, 1b phân bố nhiều ở Châu Âu và Bắc Mỹ, genotype 2 phân bố ở ĐịaTrung Hải và Trung Đông Genotype 3 thường thấy ở Pakistan, Úc, Scotland.Genotype 4 ở Trung Đông và Châu Phi cũng như South Africa Genotype 5 ởNam Phi và genotype 6 tại Hồng Kông và Việt Nam [11], [12], [13] Tổng chiphí y tế dành cho chẩn đoán và điều trị cũng như phòng viêm gan c dự đoán

tăng từ 30 tỷ USD vào năm 2009 lên đến hơn 85 tỷ USD vào năm 2024 [14].Nếu không điều trị, viêm gan C diễn biến thành biến chứng xơ gan, ung thưgan và có thể dẫn đến tử vong Khoảng 60-70% số trường hợp sẽ tiếp tục tiếntriển thành bệnh gan mạn tính Tỉ lệ nhiễm HCV dẫn đến xơ gan là 5-20% sau20-30 năm Trong đó có khoảng 1- 5 % sẽ tử vong vì hậu quả của nhữngnhiễm trùng mạn tính như xơ gan hoặc ung thư gan [15]

Hình 1.1 Phân bố tỷ lệ nhiễm HCV trên thế giới

(Nguồn: www: WHO, 2008)

1.1.2.Tình hình nhiễm viêm gan C ở Việt Nam

Ở Việt Nam hiện nay, theo số liệu của WHO có khoảng 5 - 10% dân sốnhiễm HCV Năm 2003, tại Hải Phòng tỷ lệ nhiễm HCV ở dân cư nội thành là1,7 %; 0,88% ở nông thôn và ở vùng ven biển là 0,87% [16] Ở Thanh Hóa là0,38% [17] Ở Hà Nội, tỷ lệ nhiễm HCV là 0,4% vào năm 1995 [18] Còn ởcác tỉnh phía nam, tỷ lệ nhiễm HCV tại thành phố Hồ Chí Minh là 2,53%, tạitỉnh An Giang là 4,1% và tại Cà Mau là 2,15% [19] Đối với các bệnh nhân bị

viêm gan, tỷ lệ có HCV trong máu là khoảng 11%, còn ở các bệnh nhân xơgan là 12,5% và ung thư gan là 8% [20].

1.2 Đặc điểm của virus gây bệnh viêm gan c

1.2.1 Đặc điểm sinh học của HCV

HCV là virus thuộc họ Flaviviridae Đây là một loại virus có vật liệu di

truyền là RNA, đường kính khoảng 55-65 nm Trọng lượng phân tử khoảng4.106 daltons Bộ gen (genome) của virus là một sợi đơn RNA dương, nằmbên trong phần nucleocapsid 30-35nm có cấu trúc đối xứng 20 mặt hình đadiện Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các protein E1 và E2 tạo thành cácphức hợp dimer (Hình1.2)

Hình 1.2.Virus viêm gan C: mô hình cấu trúc

Virus viêm gan C chỉ gây bệnh cho người và gây bệnh thực nghiệm chotinh tinh [21] Chưa có một nghiên cứu nào có thể xác định cấu trúc chính xáccủa virus Cho đến nay, các nhà khoa học chỉ thiết lập nên một mô hình mangtính chất mô phỏng cấu trúc của virus này Nguyên nhân của việc này là do HCVkhông thể gây nhiễm nhân tạo trên các dòng tế bào hiện có trên các phòng thínghiệm trên thế giới (không phân lập được virus mà chỉ tách được vật liệu di

truyền (acid nhân) trong huyết tương người bị nhiễm HCV RNA) Đây chính làmột trong những trở ngại lớn trong việc tìm hiểu cặn kẽ về virus này.

Mật độ HCV trong huyết thanh rất thay đổi, từ 1,03đến 1,72g/ml Sở dĩ

có sự thay đổi này là do các virion lưu hành trong máu dưới nhiều dạng khácnhau: hoặc là ở dạng tự do có tính lây nhiễm rất cao nhưng chỉ hiện diên ởmật độ tương đối thấp (khoảng 1,03 g/ml), hoặc là ở dạng kết hợp với các đạiphân tử đặc biệt là các lipoprotein hoặc hiện diện trong các phức hợp miễndịch nhưng mật độ lại cao (khoảng 1,10 g/ml) Một điểm quan trọng nữa làvirus này có khả năng biến thể nhanh và tạo thành rất nhiều type và sub-typekháng thuốc Chính vì khả năng biến thể quá nhanh mà cho đến nay vẫn chưa

có một loại vaccine nào có hiệu quả đối với HCV

1.2.2 Cấu trúc bộ gen của HCV

Bộ gen của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là ARN sợi đơndương, kích thước là 9,6 kb mã hóa cho quá trình tổng hợp một polyproteintiền chất khoảng 3011 - 3033 acid amin Sau đó polyprotein này sẽ được cắtthành các protein cấu trúc và không cấu trúc [22], [23] Bộ gen của HCVđược chia làm 2 vùng

 Vùng cấu trúc ở đầu 5’không mã hoá (5’UTR-untranslated region hay5’NC=noncodingregion) gồm 341 - 344 nucleotid [2], [24], [25] Đây là vùngtương đối ít bị biến đổi nhất giữa các phân týp (subtype) khác nhau Do đó,người ta sử dụng vùng này để phát hiện RNA của virus HCV bằng kỹ thuậtPCR Vùng này gồm các gen C, E1,E2, P7 là các gen mã hóa cho các proteincấu trúc của virus Gen C mã hóa cho P19, chúng được gắn với ARN hình thànhnên nucleocapsid (lõi) Gen E1 và E2 mã hóa cho glycoprotein gp 33 và gp 72

để tạo nên vỏ của virus Gen P7 chưa rõ chức năng [22], [26], [27]

 Vùng không cấu trúc (none structural region) nằm ở đầu 3’ không sao

mã (3’UTR-untranslated region: 3’ UTR) gồm các gen: NS2, NS3, NS4, NS5

là các gen mã hóa cho các protein chức năng: protease, helicase,

RNA-polymerase phụ thuộc ARN và các peptid tham gia vào quá trình sao chépvirus và cắt đoạn polyprotein [22], [26], [27], [28] Trước đây kiểu gen củaHCV thường được khảo sát trên vùng 5’- UTR (hay 5’ NC) bằng nhiềuphương pháp khác nhau nhưng vào năm 2007, Murphy cảnh báo xác địnhkiểu gen HCV trên vùng 5’- UTR có thể dẫn đến sự xếp nhầm kiểu gen 6 vàokiểu gen 1 và đề nghị nên khảo sát kiểu gen HCV dựa trên vùng core hoặcvùng NS5B của virus [29].

Khuyến cáo chính thức của Hiệp hội Châu Á Thái Bình Dương vềnghiên cứu bênh gan (APASL) năm 2012 cũng khuyến khích sử dụng mồicho gen đích trên vùng 5’- UTR và core để phân biệt một số dưới kiểu gencủa kiểu gen 6, thường gặp ở Đông Nam Á với kiểu gen 1 hoặc 1b [30] Một

số công trình trên thế giới cũng đã khảo sát kiểu gen HCV trên vùng NS5B[31], [32]

Hình 1.3 Cấu trúc genome virus

1.2.3 Cơ chế gây bệnh

Đầu tiên, HCV gắn vào một receptor (thụ thể) chưa được xác định trên bềmặt tế bào gan nhờ hai glycoprotein bề mặt của nó là E1 và E2 HCV xâm nhậpvào bên trong tế bào gan sau quá trình hòa màng (membrane fusion) RNAcủaHCV được dịch mã thành protein nhờ hệ thống dịch mã của tế bào chủ Protein

tiền thể tạo ra sẽ được phân cắt bởi enzyme tín hiệu (signalase) để tạo ra cácprotein cấu trúc (C, E1, E2) và các protein không cấu trúc (NS1- NS5).

Sau khi HCV tạo ra reverse transcriptase của nó thì enzyme này bắt đầuphiên mã ngược để tạo ra mạch RNA sợi (-) bổ sung với sợi (+) đã có Chínhsợi RNA (-) này là khuôn để tạo ra RNA genome của HCV ((+) ssRNA).(Hình1.3 ) Sau đó, capsomer được tạo ra từ các protein thành phần như C, E1,E2 sẽ kết hợp với RNA genome của HCV ((+)ssRNA) để tạo thành dạngnucleocapsid Nucleocapsid này tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát

ra ngoài, trở thànhdạng virus hoàn chỉnh và đi xâm nhiễm tế bào khác

Hình 1.4 Chu kỳ sống của HCV

1.3.Triệu chứng lâm sàng

1.3.1 Giai đoạn cấp tính

Bệnh nhân nhiễm HCV ở giai đoạn cấp tính thường không có biểu hiệnbệnh lý hoặc chỉ có những biểu hiện nhẹ (rất khó nhận biết trên lâm sàng).Khoảng 60-70% bệnh nhân nhiễm không biểu hiện triệu chứng, 20-30% cóthể có biểu hiện vàng da, 10% các bệnh nhân thể hiện một số triệu chứngkhông đặc hiệu như: mệt mỏi, đau bụng…

Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân ở giai đoạn nhiễm HCV cấp tínhtương tự như các bệnh nhân nhiễm virus gây bệnh khác ở gan Do vậy, việcxét nghiệm các bệnh nhân này bằng các kỹ thuật miễn dịch là điều cần thiết

để xác định bệnh nhân nhiễm loại virus viêm gan nào Tuy nhiên, các kỹ thuậtmiễn dịch này chỉ có kết quả tốt (80%) sau 15 tuần kể từ khi có những biểuhiện bệnh lý Tỉ lệ trên tăng dần theo thời gian và tối đa là sau 9 tháng hầunhư 100% các bệnh nhân nhiễm HCV đều có thể phát hiện virus bằng kỹthuật miễn dịch [33]

Tuy nhiên, xét nghiệm này dương tính chỉ có tính chất gợi ý về tìnhtrạng nhiễm HCV, không cho kết luận mới nhiễm hay đã nhiễm từ lâu vàkhông thể kết luận chắc chắn là không còn mang HCV

1.3.2 Giai đoạn mãn tính

Sau giai đoạn nhiễm cấp tính, khoảng 15- 45% bệnh nhân sẽ tự đào thảiđược tất cả các virus HCV trong vòng 6 tháng và cơ thể trở lại bình thườngnhư khi chưa nhiễm virus Tuy nhiên, khoảng 55- 85% các bệnh nhân nhiễmHCV sẽ chuyển sang giai đoạn mãn tính [34]

Trong giai đoạn mãn tính, bệnh nhân thường không có bất kỳ một biểuhiện bệnh lý nào Giai đoạn này có thể kéo dài từ 20 - 30 năm hoặc có thể kéodài hơn trước khi bệnh nhân chuyển thành ung thư gan Tỉ lệ nhiễm HCVchuyển thành xơ gan 15 - 20% sau 20 năm, tỉ lệ càng tăng nếu thời giannhiễm càng lâu, 71% bệnh nhân xơ gan nếu nhiễm hơn 60 năm Trong nhóm

bệnh nhân xơ gan do HCV, cứ mỗi năm 1,4 - 3,3% chuyển sang ung thư gan

1.4.1 Phương pháp gián tiếp tìm kháng thể anti-HCV

Anti-HCV: Có thể tìm thấy ở 70% trường hợp khi bắt đầu có triệu

chứng và khoảng 90% trong vòng 3 tháng sau Tuy nhiên, nhiều người bịviêm gan C nhưng không có triệu chứng Anti - HCV không cho biết bệnhnhân đang nhiễm HCV cấp tính, đã lành bệnh (đào thải hết virus) hay chuyển

sang giai đoạn mãn tính Tìm kháng thể anti - HCV có thể sử dụng các kỹthuật như miễn dịch điện hoá phát quang hoặc kỹ thuật miễn dịch ELISA.

1.4.2 Phương pháp trực tiếp tìm HCV RNA bằng kỹ thuật RT- PCR

HCV RNA: phát hiện trực tiếp virus trong máu, một bằng chứng của

nhiễm HCV và chứng tỏ virus đang tăng sinh Để phát hiện HCV bằng kỹthuật PCR thì cần chuyển RNA thành cDNA nhờ các enzyme phiên mã ngược

RT (Reverse Transcriptase) Sau đó dùng một đoạn DNA đặc hiệu làm mồi đểxác định DNA đích và khuyếch đại đoạn DNA đích lên nhiều lần Có thể pháthiện HCV-RNA trong vòng 2 đến 3 tuần sau khi nhiễm virus [15] Ưu điểmcủa phương pháp RT- PCR có độ nhạy cao, trong điều kiện tối ưu chỉ cần có

100 bản sao/1ml huyết thanh có thể phát hiện được bằng phương pháp này

Kỹ thuật này tương đối phức tạp, đắt tiền, chỉ thực hiện được trong phòng thínghiệm tiêu chuẩn [37], [38], [39]

1.4.3 Phương pháp định lượng RNA-HCV trong huyết thanh

1.4.3.1 Kỹ thuật Real-Time PCR

Real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, nhưng phương pháp này cóthể định lượng được hàm lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất nhuộmphát huỳnh quang được gắn vào DNA mạch kép hoặc dùng mẫu dò DNAoligonucleotid được biến đổi để phát huỳnh quang khi lai với DNA bổ trợ saukhi nhân bản Các tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ được các đầu dò của máyluân nhiệt Real time thu nhận và xử lý Khi cường độ tín hiệu huỳnh quangcủa mẫu vượt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng thì mẫuđược xem là (+) và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trịchu kỳ ngưỡng – Ct) để so sánh với một đường cong (Standard curve) đượcxây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ mà suy

ra số lượng DNA mẫu đưa vào phản ứng

Ưu điểm của kỹ thuật Real – time PCR là độ nhạy và độ đặc hiệu cao,kết quả được phân tích ngay trong lúc phản ứng đang chạy nên không bịngoại nhiễm, kết quả thu được nhanh hơn nhưng lại được kiểm soát tốt hơn.Không cần các bước sau PCR như điện di hay lai phân tử Kỹ thuật Real –time PCR để định lượng HCV được áp dụng từ những năm 1996 Kỹ thuậtnày còn cho phép đáp ứng các nhu cầu khác trong chấn đoán bệnh viêm ganvirus như xác định genotype, phân tích các đột biến kháng thuốc.

1.4.3.2 Phương pháp PCR-ELISA

Dưới sự xúc tác của enzyme kết hợp với kháng thể kháng digoxigenin,đầu tiên người ta tách chiết HCV RNA từ huyết thanh và chuyển thành cDNAnhờ enzyme phiên mã ngược, cDNA này được dùng làm bản mẫu (template)cho phản ứng PCR Trong thành phần của phản ứng PCR, một trong hai primer

sẽ được đánh dấu ở đầu 5’ với biotin Như vậy, sản phẩm PCR tạo ra sẽ có mộtmạch được đánh dấu biotin ở đầu 5’ Sau bước nhân bản, sản phẩm PCR đượcbiến tính thành dạng mạch đơn và được cho vào các giếng nhựa Mặt trong mỗigiếng nhựa được phủ streptavidin là một protein có ái lực đặc biệt cao đối vớibiotin sẽ giữ các mạch mang bitotin ở đầu 5’ Tiếp theo, người ta cho probe đặchiệu cho HCV vào giếng và tiến hành phản ứng lai Probe này được đánh dấu ởđầu 3’ với digoxigenin sẽ bắt cặp bổ sung với mạch mang biotin ở đầu 5’ Phứchợp kháng thể kháng digoxigenin-alkaline phosphatase được cho vào và ủtrong một thời gian thích hợp, phần dư thừa sẽ được loại bỏ Phản ứng màu sẽxuất hiện khi cơ chất hiện màu của alkaline phosphatase được cho vào Cường

độ màu tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong mẫu

Việc định lượng HCV RNA có trong mẫu được thực hiện bằng cáchquy giá trị cường độ màu ở mỗi vi giếng vào một đường chuẩn xây dựng từnhững mẫu có nồng độ HCV RNA biết trước Phương pháp này có khả năngphát hiện HCV với nồng độ là 600 IU/ml Độ tuyến tính của phương phápnằm trong khoảng 600 IU/ml đến 850.000 IU/ml

Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặtcũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu Nhưng phương pháp này rất hạnchế do KN không đặc hiệu sẽ ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.

1.4.3.3 Phương pháp khuyếch đại tín hiệu

Là phương pháp phát hiện và định lượng RNA bằng kỹ thuật lai vàkhuếch đại tín hiệu Bộ gen virus lúc đầu được lai vào một giá, thì các bộ dòoligonucleotide liên kết/bắt cặp đặc hiệu, sau đó tín hiệu phát ra bởi các phân

tử lai được khuếch đại và đo lường Có hai kỹ thuật hay sử dụng:

+ Kỹ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology)

+ Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture)

Kỹ thuật DNA nhánh-bDNA (Branched DNA technology)

Phản ứng bDNA dựa trên khuyếch đại tín hiệu Đây cũng là kỹ thuật lựachọn để đo lường hàm lượng virus ở bệnh nhân viêm gan mạn tính Trong kỹthuật này HCV RNA được bắt giữ trong một cái giếng, lai tạo bằng chất dòtổng hợp nucleotide bổ sung cho chuỗi hoạt động ở phút thứ 5 trong vùngkhông mã hóa và lõi gen HCV Các chất dò bổ sung sẽ gắn chặt HCV RNA vớicác phản ứng bDNA được khuyếch đại và đánh dấu bằng chất dò phát quang.Xét nghiệm này được chuẩn hóa rất tốt có độ chính xác cao và hoàn toàn có thểứng dụng được Nhược điểm chính của nó là độ nhạy tương đối thấp ở giới hạnthấp là khoảng 200.000 bản sao/ml huyết thanh Hiện nay, phản ứng bDNAđang được đánh giá để theo dõi nhiễm HCV mạn tính trong và sau điều trị Đây

là phản ứng định lượng không dùng để phát hiện HCV [40], [41]

 Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture)

Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc lai phân tử giữa một mạch của phântửADN mạch đôi và phân tử RNA tạo thành một thể lai DNA-RNA Các mẫuđược xử lý bằng dung dịch ly giải để giải phóng các nucleic acid có trong tếbào Sau đó các probe DNA hoặc RNA được cho vào và phản ứng lai xảy ra

Phức hợp lai được cho vào trong các ống nghiệm hoặc trong các giếng củamicrotiter platecó phủ một kháng thể đa dòng (polyclonal antibody) Khángthể đa dòng này bắt giữ (capture) toàn bộ các phân tử lai DNA- RNA hiệndiện trong phản ứng Các phân tử nucleic acid khác như phân tử DNA mạchđơn, RNA, thể lai DNA- RNA, RNA- RNA không phản ứng với kháng thểnày và bị rửa trôi Sau đó, các phân tử lai DNA: RNA đã được bắt giữ sẽ liênkết đặc hiệu với một kháng thể thứ hai cộng hợp với alkaline phosphatase.Một phân tử lai có thể liên kết với nhiều phức hợp kháng thể - alkalinephosphatase nên sẽ làm gia tăng độ nhạy của kỹ thuật.

Hàm lượng trình tự mục tiêu được định lượng bằng giá trị RLU(RelativeLight Unit) có cường độ tương ứng với hàm lượng trình tự đích cótrong mẫu ban đầu.

1.4.4 Các phương pháp xác định kiểu gen

a RT-PCR:

Kỹ thuật PCR phiên mã ngược được phát triển và ứng dụng đối với cácvirus có vật liệu di truyền là RNA từ những năm 1990 Đây là kỹ thuật xácđịnh nhanh, nhạy, đặc hiệu cho từng type huyết thanh Tuy nhiên do độ nhạycao nên rất dễ xảy ra dương tính giả nếu không kiểm soát được tạp nhiễm củacác tác nhân ngoại lai

b Realtime RT-PCR:

Đây là kỹ thuật sử dụng cặp mồi và đầu dò đặc hiệu cho từng kiểu gen,

sử dụng tín hiệu huỳnh quang để phát hiện các sản phẩm phản ứng theo thờigian thực mà không cần điện di Nhiều thử nghiệm realtime RT-PCR đã đượcphát triển sử dụng kỹ thuật TaqMan và SYBR Green [24]

c Kỹ thuật LiPA:

Là kỹ thuật lai trên vạch dò đặc hiệu, sản phẩm PCR được khuếch đạivới cặp mồi trong đó có một mồi gắn biotin Lai sản phẩm PCR gắn biotin trên

các vạch đoạn dò kiểu gen đặc hiệu, sau đó tiến hành lai sản phẩm PCR đã cóvới các que (strip) của bộ thuốc thử LiPA Trên mỗi strip có gắn sẵn các vạch

dò (probe) chuyên biệt cho từng kiểu gen của HCV Tuy nhiên, vì LiPA phảithực hiện trên sản phẩm PCR là kết quả của phản ứng nested PCR nên khảnăng bị ngoại nhiễm là khá cao và đây chính là lí do giải thích được tại sao cókhá nhiều trường hợp LiPA có kết quả không thể xác định được kiểu gen [2]

d Kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing): Đây là kỹ thuật chuẩn xác

nhất, kiểm soát được các sai sót, đảm bảo độ chính xác cao, khắc phục đượccác nhược điểm của các kỹ thuật trên trong xác định kiểu gen

Có nhiều phương pháp giải trình tự gen như : giải trình tự bằng phươngpháp hóa học do Maxam và Gilbert phát minh vào năm 1977, hay phươngpháp enzym của Sanger Và hiện nay các phòng thí nghiệm trên thế giớithường thực hiện giải trình tự gen trên máy tự động Trong phản ứngsequencing, quá trình sao chép sợi ADN được tổng hợp từ đầu 3’, điều đóđược thực hiện bởi vì có một nhóm OH tại vị trí các bon số 3 được dùng đểnối các nucleotide tiếp theo thông qua liên kết với nhóm phốt phát ở vị trí cácbon số 5 Các nucleotide bị khuyết nhóm OH tại vị trí các bon số 3 được gọi

là dideoxy nucleotide, và những nucleotide này đóng vai trò kết thúc sự kéodài của sợi ADN mỗi khi chúng được gắn vào Mỗi dideoxy nucleotide(ddCTP, ddATP, ddTTP, ddGTP) đều được gắn một loại dye huỳnh quang(màu sắc) khác nhau nhằm mục đích để phân biệt khi chúng phát quang Khibốn loại ddNTP đã gắn dye huỳnh quang này khi tiếp xúc với tia UV laser,chúng sẽ hấp phụ tại các bước sóng khác nhau, sau đó được phát hiện và ghilại bởi một sensor đặt trên máy DNA sequencer

Dựa vào trình tự đã giãi mã, tiến hành so sánh độ tương đồng với cáctrình tự kiểu gen chuẩn có trong Gene Bank để xác định kiểu gen của HCV.Thêm vào đó từ trình tự gen thu được ta có thể có nhiều ứng dụng tiếp theo

như phát hiện, theo dõi các đột biến; tìm hiểu mối liên quan, con đường lâynhiễm của các kiểu gen HCV khác nhau trên thế giới…

1.5 Đường lây truyền, các biện pháp phòng và điều trị bệnh viêm gan c

1.5.1 Đường lây bệnh

HCV lây lan bằng sự tiếp xúc trực tiếp qua máu Đường lây nhiễmvirus C chủ yếu gồm: Sử dụng chung kim tiêm ở những người nghiện ma túy,truyền máu hoặc các sản phẩm của máu Trước năm 1992 cứ 100 người đượctruyền máu thì có khoảng 10 người bị lây nhiễm HCV Hiện nay nhờ có xétnghiệm phát hiện HCV ở những người cho máu thì nguy cơ bị lây nhiễm bệnh

đã giảm đi đáng kể [42] Dùng kim chích xăm mình hoặc xỏ lỗ tai không đảmbảo vô trùng cũng có khả năng lây truyền HCV [43] Dùng chung các vậtdụng cá nhân như dao cạo, bàn cải đánh răng, đồ cắt móng tay, tuy ít nguy cơnhưng vẫn có thể làm lây nhiễm bệnh Tỷ lệ HCV lây truyền qua đường tìnhdục ít khoảng 5 %, thấp hơn HBV (10 - 15%) và HIV (30%) [44] Các nhânviên y tế cũng có nguy cơ nhiễm bệnh vì những tai nạn nghề nghiệp như bịkim đâm hoặc trong những trường hợp không thể tránh được có thể tiếp xúctrực tiếp với máu của người mang bệnh

Có 1- 5 % các bà mẹ bị nhiễm HCV có thể truyền bệnh cho con vào lúctrước hoặc sau khi sinh Sự lây truyền này tùy thuộc vào mức độ HCV cótrong máu của người mẹ Phụ nữ có thai đồng nhiễm HCV và HIV thì khảnăng lây truyền từ mẹ sang con sẽ cao hơn 2 đến 3 lần [15] Tuy nhiên, 30-40% các trường hợp bị nhiễm là không rõ nguyên nhân.

1.5.2 Các biện pháp phòng bệnh

Khác với HAV và HBV hiện nay HCV vẫn chưa có thuốc chủng ngừa[45], [46] Ngay cả những hy vọng về một loại vắc xin phòng bệnh này trongtương lai cũng chưa có nhiều hi vọng Vì 3 lý do sau:

+ Thứ nhất: Virus viêm gan C có khả năng thay đổi Điều này chẳng

những gây khó khăn cho hệ thống miễn dịch trong việc phát hiện và đối phóvới chúng, mà còn là nguyên nhân khiến cho việc tìm ra vắc xin phòng bệnhtrở nên khó khăn

+ Thứ hai: do HCV không gây nhiễm và gây bệnh với bất cứ loài động

vật nào khác ngoài người và một loài tinh tinh (chimpanzee) Vì thế, việcnghiên cứu thử nghiệm rất khó khăn

+ Cuối cùng: Khả năng sao chép của HCV trong điều kiện phòng thí

nghiệm rất yếu ớt

Do vậy, việc phòng ngừa bệnh viêm gan c hiện nay chủ yếu là tập trungvào các biện pháp ngăn chặn từ đầu Như đã biết, virus viêm gan C lây lan chủyếu qua sự tiếp xúc trực tiếp với máu của người có bệnh, nên các biện pháp tiệttrùng và chăm sóc thích hợp đối với các vết thương ngoài da như băng bó mọivết cắt, vết thương sẽ giảm thiểu đáng kể nguy cơ lây nhiễm bệnh Tuyệt đốikhông dùng chung bơm kim tiêm,vật dụng cá nhân bị dính máu

1.5.3 Điều trị

Hiện nay, phác đồ điều trị viêm gan C là dùng interferon phối hợp vớiuống ribavirin - một thuốc kháng sinh virus phổ rộng Tỉ lệ đáp ứng kéo dàikhi sử dụng Peginterferon kết hợp với Ribavirin thường cao hơn ở kiểu gen 2,

3 so với kiểu gen 1 Kiểu gen 1 được xem như là kiểu gen khó khăn nhất vớicác liệu pháp điều trị hiện nay Kiểu gen 2 và 3 đáp ứng với điều trị hiện naytốt hơn có thể lên đến 70% -90% [47]

Gần đây, các loại thuốc kháng virus mới đã được phát triển Những loạithuốc này được gọi là thuốc kháng virus trực tiếp DAA (Direct – ActingAntiviral), hiệu quả, an toàn hơn và dung nạp tốt hơn các phương pháp điều trị

cũ, tuy nhiên giá thành còn cao Vì vậy để diều trị hiệu quả viêm gan C với giátiền chấp nhận được vẫn là một thách thức lớn đối với các bác sỹ [5], [48], [30]

Tùy theo loại genotype mà điều trị, tức là kiểu loại di truyền của virus.Thời gian điều trị bệnh viêm gan C sẽ tùy thuộc vào kiểu gen và nồng độHCV RNA vào từng thời điểm Nếu genotype được xác định là loại số1, bệnhnhân cần điều trị khoảng một năm Nếu là loại số 2 hoặc 3, thời gian sẽ làkhoảng 6 tháng [47] Những genotype khác có thể phải điều trị từ 6 đến12tháng, tùy theo từng trường hợp.

1.6 Tình hình nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm, tải lượng virus và genotype của HCV trên thế giới và ở Việt Nam

Năm 2005, nhóm tác giả Hồ Tấn Đạt tại trung tâm Y khoa MEDIC,thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu và xác định kiểu gen HCV của 327 bệnhnhân viêm gan C cho thấy kiểu gen 1 chiếm 58,4%, kiểu gen 6 chiếm 23,9%

và kiểu gen 2 chiếm 13,1% [49]

Năm 2010, Tomoaki Tanimoto cùng cộng sự đã nghiên cứu 486 trườnghợp nhiễm HCV trên nhóm tiêm chích ma tuý tại Hải Phòng Kết quả chothấy tại vị trí 5’UTR-core kiểu gen 6e chiếm ưu thế 32,5%, tại vị trí NS5Bkiểu gen 1a chiếm ưu thế 42,6% [50]

Trong nghiên cứu của mình vào năm 2011, nhóm tác giả Phan QuốcViệt và cộng sự đã nghiên cứu và xác định kiểu gen của 50 trường hợp viêmgan C tại bệnh viện Bạch mai và Trung tâm chẩn đoán y khoa Medic cho kếtquả tại vùng 5’NC có 56% là kiểu gen 1;1,14% có kiểu gen 2 và 30% kiểugen 6 [51]

Nghiên cứu của tác giả Đông Thị Hoài An và các cộng sự (2013) đã sửdụng vùng 5’-UTR- core để xác định kiểu gen của virus viêm gan C ở 710bệnh nhân Việt Nam và Campuchia cho thấy ở người Việt Nam vàCampuchia thì tỷ lệ kiểu gen 6 cao nhất (48,81% và 44,79%) sau đó đến kiểugen 1 (30,56% và 41,66%) cuối cùng là kiểu gen 2 với tỷ lệ tương ứng là14,45% và 9,02% [52]

Gần đây nhất vào năm 2014 trong nghiên cứu của tác giả Phạm ThịThu Thủy và cộng sự tại trung tâm y khoa Medic trên 3 nhóm bệnh nhân xácđịnh kiểu gen bằng 2 vùng giải trình tự khác nhau là 5’NC và NS5B cho thấyrằng khi xác định kiểu gen trên đoạn 5’NC thì tỷ lệ lẫn kiểu gen 6 vào kiểugen 1 khi xác định trên đoạn gen NS5B là 19,8% [53].

Tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, chưa có một nghiên cứunào đánh giá tổng thể tỷ lệ nhiễm, tải lượng virus và các genotype củaHCV ở các bệnh nhân đến khám và điều trị tại bệnh viện kể từ khi bệnhviện triển khai đồng bộ các xét nghiệm xác định nhiễm HCV, tải lượng vàgenotype của HCV

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tất cả các bệnh nhân có triệu chứng nghi viêm gan đến khám và điều trịtại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ tháng 6 năm 2012 đến tháng 5năm 2016

2.1.1 Bệnh nhân hồi cứu: từ tháng 6/2012 đến tháng 8/2015

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Sinh phẩm, hóa chất

+ Cho xét nghiệm anti-HCV:

Bộ thuốc thử cho xét nghiệm Elecsys Anti HCV II của hãng Roche(Thụy Sĩ)

+ Cho xét nghiệm HCV- Viral load:

Kít đếm tải lượng virus COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV testcủa hãng Roche (Thụy Sĩ)

+ Cho xét nghiệm giải trình tự nucleotide (Sequencing) xác định genotype củaHCV:

- Kit tách chiết ZR Viral RNA Kit

- Kit OneStep RT-PCR của hãng Invitrogen

- Các cặp mồi của hãng IDT [54]

Mồi Trình tự nucleotide đoạn gen core Vị trí nucleotide

và sản phẩmSc2 5’-GGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATG-3’ 318-344 [26bp] Ac2 5’-GAGMGGKATRTACCCCATGAGRTCGGC-3’ 758-732 [26bp]

A5 5’-TACGCCGGGGTCAKTRGGGCCCA-3’ 684-660 [24bp]

R = A hoặc G; M = A hoặc C; K = G hoặc T; HC-J4/83 (số truy cập.D13558)

- KaPa Taq Hotstart hoặc Taq PCR Matster Mix

- Bright Dye terminator sequencing (Nimagen)

- ZR DNA sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA)

- POP7-Polymer for 3130/3130xl Genetic Analyzer (ABI-Mỹ)

- 3130/3100-Avant Genetic Analyzer 4-Capillary Array, 50 cm (ABI-Mỹ)

- Running buffer 1X

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị

Dụng cụ:

- Các loại pipett (10 μl, 100 μl, 200 μl ,1000 μl).l, 100 μl, 100 μl, 200 μl ,1000 μl).l, 200 μl, 100 μl, 200 μl ,1000 μl).l ,1000 μl, 100 μl, 200 μl ,1000 μl).l)

- Các loại đầu typ tương ứng

- Ống máu không chất chống đông cho xét nghiệm anti-HCV, và ốngmáu chống đông bằng EDTA cho xét nghiệm xác định genotype và đếm tảilượng virus

- Ống eppendorf các loại

- Giá để mẫu

Thiết bị:

Tủ lạnh lưu mẫu -200C, -700C, máy li tâm tốc độ cao, máy ly tâm nhỏ, máy votex

- Cho xét nghiệm AntiHCV: máy phân tích Elecsys 2010

- Cho xét nghiệm đếm tải lượng virus

COBAS® AmpliPrep Instrument: máy tách chiết acid nucleic tự động COBAS® TapMan® 48 Analyzer: máy Realtime PCR

- Cho xét nghiệm sequencing

+ Máy PCR Mastercycler gradient của Eppendorf hoặc C1000 củaBioRad hoặc tương đương

+ Máy ủ nhiệt Techine Dri-BlockR

+ Hệ thống máy điện di và máy đọc sản phẩm PCR

+ Máy giải trình tự gen ABI 3130/3130xl

2.3 Thiết kế nghiên cứu: Mô tả (hồi cứu và tiến cứu)

Hồi cứu từ 6/2012 đến 8/2015

Tiến cứu từ 9/2015 đến 5/2016

2.4 Sơ đồ nghiên cứu

Đếm tải lượng virus

< 103 bản sao/mL(Loại khỏi nghiên cứu)

≥ 103 bản sao/mL( tách chiết ARN)

giải trình tự gen xác định genotype

Dương tính

2.5 Kỹ thuật nghiên cứu

2.5.1 Kỹ thuật thu thập số liệu

Theo bộ câu hỏi có mẫu (phụ lục 1) về các thông tin cần thu thập

2.5.2 Kỹ thuật lấy mẫu xét nghiệm

- Theo thường qui của Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới

Trung ương

- Các mẫu huyết thanh của bệnh nhân có Anti-HCV dương tính được bảo

quản ở -700C tới khi làm xét nghiệm giải trình tự xác định kiểu gen vàđếm tải lượng virus

2.5.3 Kỹ thuật xét nghiệm

2.4.3.1 Quy trình xác định Anti-HCV: Sử dụng xét nghiệm miễn dịch điện

hóa phát quang “ ECLIA”

 Nguyên lý xét nghiệm: Nguyên lý bắt cặp

 Thuốc thử - dung dịch tham gia xét nghiệm: bảo quản ở 2 – 80C và sử dụngtrong vòng 8 tuần sau khi mở nắp gồm:

- M : Vi hạt phủ Streptavidin

Vi hạt phủ Streptavidin 0,72 mg/mL

- R1 : HCV- specific antigen biotin

Kháng nguyên đặc hiệu HCV đánh dấu biotin, đệm HEPESb, pH 7,4

- R2 : HCV- specific antigens Ruthenium

Kháng nguyên đặc hiệu HCV đánh dấu phức hợp ruthenium ≥ 0.3 mg/

mL, đệm HEPES, pH 7,4

- Cal 1: Mẫu chuẩn âm tính 1: huyết thanh người

- Cal 2: Mẫu chuẩn dương tính 2: huyết thanh người dương tính với

kháng thể kháng HCV

 Quy trình: