NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT TRONG DỊCH CHIẾT n HEXAN CỦA VỎ CÂY HOA SỮA TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

- Phân lập một số hợp chất hóa học có trong mẫu cao chiết từ vỏ cây hoa sữa.. Khái niệm Theo Polonopski: "Ancaloit là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM



TRẦN THỊ THÙY ANH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT

TRONG DỊCH CHIẾT N – HEXAN CỦA VỎ CÂY HOA SỮA

TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CỬ NHÂN HÓA HỌC

ĐÀ NẴNG, 2 1

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT

TRONG DỊCH CHIẾT N – HEXAN CỦA VỎ CÂY HOA SỮA

TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Sinh viên thực hiện: Trần Thị Thùy Anh Chuyên ngành : Hóa học

MSSV : 314033151102 Lớp : 15CHD1 Người hướng dẫn : GS.TS Đào Hùng Cường

ĐÀ NẴNG, 2 1

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng em

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực

Tác giả luận văn

Trần Thị Thùy Anh

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn:

Cảm ơn GS.TS Đào Hùng Cường đã rất nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp kiến thức và khích lệ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp Em thấy vô cùng may mắn khi được Thầy hướng dẫn em làm đề tài trong năm học cuối tại trường đại học Sư phạm

Cảm ơn tất cả quý Thầy Cô của khoa Hóa đã tận tình dạy dỗ em trong bốn năm qua để em có kiến thức hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Cảm ơn chị Nguyễn Thị Như Ngọc đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền thụ những kinh nghiệm quý báu cho em từ những ngày đầu thực hiện đề tài

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 1

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1

4.1 Đối tượng 1

4.2 Hoá chất và phương tiện nghiên cứu 2

4.2.1 Các loại hoá chất, dụng cụ 2

4.2.2 Các máy móc, thiết bị phân tích 2

4.3 Phạm vi nghiên cứu 2

5 Phương pháp nghiên cứu 2

5.1 Nghiên cứu lý thuyết 2

5.2 Phương pháp thực nghiệm 2

6 Bố cục luận văn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về cây hoa sữa 4

1.1.1 Đặc điểm sinh thái 4

1.1.2 Đặc tính thực vật 4

1.1.3 Công dụng của vỏ cây hoa sữa 5

1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới về cây hoa 5

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 5

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6

1.3 Ancaloit 11

1.3.1 Khái niệm 11

1.3.2 Một số ancaloit trong vỏ cây hoa sữa 11

1.3.3 Tính chất chung của ancaloit 11

1.3.4 Chiết tách ancaloit 12

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị thí nghiệm 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lí 16

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật 18

2.2.3 Phương pháp định tính một số lớp chất trong vỏ cây hoa sữa 18

2.2.4 Phương pháp phân tích vật lí 21

2.2.5 Phương pháp phân lập các hợp chất 23

2.2.6 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất 27

2.3 Các sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 27

2.3.1 Sơ đồ khảo sát sơ bộ một số yếu tố 27

2.3.2 Sơ đồ điều chế và phân lập chất tinh khiết 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Xác định một số chỉ số vật lý 29

3.1.1 Độ ẩm 29

3.1.2 Hàm lượng tro 29

3.1.3 Hàm lượng kim loại 30

3.2 Xác định thời gian chiết 31

3.3 Xác định các lớp chất trong vỏ cây hoa sữa 31

3.4 Xác định một số thành phần hóa học trong dịch chiết n - hexan bằng phương pháp GC - MS 33

3.5 Hàm lượng cao chiết so với mẫu khô 36

3.6 Xác định cấu trúc hợp chất tách được ASVH10 36

3.6.1 Hằng số vật lí và các số liệu phổ của hợp chất tách được 36

3.6.2 Xác định cấu trúc của hợp chất tách được 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

Kết luận 46

Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 49

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ASVH10: Tên hợp chất phân lập được

13 C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C - Carbon Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

ESI-MS: Phổ khối lượng phun mù điện tử - Electron Spray Ionization Mass

J, δ: Hằng số tương tác (Hz), độ dịch chuyển hóa học (ppm)

R f : Thời gian lưu - Retention factor

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm của bột nguyên liệu 29 3.2 Kết quả khảo sát hàm lượng tro trong bột nguyên liệu 30 3.3 Hàm lượng một số kim loại trong bột nguyên liệu 30 3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết với dung môi n-hexan 31 3.5 Kết quả định tính các lớp chất thiên nhiên trong vỏ cây hoa sữa 31 3.6 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane 33

3.8 Phân tích phổ hồng ngoại (FT - IR) của chất ASVH10 37

3.10 Dữ liệu phổ 13C - NMR, DEPT của chất ASVH10 38 3.11 So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASVH10 với β - amyrin 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

3.1 Sắc ký đồ GC-MS dịch chiết n-hexane của vỏ cây hoa sữa 33

3.4 Phổ 1H - NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất ASVH10 41 3.5 Phổ

1H - NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất ASVH10

3.6 Phổ 1H - NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất ASVH10 41 3.7 Phổ 13C - NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất ASVH10 42 3.8 Phổ

3.11 Phổ DEPT của hợp chất ASVH10 (giãn từ 10 - 55 ) 44 3.12 Cấu trúc hóa học và các tương tác chính của hợp chất ASVH10 45

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong thời gian qua, những hợp chất tự nhiên được phân lập từ thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, Việc nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần và cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí của cây thuốc Trên cơ sở các nghiên cứu

đó có thể tạo ra chất mới có hoạt tính sinh học cao như mong muốn để làm thuốc chữa bệnh, đặc biệt là các bệnh nan y [3]

Cây hoa sữa là một cây thường xanh có thể đạt chiều cao lên đến 40 m Vỏ cây được sử dụng chủ yếu trong y học Nó được coi là một loại thuốc bổ, hạ sốt, chữa sốt rét, bệnh phong, bệnh ngoài da, ngứa, khối u, ung loét mãn tính, hen suyễn, viêm phế quản, suy nhược cơ thể, tiêu chảy, kiết lỵ và khó tiêu Lá cây sắc lên được

sử dụng chống lại bệnh tê phù Hạt có tác dụng kích thích tình dục và tinh thần [18] Cho đến nay ở nước ta chưa có những nghiên cứu mang tính cơ bản về thành phần, tính chất, khả năng ứng dụng của hợp chất ancaloit có trong vỏ cây hoa sữa

Với những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu phân lập chất tinh khiết trong dịch chiết n - hexan của vỏ cây hoa sữa trên địa bàn thành phố Đà Nẵng” nhằm góp phần nâng cao giá trị khoa học và giá trị sử dụng của vỏ cây

hoa sữa trong y học

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định cấu trúc một số hợp chất ancaloit quan trọng trong vỏ cây hoa sữa

- Phân lập chất tinh khiết trong dịch chiết n - hexan của vỏ cây hoa sữa

- Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Xây dựng quy trình chiết với dung môi n – hexan

- Nghiên cứu, xác định cấu trúc của một số hợp chất hóa học của vỏ cây hoa sữa

- Phân lập chất tinh khiết trong dịch chiết n - hexan của vỏ cây hoa sữa

- Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng

- Vỏ của cây hoa sữa tại trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng

4.2 Hoá chất và phương tiện nghiên cứu

4.2.1 Các loại hoá chất, dụng cụ

Hóa chất: n - hexan, axit axetic, thuốc thử Mayer, , nước cất, NH3 đặc, ete dầu hỏa, aceton

Dụng cụ: Cân phân tích, nhiệt kế các loại, ống đong các loại, buret, cốc thủy

tinh các loại, đũa thủy tinh, bình cầu các loại, bình tam giác các loại, sinh hàn, lọ thủy tinh cổ rộng có nắp đậy, mao quản sạch, bản mỏng, các dụng cụ khác

4.2.2 Các máy móc, thiết bị phân tích

- Tủ sấy, lò nung

- Thiết bị cô quay chân không

- Bộ chiết soxhlet

- Máy đo quang UV-VIS

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

- Máy quang phổ hồng ngoại IR

- Máy đo sắc kí lỏng cao áp kết hợp với khối phổ HPLC - MS và GC - MS

- Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1H - NMR, 13C - NMR, DEPT

4.3 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu trên nguồn nguyên liệu tại thành phố Đà Nẵng

- Phân lập một số hợp chất hóa học có trong mẫu cao chiết từ vỏ cây hoa sữa

- Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

5 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này, tôi sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:

5.1 Nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có liên quan đến đề tài;

- Hội thảo, trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô giáo và sinh viên

5.2 Phương pháp thực nghiệm

- Xác định độ ẩm bằng phương pháp trọng lượng;

- Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hoá mẫu;

- Xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử;

- Chiết bằng phương pháp chiết nóng soxhlet và phương pháp ngâm kiệt với dung môi hữu cơ;

- Xác định thành phần các hợp chất chính trong dịch chiết từ vỏ cây hoa sữa trong dung môi chiết bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ (LC - MS), phổ hồng ngoại IR và sắc kí khí ghép khối phổ GC – MS;

- Phân lập chất bằng phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng;

- Các phương pháp xác định cấu trúc của chất phân lập được: kết hợp các phương pháp đo phổ hồng ngoại (FT - IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR): 1H - NMR, 13C - NMR, DEPT

6 Bố cục luận văn

Luận văn bao gồm 48 trang, 13 bảng, 20 hình ảnh, 18 tài liệu tham khảo và 4 phụ lục Với:

Phần mở đầu (3 trang)

Chương 1: Tổng quan (11 Trang)

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (14 Trang)

Chương 3: Kết quả và thảo luận (17 Trang)

Kết luận và kiến nghị (1 Trang)

Tài liệu tham khảo (2 Trang)

Phụ lục (4 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cây hoa sữa

1.1.1 Đặc điểm sinh thái

a) Tên gọi

- Tên thường gọi - Cây mò cua, mù cua, tinpet, popeal - khê

- Tên khoa học - Alstonia scholaris L R Br (hay còn gọi - Echites scholaris L Mant., Pala scholaris L Roberty)

b) Phân loại khoa học

- Giới: Plantae;

- Bộ : Gentianales (Long đởm);

- Họ : Apocynaceae (La bố ma);

- Chi : Alstonia (Hoa sữa);

- Loài : A Scholaris

c) Phân bố

Cây hoa sữa mọc hoang và được trồng dọc 2 bên đường phố để lấy bóng mát Hoa (nở mùa thu) có mùi thơm hắc Vỏ hái quanh năm, nhưng tốt nhất vào mùa xuân, hạ Cây hoa sữa có nguồn gốc từ các khu vực sau:

 Trung Quốc: Quảng Tây (tây nam); Vân Nam (nam);

 Tiểu lục địa Ấn Độ: Ấn Độ; Nepal; Sri Lanka;

 Đông Nam Á: Campuchia; Myanma; Thái Lan; Việt Nam, Indonesia; Malaysia; Papua New Guinea; Philippines;

 Úc: Queensland

1.1.2 Đặc tính thực vật

Cây hoa sữa là cây lá rộng 5 đến 7 lá tạo thành 1 vòng xoắn quanh nhánh cây (hiếm gặp hơn là 4 - 10 lá tạo thành 1 vòng) Các lá đơn có chiều dài từ 9 đến 20 cm và chiều rộng từ 2 đến 5 cm Mặt trên của lá thường bóng, mặt dưới xám, trong khi viền lá thì trơn tru Cuống lá dài từ 0,5 đến 3 cm Cuống hoa dài khoảng 2 đến

5 mm Mùa hoa chủ yếu giữa tháng 6 và tháng 11 Các quả chín từ tháng 12 đến tháng 5 Cây gỗ to, cao tới hơn 40m Vỏ dày, có nhiều vết nứt nẻ Hạt màu nâu,

có lông mao ở 2 đầu, toàn cây có nhựa mủ Các lá đơn, bóng mặt như da, không cuống có dạng hình elíp, hình trứng, hình mác hay thẳng và có dạng nêm ở gốc lá (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cây hoa sữa

1.1.3 Công dụng của vỏ cây hoa sữa

Kháng khuẩn, điều trị sốt rét: Vỏ cây hoa sữa có chứa các alkaloid

(amin nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra) như chất ditamine, echitenine và echitamine Những chất này được sử dụng như một loại thuốc có tác dụng kháng khuẩn, điều trị sốt rét thay cho Quinine Dịch cồn chiết từ vỏ cây hoa sữa cho thấy

hoạt tính kháng khuẩn đối với Salmonella paratyphi - B và Aspergillus niger

Ngừa ung thư, điều trị viêm phế quản: Cây hoa sữa còn giúp bảo vệ

tế bào gan, chống lại sự phát triển của tế bào ung thư, giảm đau, chống loét đường tiêu hóa, chống oxy hóa (antioxidant), điều hòa miễn dịch, chống hen, điều trị viêm phế quản Bởi lẽ, chúng có tác dụng giãn phế quản, chống dị ứng, làm

dịu các tổn thương trên da và giảm các triệu chứng dị ứng trên da [18]

Kích thích ăn uống: Hoa sữa còn có tác dụng kích thích ăn uống và làm tăng

tiết sữa ở phụ nữ cho con bú

Nhuộm vải: Vỏ cây cũng được sử dụng để nhuộm quần áo từ len, sợi bông ra các gam màu vàng khác nhau

1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới về cây hoa

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Theo tra cứu tài liệu đã công bố, cho đến nay ở Việt Nam có 1 nhóm nghiên

cứu của Trần Văn Sung, Nguyễn Hồng Vân, Phạm Thúy Hà có công trình nghiên

cứu về lá và vỏ cây hoa sữa đã xác định cấu trúc của 3 loại alkaloid gồm

picrinin (1),vallesamin (2) và scholaricin (3) có cấu tạo như sau [3]

1 Picrinin 2 Vallesamin 3 Scholaricin

N C

H3 N

C

H3

O H

CH3COOH2C

COOCH3

Ngoài ra, Nguyễn Thị Thanh Huyền và cộng sự đã nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong vỏ cây hoa sữa tại Đà Nẵng Theo đó, tác giả xác định được thành phần hóa học của vỏ cây hoa sữa thông qua phổ GC - MS,

trong đó có 3 alkaloid gồm cetylpyridinium (4), ellipatamine (5), ditamine (6) và có

hoạt tính kháng sinh tốt [5]

4 Cetylpyridinium 5 Ellipatamine 6 Ditamine

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2004, theo báo cáo của The University of Queensland, Brisbane, QLD4072, Australia , từ dịch chiết vỏ thân cây hoa sữa đã phân lập 1 alkaloid indole

mới, akuammiginone (7) và 1 alkaloid indole glycosidic mới, echitamidine - N - oxide

19 - O - β - D - glucopyranoside (8), cùng với 5 alkaloid đã biết, axit echitaminic (9), echitamidine N - oxit (10), Nb - demethylalstogustin N - oxit (11), akuammicine N - oxit (12) và Nb - demethylalstogustin (13), các hợp chất này có hoạt

tính kháng sinh tốt [7]

7 Akuammiginone 8 Echitamidine - N - oxide19 - O - β - D - glucopyranoside

9 Axit echitaminic

12 Akuammicine N-oxit 13 Nb-demethylalstogustin

Năm 2006, theo nghiên cứu của Nilubon Jong-Anurakkun, Megh Raj Bhandari, Jun Kawabata, Nhật Bản, từ lá cây hoa sữa ở Thái Lan, nhóm nghiên cứu

đã phân lập được 3 hợp chất ức chế a - Glucosidase, gồm 1 glycoside flavonoid:

quercetin 3 - O - β - D - xylopyranosyl (1’’’→2’’) - β - D - galactopyranoside (14) và 2 glucoside linan: (-) - lyoniresinol 3a - O - β - D - glucopyranoside (15), (+) - lyoniresinol 3a - O - β – D - glucopyranoside (16) Các hợp chất này

có khả năng ức chế tăng đường huyết trong điều trị bệnh tiểu đường, nhất là với bệnh tiểu đường loại 2 [13]

14 Quercetin 3 - O - β - D - xylopyranosyl (1’’’→2’’) - β - D - galactopyranoside

15 (-) - lyoniresinol 3a - O - β - D - glucopyranoside

16 (+) - lyoniresinol 3a - O - β - D - glucopyranoside

Năm 2008, từ thân cây hoa sữa, P Steve Thomas, Anil Kanaujia, Dipankar Ghosh, Rajeev Duggar và Chandra Kant Katiya, Ấn Độ, đã tìm ra

1 secoiridoid mới, được đặt tên là alstonoside (17), cùng với 2 isoflavone

apioglucosides, formononetin 7 - O - β - D - apiofuranosyl - (1 → 6) - β - D -

glucopyranoside (18); biochanin A 7 - O - β - D - apiofuranosyl - (1 → 6) - β - D - glucopyranoside (19) [15]

5 - methoxylstrictamine (34), (Z) - 16 - formyl - 5α - methoxystrictamine (35),

19 - epi - ajmalicine (36), akuammidine (37), picralinal (38), 19(E) - vallesamine (2), 20 - epi - 19 - oxodihydroakuammicine (39), echitamidine (40),

19 - epi - scholaricine (41), nareline (42), N(4) - demethylechitamine (43),

3 - epi - dihydrocorymine - 17-acetate (44), echitamine (45) [17]

19 R = OH

Năm 2013, từ cao chiết chloroform của vỏ thân cây hoa sữa, nhóm nghiên cứu Ashutosh Sharma, Maheep K Chahar, Mahesh C Sharma, Pradeep Parashar và Mahabeer P Dobhal ở Jaipur, đã phân lập được 1 steroid mới,

3 - hydroxy adiantulanosterol (46), bên cạnh 4 hợp chất đã biết: lupeol acetate (47), lupeol (48), α - amyrin acetate (49), β - amyrin acetate (50) [8]

46 3-Hydroxy adiantulanosterol 47 Lupeol acetate

49 α-amyrin acetate 48 Lupeol 50 β-amyrin acetate

Năm 2017, từ cao chiết n - hexane của lá cây hoa sữa, nhóm nghiên cứu Chao - Min Wang, Kuei - Lin Yeh, Shang - Jie Tsai, Yun - Lian Jhan và Chang - Hung Chou đến từ Đài Loan, đã phân lập được 8 triterpenoid và 5 sterol

là axit ursolic (51), axit oleanolic (52), axit betulinic (53), betulin (54), 2β, 3β, 28 - lup - 20 (29), - ene - triol (55), lupeol (48), β - amyrin (56),

α - amyrin (57), poriferastero (58), epicampesterol (59), β-sitosterol (60),

6 - β - hydroxy - 4 - stigmasten - 3 - one (61), ergosta - 7,22 - diene - 3β, 5α, 6β -triol (62) [9], [11]

Axit ursolic, axit betulinic, betulin và 2β, 3β, 28 - lup - 20 (29) - ene - triol

có khả năng ức chế hoạt động tăng sinh của tế bào ung thư phổi NSCLC, có thể tạo thành một nhóm các tác nhân trị liệu có giá trị trong tương lai Ngoài ra, axit ursolic

có hoạt tính chống ung thư mạnh mẽ chống lại một số ung thư tuyến tiền liệt, vú,

tuyến tụy và bàng quang Trong các hợp chất sterol, hợp chất (58), (59), (61), (62)

có thể giúp giảm sự hấp thụ cholesterol ở người, hợp chất (60) cũng cho thấy

tác dụng ức chế tế bào NSCLC, giảm 20% khả năng tồn tại của tế bào

 Nhận xét

Khí hậu Việt Nam rất thuận lợi để loài cây này sinh sống và phát triển Nếu cây hoa sữa được nghiên cứu và khai thác có hiệu quả thì đây sẽ là nguồn thảo dược tiềm năng của nước ta không chỉ cho nền y học cổ truyền mà còn là nguồn dược liệu quí giá trong việc điều chế các loại dược phẩm điều trị bệnh ung thư

1.3 Ancaloit

1.3.1 Khái niệm

Theo Polonopski: "Ancaloit là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, đa số

có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật, thường có hoạt tính sinh học mạnh và cho phản ứng hóa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của ancaloit” [1]

1.3.2 Một số ancaloit trong vỏ cây hoa sữa

Echitenine (C20H27NO4) là một chất bột vô định hình màu nâu và có điểm

135oC

1.3.3 Tính chất chung của ancaloit

a Lý tính

- Trạng thái tự nhiên: Phần lớn ancaloit trong công thức cấu tạo có oxi thường

ở thể rắn ở nhiệt độ thường như morophin (C17H19NO3), codein (C18H21NO3)… Những ancaloit trong công thức cấu tạo không có oxi thường ở thể lỏng như coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2)

- Mùi vị: Đa số các ancaloit không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như capsaicin, piperin…

- Màu sắc: Hầu hết các ancaloit đều không màu trừ một vài ancaloit có màu

vàng như berberin, palmatin, chelidonin

- Độ tan: hầu hết ancaloit ở dạng bazơ thường không tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ như clorofom, ete, benzen và các ancol bậc 1 có số C nhỏ như CH3OH, C2H5OH Một số ancaloit do có thêm nhóm phân cực nên tan một phần trong nước hoặc kiềm

b Hóa tính

- Tính bazơ: Ancaloit là các bazơ yếu, do sự có mặt của Nitơ lai hóa sp3 Nhưng độ kiềm của ancaloit không giống nhau do ảnh hưởng lớp điện tích trên

nguyên tử N gây ra Nói chung tính bazơ giảm dần theo thứ tự amoni bậc 4, amin bậc 1, amin bậc 2, amin bậc 3 Với các ancaloit có tính bazơ yếu cần môi trường axit mạnh hơn để tạo thành muối trong dung dịch nước Vì vậy trong môi trường axit yếu một số ancaloit bazơ mạnh có thể chuyển thành muối Trong khi các bazơ yếu vẫn tồn tại trong dung dịch dưới dạng bazơ Đặc tính này được ứng dụng trong việc tách các nhóm ancaloit có trị số pKb khác nhau khỏi hỗn hợp của chúng

- Tác dụng với axit, các ancaloit tạo ra các muối tương ứng

- Ancaloit kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pb…) tạo ra muối phức

- Các ancaloit có phản ứng với một số thuốc thử chung

1.3.4 Chiết tách ancaloit

a Nguyên tắc lựa chọn dung môi

Ancaloit là các bazơ yếu, dùng dung môi có độ phân cực yếu, ancaloit là các bazơ trung bình, mạnh thì dùng dung môi có độ phân cực trung bình hay mạnh Đối với các ancaloit chưa biết thì bắt đầu thăm dò từ dung môi kém phân cực đến dung môi phân cực mạnh Để các vết ancaloit di chuyển cao hơn và tách phù hợp

có thể thêm vào dung môi một chất kiềm

Trong cây, ancaloit thường không tồn tại dạng tự do do nó có khả năng kết hợp với tanin (nhất là những cây có nhiều tanin) tạo thành muối Vì vậy, đối với dược liệu có nhiều tanin, cần tẩm bột dược liệu bằng kiềm một thời gian để chuyển ancaloit thành dạng bazơ tự do trước khi chiết Cần dùng dung môi có độ phân cực mạnh hơn hoặc chiết nóng để tách ancaloit ra khỏi tanin và hoà tan vào dung môi

b Chiết tách ancaloit

Phương pháp 1: Chiết bằng dung môi hữu cơ

Để chiết ancaloit bằng dung môi hữu cơ, trước hết bột dược liệu phải được tẩm dung dịch bazơ để chuyển ancaloit muối trong dược liệu thành dạng bazơ Bazơ thường dùng là dung dịch NH3, Ca(OH)2, Na2CO3, NaOH Dung môi có thể dùng là clorofom, ete, benzen, etyl clorua Các bước tiến hành:

1 Bột dược liệu tẩm dung dịch amoniac đặc (hoặc dung dịch Na2CO3, NaOH, vôi) để yên 1 ÷ 2 giờ;

2 Cho bột dược liệu đã tẩm kiềm vào bình soxhlet Cho CHCl3 vào ngập bột dược liệu, ngâm 1÷ 2 giờ;

3 Tiến hành chiết nóng, với lượng dược liệu bé thường thì từ 3 ÷ 6 giờ là đủ Nếu chiết trên 1 kg thì chiết bằng đun hồi lưu từ 6 ÷ 10 giờ và chiết lại lần 2 từ

2 ÷ 4 giờ để lấy kiệt ancaloit;

4 Dịch chiết clorofom, cất thu hồi dung môi còn độ 1/2 hay 1/3 thể tích Sau đó lắc với dung dịch axit hữu cơ hoặc vô cơ 1 ÷ 2% Các axit có thể dùng là axit tactric, axit axetic, axit sunfuric, axit clohidric Như đã nói ở trên, cần xem xét

pKb của các ancaloit định chiết để cho đủ lượng axit cần thiết để chuyển ancaloit bazơ trong dịch chiết CHCl3 thành muối tan trong nước Nếu không đủ axit ancaloit

7 Dịch chiết CHCl3 tách riêng, làm khan bằng Na2SO4 khan (thường dùng

1 ÷ 2 g cho 60 ml CHCl3 hoặc cho 50 ml ete vào lắc trong 15 phút) Loại nước bằng natri sunfat khan, bốc hơi dung môi đến cạn Hoà cặn trong clorofom hoặc metanol

để chấm sắc ký Nếu có điều kiện để dung dịch CHCl3 này vào bình hút ẩm qua đêm, sau đó lọc và cất thu hồi dung môi, được ancaloit

Phương pháp 2: Chiết bằng dung dịch axit hay axit loãng trong ancol

Khác với phương pháp trên, phương pháp này sử dụng dung dịch axit vô cơ hay hữu cơ kết hợp với rượu để chiết ancaloit dưới dạng muối hoà tan Axit thường dùng là axit axetic, axit tactric, axit clohidric, axit sunfuric, axit photphoric Tùy thuộc vào từng loại ancaloit cần chiết mà lựa chọn axit cho thích hợp

 Chiết bằng axit: Đầu tiên, thu dịch chiết đem đi trung hòa với axit rồi

cô cạn Tiếp theo, hòa tan cặn lại trong axit rồi loại tạp Sau đó, dịch chiết ta đem đi kiềm hoá rồi chiết lại bằng dung môi hữu cơ Cuối cùng, làm bốc hơi dung môi rồi hòa cặn trong clorofom để chấm sắc ký Cách chiết này loại được nhiều tạp và nếu

dùng natri hydrocarbonat để kiềm hoá có thể chiết được ancaloit có chứa phenol

 Chiết bằng dung dịch axit loãng trong ancol: Thu dịch chiết dược liệu

trong dung môi ancol - axit Rồi cho bốc hơi dung môi Sau đó, lắc dịch chiết đậm đặc với dung môi hữu cơ (ete, clorofom) để loại tạp Tiếp theo, kiềm hoá dung dịch

nước axit rồi chiết bằng dung môi hữu cơ Cuối cùng, làm bốc hơi dung môi để thu được cặn ancaloit thô

Với cách chiết này, ancaloit không bị mất nhưng dịch chiết lẫn nhiều tạp Phương pháp chiết tốt nhất đối với dung môi ancol - axit là ngâm kiệt và áp dụng kĩ thuật chiết ngược dòng (dịch chiết đầu để riêng, phần dịch chiết sau làm dung môi cho mẻ mới) Vì trong môi trường axit, ở nhiệt độ cao, ancaloit dễ bị phân hủy nên dịch chiết cần trung hoà đến pH (7 ÷ 8) trước khi cất thu hồi ancol Dung dịch thu được để yên 1 ÷ 3 ngày rồi loại tạp

Trong sản xuất hiện nay chưa có đủ dung môi hữu cơ để chiết ancaloit bazơ nên phương pháp thích hợp nhất là kết tủa dung dịch chiết bằng kiềm Lọc lấy tủa, hoà tan ancaloit bazơ vào dung dịch axit, kết tủa lại bằng kiềm Lặp đi lặp lại nhiều lần đồng thời chiết lấy ancaloit Để kết tủa được tốt hơn và dễ lắng nên thực hiện

ở nhiệt độ 60 ÷ 70oC Kết tủa xong không lọc ngay mà nên để 1 ÷ 2 ngày Ancaloit

sẽ tiếp tục kết tủa trong thời gian này Khi lọc lấy tủa, dùng dung dịch amoniac hoặc kiềm loãng rửa tủa và cuối cùng rửa lại bằng nước

c Thuốc thử phát hiện ancaloit

- Các thuốc thử thông thường tạo kết tủa với ancaloit :

+ Thuốc thử Dragendorff tạo kết tủa vàng da cam đến đỏ với ancaloit;

+ Thuốc thử Mayer tạo kết tủa màu trắng hoặc vàng cam với ancaloit;

+ Thuốc thử Wagner (Bouchardat) tạo kết tủa vàng nâu với ancaloit

- Các thuốc thử thông thường tạo màu với ancaloit :

+ Dung dịch H2SO4 đậm đặc (D = 1,84 g/ml);

+ Dung dịch HNO3 đậm đặc (D = 1,4 g/ml)

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị thí nghiệm

2.1.1 Nguyên liệu

Vỏ cây hoa sữa (cây mù cua, mò cua) được thu hái tháng 11/2017 tại Đà Nẵng (Trường Đại học Sư phạm), rửa sạch, phơi, sấy khô ở nhiệt độ 50 - 600C rồi xay thành bột mịn (Hình 2.1) để chiết với dung môi n - hexane

a Vỏ cây sau khi phơi khô b Vỏ cây sau khi xay

Hình 2.1 Vỏ cây hoa sữa

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Một số hóa chất sử dụng để thực hiện đề tài được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Hóa chất sử dụng trong đề tài

Acetone

CH 3 COCH 3

Chloroform CHCl 3

Trong đề tài tôi sử dụng bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck 60F254, có độ dày 0.2 mm Silicagel cỡ hạt 197 - 400 mesh (0.040 - 0.063 mm) Bộ chiết soxhlet, thiết bị

cô quay chân không, tủ sấy, lò nung, cân phân tích (phòng thí nghiệm khoa Hoá, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng), máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS100 Perkin Elmer (Trung tâm Khí tượng Thủy văn Quốc gia, đài Khí tượng Thủy văn khu vực Trung Trung Bộ, 660 Trưng Nữ Vương - Đà Nẵng) Máy đo sắc kí khí kết hợp khối phổ GC - MS (Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, Mỹ phẩm, Dược phẩm thành phố Huế - 17 Trương Định Thành phố Huế) Cột sắc kí là cột thủy tinh (có lớp lọc thủy tinh frit) cao khoảng 45 cm, đường kính

trong 3cm, 4cm Đèn tử ngoại bước sóng λ= 254 nm và 365 nm dùng để soi bản mỏng, máy đo điểm nóng chảy Buchi melting Point B - 545 tại khoa Hóa trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Một số thiết bị xác định cấu trúc chất: + Phổ khối ESI - MS được đo trên máy Agilent LC - MSD - Trap SL tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam;

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance

500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam;

+ Phổ hồng ngoại FT - IR được đo dưới dạng viên nén KBr bằng máy Shimadzu tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lí

a Xác định độ ẩm

Để xác định độ ẩm tiến hành sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ trong khoảng

950-1100C Tiến hành thí nghiệm với 5 mẫu vỏ cây khô và lấy kết quả trung bình

* Độ ẩm của mỗi mẫu

W(%) = ( ) 100%

2

3 2

1  

m

m m m

1



(2.2)

Trong đó:

m1: Khối lượng chén sứ (g)

m2: Khối lượng vỏ cây hoa sữa (g)

m3: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g)

W (%): Độ ẩm của mỗi mẫu

Wtb (%): Độ ẩm trung bình

b Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp tro hóa mẫu bằng phương pháp khô - ướt kết hợp Mẫu được xử lý sơ bộ, có thể phân huỷ chất hữu cơ bằng

H2SO4 đặc, hỗn hợp H2SO4 với HNO3, HClO4…hoặc thêm H2O2, KMnO4 để làm tăng nhanh quá trình phân huỷ Sau đó được nung ở 500 - 550oC trong chén platin, chén sứ hay thạch anh, các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ

khó bay hơi Các mẫu (khối lượng m3) đã xác định độ ẩm ở trên Tiếp tục được

sử dụng để tro hóa Các mẫu được đốt trên bếp điện, than hóa sơ bộ Sau đó cho vào

lò nung và tiến hành tro hoá mẫu ở nhiệt độ 500 - 550oC, trong thời gian từ

4 - 6 tiếng, cho đến khi thu được tro trắng Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng không đổi, có khối lượng m4

tro



( 2.4)

Trong đó:

m1: Khối lượng chén sứ (g)

m2: Khối lượng lá yên bạch ban đầu (g)

m4: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)

c Xác định hàm lượng một số kim loại trong vỏ cây hoa sữa bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

Tro thu được sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng, định mức bằng nước cất và xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử [1]

Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử là một kỹ thuật phân tích tương đối mới

đã và đang được phát triển mạnh mẽ và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và kỹ thuật ở các nước phát triển Dùng để phân tích những lượng nhỏ các kim loại và một số á kim trong rất nhiều đối tượng mẫu: quặng, đất, nước khoáng, các mẫu sinh học, y học, các sản phẩm nông nghiệp, thực phẩm, nước uống, phân bón, vật liệu Với trang bị và kỹ thuật hiện nay người ta có thể định lượng được hầu hết các kim loại và một số á kim đến giới hạn nồng độ cỡ ppb (nanogam) với sai số không lớn hơn 15%

Cơ sở lý thuyết của phép đo là sự hấp thụ năng lượng ánh sáng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấy trong môi trường hấp thụ theo định luật hấp thụ ánh sáng Lambert - Beer Mẫu được nguyên tử hóa bằng phương pháp ngọn lửa, với hỗn hợp khí đốt là

C2H2 - không khí Định lượng bằng phương pháp lập đường chuẩn

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp chiết rắn - lỏng với các kĩ thuật chiết soxhlet và ngâm dầm

 Kĩ thuật chiết soxhlet:

Cân 5g bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình cầu, cho vào 200 mL dung môi

n - hexane, rồi tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ sôi của dung môi với những thời gian khác nhau: 4h, 6h, 8h, 10h, 12h Rót 5 mẫu dịch chiết trên vào các cốc

đã được cân khối lượng (m1, gam) Sau đó, ta để bay hơi tự nhiên đến thể tích

40 mL và tiến hành cân các cốc chứa dịch chiết (m2, gam) [6]

m6 = m5 - mc

Với m6 (gam) là khối lượng của dịch chiết Dùng phương pháp trọng lượng khảo sát độ tăng khối lượng (∆m) của dịch chiết sau mỗi 2h chiết để chọn được thời gian tối ưu chiết được nhiều chất nhất với mỗi dung môi chiết

 Kĩ thuật chiết ngâm dầm:

Ngâm bột cây trong một bình bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình

có nắp đậy Rót dung môi vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột cây, giữ yên

ở nhiệt độ phòng trong một ngày hoặc một đêm để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó dung dịch chiết được lọc qua giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có cao chiết Tiếp theo, ta rót dung môi vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết đến khi chiết kiệt mẫu cây [6]

2.2.3 Phương pháp định tính một số lớp chất trong vỏ cây hoa sữa

a Alkaloid

Áp dụng nguyên tắc thử của Webb, cách thử gồm hai phần như sau:

- Phần 1: Bột vỏ cây xay nhuyễn (5g) được ngâm trong dung dịch Prollius là hỗn hợp gồm chloroform:ethanol 95o:NH4OH đậm đặc theo tỉ lệ thể tích là 8:8:1, môi trường phải có tính base Ngâm nguội trong 24 giờ, để ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan phần cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan Lọc, lấy dịch lọc để thử nghiệm với hai loại thuốc thử Mayer, Wagner

- Phần 2: Bột vỏ cây xay nhuyễn (5g) và dung dịch nước H2SO4 1% được cho vào bình tam giác và đun nhẹ, trong 1 giờ Lọc, lấy dịch lọc để thử nghiệm với hai loại thuốc thử Mayer, Wagner

- Pha thuốc thử và hiện tượng:

+ Thuốc thử Mayer: hòa tan 1.36 gam HgCl2 trong 60 mL nước cất và hòa tan 5 gam KI trong 10 mL nước cất Thuốc thử Mayer gồm hỗn hợp hai dung dịch trên thêm nước cất cho đủ 100 mL Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào mẫu dịch lọc ở trên, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt

+ Thuốc thử Wagner: hòa tan 1.27 gam iod I2 và 2 gam KI trong 20 mL nước cất Thêm nước cho đủ 100 mL Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào mẫu dịch lọc ở trên, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu

b Flavonoid

Cân 5 gam bột cho vào bình tam giác 100 mL có nắp đậy, thêm 50 mL cồn 90˚, đậy kín Đun cách thủy trong 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc Cho 1mL dịch chiết vào ống nghiệm rồi đem đi thử với các phản ứng sau: dung dịch NaOH 10%; dung dịch H2SO4 đặc và dung dịch FeCl3 5%

- Tác dụng với dung dịch H2SO4 đặc: Thêm vài giọt dung dịch H2SO4 đặc vào ống nghiệm chứa dịch lọc Nếu là flavon, flavonol cho màu vàng đậm đến màu cam và có phát huỳnh quang đặc biệt; nếu là chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương - đỏ; nếu là flavonon cho màu từ cam đến đỏ

- Tác dụng với dung dịch NaOH 1%: Thêm vài giọt dung dich NaOH 1% vào ống nghiệm chứa dịch lọc sẽ có màu từ vàng đến cam - đỏ Nếu là flavon, isoflavon, chalcon, isoflavanon, flavanon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng Flavonol cho màu từ vàng đến cam Auron cho màu tím đến đỏ tím

- Tác dụng với dung dịch FeCl3 5%: Hợp chất flavonoid có màu khác nhau

từ xanh lục đến xanh đen

c Coumarin

Cân 5 gam bột cho vào bình nón 100mL có nắp đậy, thêm 50 mL cồn 90˚, đậy kín Đun cách thủy trong 5 phút, lọc nóng qua bông, giữ lấy phần dịch Dịch lọc thu được đem thử nghiệm với phản ứng mở đóng vòng lacton

- Cho vào 2 ống nghiệm bằng nhau mỗi ống 1mL dịch chiết: Ống thứ 1 ta thêm 0.5 mL dung dịch NaOH 10% Ống thứ 2 ta để nguyên;

- Đun cả 2 ống nghiệm cho đến sôi, để nguội quan sát hiện tượng Nếu ống 1 trong hơn ống 2 nhưng sau đó axit hóa bằng dung dịch H2SO4 loãng mà ống 1 đục hơn ống 2 thì có coumarin

d Saponin

Cân 0.1 gam bột cho vào trong ống nghiệm lớn, thêm 5 mL ethanol Sau đó, đem đun cách thủy 5 phút rồi lọc lấy dịch để thử nghiệm

- Cho vào 2 ống nghiệm bằng nhau mỗi ống 1 mL dịch chiết: Ống 1 thêm 5

mL HCl 0.1N và 3 giọt dịch chứa mẫu thử Ống thứ 2 thêm 5 mL NaOH 0.1N và 3 giọt dịch chứa mẫu thử;

- Lắc mạnh cả 2 ống nghiệm rồi để yên, quan sát các cột bột bong bóng ở cả 2 ống nghiệm Nếu cột bột trong cả 2 ống nghiệm cao bằng nhau và bột có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid Nếu ống 2 có cột bột cao hơn nhiều so với ống 1 thì có saponin steroid

e Đường khử

Cao chiết được chấm trên một tấm sắc ký lớp mỏng, giải ly Phun xịt dung dịch AgNO3 0.1N (1mL) và dung dịch NH4OH 5N (5mL) lên bản mỏng rồi sấy khô Nếu bản mỏng xuất hiện vết đen xậm thì chứng tỏ có đường khử

g Steroid

Hoà tan 2 mg cao chiết trong 2mL cloroform và 1mL H2SO4 đậm đặc Nếu

có Steroid thì dung dịch đổi thành màu đỏ đậm, xanh, xanh - tím

h Axit hữu cơ

Cân khoảng 3 gam bột vỏ cho vào ống nghiệm to, thêm 10 mL nước cất rồi đem đun sôi trực tiếp 10 phút Để nguội rồi lọc qua giấy lọc, giữ lấy phần dịch Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 mL dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 Quan sát hiện tượng, nếu có bọt khí thoát ra thì có axit hữu cơ

i Chất béo

Cân 3 gam bột vỏ cho vào bình tam giác 100 mL có nút đậy, thêm 10 mL ether dầu hỏa, đậy nắp, ngâm trong 1 giờ rồi lọc Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy lọc và sấy khô Quan sát hiện tượng nếu có vết mờ trên giấy thì có chất béo

k Carotene

Ngâm 2 gam bột vỏ cây hoa sữa trong 10 mL dung môi n - hexane trong

15 phút, lọc lấy dịch lọc và cho 2 mL dịch lọc vào ống nghiệm, đun cách thủy

thu lấy cặn Sau đó nhỏ vài giọt H2SO4 đặc lắc nhẹ Quan sát thấy xuất hiện

màu xanh lá thì có carotene

l Polysaccairid

Cân 3 gam bột vỏ cho vào bình tam giác 100 mL, thêm 20 mL nước cất, đun sôi trong vài phút Lọc qua giấy lọc vào một cốc thủy tinh 100 mL, thu lấy phần dịch lọc và đem đi định tính bằng cách chia dịch chiết vào 3 ống nghiệm: Ống thứ 1 thêm 2 mL dịch chiết và 5 giọt thuốc thử Lugol Ống thứ 2 thêm 2 mL nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol Ống thứ 3 thêm 2 mL dịch chiết Nếu ống 1 đậm hơn ống 2 và 3 thì có polysaccarid

Thuốc thử Lugol: hòa tan 0.5g KI với 1g I2 trong 5 mL nước cất, lắc cho tan hết rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 100 mL và thêm nước cất đến vạch

m Iridoid

Thuốc thử Trim - Hill: trộn 10mL CH3COOH với 1mL dung dịch CuSO4

0.2% và 0.5mL HCl đặc

Cân 3 gam bột vỏ ngâm trong 30 mL dung dịch HCl 1% trong 5 giờ Lọc lấy

1 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Trim - Hill Khi đun nhẹ mà xuất hiện màu xanh dương thì có Iridoid

n Polyphenol

Cân 1 gam bột cho vào bình tam giác 50 mL, thêm 20 mL nước cất Đun sôi trong 2 phút, để nguội rồi đem lọc Sau đó, lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm Nếu thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% mà dung dịch chuyển sang màu xanh thẫm thì

có polyphenol Nếu thêm vài giọt dung dịch chì axetat 10% mà xuất hiện kết tủa bông vàng thì có polyphenol

2.2.4 Phương pháp phân tích vật lí

a Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV - VIS

Một số ancaloit có màu nên hiệu quả của quá trình chiết được thể hiện ở

độ hấp thụ quang D Độ hấp thụ quang càng lớn thì lượng chất được chiết ra càng nhiều Vì vậy sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV - VIS) để đo độ hấp thụ quang của dịch chiết

Quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến là phương pháp phân tích dựa trên việc do độ hấp thụ bức xạ đơn sắc của dung dịch nghiên cứu ở bước sóng xác định trong vùng tử ngoại - khả kiến Phương pháp này được dùng chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất, tốn ít thời gian so với phương pháp khác, đồng thời có thể