TÌM HIỂU cơ CHẾ đề KHÁNG CARBAPENEM DO CARBAPENEMASE ở các CHỦNG ENTEROBACTERIACEAE KHÁNG CARBAPENEM BẰNG kỹ THUẬT bất HOẠT CARBAPENEM cải TIẾN, KHOANH GIẤY PHỐI hợp và PCR

Theo đánh giá của tổ chức y tế thế giới công bố năm 2017, các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae kháng carbapenem được xếp vào nhóm đầu trong các vi khuẩn kháng thuốc nguy hiểm nh

NGUYỄN TUẤN LINH

tìm hiểu cơ chế đề kháng carbapenem do

carbapenemase

ở các chủng Enterobacteriaceae kháng carbapenem

bằng kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến,

khoanh giấy phối hợp và pcr

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI, 2018

NGUYỄN TUẤN LINH

tìm hiểu cơ chế đề kháng carbapenem do

carbapenemase

ở các chủng Enterobacteriaceae kháng carbapenem

bằng kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến,

khoanh giấy phối hợp và pcr

HÀ NỘI, 2018

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy hướngdẫn của mình - TS Phạm Hồng Nhung và TS Trần Minh Châu, người thầytận tâm đã nhiệt tình dẫn dắt, giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong suốtquá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm và các thầy cô Bộ môn Visinh, trường Đại học Y Hà Nội đã truyền đạt kiến thức chuyên môn và tạonhững điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể Bác sĩ, Kỹ thuật viên,nhân viên khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trongsuốt quá trình thực tập lâm sàng, thu thập số liệu và làm luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả thầy cô trong hội đồng thôngqua đề cương và hội đồng chấm luận văn đã dành thời gian đọc và cho tôinhững đóng góp quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu và Phòng Đào tạo Sau đại họccủa trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôitrong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè thânthiết, những người đã luôn ở bên cạnh, động viên khích lệ, giúp đỡ và tạo điềukiện cho tôi được học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 12 tháng 9 năm 2018

Học viên

Nguyễn Tuấn Linh

Tôi là Nguyễn Tuấn Linh, học viên lớp nội trú 41 chuyên ngành Vi sinh

Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướngdẫn của TS Phạm Hồng Nhung và TS Trần Minh Châu

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,trung thực và khách quan

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này

Hà Nội, ngày 12 tháng 9 năm 2018

Học viên

Nguyễn Tuấn Linh

CDC : Centers for Disease Control and Prevention

: Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa KỳCLSI : The Clinical and Laboratory Standards Institute

: Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa KỳCPE : Carbapenemase producing Enterobacteriaceae

: Enterobacteriaceae sinh carbapenemase

CRE : Carbapenem resistant Enterobacteriaceae

: Enterobacteriaceae kháng carbapenem

DDST : Double Disc Synergy Test

: Phương pháp đặt hai khoanh giấyDNA : Deoxyribonucleic acid

DPH : Dehydropeptidase enzyme

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

ESBL : Extended-spectrum beta-lactamase

: Beta-lactamase phổ rộngEUCAST : European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

Ủy ban về thử nghiệm độ nhạy cảm kháng sinh của châu Âu.FDA : Food and Drug Administration

: Cục quản lý thục phẩm và dược phẩm Hoa Kì

IMI : Imipenem hydrolyzing lactamase

CE-IVD : Conformité Européenne-In Vitro Diagnostics :

Chứng chỉ cho các xét nghiệm chẩn đoán y tế của liên minhchâu Âu

KPC : Klebsiella pneumoniae carbapenemase

MALDI-TOF MS: Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight

mass spectrometry: Máy định danh dựa trên khối phổMBLs : Metallo-β-lactamases

mCIM : Modified carbapenem inactivation method

: Kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến

: Kỹ thuật Hodge cải tiếnMIC : Minimum inhibitory concentration

: Nồng độ ức chế tối thiểuMRSA : Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

: Tụ cầu vàng kháng methicillinNDM-1 : New Delhi metallo-β-lactamase-1

NMC : Not metalloenzyme carbapenemase

OXA : Oxacillin-hydrolyzing

PBP : Penicillin-binding protein

PCR : Polymerase Chain Reaction

: Phản ứng trùng hợp chuỗiSIM : Seoul imipenemase

SME : Serratia marcescens enzyme

SMP : Sao Paulo metallo-β-lactamase

TSB : Trypton soya broth

: Canh thang trypton soyaVIM : Verona integron–encoded metallo-β-lactamase

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, kháng kháng sinh đang là một trong những vấn đề nổi cộm

và nan giải của y tế thế giới Theo đánh giá của tổ chức y tế thế giới công bố

năm 2017, các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae kháng carbapenem

được xếp vào nhóm đầu trong các vi khuẩn kháng thuốc nguy hiểm nhất [1]

Kháng sinh nhóm carbapenem là những kháng sinh có phổ khángkhuẩn rộng nhất trong nhóm beta-lactam Các kháng sinh thuộc nhóm này làmột trong những lựa chọn cuối cùng cho những trường hợp nhiễm khuẩn đakháng [2], [3] Tuy nhiên, tình trạng đề kháng carbapenem trên thế giới đangngày càng phổ biến [4], [5] Các chủng vi khuẩn đề kháng carbapenemthường kháng nhiều kháng sinh khác, và chỉ còn rất ít lựa chọn điều trị nhưcolistin, tigecycline, fosfomycin, amikacin [6], [7], [8], [9] Ở các nước pháttriển, tỷ lệ tử vong của bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem vẫn lênđến 50% [10], [11]

Theo cơ chế đề kháng, Enterobacteriaceae kháng carbapenem thường được phân thành 2 nhóm chính: Enterobacteriaceae kháng carbapenem do sinh carbapenemase và Enterobacteriaceae kháng carbapenem không sinh carbapenemase Nhóm Enterobacteriaceae sinh carbapenemase được chú ý

quan tâm nhiều hơn vì chiếm tỷ lệ chủ yếu, đề kháng được hầu hết các khángsinh nhóm beta-lactam, hay phối hợp với các cơ chế đề kháng khác, và đặcbiệt là khả năng lan truyền gen kháng thuốc do các gen tổng hợpcarbapenemase phần lớn nằm trên plasmid hoặc transposon [12]

Theo phân loại của Ambler, dựa trên trình tự acid amin, beta-lactamaseđược chia làm 4 nhóm chính A, B, C, D [13]; các carbapenemase thuộc 3

nhóm A, B, D Đối với các Enterobacteriaceae sinh carbapenemase, việc

phân loại theo nhóm carbapenemase có ý nghĩa quan trọng trong dịch tễ học,kiểm soat nhiễm khuẩn và lựa chọn thuốc điều trị

Hiện nay, trước tình trạng gia tăng của vi khuẩn kháng kháng sinh,trong khi hầu như không phát hiện thêm được thuốc kháng sinh mới, việc tìmcách sử dụng các kháng sinh cũ trở thành giải pháp hữu hiệu Các kháng sinhbeta - lactam cũ kết hợp với các chất ức chế beta-lactamase mới nhưavibactam, vaborbactam, relebactam có tác dụng tốt cho điều trị các vi khuẩn

đa kháng [14], [15] Các thuốc mới này có tác dụng chọn lọc trên từng nhómcarbapenemase, ví dụ như ceftazidime-avibactam có tác đụng điều trị tốt với

các Enterobacteriaceae sinh carbapenemase nhóm A và nhóm D, nhưng bị đề

kháng bởi các chủng nhóm B, hay meropenem-vaborbactam chỉ có tác dụngtốt trên các chủng nhóm A [6], [16], [17], [18], [19]

Việc xác định kiểu hình carbapenemase cũng rất cần thiết để giúp cácbác sĩ lâm sàng cũng như các nhà hoạch định chính sách có được dữ liệu nền

để xây dựng phác đồ, hướng dẫn sử dụng kháng sinh

Từ những lí do trên trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Tìm hiểu cơ chế

đề kháng carbapenem do carbapenemase ở các chủng Enterobacteriaceae

kháng carbapenem bằng kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến, khoanh giấy phối hợp và PCR” Với 2 mục tiêu sau:

1 Phát hiện carbapenemase bằng kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến và khoanh giấy phối hợp ở các chủng Enterobacteriaceae kháng carbapenem phân lập tại bệnh viện Bạch Mai năm 2017-2018.

2 Xác định gen mã hoá carbapenemase bằng kỹ thuật PCR.

CHƯƠNG 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Kháng sinh nhóm carbapenem

1.1.1 Cấu trúc

Carbapenem thuộc nhóm lactam, có đặc điểm khác với các lactam khác ở vòng beta-lactam: vị trí 1 là C thay vì S, và có nối đôi ở C2 vàC3 Ngoài ra về cấu hình không gian, carbapenem có cấu hình trans, cònpenicillin hay cephalosporin có cấu hình cis Chính các sự khác biệt này đãlàm cho carbapenem có đặc tính ưu việt là kháng được hầu hết các beta-lactamase [20], [21], [22]

beta-Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của kháng sinh nhóm beta-lactam [20]

Vòng pyrrolidine (màu đỏ, hình B) tăng độ ổn định và phổ tác dụng củacarbapenem Cấu hình trans của vòng β-lactam ở C5 và C6 (hình F) dẫn đến

sự ổn định đối hơn với beta-lactamase so với penicillin và cephalosporin Cấuhình R của hydroxyethyl làm tăng sức mạnh của beta-lactam (hình E) [20]

Carbapenem khác nhau ở cả R1 (ở C2) và R2 (C8)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học kháng sinh nhóm carbapenem [21]

1.1.2 Cơ chế tác động của carbapenem

Carbapenem là một loại kháng sinh ưa nước như các beta-lactam khác,chúng xâm nhập vào vi khuẩn Gram âm qua các protein màng ngoài còn gọi

là porin Sau đó, carbapenem liên kết với các protein gắn penicilin Binding Proteins – PBPs) PBPs tham gia vào các giai đoạn cuối của quátrình tổng hợp peptidoglycan- thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn.PBP xúc tác sự trùng hợp của sợi glycan (transglycosylation) và sự liên kếtchéo giữa các chuỗi glycan (transpeptidation), một số PBP có thể thủy phângốc D-alanine của pentapeptide (DD -carboxypeptidation) hoặc thủy phân kếtnối peptid kết nối hai sợi glycan (endopeptidation) [23]

(Penicillin-Peptidoglycan rất quan trọng đối với tính toàn vẹn của cấu trúc vách tếbào, đặc biệt đối với các vi khuẩn Gram dương, là thành phần ngoài cùng vàthành phần chính của vách Chức năng quan trọng nhất của vách là duy trì hìnhdạng vi khuẩn, áp lực thẩm thấu bên trong tế bào thường cao hơn rất nhiều sovới môi trường mà vi khuẩn tồn tại Vách giữ cho màng sinh chất không bịcăng phồng, rồi tan vỡ Sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn là cần thiết để tăngtrưởng, phân chia tế bào và duy trì cấu trúc tế bào của vi khuẩn Sự ức chế PBPdẫn đến bất thường cấu trúc của thành tế bào, làm mất tính thẩm thấu chọn lọc,ảnh hưởng tới phân li của tế bào và cuối cùng là gây chết tế bào

Kháng sinh carbapenem có cấu trúc tương tự d-alanyl-d-alanine (tiềnchất của gốc pentapeptid của peptidoglycan) Sự tương đồng về cấu trúc giữacarbapenem và d-alanyl-d-alanine tạo điều kiện gắn kết với vị trí hoạt tính củaPBP Đây là liên kết bền vững và hủy hoạt tính của PBP Carbapenem ức chếtác dụng transpeptidase của PBP, ngăn cản tạo các liên kết ngang giữa cácchuỗi glycan của lớp peptidoglycan mới Sự tích tụ tiền chất peptidoglycankích hoạt hoạt động tự ly giải peptidoglycan mà không có peptidoglycan mớiđược hình thành Kết quả là hoạt động diệt khuẩn của kháng sinh beta-lactam

được tăng cường và cuối cùng tính toàn vẹn cấu trúc của thành tế bào giảmxuống đến khi quá trình tự ly giải xảy ra [24].

Yếu tố chính làm tăng hiệu quả của carbapenems là khả năng liên kếtvới nhiều PBP khác nhau [24] Trong số các PBP trọng lượng phân tử cao cótầm quan trọng và thiết yếu đối với vi khuẩn Gram âm là PBP1a, 1b, 2 và 3,

tất cả các loại carbapenem có ái lực lớn nhất đối với PBP2 ở Escherichia

coli và Pseudomonas aeruginosa [25], [26] Tuy nhiên, từng loại carbapenem

khác nhau có ái lực với các PBP khác nhau Imipenem ưu tiên gắn với PBP2,tiếp theo là PBP1a và PBP1b và ít hơn với PBP3 [24] Trong khi meropenem,doripenem lại thích hợp nhất với PBP2, tiếp theo là PBP3 và cũng có thể gắnvới PBP1a và PBP1b [25], [26] Vì vậy, trong trường hợp vi khuẩn đột biếnPBP2 thì imipenem bị giảm tác dụng, trong khi meropenem vẫn có tác dụngmạnh Đây có thể là nguyên nhân meropenem có hoạt tính mạnh hơnimipenem đối với vi khuẩn Gram âm Nhìn chung, meropenem hoạt độngmạnh hơn imipenem 2-16 lần đối với vi khuẩn Gram âm Nhưng imipenem có

ái lực với PBP1a và PBP1b hơn 2-8 lần so với meropenem và doripenem Do

đó, imipenem lại có hoạt tính mạnh hơn meropenem và doripenem đối vikhuẩn Gram dương

PBP2 chịu trách nhiệm cho việc kéo dài chuỗi glycan, khi PBP2 bị thayđổi, gây ra những thay đổi về hình thái tế bào dẫn đến sự hình thành các tếbào hình cầu PBP3 có tác dụng hình thành các liên kết chéo trong quá trìnhtổng hợp pepetidoglycal, ức chế PBP3 dẫn tới sự mất liên kết và hình thành tếbào hình sợi [27] PBPs 1a và 1b có cả hai chức năng mở rộng chuỗi glycan

và tạo liên kết chéo Ức chế cả PBPs 1a và 1b liên quan đến sự ly giải tế bào

1.1.3 Một số loại carbapenem sử dụng trên lâm sàng

1.1.3.1 Imipenem (N-formimidoylthienamycin)

Imipenem là kháng sinh bán tổng hợp đầu tiên của nhóm carbapenemđược sử dụng trên lâm sàng năm từ năm 1985 Tuy nhiên, imipenem không ổnđịnh đối với dehydropeptidase-1 ở thận của động vật có vú và các sản phẩmphân hủy của nó còn độc đối với thận của một số động vật nhất định Do đó,

nó được sử dụng với chất ức chế dehydropeptidase là cilastatin [33]

Có 2 dạng thuốc: tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch

Imipenem có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram dương, Gram âm, hiếukhí và kị khí

Imipenem bị thủy phân bởi các enzyme dehydropeptidase-1 ở các tếbào bàn chải của các ống lượn gần Phối hợp imipenem với cilastatin ngănchặn imipenem bị phá hủy bởi dehydropeptidase và giảm độc đối với thận docác chất chuyển hóa Khoảng 75% liều dùng imipenem được bài tiết dướidạng không thay đổi trong nước tiểu khi có mặt cilastatin [28]

Imipenem phân phối tốt vào hầu hết các dịch cơ thể

Imipenem không phải là một thuốc lựa chọn đầu tiên mà chỉ dành chonhững nhiễm khuẩn nặng, nhiễm khuẩn hỗn hợp và đặc biệt để điều trị nhữngtrường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện

Imipenem - cilastatin có hiệu quả trên nhiều loại nhiễm khuẩn, bao gồmnhiễm khuẩn đường tiết niệu và đường hô hấp dưới; nhiễm khuẩn trong ổbụng và phụ khoa; nhiễm khuẩn da, mô mềm, xương và khớp

Những tác dụng phụ về thần kinh trung ương như giật rung cơ, trạngthái lú lẫn hoặc cơn co giật sau khi tiêm tĩnh mạch imipenem - cilastatin.Giám sát thử nghiệm thuốc giai đoạn 3 đã ghi nhận tỷ lệ mắc các cơn co giật

do imipenem gây ra là 1,5% - 2,0% Các yếu tố nguy cơ về co giật bao gồmchức năng thận bị suy giảm, bệnh hệ thống thần kinh trung ương từ trướchoặc nhiễm trùng, đột quỵ hoặc tiền sử co giật trong quá khứ [29] Do đó,imipenem không được chỉ định để điều trị viêm màng não

1.1.3.2 Meropenem.

Meropenem cấp bằng sáng chế năm 1983 và được chấp thuận sử dụngtrên lâm sàng tại Mỹ từ năm 1996 kháng sinh này ổn định đối vớidehydropeptidase do được bổ sung một nhóm methyl ở vị trí 1 của phân tửcarbapenem nên không yêu cầu phải dùng phối hợp cilastatin

Meropenem dùng đường tĩnh mạch

Phổ kháng khuẩn của meropenem bao gồm phần lớn các chủng vi khuẩnGram âm và Gram dương, hiếu khí và kỵ khí quan trọng trên lâm sàng

Meropenem không có tác dụng chống lại tụ cầu kháng ethicillin Imipenem

hoạt động tích cực hơn so với meropenem chống lại các Streptococcus spp.

Cả imipenem và meropenem đều có tác dụng chống lại S pneumoniae kháng

penicillin Imipenem hoạt động gấp 4 lần so với meropenem đối với

Enterococcus faecalis và đều không có tác dụng đối với E faecium Nói

chung, meropenem hoạt động mạnh gấp 2-16 lần so với imipenem đối với vi

khuẩn Gram âm hiếu khí, 4-16 lần đối với Enterobacteriaceae [30].

Giống như imipenem, meropenem phân phối tốt vào hầu hết các dịch cơthể meropenem có khả năng thẩm thấu tốt vào mô tiêu hóa, mật, nước mắt,phổi, dịch não tủy, phụ khoa, tiết niệu Mức độ tập chung trong mô nói chungbằng hoặc cao hơn mức cần thiết để điều trị các vi khuẩn thường gây bệnh

Meropenem không phải là một thuốc lựa chọn đầu tiên mà chỉ dành chonhững nhiễm khuẩn nặng, nhiễm khuẩn hỗn hợp và đặc biệt để điều trị nhữngtrường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện

Meropenem có hiệu quả trên nhiều loại nhiễm khuẩn, bao gồm nhiễmkhuẩn đường tiết niệu và đường hô hấp dưới; nhiễm khuẩn trong ổ bụng vàphụ khoa; nhiễm khuẩn huyết; nhiễm khuẩn da, mô mềm, xương và khớp

Meropenem ít gây động kinh so với imipenem nên được dùng trongđiều trị viêm màng não do vi khuẩn [31]

1.1.3.3 Ertapenem

Ertapenem là một loại kháng sinh carbapenem có cấu trúc rất giốngvới meropenem ở chỗ nó có một nhóm 1-β-metyl

Ertapenem dùng đường truyền tĩnh mạch hoặc tiêm bắp

Ertapenem có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram dương, Gram âm, hiếukhí và kị khí Tuy nhiên, ertapenem có phổ hoạt động hẹp hơn so với

carbapenem khác (không có tác dụng đối với Pseudomonas aeruginosa và

Acinetobacter spp.) Do đó, không nên sử dụng kháng sinh này như là phương

pháp điều trị theo kinh nghiệm cho các bệnh nhiễm trùng bệnh viện vì

Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter là tác nhân chính gây nhiễm

khuẩn bệnh viện Ertapenem là một lựa chọn quan trọng đối với các nhiễmtrùng cộng đồng phải điều trị tại bệnh viện và nhiễm trùng do vi khuẩn

Enterobacteriaceae sinh beta-lactamase phổ rộng (ESBL).

Ertapenem được chỉ định trong những trường hợp nhiễm khuẩn cộngđồng từ trung bình đến nặng do vi khuẩn nhạy cảm Nhiễm khuẩn có biếnchứng trong ổ bụng, da, mô mềm, tiết niệu (bao gồm viêm thận-bể thận);viêm phổi mắc phải trong cộng đồng; nhiễm khuẩn cấp ở vùng chậu: viêm cơ,viêm nội mạc tử cung sau sinh, nạo thai, nhiễm khuẩn phụ khoa sau mổ;nhiễm khuẩn huyết

1.1.3.4 Doripenem

Doripenem được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ(FDA) phê duyệt sử dụng năm 2007

Doripenem kết hợp hoạt động in vitro của imipenem và ertapenem với

vi khuẩn Gram dương, hoạt tính in vitro của meropenem chống lại vi khuẩnGram âm

Doripenem có MIC thấp hơn 2-4 so với imipenem và meropenem đốivới P aeruginosa [32] Doripenem tác dụng trên vi khuẩn Gram dương tương

tự imipenem và trên vi khuẩn Gram âm như với meropenem Doripenem vàmeropenem có MIC đối với các chủng vi khuẩn không sinh carbapenemasenhìn chung thấp hơn từ 4 đến 8 lần so với imipenem Ngoài ra, doripenem làcarbapenem ít bị thủy phân bởi nhiều beta-lactamase nhóm A, C, D Thủyphân doripenem bởi beta-lactamase chậm hơn từ 2-150 lần so với imipenem,ngoại trừ SPM-1 là carbapenemase thủy phân doripenem và meropenemnhanh hơn imipenem [33].

Các nghiên cứu trên động vật chỉ ra rằng doripenem có ái lực gắn kết thấp đốivới các thụ thể GABA và không gây co giật ở liều lớn hơn liều imipenemhoặc meropenem gây co giật

Doripenem được chỉ định trong những trường hợp nhiễm khuẩn nặng trong ổbụng, đường tiết niệu (bao gồm cả viêm thận - bể thận)

1.2 Enterobacteriaceae kháng carbapenem

1.2.1 Định nghĩa

1.2.1.1 Enterobacteriaceae

Enterobacteriaceae là họ vi khuẩn đường ruột gồm các trực khuẩn Gram

âm có chung các tính chất sau [34]:

- Nơi cư trú: các vi khuẩn đường ruột thường sống ở ống tiêu hóa của người vàđộng vật, có thể gây bệnh hoặc không gây bệnh Ngoài ra chúng có thể sống ởngoại cảnh (đất, nước) và trong thức ăn

- Hình thể: trực khuẩn Gram âm không sinh nha bào Một số giống vi khuẩn

thường không di động (Klebsiella, Shigella), một số vi khuẩn khác di động

nhờ có lông ở xung quanh thân tế bào Một số giống có vỏ nhìn thấy được

nhờ kính hiển vi thường như Klebsiella.

- Nuôi cấy: các vi khuẩn đường ruột hiếu khí kỵ khí tùy tiện, phát triển đượctrên các môi trường nuôi cấy thông thường Trên các môi trường đặc, các

khuẩn lạc của các vi khuẩn đường ruột thường nhẵn, bóng (dạng S) Tính chấtnày có thể biến đổi sau nhiều lần nuôi cấy liên tiếp thành các khuẩn lạc có bềmặt khô và xù xì (dạng R) Các khuẩn lạc của các vi khuẩn có vỏ như

Klebsiella thường nhầy, lớn hơn khuẩn lạc dạng S và có xu hướng hòa lẫn vào

nhau

- Tính chất sinh vật hóa học: nghiên cứu các tính chất sinh vật hóa học giúp choviệc định loại vi khuẩn

Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae lên men glucose, có sinh hơi

hoặc không sinh hơi; oxidase âm tính; khử nitrate thành nitrit Lên men hoặckhông lên men một số đường (ví dụ lactose) Có hay không có một số enzymenhư urease, tryptophanase Khả năng sinh ra H2S khi dị hóa protein, axít aminhoặc các dẫn chất có lưu huỳnh

- Cấu trúc kháng nguyên: ở các vi khuẩn đường ruột người ta có thể phânbiệt:

Các kháng nguyên thân được gọi là kháng nguyên O

Các kháng nguyên lông được gọi là kháng nguyên H

Các kháng nguyên bề mặt (vỏ) được gọi là kháng nguyên K

Việc nghiên cứu các kháng nguyên khác nhau này cho phép phân chiacác vi khuẩn thuộc cùng một loài hoặc một giống ra các type huyết thanh

- Phân loại: có nhiều cách phân loại họ Enterobacteriaceae Theo cách phân loại của Bergey’s Manual (1984) chia Enterobacteriaceae làm 13 giống chính

Trong các giống kể trên thì các giống vi khuẩn có ý nghĩa y học nhất là:

Escherichia; Shigella; Salmonella; Klebsiella; Enterobacter; Proteus; Yersinia;

- Các vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gâytiêu chảy Ngoài đường tiêu háo, các vi khuẩn này có thể gây bệnh ở nhiều cơquan khác như tiết niệu, hô hấp, thần kinh, Ở bất kì bệnh phẩm nào cũng cóthể gặp thành viên của họ vi khuẩn này [34]

1.2.1.2 Định nghĩa Enterobacteriaceae kháng carbapenem:

Theo CDC năm 2015 [11] là Enterobacteriaceae có:

+ Đề kháng bất kì kháng sinh thuộc nhóm carbapenem (nghĩa là, MIC 4µg/ml với doripenem, meropenem, hay imipenem hoặc 2 µg/ml vớiertapenem)

+ Hoặc: được chứng minh là sinh carbapenemase

+ Ngoài ra: với những vi khuẩn đề kháng tự nhiên với imipenem (như:

Morganella morganii, Proteus spp., Providencia spp.), cần kháng thêm với

kháng sinh thuộc nhóm carbapenem khác, không phải imipenem

1.2.2 Cơ chế đề kháng và phân nhóm

Thường chia làm 2 nhóm chính theo cơ chế đề kháng carbapenem: dosinh men carbapenemase và không sinh carbapenemase:

Sản xuất carbapenemase là cơ chế kháng carbapenem quan trọng và

phổ biến nhất ở các loài Enterobacteriaceae Các enzyme này có thể thủy

phân hầu như tất cả các loại beta-lactam, ngoài ra các gen mã hóa enzymethường nằm trên plasmid, transposon nên truyền gen ngang cho các vi khuẩnkhác [35]

Cơ chế tác động của carbapenemase: Các beta-lactamase xúc tác sựthủy phân liên kết amit của vòng beta-lactam để tạo ra sản phẩm khônghiệu quả

Hình 1.3 Thủy phân liên kết amit của beta-lactam do beta-lactamase [35]

Hình 1.4 Cơ chế tác động của beta-lactamase [36]

Các ser-β-lactamase: là các enzym thủy phân các chất nền của chúngbằng cách hình thành một acyl-enzyme thông qua serine hoạt tính Sau đó,

acyl-enzym bị thủy phân tại liên kết amit của vòng beta-lactam để tạo ra sảnphẩm không hiệu quả [36].

Các metallo-beta-lactamase (MBL) hoạt động qua sự tác động trực tiếpcủa một ion hydroxit phối hợp với cation Zn++ ở vị trí hoạt động để phá vỡ vòngbeta-lactam [36]

Vị trí hoạt động của MBL rộng và linh hoạt phù hợp với hầu hết các chấtnền beta-lactam, tạo điều kiện cho chúng có phổ hoạt động rộng Hơn nữa, vị tríhoạt động của MBL không thấm nước nên cản trở hoạt động của các chất ức chếbeta-lactamase nhóm serine như axit clavulanic, sulbactum và tazobactam [37].1.2.2.1 Phân nhóm carbapenemase

- Theo phân loại của Ambler (dựa vào trình tự acid amin), lactamase được chia thành 4 nhóm: A, B, C, D Carbapenemase thuộc nhóm

beta-A, B, D của beta-lactamase [38]:

+ Carbapenemase nhóm A là các beta-lactamase phụ thuộc serin (cóserin ở vị trí hoạt động) Chúng đều có khả năng thủy phân nhiều loại β-lactam như: carbapenems, cephalosporins, penicillins, aztreonam, và bị ứcchế bởi acid boric, acid clavulanic, tazobactam Một số enzyme nhóm A(IMI-1, NCM-A, SME, SHV-38, SFC-1) do gen trên nhiễm sắc thể mã hóa

và thường không đi kèm với các yếu tố di truyền di động nên rất hiếm đượcphát hiện [39]; ngược lại, các enzyme khác do gen trên plasmid mã hóa(KPC, GES và IMI-2) có thể lan truyền nên xuất hiện rất phổ biến ở các vikhuẩn Gram âm [12]

Klebsialla pneumoniaeae carbapenemase (KPC) là enzyme có tác động

quan trọng nhất trên lâm sàng trong các enzyme nhóm KPC có khả năng lygiải carbapenem cao, nên dù không có các cơ chế kháng khác phối hợp thì vikhuẩn vẫn đề kháng carbapenem ở mức độ cao [40]

KPC có khả năng lây lan cao do gen mã hóa nằm trên trên rất nhiềunhóm plasmid khác nhau như IncF, IncI2, IncX, IncA/C, IncR, IncL/M,ColE1, trong đó phổ biến nhất là nhóm IncF/FIIK Plasmid nhóm IncF thườngmang thêm một số gen kháng các loại kháng sinh khác như aminoglycosides,tetracyclines, quinolones, trimethoprim, và sulfonamides [41].

+ Nhóm B metallo-beta-lactamase (MBL) là beta-lactamase phụ thuộckẽm (có chứa Zn2+ ở vị trí hoạt động) Các loại MBLs có phổ hoạt động rộng

có thể xúc tác sự thủy phân hầu hết các kháng sinh β-lactam, ngoại trừ cácmonobactam

Chúng không bị ức chế bởi các chất ức chế như acid boric, clavulanat,sulbactam, tazobactam (là những chất có hiệu quả chống lại carbapenemasenhóm A) [35] Carbapenemase nhóm B có chứa kẽm ở vị trí hoạt động nêncác enzyme này bị ức chế bởi ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) vàdipicolinic acid (DPA) do các chất này có khả năng ức chế hoạt động của ionkẽm [35], [41]

Các gen mã hóa MBLcó thể nằm trên nhiễm sắc thể và hoặc plasmid

và thường được kết hợp với các yếu tố di truyền di động truyền di động(mobile genetic elements), như transposon, gen casset và intergron [42], nênrất dễ lan truyền cho các vi khuẩn cùng loài và khác loài cho phép phổ biếnnhanh chóng trên lâm sàng

IMP-1 là MBL đầu tiên được phát hiện vào năm 1991 tại Nhật Bản[43] VIM-1 được phát hiện vào cuối năm 1997 tại Verona, Italy [44] NDM -

1 lần đầu tiên được ghi nhận trên chủng K pneumoniae phân lập được trênbệnh nhân người Thụy Điển có tiền sử du lịch tại Ấn Độ năm 2008 [45] Hiệnnay, cả 3 nhóm trên đã lan tràn trên toàn thế giới trong đó có Việt Nam [46],

[47], [48] Hầu hết các gen blaNDM-1 nằm trên plasmid, một số chủng vi khuẩn

mang nhiều plasmid có gen blaNDM-1 [45] Tuy nhiên có một số chủng mang

gen blaNDM-1 nằm trên nhiễm sắc thể, điều này chứng minh các vi khuẩn này

có khả năng tái tổ hợp gen blaNDM-1 [44] Ngoài ra plasmid chứa blaNDM-1 cònchứa thêm các gen kháng kháng sinh khác như kháng aminoglycoside,quinolone [41]

+ Nhóm D gồm các OXA (oxacillin-hydrolyzing) β-lactamase Nhìnchung hoạt tính thủy phân carbapenem của OXA yếu và không bị ức chế bởiacid clavulanic, sulbactam, tazobactam, EDTA, DPA nhưng bị ức chế bởiNaCl [49]

Hiện đã có hơn 400 β-lactamases nhóm D đã được báo cáo Chúngđược đặc trưng bởi sự đa dạng cấu trúc cao và phổ kháng phổ rộng Có hơn

190 các beta-lactamase nhóm D có khả năng thủy phân các carbapenem.Trong đó, nhóm OXA-48-like là nhóm carbapenemase nhóm D phổ biến

nhất ở các chủng Enterobacteriaceae [50] Gen blaOXA-48 lần đầu tiên được

phát hiện năm 2001 trên chủng Shewanella ở Thổ Nhĩ Kỳ Đến nay đã có 12

biến thể thuộc nhóm này được phân loại trên toàn thế giới [51] Các enzymnày có tính thủy phân yếu cả carbapenem và cephlosporin phổ rộng Nhiều

nghiên cứu chỉ ra rằng nhiều chủng Enterobacteriaceae sinh OXA-48-like có

khả năng đề kháng kháng sinh mạnh là do đồng mang nhiều gen đề kháng

khác như các gen mã hóa ESBL (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M-like), pAmpC (bla

CMY-2), NDM và cả các gen đề kháng aminoglycosid armA, rmtB, rmtC, rmtF

[50], [51], [52]

1.2.2.2 Nhóm không sinh carbapenemase

Nhóm này thường kháng carbapenem theo cơ chế phối hợp: sinh lactamase nhóm AmpC hoặc ESBL kết hợp với đột biến mất porin hoặc tăngbơm đẩy carbapenem ra ngoài tế bào [35]

beta-Giảm tính thấm màng ngoài của vi khuẩn với kháng sinh

Carbapenem xâm nhập vào vi khuẩn Gram âm qua các kênh porin là

một loại protein màng ngoài (Outer membrane proteins - OMPs) Thay đổihoặc giảm sự biểu hiện của các porin làm giảm sự xâm nhập của carbapenemvào vi khuẩn [53], [54].

Ở E coli, OmpC và OmpF là những porin giúp cho beta-lactam và một

số kháng sinh khác xâm nhập vào tế bào vi khuẩn [55] Sự đề kháng vớicarbapenem ở E coli liên quan đến sự mất biểu hiện OmpC Mất OmpCkhông chỉ tăng sức đề kháng carbapenems và cephalosporin thế hệ thứ 4, màcòn làm tăng khả năng sống của vi khuẩn trong huyết thanh của người dothoát khỏi con đường hoạt hóa kháng thể kháng thể OmpC Sự mất biểu hiệnOmpC có thể là do sự lựa chọn dưới áp lực kháng sinh [56]

Tăng bơm ngược kháng sinh

Hệ thống bơm ngược chủ động vận chuyển nhiều loại thuốc kháng sinh

ra khỏi tế bào và là nguyên nhân chính gây ra sự đề kháng nội tại của vikhuẩn Gram âm đối với nhiều thuốc kháng sinh sử dụng để điều trị nhiễmtrùng do vi khuẩn Gram dương Khi biểu hiện quá mức, hệ thống bơm nàycũng thể hiện mức độ đề kháng cao hơn đối với các kháng sinh đang có hiệuquả điều trị Các cơ chế làm tăng biểu hiện của bơm thải được tìm thấy trongcác chủng phân lập trên lâm sàng gồm: (i) đột biến gen tổng hợp (ii) đột biếngen điều hòa (iii) các đột biến vùng promoter của gen vận chuyển và (iv) cácyếu tố chèn vào vùng promoter của gen vận chuyển Thuốc kháng sinh có thể

là chất cảm ứng và điều chỉnh biểu hiện của một số bơm thải [57]

Dựa vào thành phần cấu tạo, số vùng xuyên màng, các nguồn năng lượng

và chất nền, các bơm ngược của vi khuẩn được chia thành 5 nhóm: bơm đakháng nhỏ (Small multidrug resistance - SMR), bơm kháng đa vùng (Resistance-nodulation-division - RND), bơm siêu hỗ trợ chính (Major facilitatorsuperfamily- MFS), bơm phụ thuộc ATP (Adenosine triphosphate -binding

cassette -ABC), bơm phức hợp thải độc và thuốc (Multidrug and toxiccompound extrusion- MATE) [58]

Hệ thống AcrAB-TolC thuộc họ RND là loại bơm ngược đặc trưng ởEnterobacteriacea có thể bơm thải: chloramphenicol, fluoroquinolones,nalidixic acid, fucidix acid, rifampicin, tetracycline, beta-lactam [59] và đượcchứng minh có khả năng làm tăng đề kháng với carbapenem [60] Các gen mãhoá bơm dẫn xuất AcrAB-TolC đã được tăng lên khi phát triển trong màngsinh học và tiếp xúc với một số kháng sinh [61]

Thay đổi hoặc giảm PBP

Thay đổi hoặc giảm PBP đóng một vai trò quan trọng trong khángcarbapenem và β-lactam khác ở vi khuẩn Gram dương [5]

Ở S aureus có bốn PBP nguồn gốc tự nhiên: PBP1, PBP2, PBP3, và

PBP4 Trong S aureus kháng methicillin (MRSA) có một PBP thứ năm là

PBP2a, đây là yếu tố quyết định sức đề kháng beta-lactam ở MRSA, được mãhóa bởi gen mecA là gen thu được của S aureus Beta-lactam không gắn đượcvới vị trí hoạt động của PBP2a (Do vị trí hoạt động khép kín) nên nhómkháng sinh này không có tác dụng đối với S aureus có PBP2a Đối với vikhuẩn có PBP21, khi tiếp xúc với kháng sinh beta-lactam, PBP2a vẫn hoạtđộng, quá trình tổng hợp vách vẫn diễn ra trong khi các PBP khác bị ức chế[62] Tuy nhiên, PBP2a không thể bù đắp hoàn toàn cho các PBP khác nên có

sự giảm đáng kể mức độ liên kết chéo giữa các nhưng đủ để đảm bảo sự sốngcòn của tế bào vi khuẩn [63]

Đối với vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem do thay đổi PBPs đã

quan sát thấy ở Escherichia coli [64], Pseudomonas aeruginosa [65],

Acinetobacter baumannii [66].

1.3 Các phương pháp xác định Enterobacteriaceae sinh carbapenemase 1.3.1 Các phương pháp xác định dựa trên kiểu hình.

1.3.1.1 Phương pháp dựa vào sự phân giải carbapenem

- Kỹ thuật Hodge cải tiến: dàn chủng E.coli ATCC 25922 lên đĩa

Müller-Hinton như làm kháng sinh đồ, đặt khoanh meropenem hoặc ertapenem ởgiữa Ria các đường bán kính bằng các chủng thử nghiệm Ủ ấm 35oC quađêm Các chủng sinh carbapenemase sẽ phân hủy meropenem ở cạnh đường

ria, tạo điều kiện cho chủng E.coli ATCC 25922 mọc gần khoanh giấy hơn Kết quả dương tính khi chủng E.coli ATCC 25922 mọc gần khoanh giấy carbapenem hơn khi ở cạnh đường ria của chủng Enterobacteriaceae sinh

carbapenemase, tạo nên hình cánh hoa thị

Đây là kĩ thuật dễ làm, giá thành thấp, có độ nhạy cao với các chủng sinhcarbapenemase nhóm A và D [67]; tuy nhiên độ nhạy và độ đặc hiệu thấp vớicarbapenemase nhóm B [68], [69], [70] Có thể cho kết quả dương tính giả(đặc biệt với các chủng tăng sản AmpC hoặc ESBL kết hợp với đột biến mấtporin) [70], [71], [72]; hoặc cho âm tính giả với các chủng sinh NDM [69],[70] Ngoài ra kĩ thuật này tốn thời gian 1 ngày và không phân loại được cácnhóm carbapenemase

Hình 1.5 Kỹ thuật Hodge cải tiến [67]

1-chứng dương, 3-mẫu dương, 2-chứng âm.

- Kỹ thuật bất hoạt carbapenemase cải tiến: Từ năm 2018, kĩ thuật nàyđược CLSI khuyến cáo sử dụng thay thế cho kỹ thuật Hodge test cải tiến đểphát hiện carbapenemase do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn [73] Khoanhkháng sinh meropenem 10µg được ử trong canh thang TSB pha chủng thửnghiệm Sau 4 tiếng, vớt khoanh kháng sinh ra đặt vào đĩa Müller-Hinton đã

dàn sẵn chủng E.coli ATCC 25922 Ủ ấm 35oC qua đêm Các chủng sinhcarbapenemase sẽ phân hủy meropenem trong bước ủ canh thang, làm khoanh

meropenem giảm hoạt tính, tạo điều kiện cho chủng E.coli ATCC 25922 mọc

gần khoanh kháng sinh hơn Kết quả được phiên giải theo đường kính vùng

ức chế theo hướng dẫn của CLSI 2018 [73] Đây là kỹ thuật dễ thực hiện, chiphí thấp, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao kể cả với các chủng sinhcarbapenemase nhóm B (NDM); tuy nhiên vẫn tốn thời gian 1 ngày, và khôngphân loại được các nhóm carbapenemase

Hình 1.6 Thao tác kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến [74]:

A: Ngâm khoanh giấy trong huyền dịch vi khuẩn nghiên cứu,

D: Đặt khoanh giấy lên đĩa Muller-Hinton.

Hình 1.7 Kết quả kĩ thuật mCIM: chứng dương (A): Klebsiella

pneumoniae ATCC BAA-1705, và chứng âm (B): Klebsiella pneumoniae

ATCC BAA-1706 [74].

- Sử dụng MALDI-TOF MS: Ủ kháng sinh carbapenem trong canhkhuẩn chủng thử nghiệm Các chủng sinh carbapenemase sẽ phân hủy lượng

kháng sinh tạo ra các sản phẩm thủy phân đặc hiệu Dùng máy MALDI-TOF

MS để phát hiện các sản phẩm đặc hiệu từ sự thủy phân carbapenem Phươngpháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian nhanh, nhưng đòi hỏi trangthiết bị và người làm có kinh nghiệm, không phân biệt được các nhómcarbapenemase

- Carba NP test: Ủ vi khuẩn trong môi trường có bổ sung carbapenem

và chất chỉ thị màu Phản ứng dương tính khi vi khuẩn thủy phân carbapenemtạo môi trường acid làm đổi màu chất chỉ thị Phương pháp này được CLSI

2018 khuyến cáo sử dụng So với kĩ thuật mCIM (cũng được CLSI khuyếncáo), kĩ thuật này cũng dễ thực hiện và đã có sẵn bộ sinh phẩm thương mạihóa, cho kết quả nhanh hơn (2 giờ), cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao (>90%)với các chủng sinh carbapenemase nhóm A và B Tuy nhiên có độ nhạy thấpvới các chủng sinh carbapenemase nhóm D (11% với OXA-48-like) [67] vàcũng không phân loại được các nhóm carbapenemase

Hình 1.8: Cơ chế Carba NP test [75]

1.3.1.2 Phương pháp dựa vào chất ức chế đặc hiệu.

Dựa vào các chất ức chế đặc hiệu với từng nhóm carbapenemase:carbapenemase nhóm A bị ức chế bởi boric acid, carbapenemase nhóm B bị

ức chế bởi dipicolinic acid (DPA) và ethylenediaminetetreacetic acid (EDTA),nhóm D không có chất ức chế đặc hiệu nhưng có thể sử dụng tính đề khángmạnh với temocillin của carbapenemase OXA-48-like để làm để sàng lọccarbpenemase nhóm D, test này có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu thấp docũng có nhiều cơ chế khác giúp vi khuẩn kháng temocillin [76] Dựa vào sựkhác biệt về mức độ nhạy cảm của các chủng vi khuẩn với kháng sinhcarbapenem đơn độc so với carbapenem kết hợp chất ức chế carbapenemaseđặc hiệu để xác định loại carbapenemase tuơng ứng

Phương pháp này được nghiên cứu rộng rãi do dễ thực hiện và độ đặchiệu cao Nhiều bộ test thương mại ứng dụng cơ chế này đã được phát triển,tuy nhiên độ nhạy và độ đặc hiệu đối với từng nhóm carbapenemase của từng

bộ test có sự khác biệt Có một số hình thức chủ yếu của phương pháp:

+ Etest MBL: dàn đều vi khuẩn cần phát hiện carbapenemase lên đĩathạch Muller-Hinton Đặt lên đĩa dải Etest imipenem và Etes imipenem phốihợp EDTA So sánh MIC với 2 dải Etest của chủng vi khuẩn nhằm phát hiệncác chủng sinh MBL (dựa trên tác dụng ức chế của EDTA với carbapenemasenhóm B) [77]

Hình 1.9 Etest MBL [78]

+ Kỹ thuật khoanh giấy phối hợp: dàn đều vi khuẩn cần phát hiệncarbapenemase lên đĩa thạch Muller-Hinton Đặt lên đĩa, khoanh giấycarbapenem đơn độc với các khoanh giấy carbapenem phối hợp chứa chất ứcchế đặc hiệu Nhận định kết quả dựa trên sự khác biệt giữa vùng ức chế củakhoanh giấy carbapenem đơn độc so với khoanh giấy carbapenem có bổ sungchất ức chế carbapenemase [79]

+ Kỹ thuật 2 khoanh giấy: dàn đều vi khuẩn cần phát hiệncarbapenemase lên đĩa thạch Muller-Hinton Đặt khoanh giấy carbapenem vớikhoanh giấy chứa chất ức chế đặc hiệu ở các khoảng cách xác định Nhậnđịnh kết quả dựa trên hiện tượng giao thoa giữa các cùng ức chế của cáckhoanh giấy [79]

Hình 1.10 Kỹ thuật khoanh giấy phối hợp (phải) và 2 khoanh giấy (trái) [80]

kháng thể - kháng nguyên Kháng nguyên ở đây là các carbapenemase do vikhuẩn sinh ra Các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các carbapenemase quantrọng (KPC, NDM, VIM, IMP, OXA-48-like) được nghiên cứu và tổng hợp

để tạo các bộ test sắc kí miễn dịch như RESIST-3 O.K.N (Coris BioConcept),NG-Test CARBA 5 (NG Biotech) [81], [82], [83] Phương pháp này cho kếtquả nhanh, dễ thao tác, giá thành không quá cao, và có khả năng phân loạiđược các nhóm carbapenemase, tuy nhiên chưa có đủ các nghiên cứu để kiểmđịnh độ nhạy và độ đặc hiệu của các bộ test [76]

Hình 1.11 NG-Test CARBA 5

1.3.2 Các phương pháp dựa trên kiểu gen

Các phương pháp sinh học phân tử cho độ nhạy và và độ đặc hiệu caonhất với khả năng phân loại thể từng nhóm carbapenemase Một số nhànghiên cứu coi đây là tiêu chuẩn vàng Các bộ test PCR và DNA microarrayđược thương mại hóa thường tập trung vào các gen carbapenemase thường

gặp nhất và quan trọng với lâm sàng như blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-like, blaIMP,

blaVIM Tuy nhiên PCR hay DNA microarray đều chỉ phát hiện được các gencarbapenemase được nhắm đến trong quy trình [79]

Phương pháp giải trình tự chủ yếu được sử dụng để nghiên cứu các gencarbapenemase mới hoặc đột biến [84]

1.4 Tình hình đề kháng và các kháng sinh điều trị Enterobacteriaceae

kháng carbapenem hiện nay

1.4.1 Tình hình đề kháng của các chủng Enterobacteriaceae kháng carbapenem ở Việt Nam

Tình trạng Enterobacteriaceae đề kháng carbapenem đang ngày càng

gia tăng và đã trở thành một trong những chủng vi khuẩn đa kháng nguy hiểmnhất trên thế giới [1], [46] Đặc biệt khu vực Nam Á và Đông Nam Á là mộttrong những nơi có tỷ lệ vi khuẩn đề kháng kháng sinh cao nhất trên thế giới[85], [47] Trong đó Việt Nam được xếp vào nhóm nước mức đề kháng caovới tỷ lệ K pneumoniae kháng carbapenem là 5-10% [47]

Các nghiên cứu gần đây cho thấy tỷ lệ Enterobacteriaceae đề kháng

carbapenem ở Việt Nam đang ngày càng gia tăng, các vi khuẩn này đã xuấthiện trên khắp cả nước [86], [87], [88] Ở Việt Nam có sự hiện diện của cả 3nhóm carbapenemase A, B, D với các gen chủ yếu là KPC, NDM và OXA-48-like [89], [90] Ở khoa hồi sức tích cực của bệnh viện Bạch Mai năm

2011 - 2015, K pneumoniae là một trong các tác nhân gây bệnh hàng đầu với

tỷ lệ phân lập là 15,2% và tỷ lệ nhạy cảm carbapenem chỉ còn dưới 40% [91]

1.4.2 Tình hình điều trị Enterobacteriaceae sinh carbapenemase.

Về điều trị, carbapenem vẫn có thể sử dụng với liều cao khi MIC ≤ 16mg/L [92] Việc phối hợp kháng sinh được khuyến cáo sử dụng ở những bệnhnhân nhiễm khuẩn nặng, và điều trị đơn kháng sinh có thể sử dụng ở nhữngbẹnh nhân tình trạng nhẹ [7]

Trong thử nghiệm trong phòng thí nghiệm (in vitro) Enterobacteriaceae

sinh carbapenemase thường chỉ còn nhạy cảm với một số kháng sinh:polymyxin, aminoglycoside, tigecycline, fosfomycin [7]

- Polymyxin:

Hiện tại có 2 dạng sử dụng là polymyxin E (còn được gọi là colistin) vàpolymyxin B, là các polypeptid có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu sử dụng chocác vi khuẩn Gram âm thường gặp Colistin mang nhiều điện tích dương.Những điện tích dương này tương tác theo cơ chế cân bằng điện tích với lớpmàng ngoài của vi khuẩn gram âm và thế chỗ cho những ion mang hai điệntích dương của lớp màng lipid, đặc biệt là Calci và Magie, làm phá vỡ lớpmàng ngoài và giải phóng lipopolysaccharide, dẫn đến thay đổi tính thấm củamàng tế bào vi khuẩn Điều này gây nên sự rò rỉ thành phần trong tế bào vàsau đó là sự ly giải tế bào Colistin cũng có khả năng gắn kết và trung hòaphân tử lipopolysaccharide của vi khuẩn, đây chính là hoạt tính kháng nội độc

tố của thuốc [93]

Colistin được tiêm tĩnh mạch 2 mối quan tâm chính khi sử dụngpolymyxins là độc tính trên thận và độc tính thần kinh Cơ chế chính xác củađộc tính trên thận không được hiểu rõ, và tỷ lệ trong các nghiên cứu thay đổi

từ 14% đến 53% [94], [95] Tổng liều hàng ngày và thời gian điều trị dài hơntương quan với tăng nguy cơ rối loạn chức năng thận; tuy nhiên, thường cóthể hồi phục sau khi ngưng thuốc [96] Độc tính thần kinh có thể biểu hiệndưới dạng phổ từ dị cảm đến mất điều hòa đến phong tỏa thần kinh cơ vàđược báo cáo trong khoảng 4-6% bệnh nhân [97]

Tigecycline thâm nhập tốt vào các mô da, túi mật, ruột, phổi [90].Ngược lại, nồng độ tigecycline trong huyết tương tương đối thấp, nồng độ tối

đa 0,62 µg / mL ở liều trạng thái ổn định với 50 mg mỗi 12 giờ [99] Nồng độtigecycline huyết thanh thường được coi là không đủ để điều trị nhiễm trùngmáu, nên không được chấp thuận cho chỉ định này [100] Tigecycline có thờigian bán hủy dài, 42 giờ sau nhiều lần tiêm, và không bị ảnh hưởng bởi suythận hoặc suy gan nhẹ

-Fosfomycin

Fosfomycin, là dẫn xuất của axit photphonic, là kháng sinh diệt khuẩnphổ rộng cho cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm Enzyme pyruvultransferase bị bất hoạt bởi fosfomycin dẫn đến ức chế tổng hợp thành tế bào

vi khuẩn

Fosfomycin dùng được cả đường tiêm và đường uống

Fosfomycin có trọng lượng phân tử thấp và liên kết protein không đáng

kể, phân phối tốt các mô bao gồm thận, bàng quang, tuyến tiền liệt, phổi, mômềm, xương và dịch não tủy (đặc biệt là viêm màng não) [93], [94], [95] Chủyếu bài tiết không thay đổi trong nước tiểu (38%), nồng độ cao củafosfomycin tromethamine tồn tại trong nước tiểu lên đến 48-72 giờ Thời gianbán thải là 2-3 giờ đối với fosfomycin disodium và 6 giờ đối với fosfomycintromethamine ở những bệnh nhân có chức năng thận bình thường Ở bệnhnhân suy thận, phục hồi nước tiểu thấp hơn và thời gian kéo dài đáng kể, lênđến 50 giờ [104]

Fosfomycin thường được dung nạp tốt Các tác dụng phụ phổ biến nhấtcủa các thuốc uống là rối loạn tiêu hóa thường nhẹ và thoáng qua Đối với các

sản phẩm tiêm tĩnh mạch, các tác dụng phụ phổ biến nhất bao gồm viêm tĩnhmạch và phản ứng dị ứng Có thể gây giảm bạch cầu, tăng nhẹ bilirubin vàmen gan; thường thoáng qua và không có ý nghĩa lâm sàng.

-Aminoglycoside

Các aminoglycoside ức chế tổng hợp protein bằng cách gắn vào tiểu đơn

vị 30S của ribosome Chủ yếu được sử dụng cho các vi khuẩn Gram âm [105]

Chúng phân bố tốt vào xương, dịch màng bụng và nước tiểu, phân bốkém vào dịch não tủy và tuyến tiền liệt Thời gian bán thải phụ thuộc nhiềuvào tuổi tác và chức năng thận, nhưng đối với người lớn có chức năng thậnbình thường thì khoảng 2 giờ Bài tiết chủ yếu trong nước tiểu qua lọc cầuthận Aminoglycoside thường được sử dụng phối hợp với thuốc khác [106]

Độc tính trên thận là một trong những tác dụng phụ chính củaaminoglycosid do tích tụ thuốc ở ống lượn gần Thông thường, tổn thương thận

có liên quan đến việc sử dụng aminoglycoside có thể phục hồi Tổn thương hệtiền đình ốc tai là một tác dụng phụ khác thường không thể phục hồi Khi điềutrị kéo dài, cần đánh giá thính lực cơ bản và theo dõi định kỳ Một tác dụng phụnghiêm trọng, nhưng ít phổ biến hơn là phong tỏa thần kinh cơ

-Ceftazidime/avibactam

Avibactam là chất ức chế beta-lactamse không chứa vòng beta-lactamđầu tiên được phát triển Avibactam acyl hóa beta-lactamase bằng liên kếtcộng hóa trị Avibactam có khả năng bất hoạt nhiều beta-lactamase nhóm A(KPC-2, CTX-M-15, TEM-1), nhóm C (AmpC) và nhóm D (OXA-48) nhưngkhông có tác dụng với metallo-beta-lactamase [107] Ceftazidime là

cephalosporin thế hệ 3 có ái lực cao với PBP1a, PBP1b, PBP3 ở các chủng vikhuẩn Gram âm [108].

Ceftazidime/avibactam được chỉ định trong các nhiễm trùng ổ bụng,nhiễm trùng tiết niệu (kể cả viêm thận, bể thận), viêm phổi bệnh viện [109]

- Meropenem/vaborbactam

Vaborbactam là dẫn xuất acid boric có tac dụng ức chế beta-lactamsenhóm A (KPC, SHV, TEM, CTX-M) và nhóm C (P99, MIR, FOX), nhưng ứcchế được beta-lactamase nhóm B và D [110]

FDA đã chấp thuận cho sử dụng meropenem/vaborbactam trong điều trịnhiễm trùng tiết niệu

Meropenem/vaborbactam là một lựa chọn mới cho điều trị nhiễm khuẩn

Enterobacteriaceae sinh carbapenemase nhóm A (đặc biệt là nhóm KPC), tuy

nhiên không có tác dụng trên các chủng nhóm B (NDM, VIM, IMP) và D(OXA-48-like) [111]

Đã có một số nghiên cứu về điều trị bệnh nhân nhiễm khuẩn có kết quả

nuôi cấy dương tính với Enterobacteriaceae kháng carbapenem Tuy nhiên, phác đồ điều trị tối ưu cho nhiễm Enterobacteriaceae kháng carbapenem vẫn

chưa được xác định vì một số lý do Thứ nhất, hầu hết các nghiên cứu lànghiên cứu hồi cứu thực hiện riêng lẻ ở từng đơn vị nhỏ Thứ hai, khó đểphân biệt giữa nhiễm trùng thực sự và vi khuẩn quần cư, đặc biệt là hồi cứu, ởcác chủng phân lập từ bệnh phẩm không vô khuẩn như vết thương hoặcđường hô hấp, hoặc từ nước tiểu Thứ ba, trong quá trình nhiễm trùng

Enterobacteriaceae kháng carbapenem, nhiều kháng sinh thường được sử

dụng, thay thế hoặc kết hợp Thứ tư, đồng nhiễm với các tác nhân gây bệnh

khác là khá phổ biến, đây là yếu tố nguy cơ gây chồng lấp các vi khẩn đa

kháng [112] Cuối cùng, Enterobacteriaceae kháng carbapenem thường được

phân lập từ những bệnh nhân có nhiều bệnh đi kèm, mà bản thân nó ảnhhưởng xấu đến kết quả điều trị [113] Nhìn chung, phân lập được

Enterobacteriaceae kháng carbapenem từ bất kì nguồn nào - cho dù có nhiễm

trùng lâm sàng hay không, đều có liên quan đến kết quả điều trị không tốt đẹp

[114] Trong nhiều nghiên cứu, tỷ lệ tử vong khi nhiễm Enterobacteriaceae

kháng carbapenem từ 29% đến 52% [115], [116], [117], [118]