NGHIÊN cứu một số CYTOKIN HUYẾT TƯƠNG TRÊN BỆNH NHÂN mắc BỆNH GAN DO rượu

Giai đoạnđầu của ALD diễn biến âm thầm không triệu chứng, có thể đảo ngượcnếu cai rượu, nhưng giai đoạn sau của ALD không thể đảo ngược,thường dẫn đến tử vong do các biến chứn

LÊ QUỐC TUẤN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CYTOKIN HUYẾT TƯƠNG TRÊN BỆNH NHÂN MẮC BỆNH GAN

Người hướng dẫn khoa học:

vào hồi: giờ, ngày tháng năm 201

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia

Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên

Thư viện Trường Đại học Y Dược, Đại học Thái Nguyên

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh gan do rượu (Alcohol liver disease - ALD) là hậu quảcủa sự lạm dụng rượu ở mức độ có hại và thời gian kéo dài Giai đoạnđầu của ALD diễn biến âm thầm không triệu chứng, có thể đảo ngượcnếu cai rượu, nhưng giai đoạn sau của ALD không thể đảo ngược,thường dẫn đến tử vong do các biến chứng vỡ tĩnh mạch thực quản, hôn

mê gan Không có liệu pháp điều trị nào triệt để ngoại trừ ghép gan.Bệnh không những ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của người bệnh,

mà còn gây những tác động rất lớn đến sự phát triển kinh tế xã hội

Qua các nghiên cứu cho thấy thay đổi miễn dịch và viêm lànhân tố chính, đóng góp vào sự tiến triển của ALD Các trung giancủa hệ thống miễn dịch, chẳng hạn như cytokine hoặc yếu tố gâyviêm có liên quan chủ yếu đến các giai đoạn của bệnh Trong ALD,

sử dụng ethanol mạn tính sẽ kích hoạt các tế bào Kupffer thông quacác thụ thể, làm tăng sinh interleukin-1 (IL-1) và yếu tố hoại tử khối ualpha (TNF-α), góp phần làm rối loạn chức năng gan, hoại tử, rối loạnsự chết theo chương trình của tế bào gan, xơ hóa gan tiến triển và xơgan Nghiên cứu BN viêm gan do rượu thấy tăng TNF-α, IL-1, IL-8,thâm nhiễm bạch cầu, kích hoạt bạch cầu đơn nhân và đại thực bào.Điều này càng chứng minh cho giả thuyết viêm là yếu tố then chốttrong tiến triển của ALD

Ngày càng có nhiều bằng chứng viêm là yếu tố chính đóng gópvào tiến triển ALD, các liệu pháp điều trị nhắm vào viêm là một chiếnlược hợp lý Hiểu biết sâu sắc về vai trò của một số cytokine trong cácgiai đoạn ALD giúp phát hiện ra các liệu pháp điều trị mới, ức chế viêmở giai đoạn đầu và xơ hóa ở giai đoạn sau của bệnh thực sự có lợi giúplàm chậm quá trình tiến triển của bệnh

Ở Việt Nam sự gia tăng số lượng bệnh nhân bệnh gan dorượu cũng là vấn đề đang được quan tâm và đáng lo ngại do tỉ lệ sửdụng rượu bia của Việt Nam ngày càng tăng Tuy nhiên, nghiên cứumối liên quan giữa cytokine với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng

và mức độ bệnh ở bệnh nhân bệnh gan do rượu chưa được các nhàkhoa học nghiên cứu và quan tâm nhiều Xuất phát từ lý do đó, chúng

tôi nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu một số cytokine huyết tương trên bệnh nhân mắc bệnh gan do rượu” với mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và sự biến đổi TNF-α,

IL-12, IL-1β, TGF-β ở người viêm gan và xơ gan do rượu.

2.Phân tích mối liên quan giữa sự biến đổi TNF-α, IL-12, IL-1β, TGF-β với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan và xơ gan do rượu

Ý NGHĨA KHOA HỌC

Nhấn mạnh vai trò của một số cytokin trong chẩn đoán, tiên lượng,cung cấp bằng chứng hữu ích là sở sở khoa học để ứng dụng liệu phápcytokin trong điều trị bệnh gan do rượu

Ý NGHĨA THỰC TIỄN

Xác định nồng độ TNF-α, IL-12, IL-1β, TGF-β trong huyết tươngở người viêm gan và xơ gan do rượu

Đánh giá mối liên quan giữa 4 cytokin này với một số đặc điểm lâmsàng và cận lâm sàng ở BN mắc ALD

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Là luận án đầu tiên nghiên cứu 4 cytokin trong huyết tương BNmắc ALD

- Góp phần bổ sung thông tin về vai trò cytokin trong bệnh gan

do rượu, là cơ sở khoa học cho việc ứng dụng liệu pháp điều trị nhắmvào cytokin trong điều trị bệnh gan do rượu

- Đề xuất sử dụng các dấu ấn sinh học đưa vào sử dụng trong lâmsàng để phát hiện tình trạng viêm và xơ hóa gan

BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN

Luận án gồm 102 trang: Đặt vấn đề: 02 trang Tổng quan: 37trang Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 14 trang Kết quả nghiêncứu: 17 trang Bàn luận: 22 trang Kết luận: 02 trang Khuyến nghị: 01trang Luận án có 52 bảng, 1 sơ đồ, 12 hình minh họa, 102 tài liệu thamkhảo trong đó có 7 tài liệu tiếng Việt, 95 tài liệu tiếng Anh 3 bài báo liênquan đến đề tài luận án được đăng trên Tạp chí Y học Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh gan do rượu

Dịch tễ học: Lạm dụng rượu phổ biến trên toàn thế giới, với tỉ

lệ ước tính khoảng 18% người trưởng thành ở Hoa Kỳ Năm 2010, xơgan do rượu đã gây ra 493.300 ca tử vong (chiếm 1% tổng số ca tửvong) Tại Hoa Kỳ, Viện Y tế Quốc gia ước tính trong năm 2009, đãcó hơn 31.000 ca tử vong do xơ gan và trong đó xơ gan rượu chiếm48% số ca tử vong Tỉ lệ bệnh gan do rượu cao hơn ở những khu vựccó mức tiêu thụ rượu trên đầu người cao Các khu vực có tỉ lệ caotiêu thụ rượu và bệnh gan do rượu bao gồm Đông Âu, Nam Âu, vàVương quốc Anh Các nước có số lượng lớn người Hồi giáo thì có tỉ

lệ tiêu thụ rượu và bệnh gan do rượu thấp nhất Hoa Kỳ có mức tiêuthụ trung bình 9,4 L/người lớn/năm, so với 13,4 L/năm ở Anh và 0,6L/năm ở Indonesia

1.1.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh gan do rượu

Trong hầu hết các trường hợp, bệnh cảnh lâm sàng ít rầm rộhoặc không có triệu chứng ở giai đoạn sớm và ở giai đoạn còn bù.Bệnh cảnh lâm sàng của ALD biến đổi từ bệnh không có triệu chứnghoặc nhẹ cho đến xơ gan gây tử vong Do đó, chẩn đoán phụ thuộc

nhiều vào dấu hiệu lâm sàng, các xét nghiệm khác nhau và các kỹthuật xâm lấn hoặc không xâm lấn.

Bệnh cảnh ALD điển hình:

- Bệnh nhân chán ăn, buồn nôn, nôn, khó chịu, sụt cân, đau bụng và vàng da

- Sốt đôi khi cao tới 39oC, gặp 50% các trường hợp

- Khám: đa số có gan to, đau, 1/3 số trường hợp có lách to

- Nặng hơn có thể có: cổ trướng, phù, xuất huyết, hội chứng não gan

Các triệu chứng vàng da, cổ trướng và hội chứng não gan cóthể giảm dần nếu kiêng rượu Nếu BN tiếp tục uống rượu và chế độ

ăn kém dinh dưỡng có thể dẫn đến các đợt cấp lặp đi lặp lại với cácbiểu hiện của xơ gan mất bù, dẫn tới tử vong

Một số BN giai đoạn đầu có dấu hiệu lạm dụng rượu như: căngphồng tuyến nước bọt, suy nhược cơ thể, suy dinh dưỡng, có thể códấu hiệu thần kinh ngoại vi, nhưng thường thì BN hoàn toàn không cótriệu chứng và miễn cưỡng thừa nhận uống rượu có thể là nguyên nhângây ra các biểu hiện bất thường của gan

Khi khám lâm sàng các bệnh nhân xơ gan, các biểu hiện ngoài dađiển hình của bệnh gan bao gồm: sao mạch, lòng bàn tay son và lưỡinhẵn bóng Vàng da, hội chứng não gan, cổ trướng và phù chân cũng cóthể gặp ở BN bị bệnh gan giai đoạn cuối

Nghĩ tới ALD khi BN có tiền sử uống rượu quá mức (> 40-50g/ngày) và dấu hiệu bất thường về lâm sàng và hoặc các chỉ số xétnghiệm bất thường gợi ý tổn thương gan Tuy nhiên, khi khai thác tiền sửuống rượu thường bị bỏ quên nên thường phải sử dụng các công cụ sànglọc sử dụng rượu gián tiếp

Ở bệnh nhân mắc bệnh gan do rượu, sau 72-96 giờ ngừng uốngrượu xuất hiện các triệu chứng của hội chứng cai rượu: mê sảng, nhịptim nhanh, tăng huyết áp, sốt nhẹ, đau bụng, hoang tưởng và ảo giác

Tỷ lệ AST/ALT thường > 2 AST tăng < 500 U/L, ALT tăng <

300 U/L GGT tăng cao MCV > 100 fL

Mô bệnh học: Thoái hóa phì đại tế bào gan, thể Mallory, ty thểkhổng lồ, thâm nhiễm tế bào viêm, xơ hóa gan và gan nhiễm mỡ

1.4 Chẩn đoán xác định bệnh gan do rượu

Theo hướng dẫn của Hội nghiên cứu bệnh gan Hoa kỳ năm(AASLD - 2010): Chẩn đoán dựa vào tiền sử sử dụng rượu (Sàng lọc

sử dụng rượu của Tổ chức Y tế Thế giới AUDIT - WHO), triệu chứnglâm sàng của bệnh gan, và bất thường các enzym gan Sinh thiết gangiúp chẩn đoán nguyên nhân, và xác định các giai đoạn tổn thươnggan

Các nghiên cứu quan sát cho thấy mức TNF-α ở huyết thanh cũngnhư ở gan tăng lên ở BN viêm gan do rượu, và tương quan với mức độnặng của bệnh Ứng dụng cơ sở khoa học này để dùng chất ức chế TNF-

α trong điều trị BN mắc ALD

1.5 Vai trò của một số cytokin trong bệnh gan do rượu

Nồng độ IL-12 trong huyết thanh tăng ở những BN bị nhiễm độcrượu, viêm gan do rượu, xơ gan do rượu IL-12 tăng cao nhất ở BN viêmgan do rượu và giảm dần khi kiêng rượu

TGF-β là trung tâm trong bệnh gan mạn tính, liên quan đến cácgiai đoạn tiến triển của bệnh, từ tổn thương gan ban đầu thông qua cácphản ứng viêm và xơ hóa dẫn đến xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan.TGF-β hoạt hóa sự sản xuất collagen từ tế bào hình sao Tổn thương ganlàm cho hoạt động TGF-β tăng cường điều tiết tế bào hình sao và kíchhoạt nguyên bào sợi dẫn đến một phản ứng lành vết thương, trong đó có

tăng myofibroblast và lắng đọng ngoại bào Được công nhận là mộtcytokine profibrogenic chính, các đường truyền tín hiệu TGF-β liênquan với sự ức chế sự tiến triển của bệnh gan

Nhiều dữ liệu cho thấy vai trò quan trọng của IL-1β trong cáctổn thương gan do rượu, phụ thuộc vào sự hình thành và kích hoạt củainflammasome Nó liên quan đến sự tiến triển của bệnh

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu gồm 135 người: 95 BN mắc viêm gan

và xơ gan do rượu còn bù nằm điều trị nội trú tại khoa Nội tiêu hóa

Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên và Bệnh viện Quân Y 103; 40sinh viên khỏe mạnh của Học viên Quân Y

- Thời gian: Từ tháng 1/2015 đến tháng 12/2015.

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu

* Nhóm bệnh:

- Những BN được chẩn đoán ALD (gồm viêm gan và xơ gan

do rượu) theo hướng dẫn chẩn đoán của Hội nghiên cứu bệnh ganHoa Kỳ (AASLD) năm 2010:

+ Có nghiện rượu: Điểm số AUDIT từ 8 điểm (đối với nam ≤

60 tuổi), từ 4 điểm (đối với nam > 60, nữ giới) trở lên

+ Có dấu hiệu lâm sàng của bệnh gan: đau tức hạ sườn phải,vàng da, chán ăn, chậm tiêu, gan to… có các triệu chứng của hộichứng tăng áp lực tĩnh mạch cửa và hội chứng suy tế bào gan + Có xét nghiệm enzym gan tăng: AST tăng nhưng không quá

500 U/L, ALT tăng nhưng không quá 200 U/L AST > ALT GGTtăng cao

+ Mô bệnh học: Thoái hóa phì đại tế bào gan, thể Mallory, tythể khổng lồ, thâm nhiễm tế bào viêm, xơ hóa gan và gan nhiễm mỡ.

- Bệnh nhân tự nguyện tham gia vào nghiên cứu bằng ký phiếuđồng ý tham gia

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ nhóm bệnh

Loại ra khỏi nghiên cứu những bệnh nhân

- Bệnh gan do rượu có kèm theo bệnh gan do nguyên nhânkhác: tiếp xúc với hóa chất độc hại, sử dụng thuốc, tắc mật, ung thư,virus viêm gan B, C, tự miễn

- Bệnh nhân đang bị nhiễm trùng, nấm, virus, dị ứng, tự miễn

- BN có điểm Chil-Pugh > 13

* Nhóm chứng:

40 nam sinh viên Học viện Quân y đều được phỏng vấn để điềutra tiền sử nghiện rượu dựa vào bộ câu hỏi AUDIT; hỏi bệnh và khámlâm sàng toàn diện tỉ mỉ; làm các xét nghiệm cận lâm sàng để phát hiện

và loại trừ bệnh lý gan mật Nếu thấy thực sự khỏe mạnh không mắcbệnh gan mật và không nằm trong tiêu chuẩn loại trừ nhóm bệnh sẽ đượcchọn vào nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

- Thiết kế nghiên cứu mô tả, cắt ngang, có so sánh với nhóm chứng

2.3.2.Phương pháp chọn mẫu

- Sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện: chọn chủ đíchtoàn bộ bệnh nhân thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn trong thời giannghiên cứu

- Cỡ mẫu: sử dụng công thức tính cỡ mẫu mô tả một giá trị trung bìnhtính theo nghiên cứu trước

Trong đó:

n: Số BN mắc ALD cần nghiên cứu

Z1-α/2: Hệ số giới hạn tin cậy, với mức tin cậy 95%  Z1-α/2 = 1,96

các nghiên cứu trước

δ: Độ lệch chuẩn của cytokin từ nghiên cứu trước

ε: Độ chính xác tương đối, chọn ε = 0,05

Tác giả González-Reimers và cs nghiên cứu trên BN mắc ALDcho thấy nồng độ TNF-α ở bệnh nhân ALD có xơ gan (7,18 ± 3,51pg/ml), bệnh nhân ALD chưa xơ gan (5,013 ± 2,10 pg/mL)

Cỡ mẫu tối thiểu trong nghiên cứu này là: n = 57

Trong quá trình thu thập số liệu có 95 BN và 40 người khỏemạnh đủ tiêu chuẩn đã chọn vào nghiên cứu

2.2.3 Các bước tiến hành

2.3.3.1 Chọn bệnh nhân

Tất cả các BN điều trị nội trú tại khoa Nội Tiêu hóa đủ tiêuchuẩn chọn bệnh và không nằm trong tiêu chuẩn loại trừ

2.4.6 Kỹ thuật xét nghiệm cytokine trong máu

Tất cả các mẫu huyết tương của đối tượng nghiên cứu lấy từ 2Bệnh viện đều được lưu trữ trong tủ lạnh âm sâu 800C cho đến đủ 95

mẫu bệnh và 40 mẫu chứng sẽ mang ra phân tích tại Labo Trung tâmnghiên cứu ứng dụng Y Sinh Dược học – Học Viện Quân y.

- Định lượng nồng độ 4 cytokine TNF-α, IL-12, TGF-β, IL-1βtrong 95 mẫu bệnh và 40 mẫu chứng: bằng kỹ thuật ELISA (Kit củahãng Thermo Scientific)

- Phương pháp: xét nghiệm miễn dịch enzym kiểu Sandwich

dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể được gắn ở đáy giếng vớikháng nguyên cytokine có trong mẫu thử

Mật độ quang học (Optical Density - OD) của các giếng được

đo bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm ± 10nm Giá trị OD củacác giếng ELISA tỷ lệ thuận với lượng cytokin có trong mẫu Kết quảtính toán dựa vào đường cong chuẩn đo được của các giếng chuẩnvới nồng độ đã biết

- Thực hiện các bước định lượng theo quy trình hướng dẫn của nhàsản xuất trên máy ELISA của hãng Diagnostic Automation, Hoa kỳ

- Giá trị ngưỡng:

TNF-α: 8 - 400 pg/mL

IL-1β: 1 - 20 ng/L

TGF-β: 150 - 3 000 ng/L

IL-12: 2 - 40 ng/L

2.3.3.6.Kỹ thuật sinh thiết gan

+ Phương pháp sinh thiết gan qua da dưới hướng dẫn của siêu âm,kiểu tru-cut bằng súng sinh thiết cắt tự động Pajunk của Đức, kimDeltacut 16G x 150 mm, sử dụng máy siêu âm Aloka Prosound 6, củaNhật Bản, đầu dò 3,5 MHz Mẫu mô gan được đánh giá bởi bác sỹKhoa Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Quân Y 103

2.4 Tiêu chuẩn đánh giá dùng trong nghiên cứu

- Bộ câu hỏi đánh giá sử dụng rượu của tổ chức y tế thế giới (bộ câu hỏiAUDIT - WHO), điểm số AUDIT: từ 8 điểm trở lên (đối với nam ≤ 60 tuổi),từ 4 điểm trở lên (đối với nam > 60, nữ giới) là nghiện rượu

- Chẩn đoán ALD theo hướng dẫn của hội nghiên cứu bệnh ganHoa Kỳ 2010

- Đánh giá giai đoạn xơ hóa gan theo phân loại Metavir

2.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

- Các số liệu được quản lý và phân tích bằng chương trình SPSS 20.0

- Thống kê mô tả: các biến định tính được mô tả bằng số lượng và tỷ lệ

%, các biến định lượng được mô tả bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

- Với các phân phối không chuẩn: so sánh trung vị của 2 nhómđộc lập bằng kiểm định Mann-Whitney, so sánh trung vị 3 nhómđộc lập bằng phân tích Kruskal-Wallis

- Phân tích hồi quy đơn biến với các phân phối không chuẩnbằng cách sử dụng hệ số tương quan Spearman,s

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Qua nghiên cứu 95 BN nam mắc bệnh viêm gan và xơ gan

do rượu và 40 sinh viên khỏe mạnh chúng tôi thu được kết quả sau:

3.1 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và sự biến đổi TNF-α,

IL-12, IL-1β, TGF-β ở người bệnh viêm gan và xơ gan do rượu Bảng 3.1 Đặc điểm về nhóm tuổi của đối tượng nghiên cứu

Nhận xét: Nhóm nghiên cứu có tuổi nhỏ nhất là 30 tuổi, lớn

nhất là 76 tuổi và tuổi trung bình là 50,65 tuổi Nhóm 45-59 tuổi có tỉ

Nhận xét: Triệu chứng lâm sàng chủ yếu thường gặp là mệt

mỏi với tỉ lệ 84,2%, vàng da là 66,3%, chán ăn là 64,2%, gan to là63,2%