Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm beauveria và paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại đồng bằng sông cửu long tt

Xác định loài, đặc diểm sinh học và bước đầu đánh giá hiệu quả trừ sùng khoai lang Cylas formicarius Fabricius trong điều kiện phòng thí nghiệm của các chủng nấm Beauveria ký sinh trê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: PGS.TS Trần Văn Hai

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường

Họp tại:

Vào lúc … giờ … ngày … tháng … năm …

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Huỳnh Hữu Đức và Trần Văn Hai, 2016 Xác định loài, đặc diểm

sinh học và bước đầu đánh giá hiệu quả trừ sùng khoai lang (Cylas

formicarius Fabricius) trong điều kiện phòng thí nghiệm của các

chủng nấm Beauveria ký sinh trên côn trùng gây hại phân lập tại Đồng bằng sông Cửu Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần

Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp ISSN 1859-2333 (3): 36-46

2 Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2016 Phân lập, định danh và

bước đầu đánh giá hiệu quả phòng trừ rệp sáp Planococcus lilacinus của các chủng nấm Paecilomyces javanicus thu thập tại Đồng bằng

sông Cửu Long Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Số

chuyên đề: Nông Nghiệp Xanh ISSN 1859-4581: 109-116

3 Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2018 Hiệu quả của chế phẩm

nấm Paecilomyces javanicus (Friedrichs and Bally) phòng trừ rệp sáp

Planococcus lilacinus (Cockerell) ở điều kiện phòng thí nghiệm và

nhà lưới Tạp chí Bảo vệ thực vật ISSN 2354-0710 1(276): 32-37

4 Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2018 Ảnh hưởng của một số

loài thuốc trừ nấm đến tỷ lệ nảy mầm, sự phát triển của tản nấm và

khả năng hình thành bào tử của nấm Beauveria bassiana (Bals.) Vuill

Tạp chí Bảo vệ thực vật ISSN 2354-0710 1(276): 42-48

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu

Một tập hợp đa dạng của vi sinh vật khác nhau hiện đang được xem xét như là các tác nhân sinh học kiểm soát côn trùng như: virus,

vi khuẩn, động vật nguyên sinh và nấm Trong đó giới nấm, theo ước tính của các nhà khoa học có khoảng 1,5 triệu loài (Hawksworth, 2001; Mueller and Schmit, 2007; Schmit and Mueller, 2007), với

khoảng 110.000 loài được mô tả (Kirk et al., 2008) Trong số này, 700

loài trong 90 chi được công nhận là tác nhân gây bệnh côn trùng (Roberts and Humber, 1981), và khoảng 170 sản phẩm kiểm soát dịch hại đã được phát triển dựa trên ít nhất 12 loài nấm ký sinh côn trùng (De Faria and Wraight, 2007) Các nghiên cứu tập trung phát triển và ứng dụng các loài ký sinh côn trùng thuộc Hyphomycetes trong đó có

nấm Beauveria và Paecilomyces Nấm ký sinh gây bệnh trên côn trùng Beauveria bassiana và Paecilomyces javanicus là loài nấm

được quan tâm nghiên cứu phát triển và ứng dụng nhiều do có phổ ký chủ rộng, ký sinh gây chết nhiều loại côn trùng gây hại nông lâm nghiệp, đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trên thế giới

như là tác nhân phòng trừ sinh học Nấm B bassiana đã được nhiều

nước trên thế giới như Mỹ, Canada, Anh, Úc, Nhật, Philippines, Trung Quốc… sử dụng để phòng trừ nhiều đối tượng sâu hại cây trồng như bọ hung hại mía, bọ hung hại củ cải đường, ruồi hại rễ bắp cải, củ cải… đạt kết quả tốt, đặc biệt là những loài sâu hại cây rừng như sâu róm thông, bọ hại dừa, châu chấu hại tre, mía, mối đất hại cây

ăn quả, sùng hại mía (Ferron, 1978; Rombach et al., 1988; Phạm Thị Thùy, 2004; Trần Văn Mão, 2004) Chủng nấm P javanicus kết hợp

hoạt chất Azadirachtin (tỷ lệ 100:0,05-0,25) dưới dạng bột hòa nước, huyền phù hoặc dạng nhũ dầu để phòng trừ một số loại sâu hại cây

trồng như sâu tơ, rầy phấn trắng, rầy mềm… Việc kết hợp nấm tím P

javanicus và hoạt chất Azadirzachtin giúp tăng hiệu lực của nấm ký

sinh đồng thời giảm lượng hoạt chất Azadirachtin trong phòng trừ sâu hại, ngoài ra còn kết hợp với hoạt chất Cypermethrin (100 : 0,25 -

0,56) và Acetamiprid (tỉ lệ 100 : 1,5 - 10) dưới dạng bột hòa nước để phòng trừ sâu hại, đặc biệt là các loài chích hút, còn có tác dụng ngăn ngừa tốt các loài dịch hại như bướm sâu tơ, rầy mềm, bọ trĩ., (Huang

Zhen and Ren Shunxiang, 2008a, 2008b, 2008c)

Tại Đồng bằng Sông Cửu Long, khoai lang và cây ăn trái chiếm diện tích tương đối lớn Dịch hại thường xuất hiện là sùng

(Cylas formicarius Fabricius) gây hại trên khoai lang và rệp sáp

(Planococcus lilacinus Cockerell) gây hại trên nhiều loại cây ăn trái

(mãng cầu, sầu riêng, khóm,…) gây ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng sản phẩm nên nông dân đã sử dụng rất nhiều thuốc bảo vệ thực vật để quản lý đối tượng trên, làm lưu tồn một lượng lớn thuốc BVTV trong sản phẩm có ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người tiêu dùng Vì thế, việc nghiên cứu các tác nhân phòng trừ sinh học để quản lý côn trùng gây hại có hiệu quả thay thế dần thuốc BVTV là hết sức cần thiết trong thực tế sản xuất hiện nay

Xuất phát từ thực tế, đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm

hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm

Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được

phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long” đã được thực hiện

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Thu thập và định danh đến loài của các chủng nấm thuộc hai

chi Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên một số loài côn trùng gây

hại tại các tỉnh vùng ĐBSCL

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, khả năng ký sinh gây bệnh, các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của các

chủng nấm Beauveria và Paecilomyces đã định danh đến loài

Tuyển chọn các chủng nấm Beauveria có khả năng ký sinh

cao sùng khoai lang C formicarius Fabricius ở điều kiện phòng thí

nghiệm để sản xuất chế phẩm Đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm

Beauveria ký sinh SKL ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và

ngoài đồng

Tuyển chọn các chủng nấm Paecilomyces có khả năng ký sinh cao rệp sáp P lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm để sản xuất chế phẩm Đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm Paecilomyces ký sinh rệp sáp P lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài

đồng

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đề tài có ý nghĩa khoa học cao vì nghiên cứu chi tiết có hệ thống từ trong phòng thí nghiệm, nhà lưới đến ngoài đồng ruộng nên cung cấp nhiều số liệu khoa học về đặc điểm hình thái, sinh học và

đánh giá hiệu lực của nấm B bassiana và P javanicus (I javanica)

nhằm thiết lập những thông tin cơ bản về các chủng nấm phân lập tại ĐBSCL Ngoài ra, kết quả của đề tài sẽ mở ra hướng quản lý phòng trừ một số loài côn trùng gây hại cây trồng theo IPM, để thay thế các loại thuốc hóa học cũng là cơ sở cho hướng nghiên cứu tiếp theo về đấu tranh sinh học côn trùng

1.4 Những đóng góp mới của luận án

Phân lập được 16 chủng nấm Beauveria ký sinh trên côn trùng tại 7 tỉnh ĐBSCL thuộc loài B bassiana Trong đó, tuyển chọn được

hai chủng Bb4(SKL-VL) và Bb5(SKL-HG) để sản xuất chế phẩm

Phân lập được 22 chủng nấm Paecilomyces ký sinh trên côn

trùng tại 6 tỉnh ĐBSCL trong đó định danh được 14 chủng nấm thuộc

loài P javanicus và 8 chủng nấm thuộc loài Purpureocillum

lilacinum Kết quả, tuyển chọn được hai chủng Pj6(Pl-TG) và Pj8CT) để sản xuất chế phẩm

(Pl-Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và

phát triển của nấm B bassiana và P javanicus trong điều kiện phòng

thí nghiệm

Xác định một số hoạt chất hoá học trừ nấm vô hại đối với sự

phát triển của nấm B bassiana ở nồng độ thấp (½ nồng độ liều

khuyến cáo) hoặc ảnh hưởng vừa (ở nồng độ liều khuyến cáo) như

Metalaxyl, Fenoxanil và Validamycin Đối với P javanicus hợp chất

Fenxanil, Kasugamycin và Picoxystrobin tỏ ra vô hại hoặc ảnh hưởng

vừa Tuy nhiên, đối với nấm B bassiana rất dễ bị ảnh hưởng ngay cả nồng độ rất thấp (½ nồng độ liều khuyến cáo) so với P javanicus trên

cùng hợp chất thuốc hoá học trừ nấm

Đối với chế phẩm nấm B bassiana dạng tươi để phòng trừ SKL và chế phẩm nấm P javanicus dạng tươi để phòng trừ rệp sáp P

lilacinus gây hại mãng cầu xiêm đều cho kết quả phòng trừ tốt khi sử

dụng liều lượng 3,0 - 3,5 kg/ha với mật số bào tử chế phẩm khoảng >

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi

Beauveria và Paecilomyces bằng phương pháp truyền thống dựa

trên đặc điểm hình thái học và kỹ thuật công nghệ sinh học phân

tử

3.2.1.1 Phân lập và định danh loài nấm ký sinh trên một số sâu

hại cây trồng thuộc chi nấm Beauveria và Paecilomyces theo phương pháp truyền thống

Thu thập côn trùng gây hại bị nhiễm nấm ký sinh tại 7 tỉnh vùng Đồng bằng Sông Cửu Long như: Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng và Trà Vinh về phòng thí nghiệm Bộ môn BVTV để phân lập tác nhân Nấm được nuôi cấy trên

môi trường PDA, tạo dòng thuần bằng phương pháp nuôi cấy đơn bào

tử của nấm Beauveria và Paecilomyces trên môi trường PDA, lưu trữ

trực tiếp trên môi trường ở nhiệt độ -37oC Định danh nấm theo Barnett and Barry (1972), Lawrence (1994), De Hoog (1972),

Luangsa-Ard et al (2006)

Các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces sau khi được tách

dòng thuần được nuôi cấy trên môi trường PDA trong đĩa petri (đường kính 9cm) ở nhiệt độ 27±2oC và 12 giờ sáng tối Lấy khoanh sợi nấm từ rìa mép của tản nấm 3 ngày tuổi đặt vào giữa đĩa petri chứa khoảng 10 mL môi trường nuôi cấy ở vị trí úp ngược cho sợi nấm tiếp xúc trực tiếp với môi trường nuôi cấy, tất cả thí nghiệm được lập lại 5 lần cho mỗi mẫu phân lập

Đặc điểm nhận dạng và chỉ tiêu theo dõi: đặc điểm tản nấm, đặc

điểm cơ quan sinh bào tử và hình dạng bào tử và kích thước bào tử

3.2.1.2 Định danh loài và phân tích một số khác biệt di truyền của

chủng nấm Beauveria sp và Paecilomyces spp dựa trên trình tự

DNA vùng ITS-rDNA

Chiết xuất DNA tổng số theo quy trình của Saitoh et al

(2006) Sau khi có lượng DNA sẽ thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA, đọc kết quả và giải trình tự vùng ITS-rDNA

Vùng ITS-rDNA được nhân lên bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS5 (5’- GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G - 3’) và ITS4 (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC - 3’) Các sản phẩm PCR được giải trình tự và dựa vào kết quả giải trình tự để so sánh với

các trình tự vùng ITS-rDNA của chủng nấm Beauveria và

Paecilomyces trên thế giới đã biết tên loài từ cơ sở dữ liệu của

Genbank làm cơ sở xác định tên loài của chủng nấm Beauveria và

Paecilomyces thu thập được

Sơ đồ phân nhóm xác định loài nấm thuộc chi Beauveria và

Paecilomyces sẽ được xử lý bằng phương pháp Maximum likelihood

dựa trên tình tự của vùng ITS-rDNA và phân tích bootstrap với 1.000 lần lập lại Sử dụng các chương trình phylogenetic (BioEdit, Clustalx

3.1 và Treeview) để quan sát mối quan hệ di truyền qua cây phả hệ của các loài nấm và tính tỷ lệ tương đồng giữa các DNA của các mẫu nấm thu thập

3.2.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm Beauveria

400 cho mỗi mẫu phân lập

3.2.2.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của

nấm Beauveria và Paecilomyces

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp bố trí hai nhân

tố, trong đó nhân tố A là các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces

phân lập được và nhân tố B là năm loại môi trường dinh dưỡng khác nhau PDA, CDA, SDAY1, SDAY3, SDAY - Chitin với 4 lần lặp lại Mỗi lần lặp lại sử dụng một đĩa petri có chứa 10 mL môi trường cần khảo sát Cấy một khoanh nấm có đường kính khoảng 10 mm vào giữa đĩa môi trường để úp ngược tiếp xúc trực tiếp môi trường nuôi cấy và đặt ở nhiệt độ phòng và 12 giờ sáng tối Các chỉ tiêu theo dõi:

Diện tích tản nấm (cm2)

Số bào tử (bt/mL) * V (mL) huyền phù thu được trên đĩa

Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày): trung bình của 3 lần

đo đường kính tản nấm từ 5 - 7, 7 - 9 và 9 - 11 ngày sau khi cấy

Mật số bào tử/cm2: được tính 1 lần ở thời điểm 15 ngày sau khi nuôi cấy theo phương pháp sau: Tính mật số bào tử theo phương pháp đếm mật số bào tử trực tiếp bằng buồng đếm Thoma

Số bào tử/mL = (4 a x 106) / b Trong đó: a: số bào tử có trong thể tích huyền phù ứng với diện tích ô nhỏ (= 1/400 mm2) x độ sâu 0,1 mm; b: hệ số pha loãng

Mật số bào tử/cm 2=

3.2.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và hình thành

bào tử của nấm Beauveria và Paecilomyces

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Uma et al

(2005), Võ Thị Thu Oanh (2010) Thí nghiệm được lập lại 4 lần cho mỗi mẫu phân lập, cấy các khoanh nấm (10 mm) lên bề mặt của đĩa petri có chứa khoảng 10ml môi trường nuôi cấy được lựa chọn từ thí nghiệm 3.2.2.2 và đặt ở các mức nhiệt độ 20, 25, 28, 30, 35oC trong tủ

ổn định Các chỉ tiêu theo dõi: tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày),

số lượng bào tử/cm2 (tương tự thí nghiệm 3.2.2.2) Khả năng bào tử nẩy mầm ở nhiệt độ cao (%)

Đánh giá khả năng nẩy mầm của các chủng nấm Beauveria và

Paecilomyces ở các mức nhiệt độ cao, bao gồm các nghiệm thức sau:

25o - 30o - 35o - 38oC, trong đó, nghiệm thức 25oC là nhiệt độ đối chứng Trải đều 0,1 mL dịch bào tử (106 bào tử/mL) trên các lame có phủ một lớp môi trường nuôi cấy và được đặt trong đĩa petri có lót giấy thấm để giữ ẩm, mỗi mẫu phân lập thực hiện trên 4 lame tương ứng với 4 lần lặp lại Tiếp theo, tiến hành đặt các đĩa petri vào tủ định

ôn cài đặt các mức nhiệt độ cao (30o - 35o - 38o) trong 8 giờ, sau đó chuyển về nhiệt độ đối chứng 25oC trong 16 giờ Tỷ lệ bào tử nẩy mầm (%) được đánh giá một lần sau 24 giờ (8 giờ ở nhiệt độ cao (30o

- 35o - 38oC) và 16 giờ ở nhiệt độ đối chứng 25oC) Phương pháp lấy chỉ tiêu tương tự thí nghiệm 3.2.2.1

3.2.2.4 Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ nấm đến sự phát

triển và nẩy mầm của nấm Beauveria và Paecilomyces

Thí nghiệm theo phương pháp của Hokkanen and Kotiluoto,

1992; Rachappa, 2006; Amutha et al., 2010 và Usha et al., 2014 Thí

nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, năm lần lặp lại tương ứng với năm đĩa petri Các nghiệm thức bao gồm các loại thuốc trừ nấm được khảo sát và nghiệm thức đối chứng không xử lý thuốc

Bảng 3.1 Mười loại thuốc trừ nấm sử dụng để đánh giá ảnh hưởng thuốc

trừ nấm đến sự phát triển và nẩy mầm đối với nấm Beauveria

1 Propiconazole + Tricyclazole Tillage super 525SE 1,0

2 Azoxytrobin + Difenoconazole Amistartop 325SC 1,0

Bảng 3.2 Năm loại thuốc trừ nấm sử dụng để đánh giá ảnh hưởng thuốc trừ

nấm đến sự phát triển và nẩy mầm đối với nấm Paecilomyces

1 Azoxytrobin + Difenoconazole Amistartop 325SC 1,0

Sau đó, cho 10 mL hỗn hợp vào đĩa petri, cấy khoanh nấm Beauveria

và Paecilomyces (chọn chủng nấm thích hợp dựa vào kết quả của thí

nghiệm trước đó) với đường kính 10 mm vào giữa đĩa môi trường hỗn hợp và đặt ở nhiệt độ phòng Các chỉ tiêu theo dõi sau 15 và 24 ngày nuôi cấy gồm:

Đường kính tản nấm (cm): tương tự thí nghiệm 3.4.2.2, tính thành phần trăm sự phát triển của sợi nấm bị ức chế so với đối chứng theo công thức Abbott (1925):

I = 𝐂−𝐓

𝐂 x 100

Trong đó: I: % tản nấm bị ức chế; C: đường kính tản nấm được đo ở nghiệm thức đối chứng; T: đường kính tản nấm được đo ở

nghiệm thức xử lý thuốc (Theo công thức Abbott, 1925)

Ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ: (Usha

Các giá trị T để phân loại về hiệu quả của sản phẩm hóa học trên các loại nấm như: 0 - 30 (rất ảnh hưởng), 31 - 45 (ảnh hưởng), 46

- 60 (ảnh hưởng vừa) và > 60 (vô hại)

Số lượng bào tử/cm2, tỷ lệ bào tử nẩy mầm (%) (tương tự thí nghiệm 3.2.2.1 và 3.2 2.2)

3.2.3 Bước đầu đánh giá độc tính của các chủng nấm Beauveria

ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và

Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus

Cockerell) ở điều kiện phòng thí nghiệm (PTN)

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm các chủng nấm

Beauveria (Paecilomyces) được phân lập và nghiệm thức đối chứng

Mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại gồm 30 thành trùng SKL (RS), mỗi thành trùng được nuôi riêng trong hộp nhựa nhỏ có lót giấy thấm giữ ẩm và có thức ăn là khoai lang (lá sầu riêng hoặc mãng cầu) Đối với nghiệm thức xử lý nấm, sử dụng nồng độ huyền phù bào tử nấm 5 x 108 bào tử/mL Xử lý trực tiếp lên SKL (RS) bằng cách sử dụng bình phun thuốc cầm tay với lượng dung dịch phun 25 - 30 mL

cho bốn lần lặp lại/chủng nấm Đối với nghiệm thức đối chứng ta pha dung dịch nước có thêm Tween 20 (0,1%) và xử lý SKL (RS) cũng giống như các nghiệm thức xử lý nấm Các chỉ tiêu theo dõi: ghi nhận

số SKL (RS) sống và bị chết do nấm trên mỗi nghiệm thức, độ hữu hiệu được hiệu đính bằng công thức Abbott (1925)

3.2.4 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên SKL (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh

trên RS (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện PTN

Tuyển chọn các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces để sản

xuất chế phẩm dạng tươi theo quy trình nhân nuôi nấm được nêu ở phụ chương của luận án Sau đó, tiến hành khảo sát hiệu lực chế phẩm

ở điều kiện PTN, nhà lưới và ngoài đồng

3.2.4.1 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên SKL (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh

trên RS (Planococcus lilacinus Cockerell) với 3 mật số bào tử

(bt/mL) ở điều kiện PTN

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức (3

nghiệm thức tương ứng với 3 nồng độ chế phẩm nấm Beauveria (Paecilomyces) và 1 nghiệm thức đối chứng là dung dịch nước có

thêm chất loang trải bề mặt (CLTBM) Mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại gồm 30 thành trùng SKL (RS), mỗi thành trùng được nuôi trong hộp nhựa có lót giấy thấm giữ ẩm và có thức ăn là khoai lang (lá sầu riêng hoặc mãng cầu) Sử dụng nồng độ huyền phù bào tử nấm ở 3 nồng độ (5 x 107), (5 x 108) và (5 x 109)bào tử/mL cộng CLTBM Lực Sĩ Kiến Càng 0,4 mL/L Xử lý trực tiếp lên SKL (RS) bằng cách sử dụng bình phun thuốc cầm tay với lượng dung dịch

phun 25 - 30 mL cho bốn lần lặp lại/nghiệm thức Các chỉ tiêu theo dõi (tương tự thí nghiệm 3.2.3)

3.2.4.2 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên SKL (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh

trên RS (Planococcus lilacinus Cockerell) với bốn liều lượng sử

dụng nấm (kg/ha) ở điều kiện PTN

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức (4

nghiệm thức tương ứng với 4 liều lượng chế phẩm nấm Beauveria (Paecilomyces) và 1 nghiệm thức đối chứng là dung dịch nước có

thêm CLTBM Mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại gồm 30 thành trùng SKL (RS), mỗi thành trùng được nuôi trong hộp nhựa có lót giấy thấm giữ ẩm và có thức ăn là khoai lang (lá sầu riêng hoặc mãng cầu) Sử dụng 4 liều lượng chế phẩm nấm 2 - 2,5 - 3 - 3,5 kg/ha cộng CLTBM Lực Sĩ Kiến Càng 0,4 mL/L Xử lý trực tiếp lên SKL (RS) bằng cách sử dụng bình phun thuốc cầm tay với lượng dung dịch phun 25 - 30 mL cho 4 lần lặp lại/nghiệm thức Các chỉ tiêu theo dõi (tương tự thí nghiệm 3.2.3)

3.2.4.3 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên SKL (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh

nấm (kg/ha) ở điều kiện nhà lưới

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm

thức, trong đó có: 4 nghiệm thức xử lý chế phẩm nấm Beauveria (Paecilomyces) và 1 nghiệm thức đối chứng là dung dịch nước có

thêm CLTBM Mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại tương ứng với 4 chậu khoai lang (cây mãng cầu), mỗi chậu thả 30 thành trùng SKL (RS) thực hiện với nghiệm thức Sử dụng 4 liều lượng chế phẩm nấm trắng

2 - 2,5 - 3 - 3,5 kg/ha cộng CLTBM Lực Sĩ Kiến Càng 0,4 mL/L Xử

lý trực tiếp lên SKL (RS) bằng cách sử dụng bình phun thuốc cầm tay với lượng dung dịch phun 10 mL/chậu Tiến hành phun chế phẩm vào lúc sáng sớm Các chỉ tiêu theo dõi (tương tự thí nghiệm 3.2.3)

3.2.5 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm các chủng nấm Beauveria

ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và

Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus

Cockerell) ở điều kiện ngoài đồng

Thí nghiệm diện hẹp được thực hiện theo “Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực của các thuốc bảo

vệ thực vật phòng trừ sâu và nhện hại cây trồng” số QCVN 01 - 1: 2009/BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ban

3.2.5.1 Khảo sát hiệu lực chế phẩm nấm trắng Beauveria ký sinh trên SKL (Cylas formicarius Fabricius) ở điều kiện ngoài đồng

Thí nghiệm được thực hiện trên nền đất chuyên canh màu có diện tích canh tác là 1000 m2 tại ấp Tân Qui, xã Tân Bình, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long, 2016 Thí nghiệm được

bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức, 4 lần lặp lại Các nghiệm thức được trình bày ở Bảng 3.3

Chỉ tiêu ghi nhận: Số lượng củ, trọng lượng củ, tỷ lệ (%) củ

bị SKL gây hại bên ngoài và bên trong củ ở 4 thời điểm 60 - 80 - 120

NSKT và một ngày trước khi thu hoạch

Tỷ lệ (%) củ bị SKL gây hại được tính theo công thức:

A = (A1/A2) x 100 Trong đó: A: Tỷ lệ (%) củ bị SKL gây hại; A1: Số củ bệnh, bị sâu, sùng đục củ; A2: Tổng số củ quan sát

Bảng 3.3 Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm trắng Beauveria phòng trừ SKL ở điều kiện ngoài đồng

D - Theo Nông dân Theo nông dân (15 lần/vụ)

Ghi chú: Liều lượng chế phẩm nấm 9,38 g/L (3,0 kg) được sử dụng trong thí nghiệm là dựa vào kết quả thí nghiệm hiệu lực chế phẩm trong PTN và nhà lưới.

3.2.5.2 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm tím Paecilomyces ký sinh RS (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện ngoài đồng

Thí nghiệm được thực hiện trên 60 cây mãng cầu xiêm Thái 4 năm tuổi tại ấp Thành Khương, xã Thành Đông, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long, 2017 Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức (mỗi l nghiệm thức tương ứng 5 cây mãng cầu đang mang trái) và được lặp lại 3 lần Giữa các lần lặp lại cách nhau một đường mương nước tạo vùng đệm để tránh ảnh hưởng giữa các lô thí nghiệm Các nghiệm thức trong thí nghiệm được trình bày trong Bảng 3.4

Bảng 3.4 Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm tím Paecilomyces sp trong phòng trừ RS ở điều kiện ngoài đồng

A - Chế phẩm nấm Tím 9,38 g/L H 2 O (3,0 kg) Mỗi nghiệm thức được phun 3 lần:

B - BIO-Pro Pests 10 g/L H 2 O Lần 1: khi điều tra có rệp sáp gây hại

C - Tasodant 600EC 1 L/ha (600 - 800 L nước) Lần 2: phun cách lần 1 sau 14 ngày

D - Đối chứng Phun nước Lần 3: phun cách lần 2 sau 14 ngày Ghi chú: Liều lượng chế phẩm nấm 3kg/ha được sử dụng trong thí nghiệm là dựa vào kết quả thí nghiệm hiệu lực chế phẩm trong PTN và nhà lưới

Dùng bình xịt đeo vai (thể tích 16 lít) phun ướt đều các trái mãng cầu trên cây, lượng nước phun ở giai đoạn này khoảng từ 0,5 - 0,7 L/cây Nên phun vào buổi chiều mát hoặc sáng sớm

Chỉ tiêu ghi nhận: Mật số rệp sáp trên trái: mỗi nghiệm

thức chọn 3 cây, mỗi cây điều tra số rệp sáp sống trên 8 trái (4 trái còn non da màu xanh đậm và 4 trái lớn da màu xanh hơi nhạt) vào các thời điểm trước phun và 7, 11, 14 ngày sau khi phun

Tính độ hữu hiệu của thuốc ở điều kiện ngoài đồng

ruộng theo công thức Henderson - Tilton (1955):

ĐHH (%) = (𝟏 − 𝑪𝒃 × 𝑻𝒂

𝑪 𝒂 × 𝑻 𝒃) × 𝟏𝟎𝟎

Trong đó: Tb: số RS sống ở nghiệm thức xử lý thuốc trước khi phun; Ta: số RS sống ở nghiệm thức xử lý thuốc sau

khi phun; Cb: số RS sống ở nghiệm thức đối chứng trước khi phun; Ca: số RS sống ở nghiệm thức đối chứng sau khi phun

3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu đo kích thước bào tử nấm được tính toán theo giá trị TB ± SD, số lượng mẫu là 400, độ tin cậy 95% Các số liều về tỷ lệ nẩy mầm, hình thành bào tử, thuốc trừ sâu, thuốc trừ bệnh, tỷ lệ chết (%) tùy theo dãy số liệu được chuyển đổi bằng cách dùng giá trị cân bậc hai của hàm arcsine hoặc log (x+1) hoặc √𝑥 + 0,5 để phân tích thống kê bằng các phần mền SPSS hoặc MSTATC Tính toán số liệu,

vẽ đồ thị và biểu đồ bằng phầm mềm Microsoft Excel Sử dụng các chương trình Phylogentic (BioEdit, Clustalx 3.1, Mega 7 và Treeview) để quan sát mối quan hệ di truyền

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả nghiên cứu chi Beauveria

4.1.1 Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi

Beauveria bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm

hình thái học

Kết quả thu thập và phân lập được 16 chủng nấm tại các tỉnh Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng gây bệnh cho nhóm côn trùng thuộc bộ Coleoptera (sùng khoai lang, bọ nhảy, sùng đất), Homoptera (rệp sáp giả, rầy nâu),

Lepidoptera (sâu ăn tạp) thuộc chi Beauveria và cũng là loài được

phân bố rộng ở một số tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long

Đặc điểm tản nấm: tản nấm của 16 chủng nấm trắng

Beauveria sp khi nuôi cấy trên môi trường PDA cho thấy, các chủng

nấm có đặc điểm gần như không khác biệt Tản nấm có màu trắng sau vài ngày nuôi cấy, một số chủng nấm chuyển sang màu trắng hơi ửng vàng (khi nấm già), xốp mịn, tản nấm kết chặt phát triển theo vòng

đồng tâm đôi khi có tiết dịch trên bề mặt tản nấm

Đặc điểm cơ quan sinh bào tử, hình dạng bào tử: kết quả

quan sát 16 chủng nấm thu thập được đều có chung đặc điểm là cơ

quan sinh bào tử phát triển từ sợi dinh dưỡng mọc thành đám Cuống bào tử đính phồng lên ở phía dưới có dạng hình thể bình với chiều dài không đều nhau, phân nhánh hoặc không phân nhánh Sự kéo dài của gốc ghép làm phát sinh cuống bào tử có hình zíc zắc hoặc cong gập (Hình 4.1) Bào tử có dạng đơn bào trong suốt, không có vách ngăn, dạng bào tử đính có hai loại hình cầu hoặc hình trứng, bào tử mọc trên cuống sinh bào tử hướng gốc

Hình 4.1 Cấu trúc cơ quan sinh bào tử nấm Beauveria bassiana được quan

sát dưới kính hiển vi quang học

Kích thước bào tử: Sự khác biệt về mặt kích thước

của 16 chủng nấm trắng được thể hiện qua Bảng 4.1 cho thấy, các chủng nấm này tương tự như miêu tả của Nguyen Thi Loc

(1995), Glare and Inwood (1998), Luangsa-Ard et al (2006),

Võ Thị Thu Oanh (2010) là bào tử dạng hình cầu và hình trứng kích thước dao động trong khoảng 1,42 - 3,82 x 1,47 - 3,82 µm

là loài B bassiana và tỉ lệ dài/rộng nhỏ hơn 2 µm cũng được sử dụng như là sự giới hạn cho định danh loài trong chi Beauveria

Bảng 4.1 Kích thước bào tử của các chủng nấm Beauveria bassiana

Tóm lại, kết quả quan sát đặc điểm về màu sắc tản nấm, cơ

quan sinh bào tử (cành bào đài), hình dạng và kích thước sinh bào tử

của 16 chủng đều thuộc loài Beauveria bassiana giống với mô tả

trong khóa phân loại của De Hoog (1972), Barnett and Barry (1972)

Phạm Thị Thùy (2004), Võ Thị Thu Oanh (2010)

4.1.2 Định danh các chủng nấm thuộc chi nấm Beauveria dựa

trên kỹ thuật sinh học phân tử (ITS-rDNA)

Hình 4.2 Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA của các chủng phân lập

Beauveria sp., sử dụng hai primer ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) (MK: maker

chuẩn, A - P là ký hiệu của 16 chủng nấm Beauveria sp từ Bb1 - Bb16)

Phản ứng PCR được thực hiện với 2 primer ITS4 và ITS5

(White et al., 1990) khuếch đại vùng ITS-rDNA của tất cả 16 chủng

phân lập Beauveria Kết quả Hình 4.2 cho thấy, sản phẩm sau khi

500 bp

A B C D E F G H I J K L M N O P

MK

Bb1(SKL-CT) AF291871*

Bb14(RSG-TV) EU530656*

Bb2(SKL-VL) Bb6(SKL-KG) Bb3(SKL-VL) Bb7(SKL-AG) Bb4(SKL-VL) Bb15(RN-ST) Bb5(SKL-HG) EU530654*

Bb10(BN-ST) Bb12(RSG-CT) EU530657*

EU530660*

Bb13(RSG-HG) Bb16(SAT-VL) KU363833*

KY682175*

Bb9(BN-HG) Bb11(S-CT) Bb8(BN-CT) HQ880771 AB027381 U19042 U35285 U35290

Beauveria album

khuếch đại bằng phản ứng PCR vùng ITS-rDNA trên băng màu xuất hiện 16 vạch đều bằng nhau có chiều dài nằm khoảng 580 bp khi phân tích điện di trên agarose 1% Tiếp theo các mẫu sẽ được tinh sạch để

giải trình tự gen nhằm so sánh với các loài B bassiana đã biết trước

được đăng ký dữ liệu trên Genbank để củng cố bằng chứng tên loài

Beauveria bassiana của các mẫu thu thập được

Sơ đồ phân nhóm loài dựa trên cơ sở so sánh trình tự DNA của

20 mẫu Beauveria được trình bày ở Hình 4.3 cho thấy, cây phân nhóm loài được chia thành 3 nhánh chính:

Hình 4.3 Sơ đồ phân nhóm loài của 16 chủng nấm Beauveria bassiana phân lập

được bằng phương pháp Maximum likelihood dựa trên tình tự của vùng ITS-rDNA

Phần trăm giá trị bootstrap từ 1.000 lần lặp lại được chỉ trên các nhánh Các mẫu B brongniartii, B cylindrospora và B album được xem như loài lai xa.

Nhánh thứ nhất gồm 16 chủng nấm được phân lập cùng với 4 chủng nấm EU530654, EU530656, EU530657 và EU530660 phân lập tại Việt Nam và 3 chủng nấm AF291871 (Hàn Quốc), KU363833 (Ấn Độ) và KY682175 (Trung Quốc) đã được định danh và đăng ký

là loài Beauveria bassiana, tách biệt với một nhánh nhỏ gồm hai

chủng nấm HQ880771.1 (Mỹ) và AB027381.1 (Nhật Bản) được xác định

là loài Beauveria brongniartii

Nhánh thứ hai gồm 2 chủng nấm U19042 (Đài Loan) và

U35285 (Đài Loan) được xác định là loài Beauveria cylindrospora

Nhánh thứ ba là chủng nấm U35290 (Đài Loan) được xác

định là loài Beauveria album

Như vậy, từ kết quả định danh theo phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học, hình dạng kích thước của bào tử nấm, cấu trúc của cơ quan sinh bào tử, kỹ thuật PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA và kết quả phân nhóm loài dựa trên trình tự vùng ITS-rDNA

thì tất cả 16 chủng nấm Beauveria được phân lập đều phù hợp với các đặc điểm của loài Beauveria bassiana

4.1.3 Một số đặc điểm sinh học của nấm Beauveria bassiana ký

sinh trên sâu hại cây trồng

4.1.3.1 Xác định thời gian bào tử nấm B bassiana nẩy mầm

Bảng 4.5 Tỷ lệ nẩy mầm của các chủng nấm B bassiana qua các

Tỷ lệ bào tử nẩy mầm của 16 chủng nấm B bassiana được

trình bày ở Bảng 4.5 cho thấy, tại thời điểm 8 - 12 GSKC, tất cả

16 chủng nấm đều có tỷ lệ nảy mầm thấp (dưới 30%) Tuy nhiên, tỷ lệ nảy mầm của các chủng nấm bắt đầu tăng cao sau 16 giờ nuôi cấy đạt trên 50% và có tỷ lệ bào tử nẩy mầm cao trên 94% ở giai đoạn 24 GSKC ở nhiệt độ 27 ± 2oC

4.1.3.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và

phát triển của nấm Beauveria bassiana

Kết quả tốc độ phát triển trung bình của nấm B bassiana trên

5 loại môi trường dinh dưỡng được trình bày ở Hình 4.4 cho thấy, tất

cả 16 chủng nấm đều có tốc độ phát triển nhanh trên môi trường PDA

và SDAY3, trong đó hai chủng Bb4(SKL-VL) và Bb7(SKL-AG) có tốc độ phát triển nhanh nhất trên môi trường SDAY3 (khoảng 0,3 - 0,33 cm/ngày) Trên môi trường CDA và SDAY1, 16 chủng nấm có tốc độ phát triển khá tốt (0,13 - 0,27 cm/ngày) Trên môi trường SDAY+Chitin các chủng thường cho tốc độ phát triển chậm hơn so với các môi trường còn lại

Hình 4.4 Tốc độ phát triển trung bình của 16 chủng nấm Beauveria bassiana trên

năm loại môi trường dinh dưỡng

Mật số bào tử của 16 chủng Beauveria bassiana trên năm loại

môi trường dinh dưỡng tại thời điểm 15 NSKC được trình bày ở Hình 4.5 cho thấy, các chủng nấm đều cho mật số bào tử cao trên 3 loại môi trường PDA, SDAY3 và SDAY+Chitin, trong đó chủng Bb3(SKL-

Hình 4.5 Mật số bào tử của 16 chủng nấm B bassiana trên năm loại môi trường

dinh dưỡng tại thời điểm 15 ngày sau khi cấy

Tóm lại, kết quả nghiên cứu này thì môi trường SDAY3 và PDA cho tốc độ phát triển đường kính tản nấm nhanh và cho mật số bào tử cao khoảng từ 4 - 10 x 107 bào tử/cm2, môi trường SDAY+Chitin có tốc độ phát triển chậm hơn nhưng cho mật số bào tử cũng khá cao tương đương hai môi trường trên

4.1.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và hình thành

bào tử của nấm Beauveria bassiana

Tốc độ phát triển trung bình của tản nấm nấm B bassiana ở

các mức nhiệt độ khác nhau được trình bày ở Bảng 4.6 cho thấy,

khoảng nhiệt độ tối hảo cho sự phát triển của nấm B bassiana là từ

25o - 28oC, ở điều kiện nhiệt độ 30oC các chủng nấm phân lập được có thể phát triển từ 1,71 - 2,91 mm/ngày cao hơn ở nhiệt độ 20oC Khi ở nhiệt độ 35oC hầu hết các chủng nấm đều không phát triển được Ba chủng nấm Bb4(SKL-VL), Bb7(SKL-AG) và Bb16(SAT-VL) luôn phát triển tốt nhất trên các điều kiện nhiệt độ khảo sát

Bảng 4.6 Tốc độ phát triển trung bình của tản nấm B bassiana ở các mức