Sử dụng thịt đầu tôm thẻ chân trắng (litopenaeus vannamei) để chế biến chế phẩm giàu protein

ABSTRACT Protein recovery from by-products of the frozen shrimp process and its utility based on mechanical, physicochemical, and biological effects have recently become an interest of r

KHOA NÔNG NGHI P

2019

KHOA NÔNG NGHI P

LU N ÁN T T NGHI P TI NăS NGÀNH CÔNG NGH TH C PH M

2019

L I C M T

hoƠn thƠnh đ c lu n án nƠy, ngoƠi s n l c c a b n thơn tôi đư nh n

đ c s đ ng viên, giúp đ vƠ h tr th t quý báu t các đ n v vƠ cá nhơn trong

c ng nh ngoài tr ng Xin đ c bƠy t lòng tri ơn chơn thƠnh vƠ sơu s c! Xin chơn thƠnh cám n PGs.Ts Nguy n V n M i đư t n tình h ng d n, bao dung, tin t ng, giúp đ , cung c p ki n th c vƠ ph ng pháp lƠm vi c b ích đ giúp tôi tìm ra nh ng h ng đi đúng đ n trong quá trình th c hi n nghiên

c u nƠy

Nghiên c u sinh xin g i l i cám n đ n PGs.Ts Tr n Thanh Trúc đư đ́ng ǵp ý ki n nh m đ a ra các ph ng h ng đ phơn tích s li u, th o lu n k t

qu trong su t quá trình th c hi n lu n án

i v i b n thơn, Tr ng i h c C n Th lƠ n i g n li n v i bao k ni m

tu i tr , tình yêu và hoài bão, lƠ n i nơng b c tôi t m t sinh viên, h c viên cao h c đ n hi n t i lƠ m t Nghiên c u sinh Xin đ c g i l i tri ơn chân thành

nh t đ n t t c quý Th y Cô trong B môn Công ngh th c ph m – nh ng ng i

Th y, ng i Cô luôn t n tơm truy n đ t kinh nghi m quý báu và ni m đam mê nghiên c u, c ng nh luôn luôn giúp đ tôi trong su t ch n đ ng nghiên c u

gian nan vƠ kh́ nh c

Chơn thƠnh c m n Ban Giám hi u, Ban Ch nhi m Khoa Nông nghi p

vƠ Sinh h c ng d ng, Khoa Sau i h c - Tr ng i h c C n Th ; đ c bi t,

đi u ki n cho tôi đ c s d ng trang thi t b vƠ các th t c, h s c n thi t trong

su t th i gian h c t p vƠ nghiên c u t i tr ng

Chơn thƠnh c m n, S N i v , S GD& T, S L TBXH t nh Cà Mau

vƠ Ban Giám Hi u Tr ng TCKTKT CƠ Mau đư tin t ng, t o m i đi u ki n

vƠ th t c giúp tôi th c hi n lu n án đúng th i gian vƠ k ho ch đ ra

Xin chơn thƠnh c m n Anh Nguy n Minh H i – Giám đ c Công ty CBTS Hòa Trung đư t o đi u ki n t t nh t đ tôi ć đ y đ các trang thi t b vƠ nhơn

l c thu m u C m n Ch Tr n Thanh Vơn – TPTC Công an ThƠnh ph C n

Th vƠ các ch ph́ng viên báo C n Th đư th ng xuyên giúp đ , đ ng viên đ tôi v t qua nh ng kh́ kh n trong th i gian th c hi n đ tƠi

Cám n Th c s Nguy n Th Xuân Dung - nguyên cán b Vi n Nghiên

c u và Phát tri n Công ngh sinh h c, các em Nguy n Th C m Tuy, Nguy n

Th H ng G m, Nguy n Th H ng Tr m, L u Th M Vi vƠ m t s sinh viên lƠm vi c trong phòng thí nghi m D006 đư h tr tôi hoƠn thƠnh lu n án

Cu i cùng, l i yêu th ng t n đáy lòng xin g i đ n đ ng sinh thƠnh vƠ t t

c các thƠnh viên trong gia đình đư đ ng viên tinh th n vƠ t o đi u ki n thu n

l i đ tôi hoƠn thƠnh ch ng trình h c Nghiên c u sinh C m n ch ng, luôn

n m ch t tay em, giúp em v t m i kh́ kh n trong cu c s ng c bi t, cho con kính dơng lên linh h n cha kính yêu, ng i lƠ ni m tin, lƠ đ ng l c đ con ć th hoƠn thƠnh tơm nguy n c a ng i

Xin chơn thƠnh cám n!

Trơn tr ng,

TÓM T T

Vi c nghiên c u thu h i vƠ s d ng protein t ph ph m trong ch bi n tôm đông l nh d a trên các tác đ ng c h c, h́a lý vƠ sinh h c luôn đ c đ c

bi t quan tơm b i vì đơy lƠ ngu n nguyên li u r ti n, d i dƠo, ć giá tr c v

m t dinh d ng l n ho t tính sinh h c Trong đ u tôm ch a m t l ng l n protein, chitin, astaxanthin và các h p ch t sinh h c khác, đ c bi t lƠ h enzyme

th y phơn trong th t đ u tôm ć ho t đ khá cao T đ́, c n xem vi c thu h i

và s d ng protein nh là m t s n ph m chính thay vì ch lƠ ph ph m c a quá trình s n xu t chitin-chitosan nh hi n nay Do đ́, v n đ ắNghiên c u s d ng

th t đ u tôm th chơn tr ng (Litopenaeus vannamei) đ ch bi n ch ph m giƠu protein” đ c th c hi n b ng cách s d ng enzyme protease n i t i k t h p

enzyme th ng m i đ th y phơn th t đ u tôm th nh m t o ra ch ph m protein

Ch ph m th y phơn giƠu protein t th t đ u tôm đ c s d ng nh m t nguyên

li u b sung nh m c i thi n m t s tính ch t ch c n ng trong quá trình ch bi n

th c ph m T nghiên c u đư thu đ c nh ng k t qu nh sau: (1) Enzyme protease k thu t t th t đ u tôm th chơn tr ng ho t đ ng t t nh t nhi t đ

60 °C vƠ pH 7 Ho t tính enzyme t ng nhanh khi n ng đ c ch t th t đ u tôm

t ng t 0 đ n 0,6 g/mL v i h ng s Kmc a protease kh o sát lƠ 0,0795 g/mL và giá tr Vmax đ t 11,70 µM/phút; (2) i u ki n t i u cho quá trình ti n x lý enzyme protease tr c khi th y phơn lƠ nhi t đ 56,19 °C; pH 7,04 vƠ th i gian 3,62 phút Hi u su t th y phơn (%DH) t ng đ n 41,12% và hƠm l ng protein

đ t 44,33 mg/100 g sau 6 gi th y phơn protein th t đ u tôm b ng protease n i

t i; (3) Các thông s t t nh t đ th y phơn th t đ u tôm b ng alcalase th ng

m i v i n ng đ 20 UI/g là pH 7,67; nhi t đ 57,99 °C; th i gian th y phơn 4

gi Hi u su t th y phơn (%DH) là 37,6% vƠ ho t tính ch ng oxy h́a đ t 31,57%; (4) T ng t alcalase, đi u ki n t t nh t đ flavourzyme ho t đ ng là

pH 6,97; nhi t đ 51,04 °C; n ng đ enzyme là 30 UI/g vƠ th y phơn trong 3

gi Hi u su t th y phơn (%DH) đ t 35,10% vƠ ho t tính ch ng oxy h́a là 29,50%; (5) Vi c k t h p protease th ng m i vƠ enzyme n i t i nh m m c đích v a đ t hi u su t th y phơn cao v a ć ho t tính ch ng oxy h́a t t nh t khi b sung flavourzyme sau 32,24 phút s d ng alcalase đi u ki n pH 7,01; nhi t đ 54,94 °C vƠ th i gian 2,96 gi N ng đ alcalase vƠ flavouryme b sung l n l t lƠ 19,43 UI/g vƠ 32,09 UI/g giúp hi u qu th y phơn protein t

th t đ u tôm th đ t 90,19% và ho t tính ch ng oxy h́a là 86,16%; (6) i u

ki n t t nh t cho quá trình cô đ c chân không d ch th y phơn lƠ 45,58 °C vƠ th i gian t ng ng lƠ 41,85 phút, khi đ́ hƠm l ng protein t ng s lƠ 20,56% vƠ

ho t tính ch ng oxy h́a đ t 65,21%, th i gian tr đông d ch cô đ c là 3 tháng; (7) B sung ch ph m protein th y phơn d ng cô đ c ć th nâng giá tr n c

m m d i 10oN lên h ng 1 vƠ h ng 2 n ng đ 3% d ch cô đ c lƠ t t nh t đ

h n ch quá trình oxy h́a s n ph m khô cá ĺc 1 n ng trong th i gian b o qu n

l nh 10 tu n Nghiên c u đư đ́ng ǵp d n li u khoa h c v gi i pháp k t h p

h enzyme n i t i vƠ enzyme th ng m i, t o s n ph m giá tr gia t ng t ph

ph m tôm th chơn tr ng c ng nh nơng cao giá tr s d ng, t o l i th c nh tranh cho m t hƠng tôm Vi t Nam

T khóa: Alcalase, flavourzyme, protease n i t i, th t đ u tôm th , th y phân

ABSTRACT

Protein recovery from by-products of the frozen shrimp process and its utility based on mechanical, physicochemical, and biological effects have recently become an interest of research That is because those by-products are cheap and valuable resources for nutritious aspect and biological activity The shrimp head meat contains a large amount of protein, chitin, astaxanthin and many other biological compounds Especially, the enzyme’s activity in the shrimp head is quite high From that, studies on protein recovery and its production have been considered, protein obtained from the shrimp head meat should be a main product instead of such a by-product from the chitin-chitosan production process Therefore, the research ắUtility of whiteleg shrimp head meat (Litopenaeus vannamei) for producing of protein enriched products” was conducted by using intracellular protease enzyme and commercially available enzyme to produce protein products In addition, high protein products obtained from the shrimp head meat was used to make as supplementary materials which can improve some functional properties in food processing procedure Results achieved from the research have been summarized as following: (1) Protease enzyme attained from the whiteleg shrimp head meat had a good activity at 60°C (pH 7.0) Enzyme activity was increased rapidly when the shrimp head meat amount was risen from 0 to 0.6 g/mL with Km constant of 0.0795 g/mL and Vmaxvalue was 11.70 µM/min (2) Optimal conditions for protease pretreatment before hydrolysis were 56.19°C, pH 7.04, and 3.62 minutes hydrolysis time The hydrolysis efficiency (%DH) was enhanced to 41.12% with the protein content of 44.33 mg/100 g after 6 hours hydrolysis with internal protease (3) Best parameters for shrimp head meat’s hydrolysis were 57.99°C, pH 7.67, 4 hours hydrolysis time by using 20 UI/g commercial alcalase enzyme Hydrolysis efficiency (%DH) and antioxidant activity were 37.6% and 31.57%, respectively (4) Flavourzyme enzyme had good activity at 51.04 °C, pH 6.97,

3 hours hydrolysis time by using 30 UI/g flavourzyme enzyme The hydrolysis efficiency (%DH) and antioxidant activity were 35.10% and 29.50%, respectively (5) Combination of commercial protease and intracellular enzyme have been investigated and the following results have been obtained: 54.94°C,

pH 7.01, 2.96 hours hydrolysis time by using alcalase enzyme (19.43 UI/g) and flavouryme enzyme (32.09 UI/g) The hydrolysis efficiency (%DH) and antioxidant activity have been improved to 90.19% and 86.16%, respectively (6) Good conditions to condense the high protein product were 45.58°C and 41.85 min with 20.56% total protein amount and the antioxidant activity was 65.21% The condensed product can be stored for 3 months in frozen condition

(7) This condensed product can be added into fish sauce to upgrade under 10 oN

to the 2nd and 1st grade fish sauce It was also used to evaluate the oxidation prevention of the dried snakehead fish with the intermedicate moisture 3% of the condensed product was found to be sufficient to store the dried snakehead fish for 10 weeks in cold condition Finally, this research has contributed to scientific materials for solutions on combination of intracellular enzyme and commercially available enzymes It not only creates high value products from by-products of the whiteleg shrimp process, but also improve the value of utility and competitive advantage of Vietnamese shrimp

Keywords: Alcalase, flavourzyme, hydrolysis intracellular protease, shrimp head

M C L C

L I C M T i

TÓM T T iii

ABSTRACT v

L I CAM OAN vii

M C L C viii

DANH ŚCH H̀NH xi

DANH ŚCH B NG xvi

DANH SÁCH T VI T T T xix

Ch ng 1 GI I THI U 1

1.1 t v n đ 1

1.2 M c tiêu nghiên c u 2

1.3 N i dung nghiên c u 2

1.4 i t ng và ph m vi nguyên c u c a đ tài 2

1.5 Ý ngh a c a lu n án 3

1.6 i m m i c a lu n án 3

Ch ng 2 T NG QUAN TÀI LI U 4

2.1 Gi i thi u v tôm th và ph ph m trong ch bi n tôm đông l nh 4

Tôm th 4

Thành ph n dinh d ng trong tôm th chân tr ng 4

Ph ph m tôm trong quá trình ch bi n 5

ng d ng ph ph m trong s n xu t 8

2.2 T ng quan v protease 11

Khái ni m v protease 11

H Serine protease 12

H enzyme protease trong th y s n 13

Enzyme alcalase 14

Enzyme flavourzyme 15

Kh n ng ng d ng c a protease 17

2.3 T ng quan v protein 20

Protein 20

Peptit 21

Axit amin 22

S th y phân protein 24

Vai trò c a protein th y phân 26

2.4 Các nghiên c u có liên quan 31

Nghiên c u ngoƠi n c 31

Nghiên c u trong n c 32

Ch ng 3 PH NG PH́P NGHIÊN C U 34

3.1 Ph ng ti n nghiên c u 34

a đi m và th i gian thí nghi m 34

D ng c , thi t b 34

3.2 Nguyên li u s d ng 35

3.3 Ph ng pháp trích ly và tinh s ch s b enzyme protease t th t đ u tôm 36

3.4 Ph ng pháp nghiên c u 36

Ph ng pháp phơn tích vƠ đo đ c các ch tiêu hóa 36

Ph ng pháp thu th p và x lý s li u 37

3.5 Ph ng pháp b trí thí nghi m 38

Xác đ nh thành ph n ban đ u c a nguyên li u 39

Thí nghi m 1: nh h ng c a th i gian tr đông th t đ u tôm đ n quá trình bi n đ i protease trong th t đ u tôm 39

N i dung 1: Xác đ nh đ c đi m enzyme protease n i t i trong th t đ u tôm th 40

N i dung 2: Kh o sát m t s y u t nh h ng đ n quá trình th y phân protein t tht đ u tôm b ng enzyme n i t i 42

N i dung 3: Xác đ nh đi u ki n th y phân protein (pH, nhi t đ , n ng đ enzyme) c a tht đ u tôm b ng enzyme ngo i bào (alcalase/flavourzyme) thích h p 45

N i dung 4: Xây d ng quy trình ch bi n ch ph m protein th y phơn vƠ đánh giá kh n ng b o qu n s n ph m 54

N i dung 5: ng d ng ch ph m d ch protein th y phân trong s n xu t th c ph m 59 Ch ng 4 K T QU VÀ TH O LU N 62

4.1 Tính ch t c a nguyên li u và kh n ng tr đông th t đ u tôm th 62

Thành ph n h́a lý c b n c a th t đ u tôm th chân tr ng 62

ánh giá kh n ng tr đông th t đ u tôm đ n s n đ nh c a hi u qu th y phân protein b ng protease n i t i 63

4.2 N i dung 1: c đi m c a enzyme protease n i t i hi n di n trong th t đ u tôm th 64

Xác đ nh đ b n nhi t c a protease sau tinh s ch s b t th t đ u tôm th 64

nh h ng c a n ng đ c ch t đ n ho t tính enzyme protease 66

4.3 N i dung 2: Các y u t có nh h ng đ n hi u qu th y phân protein c a th t đ u tôm b ng enzyme n i t i 68

nh h ng c a nhi t đ , pH và th i gian kích ho t protease n i t i đ n quá trình th y phân protein t tht đ u tôm th 68

Xác đ nh hi u su t th y phân c a protease n i t i theo th i gian 76

4.4 N i dung 3: Xác đ nh đi u ki n th y phân protein (pH, nhi t đ , n ng đ enzyme) c a th t đ u tôm b ng enzyme ngo i bào (alcalase/flavourzyme) thích h p 78

nh h ng c a pH và nhi t đ đ n hi u qu th y phân protein t th t đ u tôm th b ng alcalase 78

Xác đ nh n ng đ enzyme alcalase đ n hi u qu th y phân protein t th t đ u tôm th 86

Xác đ nh th i gian th y phân protein t th t đ u tôm th b ng enzyme alcalase

88

nh h ng c a pH và nhi t đ đ n hi u qu th y phân protein t th t đ u tôm th b ng enzyme flavourzyme 90

Xác đ nh n ng đ enzyme flavourzyme đ n hi u qu th y phân protein t th t đ u tôm th 96

Xác đ nh th i gian th y phân protein t th t đ u tôm th b ng enzyme flavourzyme 97

K t qu t ng tác gi a th i gian b sung flavourzyme và th i gian k t thúc quá trình th y phân khi s d ng ph i h p alcalase và flavourzyme 98

K t qu t ng tác gi a n ng đ enzyme flavourzyme và enzyme alcalase 104

4.5 N i dung 4: Xây d ng quy trình ch bi n ch ph m th y phân giàu protein và đánh giá kh n ng b o qu n s n ph m 111

K t qu t ng tác gi a nhi t đ , pH và th i gian th y phân khi ph i h p s d ng enzym n i t i và 2 enzyme alcalase và flavourzyme 111

So sánh l a ch n enzyme có kh n ng th y phân hi u qu nh t 119

Kh o sát t ng tác gi a nhi t đ và th i gian cô quay đ n tính ch t c a d ch th y phân 123

nh h ng c a th i gian b o qu n đ n s thay đ i tính ch t và thành ph n d ch th y phân sau cô quay 131

4.6 N i dung 5: K t qu ng d ng b sung ch ph m d ch protein th y phân t th t đ u tôm trong quá trình s n xu t th c ph m 133

B sung d ch th y phơn giƠu protein vƠo n c m m 133

nh h ng c a n ng đ d ch đ m th y phơn cô đ c đ n quá trình oxy hóa khô cá lóc m t n ng trong th i gian b o qu n 136

Ch ng 5 K T LU N VÀ XU T 146

5.1 K t lu n 146

5.2 xu t 147

TÀI LI U THAM KH O 148

PH L C A: ĆC PH NG PH́P PHÂN TÍCH 167

PH L C B: TH NG KÊ 180

PH L C C: HÌNH NH 257

DANH S ỄCH HỊNH

Tôm th chân tr ng 4

u tôm th chân tr ng 6

S đ các b c xúc tác c b n c a nhóm serine protease 13

nh h ng c a pH (a) và nhi t đ (b) lên ho t đ ng c a alcalase 14

Quá trình th y phân c a hemoglobin l n 16

S đ đi u ki n ph n ng b m t (nhi t đ , pH) nh h ng đ n s hình thành glycerol 17

S đ c u trúc các b c protein 21

S hình thành liên k t peptit 21

Công th c c u t o chung c a axit amin 22

S đ b trí thí nghi m t ng quát 38

S đ b trí b o qu n th t đ u tôm theo th i gian 40

S đ b trí thí nghi m kh o sát đ c đi m enzyme protease 41

S đ b trí thí nghi m b sung alcalase (flavourzyme) 46

S đ b trí thí nghi m xác đ nh th i gian th y phân th t đ u tôm khi k t h p enzyme n i t i và ngo i bào 54

S đ b trí theo dõi th i gian b o qu n d ch th y phơn cô đ c 58

S đ b trí thí nghi m 20 60

Hi u su t th y phân protein và ho t tính protease n i t i theo th i gian b o qu n 63

b n nhi t c a protease th t đ u tôm th sau tinh s ch s b 65

Ph ng trình Lineweaer- Burk c a protease trên c ch t th t đ u tôm 67

nh h ng c a các th a s kh o sát (t ng tác đ n, t ng tác đa) đ n quá trình th y phân protein t protease n i t i 71

th bi u di n s t ng tác c a nhi t đ , pH và th i gian kích ho t

enzyme n i t i đ n ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân protein 71

nh h ng c a các th a s kh o sát (t ng tác đ n, t ng tác đa) đ n IC50 c a quá trình kích ho t protease n i t i 71

th b m t đáp ng vƠ đ ng đ ng đi m bi u di n t ng tác

gi a nhi t đ , pH và th i gian kích ho t đ n hi u su t th y phân b ng enzyme n i t i 72

th b m t đáp ng vƠ đ ng đ ng đi m bi u di n t ng tác

gi a nhi t đ , pH và th i gian kích ho t đ n ho t tính ch ng oxy hóa khi th y phân b ng enzyme n i t i 72

T ng quan gi a hi u su t th y phơn xác đ nh b ng th c nghi m và tính toán theo ph ng trình h i quy khi kích ho t ho t đ ng c a enzyme n i t i 74

T ng quan gi a ho t tính ch ng oxy h́a xác đ nh b ng th c nghi m và tính toán theo ph ng trình h i quy khi kích ho t ho t đ ng c a enzyme n i t i 74

th b m t đáp ng t ng tác c a nhi t đ , pH và th i gian kích ho t đ n các hàm m c tiêu c a quá trình th y phân protein t protease n i t i 75

T ng tác c a nhi t đ , pH và th i gian kích ho t đ n các hàm m c tiêu c a

quá trình th y phân protein t protease n i t i 75

nh h ng c a các th a s kh o sát (t ng tác đ n, t ng tác đa)

đ n hi u su t th y phân protein b ng alcalase 80

nh h ng c a các th a s kh o sát (t ng tác đ n, t ng tác đa)

đ n ho t tính ch ng oxi hóa c a d ch th y phân protein b ng alcalase 80

nh h ng c a các th a s kh o sát (t ng tác đ n, t ng tác đa)

đ n IC50 khi th y phân protein b ng enzyme alcalase 81

th b m t đáp ng vƠ đ ng đi m t ng tác gi a nhi t đ v i pH đ n hi u su t th y phân protein b ng alcalase 82

th b m t đáp ng vƠ đ ng đi m t ng tác gi a nhi t đ v i pH đ n ho t tính ch ng oxy hóa d ch th y phân b ng alcalase 82

th đ ng đi m t ng tác gi a nhi t đ v i pH đ n IC50 d ch th y phân b ng enzyme alcalase 82

T ng quan gi a hi u su t th y phơn xác đ nh b ng th c nghi m và tính toán theo ph ng trình h i quy khi th y phân b ng enzyme alcalase 84

T ng quan gi a ho t tính ch ng oxy hóa d ch th y phơn xác đ nh b ng th c nghi m vƠ tính toán theo ph ng trình h i quy khi th y phân b ng enzyme alcalase 84

T ng tác c a nhi t đ vƠ pH đ n hi u su t th y phân protein và ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân th t đ u tôm th b ng enzyme alcalase 85

nh h ng c a th i gian đ n hi u su t th y phân và ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân th t đ u tôm th b ng enzyme alcalase 88

nh h ng c a các th a s kh o sát (t ng tác đ n, t ng tác đa)

đ n hi u su t th y phân protein b ng enzyme flavourzyme 91

nh h ng c a các th a s kh o sát (t ng tác đ n, t ng tác đa) đ n

ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân protein b ng enzyme flavourzyme 91

nh h ng c a các th a s kh o sát (t ng tác đ n, t ng tác đa) đ n IC50 c a d ch th y phân protein b ng enzyme flavourzyme 91

th b m t đáp ng vƠ đ ng đi m bi u di n s t ng tác

c a pH và nhi t đ n hi u su t th y phân protein b ng enzyme flavouzyme 92

th đ ng đ ng đi m bi u di n s t ng tác c a pH và nhi t đ đ n

ho t tính ch ng oxy hóa d ch th y phân protein b ng enzyme flavouzyme 92

th t ng quan gi a hi u su t th y phân theo th c nghi m và tính toán theo ph ng trình h i quy khi th y phân b ng enzyme flavourzyme 94

th t ng quan gi a ho t tính ch ng oxy hóa theo th c nghi m và tính toán theo ph ng trình h i quy khi th y phân b ng enzyme flavourzyme 94

th bi u di n t ng tác c a pH và nhi t đ c a flavouzyme lên hi u su t th y phân và ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân b ng enzyme flavourzyme 95

th bi u di n s thay đ i hi u su t th y phân và ho t tính ch ng oxy hóa theo t l flavourzyme b sung 96

nh h ng c a các th a s kh o sát (t ng tác đ n, t ng tác đa) đ n hi u

su t th y phân protein khi kh o sát th i đi m b sung flavourzyme 99

nh h ng c a các th a s kh o sát (t ng tác đ n, t ng tác đa) đ n ho t tính ch ng oxy hóa d ch th y phân khi kh o sát th i đi m b sung flavourzyme 100

nh h ng c a các th a s kh o sát (t ng tác đ n, t ng tác đa) đ n IC50 d ch th y phân khi kh o sát th i đi m b sung flavourzyme 100

th b m t đáp ng vƠ đ ng đi m bi u di n s t ng tác c a th i đi m b sung flavourzyme và th i gian th y phơn đ n hi u su t h y phân (DH%) 101

th đ ng đ ng đi m bi u di n s t ng tác c a th i đi m b sung flavourzyme và th i gian th y phơn đ n ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân 102

th t ng quan gi a hi u su t th y phân theo th c nghi m và tính toán theo ph ng trình h i quy khi kh o sát th i đi m b enzyme flavourzyme 103

th t ng quan gi a ho t tính ch ng oxy hóa theo th c nghi m và tính toán theo ph ng trình h i quy khi kh o sát th i đi m b enzyme flavourzyme 103

T ng tác c a th i đi m b sung flavourzyme và th i gian đ n hi u su t

th y phân protein, ho t tính ch ng oxy hóa và IC50 d ch th y phân 104

th bi u di n s t ng tác c a 2 nhân t n ng đ enzyme alcalase

và n ng đ enzyme flavourzyme đ n hi u xu t th y phân protein (DH%) 106

th bi u di n s t ng tác c a 2 nhân t n ng đ enzyme alcalase

và n ng đ enzyme flavourzyme đ n ho t tính ch ng oxy hóa (DPPH%) 106

th bi u di n s t ng tác c a 2 nhân t n ng đ enzyme alcalase

và n ng đ enzyme flavourzyme đ n IC50 (DPPH%) 107

th b m t đáp ng vƠ đ ng đi m bi u di n t ng tác gi a 2 nhân t

n ng đ enzyme alcalase và n ng đ enzyme flavourzyme đ n DH (%) 107

th đ ng đ ng đi m bi u di n t ng tác gi a 2 nhân t n ng đ enzyme alcalase và n ng đ enzyme flavourzyme đ n ho t tính ch ng oxy hóa (%) 108

th t ng quan gi a hi u su t th y phơn thu đ c theo th c nghi m và tính toán theo ph ng trình h i quy khi k t h p hai n ng đ alcalase và flavourzyme 109

th t ng quan gi a ho t tính ch ng oxy hóa d ch thu đ c theo th c nghi m và tính toán theo ph ng trình h i quy khi k t h p hai n ng đ alcalase và flavourzyme 109

th b m t đáp ng vƠ đ ng đ ng đi m t ng tác c a hai n ng đ alcalase và flavourzyme 110

th bi u di n s t ng tác c a pH nhi t đ và th i gian th y phân lên hi u su t th y phân protein khi k t h p enzyme protease n i t i vƠ th ng m i 113

th bi u di n s t ng tác c a pH nhi t đ và th i gian th y phân lên ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân khi k t h p protease n i t i vƠ th ng m i 113

th bi u di n s t ng tác c a pH nhi t đ và th i gian th y phân lên IC c a d ch th y phân khi k t h p protease n i t i vƠ th ng m i 113

th đ ng đi m bi u di n s t ng tác c a pH, nhi t đ và th i gian lên

hi u su t th y phân protein khi k t h p enzyme n i t i vƠ enzyme th ng m i 114

th đ ng đi m bi u di n s t ng tác c a pH, nhi t đ và th i gian lên ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân khi k t h p enzyme n i t i và enzyme th ng m i 114

th b m t đáp ng vƠ đ ng đi m bi u di n s t ng tác

c a pH, nhi t đ và th i gian lên IC50 c a d ch th y phân khi

k t h p enzyme n i t i vƠ enzyme th ng m i 115

th t ng quan gi a hi u su t th y phân theo th c nghi m và tính toán theo ph ng trình h i quy 117

th t ng quan gi a ho t tính ch ng oxy hóa theo th c nghi m và tính toán theo ph ng trình h i quy 117

th b m t đáp ng bi u di n s t ng tác c a nhi t đ , pH và th i gian đ n hi u su t th y phân protein và ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân t th t đ u tôm th b ng enzyme protease n i t i k t h p enzyme th ng m i 118

T ng tác c a nhi t đ , pH và th i gian đ n hi u su t th y phân protein và ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân t tht đ u tôm th b ng enzyme protease n i t i k t h p enzyme th ng m i 118

K t qu đi n di trên gel SDS–PAGE d ch th y phân khi k t h p

enzyme n i t i vƠ 2 enzyme th ng m i 119

th bi u di n t ng tác gi a nhi t đ và th i gian đ n

protein t ng s c a quá trình cô quay d ch th y phân protein 125

th bi u di n s t ng tác c a nhi t đ và th i gian cô quay

đ n protein t ng s (%) và hi u su t thu h i protein (%) 126

th bi u di n s t ng tác c a nhi t đ và th i gian cô quay

đ n DPPH (%) và hi u su t thu h i DPPH (%) 128

th bi u di n t ng tác gi a nhi t đ và th i gian đ n IC50 c a

quá trình cô quay d ch th y phân protein 129

T ng tác c a nhi t đ và th i gian cô quay đ n protein t ng (%), ho t tính ch ng oxy hóa DPPH (%) 129

T ng tác c a nhi t đ và th i gian cô quay đ n protein t ng (%), ho t tính ch ng oxy hóa DPPH (%) và hi u su t thu h i protein (%), DPPH (%) 130

HƠm l ng nit toàn ph n m u n c m m theo th i gian 133

HƠm l ng NH3 trong các m u n c m m theo th i gian b o qu n 134

nh h ng c a n ng đ d ch cô đ c (%) đ n PV (mEq/kg lipit) theo th i gian b o qu n 136

HƠm l ng NH3 thay đ i theo th i gian b o qu n khô cá lóc 139

nh h ng c a n ng đ d ch cô đ c đ n đ sáng L* s n ph m theo th i gian b o qu n 140

nh h ng c a n ng đ d ch cô đ c đ i v i đ màu b* s n ph m qua các tu n b o qu n 140

K t qu đi m s v đánh giá ch t l ng c m quan 141

nh h ng c a n ng đ acid ascorbic (%) k t h p v i d ch th y phơn đ n

PV (mEq/kg béo CBK) theo th i gian b o qu n 143

Qui trình khô cá lóc t m ch ph m th y phơn protein giƠu đ m 145

Hình PLA.1: ng chu n tyrosine 168

Hình PLA.2: ng chu n Brandford 172

Hình PLA.3: Bi u đ màu (L*a*b* chart) 174

Hình PLC.1: u tôm th 257

Hình PLC.2: Th đ u tôm th 257

Hình PLC.3: Ph ph m tht đ u tôm sau khi xay nhuy n 258

Hình PLC.4: Th y phân ph ph m tht đ u tôm 258

Hình PLC.5: D ch th y phân sau ly tâm 259

Hình PLC.6: Cô quay d ch th y phân 259

Hình PLC.7: D ch th y phơn tr c và sau cô quay 260

Hình PLC.8: N c m m b sung ch ph m d ch protein th y phân t th t đ u tôm

260

Hình PLC.9: Qui trình khô cá lóc b sung ch ph m d ch protein th y phân t tht đ u tôm 261

Hình PLC.10: Khô cá lóc b sung ch ph m d ch protein th y phân t tht đ u tôm

261

DANH S ỄCH B NG

Thành ph n dinh d ng c a tôm th chân tr ng tính trên 100 g thành ph n

n đ c 5

Di n tích nuôi và s n l ng tôm sú và th qua các n m 6

Thành ph n h́a lý c b n c a tôm th và tôm sú 6

M t s serine protease có ngu n g c đ ng v t thông d ng 12

Tính ch t c a alcalase 15

Thành ph n d ch th y phân protein t ph ph m tôm 23

Thành ph n axit amin trong d ch th y phân th t đ u tôm sú đi u ki n th y phân t i u c a alcalase (% so v i protein) 24

Ph ng pháp ki m tra các thành ph n h́a lý c b n 37

Ma tr n quy ho ch th c nghi m quá trình xác đ nh t ng tác pH vƠ nhi t đ th y phân t tht đ u tôm 44

Các nghi m th c kh o sát theo ph ng pháp b m t đáp ng 2 nhân t pH và nhi t đ th y phân c a enzyme alcalase 47

Các nghi m th c kh o sát theo ph ng pháp b m t đáp ng 2 nhân t pH và nhi t đ th y phân c a enzyme flavourzyme 49

Các nghi m th c kh o sát theo ph ng pháp b m t đáp ng, áp d ng thi t k trung tâm ph c h p 52

Ma tr n quy ho ch th c nghi m quá trình t i u h́a k t h p hai n ng đ enzyme th ng m i 53

Các nghi m th c kh o sát theo ph ng pháp b m t đáp ng, áp d ng thi t k trung tâm ph c h p 55

Ma tr n quy ho ch th c nghi m quá trình t i u h́a k t h p nhi t đ và th i gian cô quay 57

Thành ph n h́a lý c b n c a th t đ u tôm 62

Giá tr các nghi m th c d a trên t ng tác c a các bi n đ c l p 69

nh h ng c a các nhân t mư h́a đ i v i ph ng trình h i quy Y1 69

nh h ng c a các nhân t mư h́a đ i v i ph ng trình h i quy Y2 70

K t qu t i u h́a đi u ki n th y phân v i hàm m c tiêu Y1, Y2 và Y3 73

K t qu t i u h́a đi u ki n th y phơn đáp ng ba m c tiêu Y1; Y2 và Y3

75

nh h ng c a th i gian th y phơn đ n hi u su t thu h i d ch th y phân 77 Các nghi m th c kh o sát theo ph ng pháp b m t đáp ng 2 nhân t pH và nhi t đ th y phân c a enzyme alcalase 79

nh h ng c a các nhân t mư h́a đ i v i ph ng trình h i quy – Y4 (DH%) đ n hi u su t th y phân b ng enzyme alcalase 79

nh h ng c a các nhân t mư h́a đ i v i ph ng trình h i quy Y5 (%DPPH) đ n ho t tính ch ng oxy hóa d ch th y phân b ng enzyme alcalase 80

K t qu t i u h́a đi u ki n th y phân v i hàm m c tiêu Y4; Y5 và Y6 83

K t qu t i u h́a đi u ki n th y phơn đáp ng ba m c tiêu Y4; Y5 và Y6 84

tính ch ng oxy hóa c a d ch th y phân b ng enzyme flavourzyme 90

K t qu t i u h́a đi u ki n th y phân v i hàm m c tiêu Y7, Y8 và Y9 93

K t qu t i u h́a đi u ki n th y phơn đáp ng 3 m c tiêu Y7,Y8 và Y9 95

K t qu bi u di n s thay đ i hi u su t th y phân và ho t tính ch ng oxy

hóa theo th i gian th y phân b ng enzyme flavourzyme 97

nh h ng các nhân t mư h́a đ n ph ng trình h i quy lên hi u su t th y

nh h ng các nhân t mư h́a đ n ph ng trình h i quy d a trên hi u su t

th y phân Y13– DH(%) kh o sát k t h p n ng đ enzyme alcalase và enzyme flavourzyme

105

nh h ng các nhân t mư h́a đ n ph ng trình h i quy d a trên ho t tính

ch ng oxy hóa Y14– DPPH (%) (*) khi kh o sát k t h p hai n ng đ enzyme alcalase

và enzyme flavourzyme 105

K t qu t i u h́a đi u ki n th y phân v i m c tiêu Y13 và Y14 và Y15 108

K t qu t i u h́a n ng đ 2 enzyme đáp ng 3 m c tiêu Y13,Y14 và Y15 110Các nghi m th c kh o sát theo ph ng pháp b m t đáp ng 3 nhân t pH,

nhi t đ và th i gian th y phân k t h p enzyme n i t i vƠ enzyme th ng m i 111

nh h ng các nhân t đ n ph ng trình h i quy d a trên hi u su t th y

phân Y16 (DH%) khi k t h p enzyme n i t i vƠ enzyme th ng m i 112

nh h ng các nhân t đ n ph ng trình h i quy d a trên ho t tính ch ng

oxy hóa Y17(DPPH%) khi k t h p enzyme n i t i vƠ enzyme th ng m i 112

K t qu t i u h́a đi u ki n th y phân v i hàm m c tiêu Y16, Y17 và Y18 116

K t qu t i u h́a đi u ki n th y phơn đáp ng 3 m c tiêu Y16; Y17 và Y18

117

So sánh hi u qu th y phân b ng các enzyme khác nhau 120

Thành ph n axit amin trong d ch th y phân th t đ u tôm th đi u ki n th y

phân t i u khi k t h p enzyme n i t i vƠ 2 enzyme th ng m i (% so v i d ch th y

phân) 122

Các nghi m th c kh o sát theo ph ng pháp b m t đáp ng 2 nhân t nhi t đ và th i gian cô quay 123

nh h ng c a các nhân t mư h́a đ i v i ph ng trình h i quy d a trên protein t ng s (%)- Y19 124

nh h ng c a các nhân t mư h́a đ i v i ph ng trình h i quy d a trên hi u su t thu h i protein t ng s - Y20 124

K t qu t i u h́a đi u ki n cô quay v i hàm m c tiêu Y19 và Y20 125

K t qu t i u h́a đi u ki n cô quay đáp ng 2 m c tiêu Y19 và Y20 126

nh h ng c a các nhân t mã hóa đ i v i ph ng trình h i quy d a trên kh n ng ch ng oxy hóa 127

nh h ng c a các nhân t mã hóa đ i v i ph ng trình h i quy d a trên hi u su t thu h i kh n ng ch ng oxy hóa 127

K t qu t i u h́a đi u ki n cô quay c a hàm m c tiêu Y21; Y22 và Y23 128 K t qu t i u h́a đi u ki n cô quay đáp ng 3 m c tiêu Y19; Y21 và Y23

129

K t qu t i u h́a đi u ki n cô quay nhi u b m t đáp ng v i các hàm m c tiêu Y19,Y20 ,Y21 và Y22 130

S bi n đ i thành ph n c a d ch cô đ c theo th i gian b o qu n 131

Ch tiêu vi sinh trong các m u n c m m (TCVN 5107-2003) 135

B ng đi m s v đánh giá ch t l ng c m quan gi a các m u thí nghi m

135

K t qu ki m tra vi sinh m u khô b sung ch ph m tôm 3% 142

nh h ng c a n ng đ (%) k t h p v i d ch th y phơn đ n đ m bay h i (TVBN mg N/100 g) theo th i gian b o qu n 142

B ng PLA.1 Xây d ng đ ng chu n n ng đ tyrosine 167

B ng PLA 2 Ph ng pháp xác đ nh l ng tyrosine trong m u 167

B ng PLA.3 S li u xây d ng đ ng chu n tyrosine 168

B ng PLA.4 H s chuy n đ i v hƠm l ng đ m t ng s 169

B ng PL A.5 N ng đ Bovin serum albumin chu n 171

B ng PLA.6 S li u xây d ng đ ng chu n Bradford 172

B ng PLA.7 H s quan tr ng cho m i ch tiêu c a s n ph m khô cá lóc m t n ng

176

B ng PLA.8 ánh giá ch t l ng s n ph m theo đi m c m quan chung 176

B ng PLA.9 B ng đi m đánh giá c m quan khô cá ĺc ć đ m trung gian 177

B ng PLA 10 B ng đi m đánh giá c m quan n c m m 177

DANH SÁCH T VI T T T

IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology

VASEP The Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers

CH NGă1.ă GI I THI U

N m 2007, Vi t Nam gia nh p WTO - m t t ch c th ng m i l n nh t

th gi i ơy lƠ c h i t t cho nh ng b c ti n c a kinh t Vi t Nam, nh ng

c ng không th tránh đ c nh ng thách th c mà t ch c nƠy đ t ra c ng nh s

c nh tranh gay g t c a các thành viên khác trong t ch c làm nh h ng đ n nhi u l nh v c kinh t , đ c bi t lƠ đ i v i l nh v c xu t kh u th y s n c a n c

ta M t trong các gi i pháp nơng cao n ng l c c nh tranh c a các doanh nghi p

là c i thi n quy trình ch bi n, nơng cao n ng su t, t n d ng tri t đ ngu n ph

ph m mƠ theo quan đi m trong s n xu t hi n đ i g i là nguyên li u còn l i đ

ch bi n các s n ph m có giá tr gia t ng Trong các nguyên li u còn l i ph i k

đ n đ u và v tôm th i ra trong quá trình s n xu t tôm đông l nh, th ng chi m 50÷70% nguyên li u ban đ u ( V n Nam và ctv., 2005; Shahidi and Synowiecki, 1991) N m 2017, s n l ng tôm th đ t 470,5 nghìn t n (61,41%), tôm sú 230,5 nghìn t n (38,59%) (http://www.vasep.com.vn), v i l ng ph

ph m th i ra trong quá trình s n xu t chi m kho ng 45-55% kh i l ng tôm nguyên li u ây là ngu n nguyên li u ti m n ng trong ch bi n và có giá tr dinh d ng t t (Murueta et al., 2007) G n đơy, vi c thu h i protein t các nguyên li u th y s n đư tr nên ph bi n trong ngành công nghi p th c ph m

do ngu n ph ph m r ti n và d i dào Th y phân protein làm gi m kích th c các peptit, d ch th y phân là ngu n axit amin có s n cho quá trình sinh t ng h p protein (Gildberg and Stenberg, 2001), là ngu n peptit có ho t tính sinh h c mang đ n ti m n ng đáng k trong d c ph m nh kh n ng ch ng oxy hóa,

kh n ng ki m soát enzyme gây cao huy t áp (Dey and Dora., 2014a; Holanda

et al., 2006; Ganugula et al., 2008) hay kh n ng ch ng đ t bi n gen có kh

n ng gơy ung th (Babu et al., 2008; Wilson-Sanchez et al., 2010; López-Saiz

et al.,2016) Trong các ph ng pháp đ c s d ng đ thu h i protein thì bi n pháp sinh h c, đ c bi t là b sung enzyme th ng m i đi n hình nh enzyme alcalase, pancreatin, trypsin, pepsin, papain, neutrase, protamex, flavourzyme (Chakrabar ti, 2002; Gunasekaran et al., 2015; Randriamahatody et al., 2011; 2009; Dey and Dora, 2014a) nh m rút ng n th i gian th y phân và nâng cao

hi u qu th y phơn protein c ng nh ch t l ng c a d ch th y phân thu nh n ngày càng đ c quan tâm nhi u h n Bên c nh đ́, nhi u k t qu nghiên c u đư xác đ nh trên đ u tôm ch a h enzyme protease có kh n ng ho t đ ng khá

m nh (Hà Th Th y Vy và ctv., 2016; Cao et al., 2008…) Vì th , nghiên c u kích ho t protease n i t i có trong tht đ u tôm đ ng th i b sung enzyme protease th ng m i có kh n ng lƠm gia t ng hi u su t th y phân, t o d ch th y

phân có ho t tính ch ng oxy hóa t t S d ng ch ph m th y phân giàu protein trong ch bi n th c ph m lƠ h ng đi đ y tri n v ng

1.2 M c tiêu nghiên c u

M c tiêu chính c a nghiên c u trong lu n án là xác đ nh ch đ thích h p cho quá trình th y phân protein t th t đ u tôm th b ng enzyme protease n i

t i vƠ enzyme th ng m i (enzyme alcalse/flavourzyme) đ thu nh n d ch ch

ph m d ch protein th y phân Trên c s đ́, enzyme protease n i t i đ c k t

h p v i enzyme th ng m i trong th y phân th t đ u tôm th nh m gia t ng

hi u su t quá trình và nâng cao tính ch t ch c n ng c a d ch đ m thu nh n đ c Sau khi x lý, ch ph m th y phân giàu protein t tht đ u tôm th đ c th nghi m nh ngu n nguyên li u b sung nh m c i thi n ch t l ng cho m t s

th c ph m ch bi n tiêu bi u đ ng b ng sông C u Long

1.3 N i dung nghiên c u

D a trên m c tiêu đ c đ t ra, nghiên c u ti n hành th c hi n các n i dung c b n sau:

- Xác đ nh m t s tính ch t c b n c a enzyme protease thô thu nh n đ c

b ng vi c trích ly t ngu n nguyên li u tht đ u tôm th và sau khi tinh s ch s

th ng m i và enzyme n i t i nh m gia t ng hi u qu th y phân protein trong

1.4 iăt ng và ph m vi nguyên c u c aăđ tài

i t ng nghiên c u c a lu n án là nguyên li u th t đ u tôm th chân

tr ng (Litopenaeus vannamei) - ph ph m t quy trình ch bi n tôm l nh đông,

đ t o ra ch ph m giƠu đ m và có ho t tính sinh h c (ho t tính ch ng oxy hóa)

Ph m vi nghiên c u là kh o sát đ c đi m và kích ho t protease n i t i có trong

t đ u tôm th và gi i pháp k t h p enzyme n i t i v i 2 enzyme th ng

m i (alcalase vƠ flavourzyme) đ t o ra d ch đ m giƠu dinh d ng và có ho t tính ch ng oxy hóa cao Ch ph m th y phân giàu protein t tht đ u tôm th

đ c th nghi m nh m t nguyên li u b sung nh m c i thi n ch t l ng cho

m t s th c ph m, giúp gi m thi u đ c s lãng phí ngu n nguyên li u

1.5 ụăngh aăc a lu n án

Là công trình nghiên c u m i đ c th c hi n m t cách có h th ng, t n

d ng đ c ngu n protein và enzyme protease n i t i t nhiên đ thu nh n s n

ph m an toƠn, đ́ng ǵp nh ng d n li u khoa h c quan tr ng v kích ho t ho t

đ ng c a h enzyme n i b o và s d ng ngu n protein giƠu dinh d ng c a ph

ph m vào trong ch bi n th c ph m D a trên các đi u ki n ho t đ ng c a enzyme n i t i, cùng v i đi u ki n ho t đ ng t i u c a enzyme th ng m i trên th t đ u tôm th đ ti n hành kh o sát kh n ng k t h p enzyme protease

n i t i vƠ enzyme th ng m i Nghiên c u đư xác đ nh đ c ph ng pháp k t

h p và các thông s t i u cho qu trình t o d ch th y phơn cô đ c v a có giá

tr dinh d ng v a có ho t tính sinh h c (ho t tính ch ng oxy h́a); đ xu t

ph ng pháp ng d ng d ch giàu protein trong s n xu t pepton, h tr tiêu hóa

t tht đ u tôm th vào quá trình s n xu t K t qu nghiên c u là gi i pháp thi t

th c t th c t s n xu t c a ngành ch bi n tôm đông l nh, t o s n ph m có giá

tr gia t ng t ngu n ph ph m tôm, góp ph n phát tri n b n v ng công nghi p tôm c a Vi t Nam

1.6 i m m i c a lu n án

K t qu nghiên c u làm phong phú thêm nh ng hi u bi t v đ c đi m c ng

nh các thông s ho t đ ng c a enzyme n i t i hi n di n trong th t đ u c a tôm

th chân tr ng T đ́, kích ho t có hi u qu ngu n enzyme n i t i an toàn có

s n trong tht đ u tôm th đ thu nh n d ch th y phân giàu ch t dinh d ng và

ho t tính ch ng oxy hóa cao ng th i, lu n án đư đ a ra ph ng pháp k t

h p nh m t n d ng các u đi m c a enzyme th ng m i d a trên các thông s

t i u cho ho t đ ng c a enzyme alcalase và enzyme flavourzyme trên c ch t

th t đ u tôm th , k t h p hi u qu enzyme n i t i vƠ enzyme th ng m i trong

th y phân protein c a th t đ u tôm, xây d ng đ c quy trình cho ho t đ ng th y phân protein c a t h p enzyme S d ng ch ph m cô đ c giàu protein và kh

n ng ch ng oxy hóa vào m t s quy trình ch bi n th c ph m có hi u qu Qua đ́, lu n án đư góp ph n đ nh h ng cho vi c ng d ng ngu n ph ph m trong quá trình ch bi n tôm đông l nh n c ta nh m gi m thi u ô nhi m môi tr ng, nâng cao s c c nh tranh c ng nh giá tr m t hàng tôm th đông l nh

CH NGă2.ă T NG QUAN TÀI LI U

2.1 Gi i thi u v tôm th và ph ph m trong ch bi nătômăđông l nh

Tôm th

Tôm th có tên khoa h c là Litopenaeus vannamei, tr c đơy là Penaeus vannamei (Hernandez et al.,1997) Tên th ng dùng là tôm th chân tr ng, tôm

tr ng ho c tôm tr ng Thái Bình D ng Vi t Nam, tôm phân b v nh B c

b , ven bi n mi n Trung và Nam b , hi n nay tôm đ c nuôi r t nhi u n c trên th gi i nh Ơi Loan, Trung Qu c, Vi t Nam (Hình 2.1)

Thành ph n dinh d ng trong tôm th chân tr ng

Thành ph n dinh d ng c a tôm th chân tr ng bao g m đ m, béo, n c,

và các khoáng ch t Các thành ph n trong nguyên li u có th thay đ i ph thu c vào gi ng, loƠi, đ tu i, thành ph n th c n, đi u ki n môi tr ng và nh ng bi n

đ i sinh lý tôm Giá tr thành ph n dinh d ng c a tôm đ c th hi n

nh eicosapentaenoic axit (EPA, 20:5n-3) và docosahexaenoic axit (DHA, 22:6n-3) ng n ng a hình thành các cholesterol (Pedrazzoli et al., 1998)

Trong thành ph n tôm th chân tr ng có 18 axit amin, trong đ́ axit amin thi t y u bao g m arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, lysine và valine Ngoài ra còn có các axit amin không thi t y u nh alanine, asparagine, aspartic axit, cysteine, glutamic axit, glycine, proline, serine và tyrosine (Gunalan et al., 2013) Trong đ́, valine (23,72%) chi m t l t i đa Ti p đ n, lysine (13,42%) có vai trò quan tr ng trong vi c h p thu canxi, t o c b p, ph c h i sau ch n th ng, ph u thu t đ ng

th i t ng h p các hóc môn, enzyme và các kháng th , methionine (13,06%) có

g c l u hu nh giúp trung hòa các g c t do gi m m t s b nh t t c a ng i già

và lão hóa (Hoshi et al., 2001) Ch ng t , tôm th chân tr ng là th c ph m có giá tr dinh d ng cao

Ph ph m tôm trong quá trình ch bi n

Theo báo cáo t ng k t hƠng n m c a T ng c c th y s n và s li u c a VASEP, c c u xu t kh u c a m t hàng tôm sú và tôm th trong nh ng n m

Di n tích nuôivà s n l ng tôm sú và th qua các n m

Ngu n: https://tongcucthuysan.gov.vn; http://www.vasep.com.vn

C n c s li u báo cáo hƠng n m cho th y, s n l ng tôm th xu t kh u

t ng tr ng nhanh chóng, v t tôm sú trong nh ng n m g n đơy m c dù di n tích nuôi tr ng ch chi m kho ng 1/6 di n tích so v i di n tích nuôi tôm sú S n

l ng t ng đ ng ngh a v i l ng ph ph m th i ra trong quá trình s n xu t t ng, chi m kho ng 45-55% kh i l ng tôm nguyên li u

Thành ph n h́a lý c b n c a tôm th và tôm sú

Tôm th Tôm sú Protein (%) 47,4 ± 1,8 49,6

Hi n nay, ph ph m đ c s d ng ch y u là ph n v đ s n xu t chitin, chitosan, ph n th t đ u tôm ch y u ch a protein th ng đ c dùng làm phân bón, th c n gia súc, th c n th y s n nh ng giá tr th ng ph m c a các s n

ph m nƠy ch a cao, m c dù đơy lƠ thƠnh ph n có giá tr dinh d ng và chi m

t l cao nh t (B ng 2.3), l i ch đ c xem là ph ph m c a qu trình s n xu t chitin-chitosan Theo Ngô Th HoƠi D ng (2015) trong nghiên c u quá trình thu nh n chitin-chitosan t ph li u tôm th chân tr ng nâng cao hi u qu ch t

l ng s n ph m đư xác đ nh thành ph n hóa h c c a nguyên li u còn l i c a đ u tôm th chân tr ng trong quá trình ch bi n ć hƠm l ng protein chi m 44,7%

và chitin là 18,3% Khi phân tích thành ph n và giá tr dinh d ng c a ph ph m tôm Pandalus borealis và Trachypena curvirostris cho k t qu hƠm l ng protein thô chi m kho ng 9,3–11,6%, hƠm l ng t ng s axit amin t do trong

ph ph m cao h n 15% so v i ph n n đ c (Heu et al., 2003b) T nghiên c u

c a Sachindra et al (2006) c ng đư ch ng minh đơy là ngu n nguyên li u giàu dinh d ng, v i hƠm l ng protein 35÷40%, chitin t 10÷15%, các thành ph n

ch ng minh s hi n di n v i n ng đ cao protein chi m 30÷50% (c n b n khô, tính trên đ u tôm sú nguyên v ) Ti n hành tách riêng th t đ u tôm sú, k t qu phân tích c a Hu nh V n Nguyên (2012) cho th y, t l protein th t đ u tôm

đ c thu nh n t i các nhà máy ch bi n th y s n C n Th vƠ Śc Tr ng chi m

đ n 14,82% (hay 83÷84%, tính theo c n b n khô) i u này ch ng minh, th t

đ u tôm r t d ch u s t n công c a các vi sinh v t và các bi n đ i sinh hóa, hóa

h c gơy h h ng (Tran et al., 2011) Bên c nh các y u t thu n l i là ngu n nguyên li u ć hƠm l ng protein t ng s cao, phong phú, r ti n và d tìm thì

đi m thu n l i đ c bi t đ́ lƠ không gi ng nh các loài đ ng v t th y s n khác,

đ u tôm lƠ n i t p trung c quan tiêu hoá, gan t y đ c lo i ra trong quá trình

ch bi n t các nhà máy th y s n (Heu et al., 2003a), do đ́ ph n th t đ u tôm

lƠ n i có s hi n di n c a enzyme protease n i t i cao nh t, sau đ́ đ n các c quan khác Các protease tìm th y trong tôm bao g m carboxypeptidases A và

B, trypsin, chymotrypsin, cathepsin và collagenase (Hernandez et al., 1997; Honjo et al., 1990; Kim et al., 1994; Roy et al., 1996; Tsai et al., 1986; Wormhoudt et al., 1992, Nguy n L Hà, 2011) Nguy n L HƠ (2011) đư nghiên

c u tách chi t và ng d ng enzyme protease t gan t y vƠ đ u tôm sú vào ch

bi n th y s n c bi t, đ u tôm ch a hƠm l ng đ m l n và cân b ng gi a các acid amin thi t y u cùng v i các khoáng ch t nh Ca, P, Na vƠ Zn (Ibrahim et al., 1999) Bên c nh đ́, s c nh tranh gay g t c a th tr ng, c n phát tri n các

s n ph m có giá tr gia t ng t các ph ph m đ nâng cao hi u qu kinh t cho công ty c ng nh gi m ô nhi m môi tr ng (Gildberg and Stenberg, 2001) S

d ng k t h p enzyme n i t i vƠ enzyme th ng m i đ th y phân protein còn

l i trong ph ph m nh m t o ra ch ph m th y phơn giƠu đ m ch a các đo n peptit có ho t tính ch ng oxy hóa t nhiên

ng d ng ph ph m trong s n xu t

Thông qua các ph ng pháp thu h i protein t ph ph m c a quá trình s n

xu t tôm đông l nh, ngu n ch ph m d ch protein th y phân đ c khai thác s

d ng trên nhi u l nh v c khác nhau nh th c ph m cho ng i, th c n dƠnh cho

đ ng v t, phân bón hay khai thác m t s ho t tính sinh h c dùng trong d c

ph m

2.1.4.1 Trong l nh v c th c ph m

i v i l nh v c th c ph m, Khan and Nowsad (2012) c ng đư s d ng

b t tôm thu đ c t ph ph m tôm đem s y khô và nghi n m n đ b sung vào bánh cracker, phát tri n s n ph m giàu protein t ph ph m Karnataka (2011)

s d ng các ph ph m đ s n xu t s n ph m giá tr gia t ng giƠu protein v i 3

s n ph m chính đ́ lƠ: súp tôm (prawn soup), bánh quy tôm l t (prawn chilly biscuits) và bánh quy tôm m n (prawn salt biscuits)

V i ph n th t t đ u tôm sú chi m kho ng 15% kh i l ng đ u tôm nguyên

li u (Nguy n V n M i và ctv., 2013), t n d ng th t đ u tôm giƠu protein đ c tách ra t đ u tôm, k t h p v i th t tôm th ph m theo t l 30% th t đ u đ u tôm và 70% th t tôm th ph m s t o đ c kh i paste có c u trúc không khác

bi t so v i paste đ c ch bi n t tôm th t th ph m trong quá trình ch bi n xúc xích, nghiên c u nƠy đư m ra h ng m i trong vi c nâng cao giá tr th ng

ph m c a tôm, đa d ng các s n ph m ch bi n t tôm Ngoài ra Nguy n V n

M i và ctv (2014) đư nghiên c u ch bi n và b o qu n b t th t đ u tôm sú t o

Sau khi th y phân, d ch th y phơn th ng đ c x lý b ng ph ng pháp

l c, ly tâm ho c k t t a đ thu các d ng s n ph m khác nhau nh carotenoprotein, astaxanthin glycosaminoglycans (Cahú et al., 2012; Armenta-López, 2002) Huang et al (2011) đư ch ng minh các peptit có kh n ng ch ng oxy hóa ho c

ki m soát enzyme gây cao huy t áp (Zhao et al., 2011) Các s n ph m th y phân giàu protein t đ u tôm trong các nghiên c u g n đơy c a Randriamahatody et

al (2011) cho k t qu khi th y phân tôm b i enzyme protease th ng m i có tính ki m ho c axit thành ph n thu đ c ch y u là các phân t peptit nh , trên 80% có kh i l ng phân t d i 1.000 Da, ngoƠi ra còn xác đ nh chi ti t có 14÷15 axit amin Zhao et al (2011) s d ng enzyme alcalase th y phân ph

ph m tôm, k t qu thu đ c d ch th y phơn đ c chi ra lƠm 5 phơn đo n, tùy theo kh i l ng phân t Phân tích d ch th y phơn đư thu đ c 18 axit amin , trong đ́ ć h u h t các các axit amin c n thi t (tr Trp) mƠ c th không t

t ng h p đ c, trong các axit amin ć đ n 40,4% thu c nhóm axit amin k n c

D ch th y phơn giƠu đ m có ho t tính ch ng oxy hóa, n đ nh các đi u ki n khác nhau nh b n nhi t đ cao và duy trì 70% pH th p h n 2, nh ng b nh

h ng b i ion Cu2+ và Zn2+ Tác gi c ng kh ng đ nh d ch đ m này có th b sung vào th c n vƠ ch đ dinh d ng, trong t ng lai s n ph m đ c bi t này

s đ c ch p nh n và ng d ng s d ng nhi u d ng khác nhau sau khi nghiên

c u lo i b v đ ng

2.1.4.2 Trongăl nhăv c th că năch nănuôi

T n d ng ph ph m tôm sau quá trình ch bi n làm th c n cho v t nuôi

đư đ c th c hi n t r t lơu, đơy lƠ s n ph m chính c a đ u tôm sau quá trình thu h i chitin và chitosan, m c dù thành ph n protein c ng đư đ c các tác gi quan tâm thu h i nh ng v i vai trò là s n ph m ph c a quá trình thu h i chitin nên có giá tr th p, ch phù h p làm th c n ch n nuôi Protein thu h i theo hình

th c th y phân có th đ c s d ng nh lƠ ch t mùi, đi n hình Randriamahatody

et al (2011) th y phân các ph ph m tôm t Madagascar Patcharee and Nongnuch (1995) s n xu t các s n ph m mùi t đ u tôm, s n ph m thu đ c

đ a vƠo các lo i th c ph m có ngu n g c t cá, th c n cho nuôi tr ng thu s n

ho c ngu n nit trong môi tr ng cho s phát tri n c a các vi sinh v t (Cavalheiro et al., 2007) và th c n gia súc (Coward - Kelly et al., 2006) S n

xu t b t protein t ph ph m đ u tôm giƠu d ng ch t phù h p cho th c n gia súc (Mizani et al., 2005) nghiên c u ti n hành nh m t o ra các s n ph m giá tr gia t ng t nh ng ph li u trong ch bi n tôm, bao g m c vi c chi t xu t chitin Phan Th Bích Trâm và Ph m Thu Cúc (2004) x lý v đ u tôm v i r đ ng

và enzyme dùng làm th c n cho gia súc, gia c m Tr nh Ng c Vinh (2006) ti n hành chua đ u v tôm có thêm vi khu n Lactobacillus spp giúp quá trình lên men đ c nhanh h n, t o ra s n ph m th c n gia súc ć ch t l ng cao h n,

có tính ph bi n r ng rãi, giá tr kinh t cao và gi m thi u vi c gây ô nhi m môi

tr ng Ngô Th HoƠi D ng và ctv (2008) c ng đư nghiên c u x lý carotenoprotein thu h i t quá trình s n xu t chitin vƠ b c đ u th nghi m ph i

tr n th c n cá NgoƠi ra Nguy n V n L (1996) đư s d ng protease đ u tôm

b p đ th y phân thu b t đ m t ph li u đ u tôm và ng d ng trong th y phân Nguy n Th M Trang (2004), nghiên c u chi t xu t protease t đ u tôm b c ngh Metapenaeus Brevicornis và ng d ng th y phơn c th t cá m i

Synowiecki and Khateeb (2000) nghiên c u ng d ng alcalase đ kh protein c a ph li u v tôm Crangon crangon nh m thu h i Chitin và protein Ban đ u v tôm Crangon crangon đ c kh khoáng s b b ng dung d ch HCl 10% 200C trong 30 phút và kh protein b i enzyme th ng m i Alcalase

550C vƠ pH 8,5 th y phân (DH) cao nh t là 30% và d ch th y thu đ c ch a 63% protein so v i ch t khô, 6,24% lipit, 23,4% NaCl Holanda and Netto (2006) nghiên c u thu h i 3 thành ph n chính c a ph li u tôm, protein, chitin, astaxanthin b ng vi c s d ng enzyme alcalase và pancreatin Theo tác gi trong

ph li u tôm Xiphopenaeus kroyeri có ch a 39,42% protein, 31,98% tro và 19,92% chitin Ti n hành th y phân b ng enzyme Alcalase t i các đi u ki n: t

l enzyme/nguyên li u (E/S) 3%, nhi t đ 600C, pH = 8,5 K t qu cho th y khi

t ng đ th y phân (DH) t 6% t i 12% thì thu đ c 26% vƠ 28% protein t ng

ng, alcalase nh h ng nhi u h n pancreatin, ć th thu h i protein t 57,5%

đ n 64,6% và astaxanthin t 4,7 đ n 5,7 mg astaxanthin/100g ph li u tôm t i

DH 12% Gildberg và Stenberg (2001) thu đ c 68,5% protein t ph li u tôm Pandalus borealis sau 2 gi th y phân v i enzyme Alcalase ng Th Hi n (2008) đư s d ng enzyme Alcalase đ ti n hành th y phân ph li u tôm và t n thu protein và astaxanthin trong công ngh s n xu t chitin – chitosan t i nhi t

đ 540C, 8 gi , t l enzyme b sung là 0,22% ; pH 8, t l n c/nguyên li u là 1/1 thì thu h i đ c 52,7% protein so v i ban đ u

2.1.4.3 Trongăl nhăv căd c

S n ph m sau th y phân c a đ u tôm là ngu n peptit có ho t tính sinh h c mang đ n ti m n ng đáng k trong d c ph m (Gildberg and Stenberg, 2001)

He et al (2006) nghiên c u kh n ng s n xu t các thành ph n th c ph m ch c

n ng thông qua quá trình th y phân ph ph m và ph li u tôm c ng đư đ c đ

xu t b i các báo cáo nghiên c u g n đơy v c ch ho t đ ng c a enzyme chuy n đ i angiotensin-I (angiotensin-I-converting enzyme, ACE) và ho t đ ng

ch ng oxy hóa trong d ch th y phân oligopeptit làm giàu t Acetes chinensis,

m t loài tôm ít s d ng D ch thu h i sau th y phơn đ c ch ng minh có ho t tính sinh h c r t cao: kh n ng ch ng oxy hóa, kh n ng ki m soát enzyme gây cao huy t áp (Dey and Dora, 2014a; Ganugula et al., 2008) G n đơy m t s nhà nghiên c u đư thu đ c ph c h p carotenoid-protein t đ u tôm và s d ng

nh ngu n carotenoids và s d ng lƠm môi tr ng nuôi c y vi sinh nh m thu

gây ung th (Babu et al., 2008; Wilson-Sanchez et al., 2010; López-Saiz et

al.,2016)

Th y phân protein b ng protease th ng thu đ c s n ph m th y phân

nh ng peptit v i ch c n ng cao h n ho c nâng cao giá tr dinh d ng và kh

n ng ch ng oxy hóa (Zhao et al., 2011) Do s khác bi t trong tính ch t hóa lý

c a các peptit th ng nh , nên c ch phân c t có th phân bi t s khác bi t nh

nh vào ch c n ng, kích c và s k n c c a các peptit là c n thi t Tr ng

l ng phân t c a protein th y phân là m t trong nh ng y u t quan tr ng nh t trong s n xu t th y phân protein v i các thu c tính ch c n ng mong mu n s

d ng ch c n ng c a nguyên li u Th y phơn protein đ c s d ng r ng rãi trong

s n xu t các ch ph m sinh h c và các s n ph m lên men

2.2 T ng quan v protease

Khái ni m v protease

Enzyme là ch t xúc tác sinh h c có kh n ng đ y nhanh ti n đ các ph n

ng hóa h c và là công c h tr giúp nâng cao ch t l ng th c ph m c ng nh

hi u su t ch bi n Nghiên c u, s n xu t và ng d ng enzyme đ c phát tri n

r t m nh t đ u th k 20 đ n nay Công ngh s n xu t enzyme đư đem l i l i nhu n l n cho nhi u n c, s n l ng và kim ng ch mua bán các ch ph m enzyme trên th tr ng th gi i t ng 20÷30% m i n m (Murado et al., 2009) Trong s các enzyme đ c s d ng trong ch bi n th c ph m, enzyme th y phân chi m t l l n nh t (Rao et al., 1998), kho ng 97% doanh s enzyme công nghi p toàn c u (Haard and Simpson, 2000) Trong đ́, protease lƠ enzyme th y phân có giá tr th ng m i r t l n, chi m kho ng 60% t ng giá tr th ng m i enzyme công nghi p đ c cung c p trên th tr ng th gi i v i nhi u ng d ng

r ng rãi trong nhi u l nh v c nh công nghi p, nông nghi p, m ph m đ c bi t trong y h c hi n đ i (Joo and Chang, 2006; Tunga et al., 2003) S d ng enzyme

th y phơn nh m t tác nhân h tr d a trên m t s u đi m h n so v i s d ng hóa ch t, trong đ́ ć đ đ c hi u cao, hi u qu c a xúc tác nhi t đ v a ph i

và thân thi n v i môi tr ng

Protease là nhóm enzyme xúc tác ph n ng th y phân liên k t peptit c a protein Vi c phân lo i nh́m enzyme protease đ c thay đ i qua các th i k (Barrett, 2001) Theo Grassmann and Dyckerhoff (1928, trích d n b i Barrett, 2001) protease phân chia thành proteinase và peptidase D a trên vi c phân tích ngh a r ng vƠ ngh a h p c a t ắpeptidase” nên đ tránh nh m l n, theo yêu c u

c a IUBMB protease đ c coi lƠ peptidase nh ng chia lƠm hai lo i là endopeptidase và exopeptidase (Bergmann and Ross (1936), trích d n b i

Barrett, 2001); Hartley, (1960), trích d n b i Phan Th Bích Trơm, 2010) đư phân lo i enzyme th y phân protein theo b n nhóm d a theo tên hóa h c các axit amin tham gia vào tâm v trí xúc tác:

- Aspartic peptidase là nh ng protease ch a nhóm carboxyl (–COOH) trong trung tâm ho t đ ng

- Cysteine peptidase: các enzyme thu c nhóm này có nhóm thiol (-SH) c a cysteine trong trung tâm ho t đ ng

- Kim lo i peptidase là nh ng protease trong trung tâm ho t đ ng có ch a các ion kim lo i tr c ti p tham gia ph n ng

- Serine peptidase: là nh ng protease có nhóm hydroxyl (–OH) c a serine trong trung tâm ho t đ ng Các peptidase serine nƠy th ng là ho t đ ng vùng

pH khá r ng t trung tính đ n ki m, nhóm –OH c a serine tác đ ng lên nhóm –

CO– c a liên k t peptit t o h p ch t trung gian Các enzyme thu c nhóm này thông d ng nh t là trypsin và chymotrypsin Chúng b c ch b t thu n ngh ch

d i tác d ng di-isopropyl-phospho-fluoridate (DFP), phenyl-methane-sulfonyl flouride (PMSF), coumarin và m t s ch t c ch thu n ngh ch nh antitrypsin

đ u nành (SBTI), aprotinin, chymostatin (Gupta et al., 2002)

Hi n nay nh́m serine protease đư đ c phát hi n và nghiên c u trên nhi u

đ i t ng khác nhau v i các tên thông d ng nh li t kê B ng 2.4 Nhóm serine protease đ c ng d ng r ng rãi nhi u l nh v c do chúng có kh n ng thích

ng trong kho ng pH khá r ng t trung tính đ n ki m m nh đư lƠm t ng kh

n ng ng d ng nhóm enzyme này so v i các nhóm protease khác

M t s serine protease có ngu n g c đ ng v t thông d ng

u C các amin

H th ng tiêu hóa đ ng v t và m t s loài

H th ng tiêu hóa đ ng v t và m t s loài

H th ng tiêu hóa đ ng v t và m t s loài

Máu Máu

H th ng tiêu hóa đ ng v t (Ngu n: Phan Th Bích Trâm, 2010)

H Serine protease

Serine protease có chung nhóm phân lo i EC 3.4.21 là m t trong s các enzyme đ c nghiên c u khá r ng rãi ngoài kh n ng th y phân protein trong quá trình tiêu hóa c a đ ng v t ph bi n nh t là trypsin, chymotrypsin và elastase Serine protease còn tham gia vào nhi u hi n t ng sinh lý trong c th

nh phá c c máu ngh n và ho t hóa các b th (Phan Th Bích Trâm, 2010;

Gupta et al., 2002) Trung tâm ho t đ ng c a nhóm enzyme này ch a các axit amin: aspartic, histidin vƠ serine trong đ́ serine gi vai trò tr c ti p g n v i c

ch t theo c ch đ c trình bày Hình 2.3

S đ các b c xúc tác c b n c a nhóm serine protease

(Ngu n: Phan Th Bích Trâm, 2010)

H enzyme protease trong th y s n

S tiêu h́a vƠ trao đ i ch t protein và các h p ch t nit khác gi a các loài giáp xác khác nhau r t nhi u H u h t, các c ch tiêu hóa và h p th khác v i

đ ng v t ć x ng s ng Các enzyme tiêu h́a, đ c bi t các enzyme tiêu hóa protein giáp xác nói chung và c a tôm nói riêng khá gi ng v i enzyme có trong d dày c a cá Các protease tìm th y trong tôm bao g m carboxypeptidases A và B, trypsin, chymotrypsin, cathepsin và collagenase (Honjo et al., 1990; Liu et al, 1999; Roy et al., 1996; Tsai et al., 1986; Worrnhoudt et al., 1992) Protease c a tôm c ng nh c a các loƠi đ ng v t thu

s n khác là các protease n i t i, t p trung nhi u nh t c quan tiêu h́a, sau đ́

là n i t ng vƠ c th t c bi t là tôm do đ c đi m h tiêu hóa n i t ng n m

ph n đ u nên h enzyme s t p trung nhi u nh t ph n đ u, sau đ́ đ n các c quan khác

Protease tôm không có d ng pepsin, ch y u d ng trypsine ho c protease serine d ng trypsine và có kh n ng ho t đ ng r t cao Theo k t qu nghiên c u c a Ph m Th Trân Châu và ctv (1993) v protease đ u tôm bi n và Nguy n Th M Trang (2004) v protease đ u tôm b c ngh cho th y các enzyme tiêu hóa protein là các enzyme ho t đ ng m nh trong môi tr ng ki m Protease t tôm sú l i th hi n ho t tính cao môi tr ng g n trung tính (Nguy n Vi t D ng, 1999) Theo k t qu nghiên c u c a Omondi (2005), tôm

th n có h enzyme n i t i ho t đ ng kho ng pH thích h p dao đ ng t 7,2 đ n 8,5 trong đ́ trypsin lƠ 7,5 - 8,0 chymotrypsin 7,2 - 7,8 và elastase là 6,8

– 8,5) Nh v y, qua m t s nghiên c u c a m t s tác gi cho th y enzyme t tôm nói chung là các protease có kho ng pH ho t đ ng khá r ng

Enzyme alcalase

Alcalase lƠ enzyme ć đ c tính th y phơn protein đ c s n xu t t quá trình lên men chìm (SmF) Bacillus lichenniformis Thành ph n chính c a enzyme này là subtilisin A thu c nhóm serine S8 endoproteinase

nh h ng c a pH (a) và nhi t đ (b) lên ho t đ ng c a alcalase

(Ngu n: Neidhart and Petsko, 1988) Trong h th ng danh pháp MEROPS phân lo i protease, Alcalase (EC.3.4.21.62) thu c phân nhánh S8 c a nhóm serine protease (EC.3.4.21._)

v i đi m đ c tr ng lƠ s d ng đ n phơn serine (Ser) n m trong trung tâm xúc tác ph n ng c a enzyme i u ki n ho t đ ng t i u c a enzyme nƠy đ c dao

đ ng trong kho ng nhi t đ 55÷70C, tùy thu c vào lo i c ch t, đ ng th i pH thích h p cho ho t đ ng c a alcalase dao đ ng trong kho ng 6,5÷8,5 Enzyme nƠy cho phép đi u ch nh d dƠng đ th y phân, ti n hƠnh đ n gi n do ho t đ ng trong môi tr ng pH ki m t nhiên c a đ u tôm ơy lƠ enzyme có ngu n g c

t vi sinh v t có nhi u u đi m h n các ngu n g c khác nh ho t tính th y phân

t t h n, ć m c pH cao h n vƠ b n nhi t (Diniz and Martin, 1997) Enzyme alcalase là m t enzyme protease vi khu n t Bacillus licheniformis hi u qu

nh t đ s n xu t các lo i protein th y phân (Kristinsson and Rasco, 2000 Nhi t

đ b o qu n t t nh t 0÷10 °C T t c protease có th b b t ho t b ng cách x

lý nhi t 90 °C trong 10 phút

C ch xúc tác c a alcalase gi ng nh serine protease C u trúc s p x p axit amin và three– dimensional trong chu i peotein có th phân bi t rõ ràng v i các protease serine khác, ch ng h n nh chymotrypsin, carboxypeptidase vƠ peptidase A t Escherichia coli Trung tâm ho t đ ng c a alcalase c ng nh lƠ

th ng đ c g i là b ba xúc tác Khi trình t s p x p c a b ba này trong c u trúc b c 3 c a protease thì t o thành m t liên k t y u lƠm protease tích đi n âm

do các hydro r i kh i nhóm R – hydroxyl sau đ́, histidine t n công vào nhóm cacboxyl c a chu i peptit và phân c t chúng Tính ch t c a alcalase đ c tóm

Ghi chú: (1): DFP= Di-isopropyl fluorophosphate, PMSF = Phenyl-methyl-sulphonyl-fluoride

(2): EDTA = Ethylenediamine tetra-acetic axit

(3):NH 2 -Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-CySO 3

H-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-CySO 3 H-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala-

(Johansen et al., 1968; trích d n b i Novozymes, 2001)

Khi s d ng nhi u lo i enzyme th ng m i khác nhau trong th y phân protein t ph ph m tôm nh : alcalase, pancreatin, trypsin, pepsin, papain, neutrase, protamex, flavourzyme…thì alcalase đ t hi u qu th y phân t t nh t (Chakrabarti, 2002; Dey and Dora, 2014a)

Alcalase c ng ć th b t ho t pH=4 hay m c pH th p h n trong kho ng

30 phút Ph n ng th y phân có th d ng t c th i b ng cách thêm vào các axit thích h p nh axit acetic, lactic, hydrochloric, Tuy nhiên, gi m pH t c th i kh́ đ t đ c d i các đi u ki n công nghi p, h n n a khó ki m soát hi u su t

th y phân protein do s th y phân có th v n ti p t c trong su t giai đo n b t

ho t (Nielsen, 2001)

Enzyme flavourzyme

Flavourzyme (EC 3.4.11.1) đ c s n xu t b i Novozymes ( an M ch)

ơy lƠ enzyme protease có ngu n g c t m t dòng tuy n ch n c a n m m c Aspergillus oryzae Flavourzyme là m t aminopeptidase s n xu t d ng b t, màu nâu, có c tính exopeptidase và endopeptidase Tuy nhiên, ho t đ ng chính

c a enzyme đ c cung c p b i exopeptidase Ho t đ c a flavourzyme là 276,3 UI/g i u ki n ho t đ ng t i u c a flavourzyme trong kho ng nhi t đ

40÷55 °C, pH trung tính ho c h i axit (5,0÷7,0) Flavourzyme đ c b o qu n

t t nh t 0÷10 °C (Novozyme, 2011) Enzyme này có th c t đ t h n 70% liên

k t peptit trong m ch S n ph m th y phân c a flavourzyme là m t h n h p

m t s peptit đ ng khác nhau, nh ng ph n l n là các peptit nh và axit amin

pH 7, enzyme ch y u th hi n tính ch t c a m t exopeptidase Trong vi c th y phân protein s k t h p endopeptidase và exopeptidase h n h p cùng v i aminopeptidase cho k t qu các peptit có v đ ng gi m đáng k (Blortz et al., 1999; Slattery et al., 1998), flavourzyme là m t trong nh ng enzyme th ng

m i có th gi m v đ ng trong s n ph m th y phân (Imm et al., 1999) Flavourzyme có th b vô ho t 85 °C trong th i gian 5 đ n 10 phút ho c trong

5 giây v i nhi t đ 120 °C T ng t nh các enzyme khác, ho t đ ng c a flavourzyme có th m t d n trong th i gian l u tr

Khi kh o sát s th y phân c a enzyme này trên protein cây lúa m ch, Bamdad et al (2011) nh n th y quá trình th y phân protein b i flavourzyme

t ng đ i r ng rãi và nhanh chóng, d n đ n s hình thành c a các peptit v a và

nh phân b rõ ràng

(Ghi chú: ( ) Trypsin, ( ) Flavorzyme, ( ) Papain, (×) AS1398, ( ) Alcalase, ( ) Pepsin)

Quá trình th y phân c a hemoglobin l n

(Ngu n: Sun et al., 2011) Trong m t nghiên c u khác c a Kao et al (2011) đư ti n hành thí nghi m

đ xác đ nh đi u ki n t i u c a quá trình th y phơn protein đ u nành b ng flavourzyme nh m gi i phóng các glycerol trong t bào m

K t qu đ th Hình 2.6 cho th y đi u ki n th y phơn đ gi i phóng

l ng glycerol cao nh t là pH 7,12, nhi t đ 48,77 °C và th i gian th y phân là 124,85 phút

S đ đi u ki n ph n ng b m t (nhi t đ , pH)

nh h ng đ n s hình thành glycerol

(Ngu n: Kao et al., 2011)

M t nghiên c u v th y phân gluten trong lúa mì b ng cách k t h p các peptidase vƠ ph ng pháp th m tách b ng đi n (Giesler et al., 2013) đư ch ng minh r ng trong quá trình th y phân flavourzyme b c ch b i 2 axit amin là

Giai đo n ti p theo là s d ng ch ph m enzyme thêm vào quá trình th y phân

nh ch ph m bromelain, papain, ficin, ch ph m protease t n m m c A.oryzae,

vi khu n Bacillus subtilis ho c n m s i và c các ch ph m trích ly t đ ng v t Khi b sung trypsin và chymotrypsin vào quá trình s n xu t n c m m cá v i

t l 0,3% và 0,6% cho th y hƠm l ng đ m amin t ng cao, quá trình th y phân nhanh h n nên rút ng n đ c th i gian ch bi n n c m m t 6 đ n 12 tháng

xu ng còn 2 tháng, k t qu c m quan v màu s c vƠ h ng v n c m m có b sung trypsin và chymotrypsin nh n th y không có s khác bi t so v i n c m m lên men truy n th ng (Chaveesuk, 1991) Nghiên c u s d ng nhi u lo i enzyme nh protease A, aroase vƠ papain đ b sung vƠo qui trình lên men n c

m m cá h i n ng đ 1%, k t qu nghiên c u cho th y protease A (n m m c

A oryzae) là phù h p nh t, cho n c m m ć hƠm l ng nit t ng s vƠ nit amin cao h n c n c m m lên men truy n th ng, th i gian th y phân ch còn

4 tháng (Taniguchi et al., 2003) T ng t Hariono et al (2006) đư s d ng 1% protease A (n m m c A oryzae) có b sung thêm 25% Koji vƠ 30% n c; 16%

mu i; pH 6,5 và nhi t đ phòng trong th i gian 2,5 tháng, đư thu đ c n c

m m ć hƠm l ng đ m cao ph ng pháp nƠy đư thƠnh công trong vi c t n

d ng l ng l n cá nh , t p có giá tr kinh t th p M t nghiên c u mang ý ngh a

và gây ti ng vang l n trong vi c ng d ng enzyme protease th ng m i trong

s n xu t n c m m ph i k đ n là công trình nghiên c u c a Yongsawatdigul

et al (2007) khi k t h p hai enzyme th ng m i alcalase (n m Bacillus licheniformis) 0,25%, 65oC trong 2 gi , sau đ́ b sung 0,5% enzyme flavourzyme (n m m c Aspergillus oryzae) trong 4 gi , ti p theo b sung 10% canh tr ng nuôi c y vi khu n và mu i đ n 25% K t qu sau 4 tháng thu đ c

n c m m có hàm l ng axit amin cao và màu s c đ p không khác bi t so v i

n c m m lên men truy n th ng

2.2.6.2 ng d ng trong s n xu t b tăđ m

M t l nh v c khác nghiên c u s n xu t b t đ m cao t protein có trong

th c v t (đ u nành, b p ) hay đ ng v t (b t tôm, b t cá) b ng cách s d ng các enzyme n i t i đ c i bi n kích th c phân t protein và x lý các protein c

ch tiêu hóa có s n trong nguyên li u hay b sung enzyme protease th ng m i Alcalase, Novozyme, Flavourzyme th y phân b t đ u nành tách béo nh m làm

t ng hƠm l ng axit amin t do đ t hi u su t th y phân cao và rút ng n th i gian th y phân, làm gi m thi u s ho t đ ng c a vi sinh v t đư ć b c phát tri n đáng k , nhi u k t qu đư đ c ng d ng Nguyen et al (2011) đư thƠnh công trong s d ng enzyme protamex th y phân protein t đ u cá ng vây vàng,

s n ph m ć hƠm l ng protein 88,2%, lipit 1,4% và tro 8,3%, b t có giá tr dinh d ng cao, giàu axit amin không hay th (chi m 56,31% t ng l ng axit amin), có th b sung b t dinh d ng, s n xu t n c m m hay th c n đ ng v t

M t l nh v c khác nghiên c u s n xu t b t đ m cao c p cho tr em và

ng i l n tu i t b t đ u nành s d ng ch ph m prozima ch a bromelain đ

c i bi n kích th c phân t protein và x lý các protein c ch tiêu hóa có s n trong nguyên li u, ho c s d ng các protease th ng m i alcalase, novozyme, flavourzyme, (Chakrabarti, 2002; Aspmo et al., 2005) th y phân d ch tôm

nh m lƠm t ng hƠm l ng axit amin t do đ t hi u su t th y phân cao và rút

ng n th i gian th y phân, làm gi m thi u s ho t đ ng c a vi sinh v t Holanda and Netto, (2006), đư ch ng minh d ch protein thu h i sau th y phân t tôm có

ho t tính sinh h c r t cao nh kh n ng ch ng oxy hóa, kh n ng ki m soát enzyme gây cao huy t áp

2.2.6.3 ng d ng trong s n xu t d chăđ m th y phân

Th y phân nguyên li u ć hƠm l ng protein cao b ng các enzyme

vƠ enzyme th ng m i hi n đang r t ph bi n, đ c bi t trong

l nh v c th y s n ơy lƠ ngu n nguyên li u r ti n và phong phú, nguyên li u

th y phơn th ng là các ph ph m th i ra trong quá trình ch bi n nh đ u, v ,

v y hay n i t ng,… ngu n nguyên li u còn đ c đi u ch t các loài cá có giá

tr kinh t th p, cá t ng đáy,…

Thông th ng, nguyên li u đ c xay nhuy n vƠ đ c th y phân b i enzyme n i t i hay b sung các enzyme th ng m i, trong m t th i gian

m t nhi t đ và pH thích h p tùy theo enzyme đ c s d ng Các ho t đ ng

c a enzyme đ c b t ho t b ng cách x lý nhi t sau khi đ t các đ c tính mong

mu n, sau đ́ d ch th y phơn đ c ly tâm và cô đ c (Gildberg, 1993) Các thu c tính c a d ch th y phân t protein cá ph thu c vào s l a ch n c a các enzyme

vƠ các đi u ki n quá trình th y phân (Nakkarike et al., 2011) Kh n ng hòa tan

c a protein cá ph thu c vào th i gian và n ng đ enzyme b sung vào (Quaglina and Orban, 1987) N u kéo dài th i gian th y phân s thu đ c các chu i axit amin ng n, thi u các tính ch t ch c n ng c a protein ban đ u M t s enzyme tiêu h́a th ng đ c s d ng nh : pepsin, trypsin, chymotrypsin, alcalase, flavourzyme S n ph m th y phân protein có nhi u ng d ng ti m

n ng trong th c ph m nh : ch t t ng c ng h ng v , thành ph n ch c n ng,

ph gia dinh d ng b sung vào s n ph m có ch t l ng protein th p, ch t thay

th s a cho bé và là ngu n cung c p các protein có ho t tính sinh h c (Gildberg, 1993; Kim and Mendis, 2006; Nakkarike et al., 2011) D ch th y phân giàu

đ m ngoƠi vai trò dinh d ng do ch a đ y đ các axit amin đ c bi t là các axit amin c n thi t, các peptit có kh n ng ch ng oxy hóa, ch ng t ng huy t áp (Dey and Dora., 2014a; Ganugula et al., 2008) hay ch ng bi n đ i gen có kh n ng

gơy ung th (Babu et al., 2008; Wilson-Sanchez et al.,2010; López-Saiz et

al.,2016)

D ch ép tách protein t ph ph n đ u v tôm th (Penaeus vannamei) trong

s n xu t chitin đ c Nguy n Minh Trí và ctv (2009) t n d ng protein làm th c

ph m, th nghi m b ng cách s d ng th y phân b ng enzyme Protamex, sau đ́

cô đ c d ch th y phân 85÷95oC đ n hƠm l ng nit t ng s đ t 20 g/L, b sung 20% mu i vƠ đ a vƠo ch p đư lên men 105 ngƠy v i t l 20% th tích

ch p N c m m đ c thu h i sau 1 tháng ć đ đ m t ng t ng ng v i

l ng protein b sung so v i m u đ i ch ng

2.2.6.4 ng d ng trong công ngh s n xu t s a và các s n ph m t s a

S a là ngu n th c ph m giƠu dinh d ng, t nguyên li u s a ch bi n ra

r t nhi u s n ph m có c u trúc, tr ng thái vƠ h ng v khác nhau Các s n ph m

t s a có th d ng b t, d ng r n, s t hay l ng v i h ng v đ c tr ng tùy theo

m c đích ch bi n ng d ng enzyme protease trong cho quá trình s n xu t s a