SỬ DỤNG kỹ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE để PHÁT HIỆN CMV và HSV,HZV TRONG THỦY DỊCH của BỆNH NHÂN bị VIÊM MÀNG bồ đào TRƯỚC cấp TÍNH

Kết quả của phản ứng chuỗi polymerase để phát hiện CMV, HSV, HZV trong thủy dịch của bệnh nhân bị viêm MBĐ trước cấp tính...33... Casonx và cộng sự [2] khinghiên cứu tìm nguyên nhân trên

HÀ TRUNG KIấN

Sử DụNG Kỹ THUậT PHảN ứNG CHUỗI POLYMERASE

Để PHáT HIệN cmv và hsv, hzv TRONG THủY DịCH CủA bệnh nhân bị viêm màng bồ đào trớc cấp tính

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SĨ CHUYấN KHOA II

HÀ NỘI - 2016

BỘ Y TẾ

HÀ TRUNG KIấN

Sử DụNG Kỹ THUậT PHảN ứNG CHUỗI POLYMERASE

Để PHáT HIệN cmv và hsv, hzv TRONG THủY DịCH CủA bệnh nhân bị viêm màng bồ đào trớc cấp tính

Chuyờn ngành: Nhón khoa

Mó số: CK 62725601

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SĨ CHUYấN KHOA II

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS Phạm Trọng Văn

2 TS Vũ Tuấn Anh

HÀ NỘI - 2016 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

HIV Human Immunodeficiency virus

HSV Herpes Simplex virus

HZV Herpes Zoster virus

MBĐ Màng bồ đào

PCR Polymerase Chain Reaction

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Màng bồ đào 3

1.1.1 Giải phẫu, sinh lý màng bồ đào 3

1.2 Bệnh viêm màng bồ đào 5

1.2.1 Định nghĩa viêm màng bồ đào 5

1.2.2 Nguyên nhân viêm MBĐ 6

1.2.3 Phân loại viêm MBĐ 7

1.2.4 Cơ chế bệnh sinh viêm MBĐ 8

1.2.5 Viêm MBĐ do cơ chế tự miễn 9

1.3 Phản ứng chuỗi Polymerase 11

1.3.1 CytoMegalovirus 17

1.3.3 Herpes Zoster virus 21

1.4 Tình hình nghiên cứu về nguyên nhân gây viêm MBĐ trên thế giới và tại Việt Nam 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 25

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu và phương tiện nghiên cứu 25

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 25

2.2.2 Phương tiện nghiên cứu 26

2.3 Các bước tiến hành 26

2.3.1 Hỏi bệnh 26

2.3.2 Thăm khám mắt 27

2.3.3 Lấy bệnh phẩm làm xét nghiệm PCR 27

2.4 Các biến số, chỉ số đánh giá kết quả 28

2.4.1 Đặc điểm lâm sàng của VMBĐ trước cấp tính 28

2.4.2 Kết quả của phản ứng chuỗi polymerase để phát hiện CMV, HSV, HZV trong thủy dịch của bệnh nhân bị viêm MBĐ trước cấp tính 33

CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ nghiên cỨu 37

3.1 Đặc điểm lâm sàng 37

3.1.1 Tuổi 37

3.1.2 Giới 37

3.1.3 Thời gian mắc bệnh trong năm 37

3.1.4 Thời gian bị bệnh 37

3.1.5 Số lần tái phát 37

3.1.6 Tình trạng mắt bị bệnh 37

3.1.7 Triệu chứng chủ quan 37

3.1.8 Tình trạng thị lực người bệnh khi tới khám 37

3.1.9 Tình trạng nhãn áp 37

3.1.10 Giác mạc 37

3.1.11 Tủa mặt sau giác mạc 37

3.1.12 Tình trạng mống mắt 38

3.1.13 Tình trạng đồng tử 39

3.1.14 Tình trạng tiền phòng 39

3.1.15 Tình trạng góc tiền phòng 39

3.1.16 Tình trạng thủy tinh thể 39

3.1.17 Gai thị - võng mạc 40

3.2 Mối liên quan giữa bệnh cảnh lâm sàng và kết quả xét nghiệm thủy dịch của bệnh nhân bị viêm MBĐ trước cấp tính 40

3.2.1 CMV 40

3.2.2 HSV và HZV 43

Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 44

4.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân bị viêm MBĐ trước cấp tính 44

4.1.1 Tuổi 44

4.1.2 Giới 44

4.1.3 Thời gian mắc bệnh trong năm 44

4.1.4 Thời gian bị bệnh 44

4.1.5 Số lần tái phát 44

4.1.6 Mắt bị bệnh 44

4.1.7 Triệu chứng chủ quan 44

4.1.10 Tình trạng giác mạc 44

4.1.11 Tủa mặt sau giác mạc 44

4.1.12.Tình trạng mống mắt 44

4.1.13 Đồng tử 44

4.1.14 Tiền phòng 44

4.1.15 Góc tiền phòng 44

4.1.16 Thủy tinh thể 44

4.1.17 Gai thị - võng mạc 44

4.1.18 Toàn thân 44

4.2 Xác định mối liên quan giữa bệnh cảnh lâm sàng và kết quả xét nghiệm 44 4.2.1 CMV 44

4.2.2 HSV và HZV 44

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 3.1: Tình trạng mắt bị bệnh 37

Bảng 3.2: Số lượng tủa giác mạc 37

Bảng 3.3: Liên quan giữa số lượng tủa giác mạc và nhãn áp 37

Bảng 3.4: Màu sắc tủa giác mạc 38

Bảng 3.5: Kích thước tủa giác mạc 38

Bảng 3.6: Phân bố vị trí tủa giác mạc 38

Bảng 3.7: Màu sắc mống mắt 38

Bảng 3.8: Tình trạng Tyndall tiền phòng: 39

Bảng 3.9: Mức độ dính góc theo góc phần tư 39

Bảng 3.10: Tình trạng bạch cầu trong máu 40

Bảng 3.11: Tình trạng tiền sử về bệnh khớp 40

Bảng 3.12: Mối liên quan giữa nhóm CMV dương tính - CMV âm tính với tuổi người bệnh 41

Bảng 3.13: Mối liên quan giữa nhóm CMV dương tính – CMV âm tính với giới tính người bệnh 41

Bảng 3.14: Mối liên quan giữa nhóm CMV dương tính - CMV âm tính với tình trạng nhãn áp 41

Bảng 3.15: Mối liên quan giữa nhóm CMV dương tính - CMV âm tính với tình trạng giác mạc 42

Bảng 3.16: Mối liên quan giữa nhóm CMV dương tính - CMV âm tính với tình trạng tủa sau giác mạc 42

Bảng 3.17: Mối liên quan giữa nhóm CMV dương tính - CMV âm tính với tình trạng tyndall tiền phòng 42

Bảng 3.18: Mối liên quan giữa nhóm CMV dương tính - CMV âm tính với màu sắc mống mắt 43

Bảng 3.19: Mối liên quan giữa nhóm CMV dương tính - CMV âm tính với tình trạng teo nhu mô mống mắt 43

Bảng 3.20: Mối liên quan giữa nhóm CMV dương tính - CMV âm tính với tình trạng đồng tử 43 Bảng 3.21: Mối liên quan giữa nhóm CMV dương tính - CMV âm tính với

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm màng bồ đào là tình trạng viêm nhiễm một trong ba thành phần củamàng bồ đào, bao gồm: Viêm mống mắt thể mi (viêm màng bồ đào trước),viêm pars plana và viêm hắc mạc Những năm gần đây khái niệm về viêmmàng bồ đào (MBĐ) đã được mở rộng không chỉ giới hạn ở MBĐ mà còn làviêm ở các tổ chức lân cận như: Dịch kính, võng mạc, mạch máu võng mạc,củng mạc và thượng củng mạc [1] Đây là một bệnh lý nặng trong nhãn khoa,thường hay tái phát và có nhiều biến chứng, di chứng nặng nề, để lại hậu quảnghiêm trọng làm ảnh hưởng đến chức năng thị giác và cấu trúc nhãn cầu củangười bệnh Việc điều trị viêm MBĐ hầu hết mới chỉ dừng lại ở điều trị triệuchứng và điều trị bao vây do không tìm được nguyên nhân gây bệnh rõ ràng.Năm 2006, Schryver, F Rozenberg, N Casonx và cộng sự [2] khinghiên cứu tìm nguyên nhân trên 5 bệnh nhân bị viêm MBĐ trước bằng cáchlấy thủy dịch làm phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) thì cả 5 trường hợp đềudương tính với Cytomegalovirus (CMV), không thấy có sự xuất hiện của cácvirus khác như Herpes Simplex virus (HSV), Herpes Zoster virus (HZV) hayRubella trong thủy dịch của những bệnh nhân này

Năm 2007, trong một báo cáo của mình, Soon Phaik Chee, Kristine Bacsal,Aliza Jap, Su-yun se- Thoe, Chingli Cheng, Ban Hock Tan và cộng sự [3] đãnghiên cứu trên 105 mắt bệnh nhân bị viêm MBĐ trước, bằng cách làm phản ứngPCR dịch tiền phòng đã thấy có 24 bệnh nhân (22,8%) dương tính với CMV Hầu hết các tác giả sau khi nghiên cứu thủy dịch của bệnh nhân bị viêmMBĐ bằng kỹ thuật PCR, thấy sự có mặt của CMV trong thủy dịch đã điềutrị kết hợp cho bệnh nhân bằng Valganciclovir hoặc Ganciclovir theo đườnguống cho kết quả khá tốt, tỷ lệ khỏi bệnh cao, tỷ lệ tái phát thấp [2],[4],[5],[6],[7],[8],[9]

Tại Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có báo cáo nào đề cập đến việc lấydịch tiền phòng làm phản ứng PCR để tìm nguyên nhân cho bệnh nhân bịviêm MBĐ trước cấp tính mà mới chỉ có một số tác giả đề cập đến việc điềutrị biến chứng và di chứng của viêm MBĐ trước [10],[11],[12].

Phòng khám của bệnh viện Mắt Trung Ương trong những năm gần đây

số người bệnh đến khám và tái khám với chẩn đoán viêm MBĐ trước cấp tínhngày càng tăng Tuy nhiên việc điều trị bệnh viêm MBĐ trước còn gặp nhiềukhó khăn do chưa xác định rõ được nguyên nhân gây bệnh, hầu như các phác

đồ điều trị đều là điều trị triệu chứng mà chưa có điều trị nguyên nhân cụ thể

Tỉ lệ bệnh tái phát cao gây tổn hại chức năng thị giác và cấu trúc nhãn cầu,gây nhiều lo lắng cũng như tốn kém tiền bạc, thời gian, công sức của ngườibệnh Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm hiểu đặc điểm lâm sàng, nguyên nhângây bệnh để từ đó đưa ra những tiêu chuẩn chẩn đoán xác định, hướng điều trịnguyên nhân có hiệu quả với thể loại bệnh này có một ý nghĩa hết sức quantrọng trong thực tế

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Sử dụng

kỹ thuật phản ứng chuỗi Polymerase để phát hiện Cytomegalovirus và Herpes Simplex virus, Herpes Zoster virus trong thủy dịch của bệnh nhân bị viêm màng bồ đào trước cấp tính”.

Với 2 mục tiêu nghiên cứu:

1 Mô tả đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân viêm màng bồ đào trước cấp tính.

2 Xác định mối liên quan giữa bệnh cảnh lâm sàng và kết quả xét nghiệm thủy dịch của bệnh nhân bị viêm màng bồ đào trước cấp tính.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Màng bồ đào

1.1.1 Giải phẫu, sinh lý màng bồ đào [13],[14],[15]

Màng bồ đào thuộc tổ chức trung bì, còn gọi là mạch mạc, bao gồm 3phần: Mống mắt ở trước, thể mi ở giữa và hắc mạc ở sau Màng bồ đào cónăm nhiệm vụ chính: điều chỉnh ánh sáng, dinh dưỡng, tiết thể dịch, điều tiết

và tạo buồng tối để ảnh hiện rõ trên võng mạc

* Mống mắt:

- Mống mắt có hình đồng xu, có lỗ thủng ở trung tâm gọi là đồng tử.Mống mắt nằm ngay ở trước thể thủy tinh, ngăn cách giữa tiền phòng ở phíatrước và hậu phòng ở phía sau Chân mống mắt tiếp giáp với thể mi

- Từ trước ra sau mống mắt có 5 lớp tổ chức : lớp nội mô, lớp giới hạntrước, lớp đệm và lớp màng sau, nhưng 4 lớp trước đều là một tổ chức liên kết

có cùng hệ thống mạch máu và thần kinh dày đặc

- Đồng tử là một lỗ thủng ở trung tâm mống mắt Bình thường đồng tửhai mắt đều nhau, có hình tròn đường kính 2 - 4 mm Đồng tử thay đổi kíchthước do tác động của nhiều yếu tố: ánh sáng, nhìn xa, nhìn gần, các kíchthích thần kinh cảm giác

- Các mạch máu :

+ Các động mạch của mống mắt đều xuất phát từ vòng động mạch lớncủa mống mắt nằm trong thể mi Các tiểu động mạch đi từ vòng động mạchlớn theo hướng nan hoa về phía đồng tử và nối chắp chủ yếu ở chân mốngmắt và ở gần cơ vòng

+ Các tĩnh mạch của mống mắt xuất phát từ vòng quanh đồng tử đi theohướng nan hoa qua vùng thể mi, cùng với các tĩnh mạch của thể mi đổ vào 4tĩnh mạch trích trùng

- Các dây thần kinh của mống mắt:

+ Dây thần kinh cảm giác: là các nhánh thần kinh mi dài thuộc dây VI(dây thần kinh của Willis)

+ Các nhánh thần kinh vận động từ dây thần kinh mi ngắn đi từ hạch mi(nhánh của dây III) chi phối cơ vòng của mống mắt làm co đồng tử

+ Các nhánh thần kinh giao cảm đi từ hạch cổ trên chi phối cơ xòe củamống mắt làm giãn đồng tử và vận mạch

- Chức năng: mống mắt có nhiệm vụ như một màn chắn, để điều chỉnhlượng ánh sáng vào trong nhãn cầu nhờ thay đổi đường kính đồng từ do hoạtđộng của các cơ vòng và cơ xòe của mống mắt

* Thể mi:

- Thể mi là phần nhô lên của MBĐ, nằm giữa mống mắt ở phía trước vàhắc mạc ở phía sau, có hai chức năng chính:

+ Điều tiết giúp nhìn rõ các vật ở gần

+ Tiết ra thủy dịch nhờ các tế bào lập phương ở thể mi

- Từ ngoài vào trong gồm 7 lớp: lớp trên thể mi, lớp cơ thể mi, mạchmáu thể mi, lá thủy tinh, lớp biểu mô sắc tố, lớp biểu mô thể mi và lớp giớihạn trong

- Các mạch máu:

+ Các động mạch chủ yếu của vùng thể mi đều xuất phát từ vòng độngmạch lớn của mống mắt Vòng động mạch này nhận máu từ hai động mạch

mi dài sau và các động mạch mi ngắn trước

+ Các tĩnh mạch của thể mi đều chạy về hắc mạc ở phía sau và được đưa

* Hắc mạc:

- Hắc mạc là phần sau của MBĐ, có chứa nhiều mạch máu để nuôi nhãncầu và nhiều tế bào mang sắc tố đen hấp thụ các tia sáng từ ngoài vào làmthành buồng tối trong mắt, tạo điều kiện ảnh hiện rõ trên võng mạc

- Hắc mạc có 3 lớp từ ngoài vào trong: khoang thượng hắc mạc, lớp hắcmạc chính danh, màng Bruch

- Các mạch máu:

+ Có 20 động mạch mi ngắn bắt nguồn từ động mạch mắt xuyên quacủng mạc ở quanh thị thần kinh Các động mạch này chia nhánh chằng chịttrong hắc mạc và nối nhánh quặt ngược của vòng động mạch lớn của mốngmắt ở phía trước Trong vùng quanh đĩa thị, hai hoặc ba động mạch mingắn sau cấp máu nuôi dưỡng hắc mạc và thị thần kinh tạo thành vòngđộng mạch Zinn

+ Các tĩnh mạch của hắc mạc đổ về bốn tĩnh mạch trích trùng để chảy vềcác tĩnh mạch mắt

- Thần kinh: Các dây thần kinh của hắc mạc đều xuất phát từ các dâythần kinh mi ngắn và mi dài Các nhánh thần kinh nối chắp nhau tạo thànhmột mạng lưới thần kinh dày đặc, có các sợi thần kinh đi đến các mạch máu

và các sợi kéo dài tới tận lớp mao mạch hắc mạc tiếp xúc với cả màng Bruch

1.2 Bệnh viêm màng bồ đào

1.2.1 Định nghĩa viêm màng bồ đào

Catalan R.A, Nelson L.B năm 1992 trong một nghiên cứu của mình đãnêu ra định nghĩa về viêm màng bồ đào như sau [1]:

”Viêm MBĐ là một tên gọi chung về hình thái viêm nhiễm của MBĐ

Sự viêm nhiễm không chỉ giới hạn trong cấu trúc của MBĐ mà còn bao gồmcác cấu trúc không phải của MBĐ như: dịch kính, võng mạc, mạch máu võngmạc, trong mô sắc tố võng mạc, củng mạc và thượng củng mạc”

1.2.2 Nguyên nhân viêm MBĐ

Theo Nussenbatt, Whitcup, Polestine [16],[17],[18]:

Nguyên nhân nhiễm trùng:

- Vi khuẩn: lao, giang mai, liên cầu, não mô cầu

- Virus: HIV, Herper, CMV, Rubella

- Nấm: Candida, Aspergillus

- Ký sinh trùng: Toxoplasma, Giun toxocariasis

Nguyên nhân không do nhiễm trùng:

Nhãn viêm đồng cảm, Vogt Koyanagi - Harada, Behset, sarcoidose,viêm mạch võng mạc

Các tác giả khác như Amer, Kanski, Wong cho rằng viêm cột sống dínhkhớp hội chứng Reiter, bệnh viêm đường ruột, viêm khớp vảy nến, bệnh khớpthanh thiếu niên đều là nguyên nhân gây viêm MBĐ trước và có tỷ lệ HBLAB27 dương tính cao [18],[19],[20]

Theo Giles, Offret [21],[22]: Quá trình viêm nhiễm của MBĐ cho dù cănnguyên là nội sinh hay ngoại sinh thì đều biểu hiện dưới hai bệnh cảnh lâmsàng là viêm MBĐ làm mủ và viêm MBĐ không làm mủ

- Viêm MBĐ không làm mủ hay viêm MBĐ phản ứng là phản ứng viêmkhông đặc hiệu của MBĐ và thường có vai trò của các yếu tố miễn dịch bệnh lí

- Viêm MBĐ mủ: sự xuất hiện của một phản ứng viêm mủ trong MBĐhay dịch kính xảy ra do sự tỏa lan từ một ổ nhiễm trùng và thường ảnh hưởngtới cấu trúc cạnh nhãn cầu Nguồn gốc của nhiễm trùng có thể là ngoại sinh(các vết thương sau phẫu thuật, dị vật xuyên nhãn cầu, loét giác mạc) hay nộisinh (do vi khuẩn,nấm, ký sinh trùng hay virus) theo đường máu đến khu trú ởmắt [17],[23],[24],[25]

Theo Nguyễn Xuân Nguyên, Hà Huy Tiến, Cù Nhẫn Nại [26], Kanski[20], Hội nhãn khoa Mỹ [14] thì lại chia viêm MBĐ thành 2 hình thái:

- Viêm MBĐ ngoại sinh: Các yếu tố gây viêm MBĐ từ ngoài vào sau tổnthương tại mắt: vi khuẩn, virus, nấm, viêm MBĐ sau chấn thương xuyên,chấn thương đụng giập nhãn cầu, sau bỏng, viêm MBĐ sau phẫu thuật, viêmMBĐ sau viêm loét giác mạc, viêm củng mạc.

- Viêm MBĐ nội sinh: Các yếu tố gây bệnh trong cơ thể đi vào mắt quađường máu hoặc bạch mạch Các vi khuẩn, virus, nấm, ký sinh trùng từ các ổnhiễm khuẩn như: viêm phổi, mũi họng, răng hàm mặt, viêm da, đường tiêuhóa, thận, tủy xương Các yếu tố dị ứng trong bệnh viêm khớp, đốt sống, một

số yếu tố gây rối loạn chuyển hóa trong bệnh gút, đái tháo đường, nhữngbệnh mãn tính [19],[26] Ngoài ra một số lớn trường hợp không tìm thấynguyên nhân [18],[26]

1.2.3 Phân loại viêm MBĐ

Tùy theo từng tác giả hoặc nhóm tác giả mà có nhiều cách phân loại viêm MBĐ khác nhau

1.2.3.1 Phân loại theo cấu trúc giải phẫu

Theo Nguyễn Xuân Nguyên, Hà Huy Tiến, Cù Nhẫn Nại [26]:

- Viêm mống mắt

- Viêm mống mắt thể mi

- Viêm hắc mạc

Theo Amer Acad Ophth, Kanski, Spencer N.A [19],[20],[27]:

- Viêm MBĐ trước: gồm viêm mống mắt và thể mi

- Viêm MBĐ trung gian: là viêm phần giữa nhãn cầu trên Pars plana

- Viêm MBĐ sau: viêm chỉ có thể ảnh hưởng đến hắc mạc, đến võngmạc hoặc cả hai

- Viêm MBĐ toàn bộ: gồm viêm cả mống mắt - thể mi và hắc mạc

- Viêm nội nhãn: Viêm trong nhãn cầu chủ yếu là dịch kính và tiền phòng

1.2.3.2 Phân loại theo tiến triển của bệnh

Theo Catalan, Nelson [1], Kanski [20]:

- Viêm cấp tính: bệnh tiến triển dưới 3 tháng

- Viêm mạn tính: Bệnh tiến triển trên 3 tháng

Một số tác giả phân các nguyên nhân hay gặp theo tiến triển của bệnh [28]:

- Cấp tính: Viêm MBĐ trước vô căn, viêm đốt sống cổ, hội chứngReiter, Fuchs, hội chứng Vogt - Koyanagi - Harada, Toxoplasma, hoại tửvõng mạc cấp, nhiễm khuẩn sau phẫu thuật, chấn thương

- Mạn tính: Viêm khớp trẻ em, viêm MBĐ do lao, giang mai, sarcoidose,viêm Pars plana

1.2.3.3 Phân loại theo nguyên nhân

Viêm MBĐ do vi khuẩn, do virus, do nấm, do kí sinh trùng, do dị ứngliên quan đến yếu tố miễn dịch

1.2.3.4 Phân loại theo tổn thương giải phẫu bệnh

Theo Catalan [1], Kanski [20], Aubert, Baudet, Baudouin, Asbury [29]:

- Viêm MBĐ không u hạt

- Viêm MBĐ có u hạt

1.2.4 Cơ chế bệnh sinh viêm MBĐ

Sự thâm nhiễm dẫn đến mạch máu bị cương tụ, tiếp theo là giãn mạch,nghẽn mạch, tăng tính thấm, rò protein, tế bào xuyên mạch gây nên đục thủydịch Đó cũng là kết quả của quá trình phá vỡ hàng rào máu - thủy dịch Tếbào bạch cầu và các tế bào khác làm nên dấu hiệu Tyndall, tủa sau giác mạc,máu tiền phòng, mủ tiền phòng, lắng đọng các tế bào sau thể thủy tinh vàtrong dịch kính

Các tế bào viêm, mảnh vụn tế bào, tổ chức thoái hóa lắng đọng mặt saugiác mạc: theo các tác giả là sự nóng lên của thủy dịch khi đi qua mống mắt

và gặp giác mạc lạnh hơn nên gặp tủa loại này Ngoài ra còn hình thành dính

trước và dính sau mống mắt Các sắc tố xuất hiện mặt trước, sau thể thủy tinh

và dịch kính

Viêm giai đoạn đầu kích thích thể mi tăng tiết do vậy nhãn áp cao tạmthời Khi gây viêm teo thể mi thì nhãn áp có thể thấp Nhãn áp có thể tăngnhanh nếu các mảnh vụn viêm bít tắc vùng bè và bít đồng tử [1],[16],[17],[24],[26]

Sự thâm nhiễm có thể làm thể mi phù và kích thích xuất tiết protein vàohậu phòng và dịch kính trước Một màng xơ thể mi co kéo có gây bong Parsplana và hắc mạc phía trước, cuối cùng thể mi teo, xơ hóa và thoái hóa hyalin.Trong viêm hắc mạc, mạch máu giãn gây thoát mạch, mạch máu có viền bọctrắng do các tế bào viêm và xuất tiết ở xung quanh mạch Sự viêm nhiễmphần sau thường kéo theo giảm thị lực, nhìn hình biến dạng to ra hoặc nhỏ lại[1],[17],[24],[26]

1.2.5 Viêm MBĐ do cơ chế tự miễn

* Viêm MBĐ do phản vệ thể thủy tinh:

Do sự khác biệt giải phẫu của thể thủy tinh với phần còn lại của cơ thể ởgiai đoạn sớm của quá trình phát triển bào thai Vì thế sự tiếp xúc với khángnguyên thể thủy tinh ở giai đoạn sau này có thể dẫn đến một đáp ứng miễndịch đối với mô được coi là lạ Do đó lâm sàng được gọi là viêm MBĐ do thểthủy tinh Giác mạc có tủa dạng “mỡ cừu”, mạch máu mống mắt cương tụ, códính sau mống mắt, nhiều tế bào và Tyndall dày đặc

* Nhãn viêm đồng cảm:

Bệnh căn của nhãn viêm đồng cảm chưa được biết rõ, những giả thuyết gồm

có mẫn cảm với sắc tố, tác nhân nhiễm trùng hoặc mẫn cảm với kháng nguyên Scủa võng mạc hoặc các protein khác của võng mạc hoặc MBĐ [18],[19]

Trên lâm sàng viêm có thể xảy ra sớm ở mắt thứ 2 sau chấn thương mắtthứ nhất 10 ngày muộn nhất là 50 năm Thường sau 4 - 8 tuần, 80% xuất hiện

trong 3 tháng đầu Mắt gây đồng cảm thường bị kích thích dai dẳng dẫn đếnmột viêm MBĐ toàn bộ, âm ỉ, mắt bị đồng cảm có thể viêm MBĐ trước, viêmMBĐ sau, viêm MBĐ toàn bộ, MBĐ dày lên, tủa sau giác mạc dạng ”mỡcừu”, nốt thâm nhiễm ở mống mắt, dính chân mống mắt, viêm gai thị, kèmtheo hội chứng thần kinh, biến đổi sắc tố da niêm mạc, rụng lông, tóc, tế bàotrong dịch não tủy, rối loạn thính giác là những triệu chứng hiếm gặp nhưng

có giá trị cho việc chẩn đoán [17],[18],[19]

* Hội chứng Vogt - Koyanagi - Harada:

Hội chứng Vogt - Koyanagi - Harada là một rối loạn liên quan đến nhiều

hệ thống tổ chức bao gồm: mắt, tai, da và màng não Thường gặp ở người 30

-50 tuổi, không gặp ở trẻ em, ít gặp ở người già Bệnh căn còn chưa biết rõ.Người ta gợi ý cơ chế là một phản ứng miễn dịch đối với protein liên kết vớimelalin, những hắc tố bào, hoặc biểu mô sắc tố [17],[18],[19] Nhóm nghiêncứu viêm MBĐ của Mỹ cho rằng trọng tâm của giả thuyết ban đầu là vai tròcủa hắc tố như một kháng nguyên dẫn đến đáp ứng miễn dịch, nó đã đượcchứng minh trong thực nghiệm invitro [18]

Biểu hiện lâm sàng: hội chứng não - màng não:

- Thay đổi da và lông tóc (30%), bao gồm rụng lông tóc, bạc lông, bạchbiến da

- Những triệu chứng của thần kinh: đau đầu, cổ cứng, nôn

- Triệu chứng thính giác: ù tai, chóng mặt và điếc

Tăng lympho bào ở dịch não tủy

1.3 Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR)

Năm 1983, Kary Mullis đã phát hiện ra các nguyên tắc cơ bản giúp ông

có thể phát triển và triển khai thành công kỹ thuật PCR [30]

Phương pháp PCR là phương pháp dùng khuếch đại đoạn gen đích, ưuđiểm lớn nhất của phương pháp này là có xác định được hàm lượng DNA rấtthấp trong mẫu, khoảng 102 copies/ml

Nguyên lý của PCR là phản ứng hóa học tổng hợp DNA dựa trên sợiDNA khuôn mẫu ban đầu nhờ hoạt động của enzym DNA-polymerase Phảnứng dựa trên sự thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ, ban đầu DNA khuôn được biếntính từ sợi đôi thành sợi đơn ở nhiệt độ cao (khoảng 92oC), tiếp theo nhiệt độđược giảm xuống khoảng 55o đến 65oC để tạo điều kiện cho mồi gắn vàoDNA khuôn, sau bước này nhiệt độ lại tăng lên khoảng 72oC cho enzym hoạtđộng tổng hợp kéo dài chuỗi DNA từ trình tự mồi, sau 3 bước nhiệt độ, quátrình được quay lại từ bước một đến bước 3, cứ như vậy quá trình lặp lại liêntiếp khoảng 30 đến 35 chu kỳ Kết thúc phản ứng, lượng DNA tạo ra là Ax2n(A là số DNA khuôn ban đầu trong mẫu, n là chu kỳ nhiệt)

Thành phần chính tham gia phản ứng PCR là:

o DNA khuôn: là DNA của vius, vi khuẩn hay của tế bào sinh vật khác

o Mồi: là 2 trình tự nucleotide ngắn, đặc trưng cho gen cần nhân lên

o Enzym: Là emzym có hoạt tính DNA polymerase

o dNTPs: là các nucleotide dùng làm nguyên vật liệu tổng hợp DNA

o Đệm: là môi trường cho phản ứng, đệm chứa nước và một số ion cần thiết

Hình 1.1: Sơ đồ minh họa các bước phản ứng PCR (1 )Biến tính; (2) Gắn mồi; (3) Kéo dài chuỗi; (4) Sản phẩm

Trong một số kít thương mại như hãng Amplicor dùng một đoạn 104bptrên vùng bảo tồn của gen pre-core Ngoài ra PCR giúp phát hiện đột biến trêngen pre-core hay core promoter cũng như định lượng cccDNA (covalentlyclosed circular DNA) trong quá trình điều trị với thuốc kháng vius vàinterferon trên bệnh nhân

Trong kỹ thuật PCR, sau khi hoàn tất khuyếch đại đoạn DNA đích,người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước thí nghiệm để đọc kếtquả xác định có sản phẩm khuyếch đại mong muốn trong ống phản ứng haykhông Giai đoạn này được gọi là giai đoạn thí nghiệm sau PCR Trong giaiđoạn này người làm thí nghiệm có thể thực hiện điện di sản phẩm PCR trêngel agarose để xem có vạch sản phẩm khuyếch đại đúng kích thước mongmuốn hay không, cũng có thể thực hiện thí nghiệm lại với các đoạn dò đặc

hiệu (trên màng, trên giếng hay phiến nhựa…) để xem sản phẩm khuyếch đại

có trình tự mong muốn hay không Kỹ thuật PCR mà cần phải có giai đoạn thínghiệm để đọc và phân tích sau khi hoàn tất phản ứng khuyếch đại được gọi

*Nguyên lý phản ứng Real-time PCR:

Phản ứng Real-time sử dụng TaqMan probe được thiết kế gồm: Một bộ

mồi đặc hiệu và một chuỗi oligonucleotide (probe) có trình tự bổ sung vớiđoạn trình tự khuôn nằm giữa hai mồi

Mẫu dò oligonucleotide được thiết kế với đầu 5’ gắn chất phát tín hiệuhuỳnh quang (reporter) và đầu 3’ gắn một chất kìm hãm sự phát tín hiệuhuỳnh quang phát ra từ reporter được gọi chung là quencher Mẫu dò này ởtrạng thái nguyên vẹn (không bị phân hủy) Ở trạng thái bình thường (không

bị kích hoạt) thì toàn bộ năng lượng phát ra từ reporter được truyền sangquencher khiến cho reporter không phát được tín hiệu huỳnh quang mà chỉ cóquencher phát được, nhưng máy chủ sẽ không nhận được tín hiệu vì hệ thốngkính lọc không phù hợp với bước sóng phát ra từ quencher

Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bắt cặp bổ sung vào DNA khuôn

sau đó bị phân cắt bởi 5’exonuclease của TaqDNA polymerase trong quá

trình tổng hợp chuỗi Chính nhờ sự phân cắt này, reporter được giải phóngkhỏi quencher để phát tín hiệu huỳnh quang, đồng thời loại bỏ mẫu dò khỏi

khuôn DNA cho phép kéo dài tiếp sản phẩm PCR Reporter bị phân cắt khỏikhuôn DNA sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR có nghĩa là tín hiệu huỳnhquang thu được tỷ lệ với sự nhân lên của sản phẩm PCR

Hình 1.2 Nguyên lý phản ứng định lượng Real-time PCR sử dụng TaqMan probe

* Kỹ thuật PCR bao gồm 3 giai đoạn khác biệt nhau và được điều hòa bởinhiệt độ:

- Giai đoạn 1: chuỗi xoắn kép DNA khuôn bị biến tính, tách khỏi nhauthành hai chuỗi đơn nhờ nhiệt độ tăng lên (khoảng 94 - 95°C)

- Giai đoạn 2: Nhiệt độ được hạ xuống về nhiệt độ gắn mồi (40 - 72°C,thường là 55°C) cho phép các đoạn oligonucleotid gắn với sợi DNA khuôn.Trong quá trình gắn mồi, enzym DNA polymerase bền với nhiệt sẽ được hoạthóa và bắt đầu giai đoạn kéo dài mồi

- Giai đoạn 3: Nhiệt độ lại được nâng lên đến nhiệt độ tối ưu của enzyme(khoảng 72°C), xúc tác cho quá trình kéo dài phân tử DNA bắt đầu từ haiđoạn mồi

Hình 1.3 Hình minh họa kỹ thuật PCR (P1 và P2: các đoạn mồi)

Chu kỳ nhiệt gồm ba giai đoạn trên được nhắc lại 25 - 40 lần Số lượngchu kỳ tùy thuộc vào từng mục đích ứng dụng cụ thể

Cuối cùng sản phẩm của phản ứng được làm lạnh về nhiệt độ phòng hoặc4°C, tùy theo mục đích ứng dụng và loại thiết bị tạo chu kỳ nhiệt được sử dụng

* Vai trò của cặp mồi:

- Cặp mồi và đầu dò (probe) được thiết kế dựa trên chương trình Beacondesigner, trình tự mồi và đầu dò được thiết kế trên vùng bảo tồn đặc trưng cho

DNA genome của virus CMV và HSV, HZV

-Tất cả các trình tự mồi và đầu dò đều được khảo sát các đặc tính vềtrình tự nucleotide A,T,G,C; cấu trúc thứ cấp bằng phần mềm Beacondesigner Kết quả các thông số phải nằm trong giới hạn cho phép để đảm bảo

sự hoạt động tốt nhất của mồi và đầu dò Các trình tự này cũng được BLASTvới các trình gen trên NCBI để kiểm tra độ tương đồng của chúng với các

trình tự gen đích của CMV và HSV, HZV và các trình tự gen khác Mồi được

lựa chọn khi kết quả cho thấy các trình tự có độ tương đồng 100% với DNA

genome của CMV,HSV, HZV và không có sự tương đồng với các trình tự khác

hoặc nếu có thì rất thấp

- Các đoạn mồi (primers) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide cóchiều dài khoảng 20- 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu vớitrình tự của hai đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản Ở giai đoạn 2 các đoạn mồitìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích Giai đoạn 3 dướihoạt tính của men Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồiđang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nênmạch bổ sung Như vậy qua một chu kỳ nhiệt một DNA đích đã được nhânbản thành hai bản sao Nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 25 đến 40lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 225 đến 240 bản sao, tức làđến hàng tỷ bản sao.

* Quy trình ly trích DNA:

Ly trích DNA bằng bộ kit ly trích QIAamp DNA Mini USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Hình 1.4: Kit QIAamp DNA Mini ly trích DNA

1 Đặt mẫu vào ống Axygen, thêm 200 µl PBS 1X vào từng ống Ủ khoảng2-5 phút ở trong máy real-time PCR

2 Thêm 10 µl protease K và 200 µl dung dịch đệm AL Trộn đều bằng cáchvoltex 15 giây Spin down 10 giây

3 Ủ 56oC 10 phút Spin down 10 giây

4 Thêm 200 µl Ethanol 100% lạnh vào rồi lắc nhẹ Spin down 10 giây

5 Cho tất cả hỗn hợp này vào ống (1) có chứa QIAGEN (ống QIAGEN:610µl) Đậy nắp ống (1) lại Quay ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút

6 Lấy các chất có trong ống (1) cho vào 1 ống mới (ống 2), bỏ ống (1) đi.

7 Cho 500 µl dung dịch rửa AW1 vào ống (2) Ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút

8 Lại lấy các chất trong ống (2) cho vào 1 ống mới (ống 3), bỏ ống (2)

9 Cho 500 µl dung dịch rửa AW2 vào ống (3) Ly tâm 14.000 vòng 3 phút10.Lấy các chất trong ống (3) cho vào 1 ống Axygen mới (ống 4), bỏ ống (3)

11 Ly tâm 14.000 vòng 1 phút Lấy ống (4) cho vào 1 ống mới (ống 5), bỏ ống(4) Cho 100 µl dung dịch hòa tan AE vào ống (5) Ủ khoảng 1 phút ở nhiệt

độ phòng, quay ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút để ly trích được DNA

11 DNA sau tách chiết được kiểm tra bằng đo OD và điện di trên gel Agarose

Độ tinh khiết của dung dịch DNA được xác định bằng tỷ lệ giữa độ hấpthụ quang của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm và 280 nm (A260/A280)

Độ tinh khiết tốt nhất trong khoảng 1,8 – 2,0 Nếu độ tinh khiết <1,6 chứng tỏmẫu còn lẫn protein, dựa vào mục đích sử dụng DNA tách chiết được để xemxét có thể sử dụng được hay phải tinh sạch lại

Độ tinh khiết được kiểm tra song song bằng điện di dung dịch DNA trêngel agarose 1%

1.3.1 CytoMegalovirus (CMV) [31]

CMV thuộc họ Herpes Viridae có acid Nucleic là DNA hai sợi thẳng,capsid có đối xứng hình khối bao gồm 162 capsome, có vỏ ngoài, virus đượclấy từ màng nhân tế bào, có dạng hình cầu, đường kính từ 120 - 200nm, lắpráp trong nhân tế bào, nhạy cảm Ether, gây nhiễm nhiều loài động vật vàngười Trên cơ thể người CMV nhân lên trong tế bào của nhiều cơ quan như

tế bào tuyến nước bọt, tế bào gan, thận, phổi Gần đây virus này được xácđịnh trong tế bào lymphocyte ở máu người bệnh khỏe mạnh có phản ứnghuyết thanh dương tính

Đặc điểm cơ bản của bệnh do CMV gây ra là những thể vùi khổng lồtrong nhân tế bào bị nhiễm CMV có ba hình thái nhiễm trùng là gây hủy hoại

tế bào (bệnh cấp tính), tiềm tàng và nhiễm virus thể ẩn

Đa số người bị nhiễm CMV không có triệu chứng lâm sàng Các cá thể

có biểu hiện lâm sàng thường là các đối tượng có nguy cơ cao nhất như bịnhiễm ở thời kỳ chu sinh, điều trị ức chế miễn dịch, truyền máu hoặc ghép cơquan Nhiễm CMV ở người lớn là khá phổ biến, tỉ lệ nhiễm CMV tăng dần từthời thơ ấu đến tuổi thành niên Sự lây nhiễm virus dễ dàng do tiếp xúc gầngũi với các cá thể Người ta biết đến viêm võng mạc do CMV là một trongnhững nhiễm trùng cơ hội hay gặp nhất trên các bệnh nhân AIDS, điển hìnhđặc trưng là có CD4+ lymphocyte < 50 tế bào/ µL Dù số lượng ca bệnh giảmkhi sử dụng phác đồ HAART nhưng các ca mới vẫn được ghi nhận Các bệnhnhân viêm võng mạc do CMV bị giảm thị lực, có thể dẫn đến mù nếu khôngđược điều trị Bệnh có thể biểu hiện ở một mắt hoặc hai mắt Điều trị viêmvõng mạc do CMV cần phải kéo dài để ngăn ngừa tái phát Viêm mống mắt

do CMV có thể biểu hiện từng đợt, thường sợ ánh sáng, giảm thị lực, đaunhãn cầu Một số bệnh nhân có phù hoàng điểm dẫn đến mất thị lực hoặcbệnh lý màng bồ đào và võng mạc tăng sinh, xuất huyết võng mạc tự phát vàbong võng mạc

Hình 1.5 Hình ảnh viêm võng mạc do CMV

1.3.2 Herpes Simplex virus (HSV) [13],[31]

HSV gây nhiễm cho tế bào người bởi đặc trưng gây tổn thương lớp niêmmạc và xuất hiện các tiểu thể nội bào Sự xuất hiện của virus ở nhân và chấtnguyên sinh đã được chứng minh bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

HSV có hai type huyết thanh là HSV1 và HSV2 Chúng có khángnguyên rất giống nhau nhưng vẫn tách biệt được bằng kỹ thuật trung hòa hoặchuỳnh quang Hai type này cũng gây nhiễm những cơ quan khác nhau:

- HSV1: Thường gây nhiễm phần trên thắt lưng như mắt, mồm, môi, da…

- HSV2: Thường gây nhiễm phần dưới thắt lưng, đặc biệt là nhiễm virusđường sinh dục và tiết niệu

Nhiễm HSV lần đầu thường nặng, biểu hiện toàn thân và có thể tử vong

Sơ nhiễm thường xảy ra với người chưa bị nhiễm hoặc chưa có kháng thểtrung hòa HSV gây sơ nhiễm thường không thể loại trừ ra khỏi cơ thể mà nótồn tại tiềm ẩn Tái nhiễm HSV có thể với Serotype khác Với các cá thể đã cókháng thể trung hòa chỉ bị nhiễm HSV khu trú mà không bị nhiễm toàn thân Tại mắt HSV có thể gây ra viêm kết mạc - giác mạc, viêm màng bồđào Viêm màng bồ đào do HSV có ba hình thái: viêm mống mắt- thể mi -giác mạc, viêm mống mắt - thể mi không có viêm giác mạc, viêm hắc võngmạc [32]

+ Viêm mống mắt - thể mi - giác mạc do HSV:

Hay gặp viêm mống mắt - thể mi nhẹ, thoáng qua và tự ổn định Có ít tủagiác mạc, ít tế bào trong thủy dịch Tổn thương giác mạc thường là loét giácmạc hình cành cây hoặc viêm giác mạc hình đĩa, cảm giác giác mạc giảm

Có thể thấy viêm mống mắt - thể mi - giác mạc nặng: cương tụ rìanhiều, tủa giác mạc to và nhiều ở toàn bộ giác mạc, thủy dịch đục nhiều, cóthể xuất huyết hoặc mủ tiền phòng, dính sau Thường có tăng nhãn áp donghẽn hoặc viêm vùng bè Hình thái này có thể do virus xâm nhập trực tiếp

ở màng bồ đào

Hình 1.6: Hình ảnh viêm giác mạc do HSV

+ Viêm mống mắt - thể mi không có viêm giác mạc do HSV:

Tổn thương do virus xâm nhập trực tiếp ở màng bồ đào, có thể kèm theotổn thương Herpes ở mặt hoặc ở đường sinh dục Mắt đau đỏ, tủa giác mạcnhiều, tyndal dương tính, tiền phòng có thể có mủ hoặc máu, dính sau, có thểteo mống mắt từng mảng và thường teo mống mắt ở gần cơ vòng đồng tử.Hay có tăng nhãn áp do viêm vùng bè hoặc nghẽn bè Có thể có biến chứngđục thủy tinh thể

Hình 1.7: Hình ảnh viêm mống mắt thể mi do HSV

+ Viêm hắc võng mạc do HSV:

Tổn thương do virus xâm nhập vào hắc mạc hoặc do một quá trình miễndịch trong đợt nhiễm HSV toàn thân có thể có viêm não do HSV Những ổviêm hắc võng mạc hoại tử ở cả hai mắt, xuất tiết màu vàng trắng, ranh giới

rõ, võng mạc phù đục tỏa lan, đục dịch kính Có thể có viêm quanh mạchmáu, xuất huyết võng mạc, phù gai thị Bong võng mạc xuất tiết là biến chứngphổ biến Khi viêm thành sẹo, có biến đổi sắc tố võng mạc, những vùng mấtsắc tố và những vùng tăng sinh sắc tố.

1.3.3 Herpes Zoster virus (HZV) [14]

Thông thường viêm màng bồ đào do Herpes Zoster virus là một viêmgiác mạc – mống mắt thứ phát sau bệnh giác mạc Đôi khi viêm mống mắt cóthể xảy ra mà không có viêm giác mạc rõ ràng Trong nhiều trường hợp viêmtrở thành mạn tính Cần nghĩ đến Herpes Zoster trong chẩn đoán phân biệtcủa mống mắt – thể mi một bên mạn tính, ngay cả khi triệu chứng da đã cótrong quá khứ hoặc thậm chí nếu có thì rất ít

Những mụn nước ở cạnh đầu mũi chứng tỏ tổn thương thần kinh mũi

-mi và có nhiều khả năng mắt sẽ bị tổn thương

Tủa trong viêm màng bồ đào do HZV đôi khi có hình sao Tủa giác mạchình sao thường phân bố tỏa lan, trái ngược với phân bố thông thường ở mộtphần ba dưới giác mạc (tam giác Arlt) Ngoài ra tủa giác mạc nhỏ và hìnhdạng sợi, thường có hình sao rõ ràng khi khám bằng sinh hiển vi với độ phóngđại cao Ở những bệnh nhân có bệnh Herpes và giác mạc đồng thời, dù nhẹđến mức nào, viêm phần trước cũng có thể kèm theo giảm cảm giác giác mạctỏa lan hoặc khu trú và viêm giác mạc do dinh dưỡng thần kinh

Teo mống mắt cũng đặc hiệu cho viêm do Herpes, đặc biệt là HerpesZoster Đối với Herpes Zoster teo thường xảy ra ở gần chân mống mắt Teomống mắt khu vực là đặc điểm của Herpes Zoster, nó gây ra viêm tắc mạchmáu nhu mô mống mắt là nguyên nhân của hình thái khác biệt này

Viêm võng mạc do HZV có thể gặp, đặc biệt ở những túc chủ bị suygiảm miễn dịch Viêm mạch máu thường xảy ra trong bệnh Zona mắt và gâythiếu máu cục bộ phần trước, tắc động mạch võng mạc và viêm củng mạc.Viêm mạch máu trong hốc mắt có thể dẫn đến liệt cơ