NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CLOROFORM, ETHYL ACETATE VÀ METHANOL CỦA VỎ CÂY HOA SỮA TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

HỒ THỊ BÍCH NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CLOROFORM, ETHYL ACETATE VÀ METHANOL CỦA VỎ CÂY HOA SỮA TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG KHÓA LUÂN TỐT

HỒ THỊ BÍCH

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CLOROFORM, ETHYL ACETATE VÀ METHANOL CỦA VỎ CÂY HOA

SỮA TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

KHÓA LUÂN TỐT NGHIỆP

HÓA HỌC

Đà Nẵng - Năm 2019

HỒ THỊ BÍCH

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CLOROFORM, ETHYL ACETATE VÀ METHANOL CỦA VỎ CÂY HOA

SỮA TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Mục lục

MỞ ĐẦU 1

1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

3 MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 2

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2

5 BỐ CỤC KHÓA LUẬN BAO GỒM 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HỌ APOCYNACEAE VÀ CÂY HOA SỮA 4

1.1.1 Họ Apocynaceae 4

1.1.2 Cây hoa sữa 4

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÂY HOA SỮA (ALSTONIA SCHOLARIS ) 7

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở việt nam 8

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 15

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lí 16

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật 18

2.2.3 Khảo sát các điều kiện chiết……… 19

2.2.4 Phương pháp định tính một số lớp chất trong vỏ cây hoa sữa 19

2.2.5 Phương pháp khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của các cao chiết 23

2.3 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 31

2.3.1 Sơ đồ khảo sát sơ bộ một số yếu tố 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ SỐ VẬT LÝ 32

3.1.1 Độ ẩm 32

3.3 XÁC ĐỊNH CÁC LỚP CHẤT TRONG VỎ CÂY HOA SỮA 35

3.4 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS 37

3.4.1 Định danh một số cấu tử trong dịch chiết chloroform 37

3.4.2 Định danh một số cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate 38

3.4.3 Định danh một số cấu tử trong dịch chiết methanol 40

3.4.4 Tổng hợp thành phần hóa học được định danh trong các dịch chiết 43

3.5 HÀM LƯỢNG CÁC CAO CHIẾT SO VỚI MẪU KHÔ 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

bảng

3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm của mẫu bột nguyên liệu khô 32 3.2 Kết quả khảo sát hàm lượng tro trong mẫu bột thí nghiệm 33 3.3 Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại nặng trong mẫu bột

thí nghiệm

33

3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết với các dung môi chiết 34 3.5 Kết quả định tính các lớp chất thiên nhiên trong vỏ cây hoa sữa 35 3.6 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform 37 3.7 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate 39 3.8 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết methanol 41 3.9 Tổng hợp thành phần hóa học được định danh trong các dịch

chiết

43

3.10 Hàm lượng % các cao chiết so với mẫu khô 48

hình Tên hình Trang

3.1 Sắc ký đồ GC-MS GC-MS dịch chiết chloroform của vỏ cây

hoa sữa

37

3.2 Sắc ký đồ GC-MS dịch chiết ethyl acetate của vỏ cây hoa sữa 39 3.3 Sắc ký đồ dịch chiết methanol của vỏ cây hoa sữa 41

MỞ ĐẦU

1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Việt Nam ta là một nước nhiệt đới, nóng, ẩm và mưa nhiều, có nguồn dược liệu rất phong phú, đa dạng và một nền y học dân tộc phát triển lâu đời Từ xa xưa, ông cha ta đã biết cách sử dụng nhiều loại thảo dược trong việc dưỡng thương, trị bệnh

và bồi bổ cơ thể Như vậy, những cây thuốc dân gian đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hằng ngày của con người

Ngày nay, khi biệt dược của nền y học hiện đại được sử dụng rộng rãi, nhiều loài cây cỏ trong tự nhiên vẫn được sử dụng trong dân gian để chữa bệnh rất có hiệu quả Nhiều loại bệnh tật đã được chữa khỏi nhờ thảo dược, trong đó rất nhiều thực vật được dùng để chế biến thành thực phẩm chức năng quý giá Trong thời gian qua, những hợp chất tự nhiên được phân lập từ thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và

mỹ phẩm v.v Việc nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần

và cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí của cây thuốc Trên cơ sở các nghiên cứu đó có thể tạo ra chất mới có hoạt tính sinh học cao như mong muốn

để làm thuốc chữa bệnh, đặc biệt là các bệnh nan y [3], [4], [10]

Cây hoa sữa là một cây thường xanh có thể đạt chiều cao lên đến 40 m Vỏ cây được sử dụng chủ yếu trong y học Nó được coi là một loại thuốc bổ, hạ sốt, chữa sốt rét, bệnh phong, bệnh ngoài da, ngứa, khối u, ung loét mãn tính, hen suyễn, viêm phế quản, suy nhược cơ thể, tiêu chảy, kiết lỵ và khó tiêu Lá cây sắc lên được sử dụng chống lại bệnh tê phù Hạt có tác dụng kích thích tình dục và tinh thần [15], [16]

Cho đến nay ở nước ta chưa có nhiều nghiên cứu mang tính cơ bản về thành phần, tính chất, khả năng ứng dụng của các hợp chất có trong vỏ cây hoa sữa Với

những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “nghiên cứu chiết tách, định danh

thành phần hóa học có trong dịch chiết cloroform, ethyl acetate và methanol của

vỏ cây hoa sữa trên địa bàn thành phố Đà Nẵng” nhằm góp phần nâng cao giá trị

khoa học và giá trị sử dụng của vỏ cây hoa sữa trong y học

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

- Vỏ cây hoa sữa, được lựa chọn một cách ngẫu nhiên trên đại bàn thành phố

Đà Nẵng

2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu trên nguồn nguyên liệu tại thành phố Đà Nẵng

- Nghiên cứu chiết tách vỏ cây hoa sữa trên địa bàn thành phố Đà Nẵng bằng dịch chiết cloroform, ethyl acetate và methanol

- Định danh thành phần hóa học có trong dịch chiết cloroform, ethyl acetate và

methanol của vỏ cây hoa sữa trên địa bàn thành phố Đà Nẵng

3 MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

3.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng qui trình chiết tách các hợp chất từ vỏ cây hoa sữa

- Định danh thành phần hóa học có trong dịch chiết cloroform, ethyl acetate và methanol của vỏ cây hoa sữa trên địa bàn thành phố Đà Nẵng

3.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu, xác định cấu trúc của một số hợp chất hóa học của vỏ cây hoa sữa

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để thực hiện đề tài này, tôi sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:

4.1 Nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có liên quan đến đề tài

- Trao đổi với giáo viên hướng dẫn và các bạn sinh viên

4.2 Phương pháp thực nghiệm

- Phương pháp chọn, thu hái và xử lí mẫu

- Phương pháp xác định các chỉ số hóa lý

- Phương pháp chiết

5 BỐ CỤC KHÓA LUẬN BAO GỒM

Khóa luận bao gồm 52 trang, 10 bảng, 9 hình ảnh, 22 tài liệu tham khảo Với: Phần mở đầu (3 trang)

Chương 1 – Tổng quan (11 Trang)

Chương 2 – Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (17 Trang)

Chương 3 – Kết quả và thảo luận (17 Trang)

Kết luận và kiến nghị (2 Trang)

Tài liệu tham khảo (2 Trang)

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HỌ APOCYNACEAE VÀ CÂY HOA SỮA

1.1.1 Họ Apocynaceae

Họ La bố ma (danh pháp khoa học: Apocynaceae) còn được gọi là họ Dừa

cạn (theo chi Vinca/Catharanthus), họ Trúc đào (theo chi Nerium), họ Thiên lý (theo chi Telosma) với các danh pháp khoa học đồng nghĩa khác như Asclepiadaceae,

Periplocaceae, Plumeriaceae, Stapeliaceae, Vincaceae, Willughbeiaceae Tuy nhiên, trong văn bản thường lấy theo tên gọi của chi điển hình là chi Apocynum (la bố ma) nên gọi là họ La bố ma Nhiều loài là các loại cây thân gỗ cao trong các rừng mưa nhiệt đới và chủ yếu là sinh trưởng trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới ẩm ướt, nhưng có một số loài sinh trưởng trong các môi trường khô hạn của vùng nhiệt đới, cũng tồn tại một số loài cây lâu năm thân thảo ở khu vực ôn đới Hiện nay người

ta công nhận trong họ này 4.555 loài và được chia ra thành khoảng 415-424 chi [15] Trong đó, chi Hoa sữa (danh pháp khoa học: Alstonia) là một chi phổ biến rộng bao gồm các cây gỗ và cây bụi thường xanh Nó được Robert Brown đặt tên khoa học năm 1811, lấy theo họ của Charles Alston (1685-1760), giáo sư về thực vật học tại Edinburgh trong khoảng các năm 1716-1760 Chi Alstonia bao gồm khoảng 40-

60 loài (theo các nguồn khác nhau), có nguồn gốc ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Phi, Trung Mỹ, Đông Nam Á, Polynesia, New South Wales, Queensland và miền bắc Úc, với phần lớn các loài thuộc khu vực Malesia [31] Loài điển hình của chi

này là Alstonia scholaris (L.) R.Br., nguyên thủy có danh pháp Echites scholaris do Linnaeus đặt năm 1767

1.1.2 Cây hoa sữa

a Đặc điểm sinh thái

Tên gọi

Tên thường gọi - cây mò cua, mù cua, tinpet, popeal-khê…

Tên khoa học - Alstonia scholaris L R Br ( hay còn gọi - Echites scholaris L

Mant., Pala scholaris L Roberty)

Phân loại khoa học

hạ Cây hoa sữa có nguồn gốc từ các khu vực sau:

Trung Quốc: Quảng Tây (tây nam), Vân Nam (nam)

Tiểu lục địa Ấn Độ: Ấn Độ; Nepal; Sri Lanka

Đông Nam Á: Campuchia; Myanma; Thái Lan; Việt Nam, Indonesia;

Malaysia; Papua New Guinea; Philippines

và tháng 11 Quả đại mọc theo cặp, hơi lượn sóng hoặc cong, dài từ 30 tới 60 cm,

rộng từ 2 đến 5 mm và chứa nhiều hạt hình chữ nhật Hạt có lông ngắn và nhỏ, đầu cuối có túm lông dài 1.5-2 cm Các quả chín từ tháng 12 đến tháng 5 Cây gỗ to, cao tới hơn 40 m Vỏ dày, có nhiều vết nứt nẻ Lá mọc vòng, 3 - 8 cái, thường tập trung

ở đầu cành Phiến lá dày hình thuôn dài, đầu tròn, nhiều gân phụ song song Cụm hoa hình xim tán, gồm nhiều hoa nhỏ màu trắng lục, có mùi thơm hắc Các lá đơn, bóng mặt như da, không cuống có dạng hình elíp, hình trứng, hình mác hay thẳng và có dạng nêm ở gốc lá Phiến lá thuộc loại lưng-bụng, kích thước trung bình tới lớn và được sắp xếp theo kiểu đối nhau hoặc mọc thành vòng, các mép lá nhẵn [14] Gân lá hình lông chim với nhiều gân kết thúc tại gân mép lá (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cây hoa sữa

c Công dụng của cây hoa sữa

Tại Việt Nam, hoa sữa đi vào trong thơ ca, nó như là nét đặc trưng của Hà Nội Không chỉ mang vẻ đẹp lãng mạn và mùi hương quyến rũ, hoa sữa còn là một trong những loại thảo dược giúp con người vượt qua nhiều bệnh tật

Một số công dụng sức khỏe từ cây hoa sữa :

Kháng khuẩn, điều trị sốt rét: Vỏ cây hoa sữa có chứa các alkaloid (amin nguồn

gốc tự nhiên do thực vật tạo ra) như chất ditamine, echitenine và echitamine Những chất này được sử dụng như một loại thuốc có tác dụng kháng khuẩn, điều trị sốt rét

thay cho Quinine Dịch cồn chiết từ vỏ cây hoa sữa cho thấy hoạt tính kháng khuẩn

đối với Salmonella paratyphi-B và Aspergillus niger [15],

Trị tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa: Nước sắc vỏ cây có tác dụng điều trị tiêu chảy,

rối loạn tiêu hóa, hạ sốt, điều hòa kinh nguyệt Nước sắc lá cây được dùng để trị bệnh

beribri (bệnh viêm đa dây thần kinh do thiếu Vitamin B1),

Ngừa ung thư, điều trị viêm phế quản: Cây hoa sữa còn giúp bảo vệ tế bào gan,

chống lại sự phát triển của tế bào ung thư, giảm đau, chống loét đường tiêu hóa, chống oxy hóa (antioxidant), điều hòa miễn dịch, chống hen, điều trị viêm phế quản Bởi lẽ, chúng có tác dụng giãn phế quản, chống dị ứng, làm dịu các tổn thương trên da và

giảm các triệu chứng dị ứng trên da,

Kích thích ăn uống: Hoa sữa còn có tác dụng kích thích ăn uống và làm tăng

tiết sữa ở phụ nữ cho con bú,

Nhuộm vải: Vỏ cây cũng được sử dụng để nhuộm quần áo từ len, sợi bông ra các gam màu vàng khác nhau

Một số Bài thuốc dân gian

Thường vỏ cây hoa sữa được dùng làm thuốc bổ, chữa sốt, điều kinh, chữa lỵ với các cách sau:

1 Bột vỏ cây sữa phơi khô hoặc sấy khô rồi tán nhỏ, ngày uống 0.2-0.3 g

2 Rượu vỏ cây hoa sữa: Vỏ cây sữa tán nhỏ 75 g, rượu uống (35-400) 500 ml, đậy kĩ, ngâm trong 7 ngày, thỉnh thoảng lắc đều Sau đó lọc và thêm rượu vào cho đủ

500 ml Ngày uống 4-8 g rượu này Uống 15 phút trước 2 bữa ăn chính

3 Cao lỏng vỏ cây sữa: Chế bằng cồn 600 theo phương pháp chế cao lỏng hoặc

có thể ngâm bột vỏ sữa với cồn 600 trong 7 ngày Thỉnh thoảng lắc, lọc và thêm cồn

600 cho bằng trọng lượng của vỏ Ví dụ ngâm 1 kg vỏ thì sẽ được 1 lít cao lỏng Cao lỏng này dùng với liều 0.5-1.5 g mỗi ngày Nhiều nhất chỉ uống 2 g/lần và 6 g trong

chất hoạt tính sinh học khác nhau như echitamidine, loganin, lupeol, boonein, axit ursolic, Nα-formylechitamidine và β-amyrin trong đó các alkaloid và triterpenoid tạo thành một phần chính Trong đó thì thành phần hóa học của vỏ cây hoa sữa giàu các chất alkaloid, hàm lượng khoảng 0.16 – 0.27% Các chất alkaloid chính là echitenine, ditamine, echitamine, echitamidine, ellipatamine và một số ít các alkaloid khác như alstonidine, alstonine, alstovenine, echicaoutchin, echicerin, macrocarpamine, echiretinO-methylmacralstonine, macralstonine, villalstonine

O-acetylmacralstonine, corialstonine và corialstonidine Ngoài ra còn có một số chất

khác như steroid, triterpenoid: lupeol linoleate, lupeol palmitate, alpha-amyrin linoleate, beta-amyrin, một ít flavonoid và các axit phenolic, các axit béo khác [5], [10], [13]

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Theo tra cứu tài liệu đã công bố, cho đến nay ở Việt Nam có một nhóm nghiên

cứu của Trần Văn Sung, Nguyễn Hồng Vân, Phạm Thúy Hà có công trình nghiên cứu

về lá và vỏ cành cây hoa sữa đã xác định cấu trúc của 3 loại alkaloid: picrinin (1), vallesamin (2) và scholaricin (3) có cấu tạo như sau [3]:

1 Picrinin 2 Vallesamin 3 Scholaricin

Ngoài ra, Nguyễn Thị Thanh Huyền và cộng sự đã nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong vỏ cây hoa sữa tại Đà Nẵng Theo đó, tác giả xác định được thành phần hóa học của vỏ cây hoa sữa thông qua phổ GC-MS, trong đó

có 3 alkaloid gồm cetylpyridinium (4), ellipatamine (5), ditamine (6) và có hoạt tính

kháng sinh tốt [5]

N C

C

H3

O H

hoa sữa ( Alstonia scholaris) đã phân lập một alkaloid indole mới, akuammiginone (7)

và một alkaloid indole glycosidic mới, echitamidine-N-oxide

19-O-β-D-glucopyranoside (8), cùng với năm alkaloid đã biết, axit echitaminic (9), echitamidine N-oxit (10), Nb-demethylalstogustin N-oxit (11), akuammicine N-oxit (12) và Nb- demethylalstogustin (13), các hợp chất này có hoạt tính kháng sinh tốt [6]

7 Akuammiginone 8.Echitamidine-N-oxide19-O-β-D-glucopyranoside

9 Axit echitaminic

12 Akuammicine N-oxit 13 Nb-demethylalstogustin

Năm 2006, theo nghiên cứu của Nilubon Jong-Anurakkun, Megh Raj Bhandari, Jun Kawabata, Nhật Bản, từ lá cây hoa sữa (Alstonia scholaris) được thu hái ở Thái Lan, nhóm nghiên cứu đã phân lập được 3 hợp chất ức chế a-Glucosidase, gồm một glycoside flavonoid: quercetin 3-O-β-D-xylopyranosyl (1’’’→2’’)-β-D-

galactopyranoside (14) và hai glucoside linan : (-)-lyoniresinol glucopyranoside (15), (+) -lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside (16) Các hợp

3a-O-β-D-chất này có khả năng ức chế tăng đường huyết trong điều trị bệnh tiểu đường, nhất là với bệnh tiểu đường loại 2 [10]

14 Quercetin 3-O-β-D-xylopyranosyl (1’’’→2’’)-β-D-galactopyranoside

(-)-lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside (15) (+)-lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside (16)

α

β

Năm 2008, từ thân cây hoa sữa ( Alstonia scholaris ), P Steve Thomas, Anil Kanaujia, Dipankar Ghosh1, Rajeev Duggar& Chandra Kant Katiya , Ấn Độ, đã tìm

ra một secoiridoid mới glucoside, được đặt tên là alstonoside (17), cùng với hai

isoflavone apioglucosides, formononetin 7-Oapiofuranosyl- (1 → 6)

glucopyranoside (18) và biochanin A 7-Oapiofuranosyl- (1 → 6) glucopyranoside (19) [11]

Năm 2009, nhóm nghiên cứu Tao Feng, Xiang-Hai Cai, Pei-Ji Zhao, Zhi-Zhi

Du, Wei-Qi Li, Xiao-Dong Luo từ thân cây hoa sữa (Alstonia scholaris) đã phân lập

được 21 alkaloid indo monoterpenoid, trong đó các hợp chất (27- 32) là những hợp chất mới so với 15 chất còn lại đã biết trước đây: picrinine (1), leuconoxine (33), 5- methoxylstrictamine (34), (Z)- 16-formyl-5α-methoxystrictamine (35), 19-epi- ajmalicine (36), akuammidine (37), picralinal (38), 19(E)-vallesamine (2), 20-epi-19- oxodihydroakuammicine (39), echitamidine (40), 19-epi-scholaricine (41), nareline (42), N(4)-demethylechitamine (43), 3-epi-dihydrocorymine, 17-acetate (44), and echitamine (45) [13]

Năm 2013, từ cao chiết chloroform của vỏ thân cây hoa sữa ( Alstonia scholaris ), nhóm nghiên cứu Ashutosh Sharma , Maheep K Chahar , Mahesh C Sharma , Pradeep Parashar and Mahabeer P Dobhal ở Jaipur, đã phân lập được một steroid

mới, 3-hydroxy adiantulanosterol (46), bên cạnh bốn hợp chất đã biết : lupeol acetate (47), lupeol (48), α-amyrin acetate (49), β-amyrin acetate (50) [7]

46 3-Hydroxy adiantulanosterol 47 Lupeol acetate

49 α-amyrin acetate 48 Lupeol 50 β-amyrin acetate

Năm 2017, từ cao chiết n-hexane của lá cây hoa sữa ( Alstonia scholaris ), nhóm nghiên cứu Chao-Min Wang, Kuei-Lin Yeh , Shang-Jie Tsai, Yun-Lian Jhan and Chang-Hung Chou đến từ Đài Loan, đã phân lập được tám triterpenoid và năm sterol:

axit ursolic (51), axit oleanolic (52), axit betulinic (53), betulin (54), 2β, 3β,

28-lup-20 (29) -ene-triol (55), lupeol (48), β-amyrin (56), α-amyrin (57), poriferastero (58),

epicampesterol (59), β-sitosterol (60), 6-β-hydroxy-4- stigmasten-3-one (61), và ergosta-7,22-diene-3β, 5α, 6β-triol (62) [8], [9]

Axit ursolic, axit betulinic, betulin, và 2β, 3β, 28-lup-20 (29) -ene-triol có khả

năng ức chế hoạt động tăng sinh của tế bào ung thư phổi NSCLC, có thể tạo thành một nhóm các tác nhân trị liệu có giá trị trong tương lai Ngoài ra, axit ursolic có hoạt tính chống ung thư mạnh mẽ chống lại một số ung thư tuyến tiền liệt, vú, tuyến tụy

và bàng quang Trong các hợp chất sterol, hợp chất (58), (59), (61), (62) có thể giúp giảm sự hấp thụ cholesterol ở người, hợp chất (60) cũng cho thấy tác dụng ức chế tế

bào NSCLC, giảm 20% khả năng tồn tại của tế bào

 Nhận xét

Với một số lượng lớn các công trình nghiên cứu về cây hoa sữa (Alstonia scholaris) đến từ nhiều quốc gia khác nhau đã cho thấy tầm quan trọng của cây thuốc

cổ truyền này trong ngành thảo dược trên thế giới Mặc dù, ở các nước có nền y học

cổ truyền lâu đời như Trung Quốc, Ấn Độ các bài thuốc từ loài cây này đã được sử dụng rộng rãi, tuy nhiên ở nước ta còn hạn chế hơn so với hai quốc gia trên Nước ta cũng có một nền y học cổ truyền phát triển lâu đời với việc chịu khó học hỏi sử dụng các loại thảo dược Hơn nữa, khí hậu Việt Nam rất thuận lợi để loài cây này sinh sống

và phát triển Nếu cây hoa sữa được nghiên cứu đầy đủ và khai thác có hiệu quả thì đây sẽ là nguồn thảo dược tiềm năng của nước ta không chỉ cho nền y học cổ truyền

mà còn là nguồn dược liệu quí giá trong việc điều chế các loại dược phẩm điều trị bệnh ung thư, HIV

CHƯƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM

2.1.1 Nguyên liệu

Vỏ cây hoa sữa (cây mù cua, mò cua) được thu hái tháng 11/2017 tại Đà Nẵng (Trường Đại học Sư phạm ), rửa sạch, phơi, sấy khô ở nhiệt độ 50-600C rồi xay thành bột mịn (Hình 2.1) để chiết lần lượt với các dung môi n–hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol

a Vỏ cây sau khi phơi khô b Vỏ cây sau khi xay

Hình 2.1 Vỏ cây khô xay thành bột

2.1.2 Hoá chất và thiết bị nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này, chúng tôi sử dụng ba dung môi sau:

Chloroform CHCl 3

Ngoài ra còn có các hóa chất khác dùng để làm khan, pha chế thuốc thử trong định tính các lớp chất

Trong đề tài này, tôi sử dụng các thiết bị sau:

Bộ chiết soxhlet, tủ sấy, lò nung, cân phân tích (phòng thí nghiệm khoa Hoá, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng), Máy đo sắc kí khí kết hợp khối phổ GC-MS ( Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, Mỹ phẩm, Dược phẩm thành phố Huế - 17 Trương Định Thành phố Huế )

Đèn tử ngoại bước sóng λ= 254 nm và 365 nm dùng để soi bản mỏng

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lí

a Xác định độ ẩm

Để xác định độ ẩm tiến hành sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ trong khoảng 950

-1100C Tiến hành thí nghiệm với 3 mẫu bột vỏ cây khô và lấy kết quả trung bình Chuẩn bị các chén sứ có kí hiệu sẵn, các chén sứ được rửa sạch và được sấy khô trong

tủ sấy, làm nguội đến nhiệt độ phòng, đem cân lại đến khối lượng không đổi m1 Mẫu bột vỏ cây để xác định độ ẩm là mẫu đã qua xử lí Lấy vào mỗi chén sứ khoảng 3 g bột nguyên liệu (m2) theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén sứ, sấy ở nhiệt

độ trên, cứ sau 5 giờ lại lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân, đến khi khối lượng mẫu và cốc không đổi m3 Khối lượng ẩm của mỗi mẫu là hiệu số giữa khối lượng mẫu trước và sau khi sấy m = (m1 + m2) – m3 Độ ẩm trung bình của các mẫu tính ra % theo khối lượng mẫu bột khô vỏ cây ban đầu [1, tr 1300]

m

m m m

* Độ ẩm trung bình

m2: Khối lượng mẫu bột khô vỏ cây hoa sữa (g)

m3: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g)

W (%): Độ ẩm của mỗi mẫu

Wtb (%): Độ ẩm trung bình

b Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu

Để xác định hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động vật, thực vật người ta dùng các phương pháp tro hóa mẫu

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp tro hóa mẫu bằng phương pháp khô – ướt kết hợp Các mẫu (khối lượng m3) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục được sử dụng để tro hóa Các mẫu đựng trong chén sứ được đun trên bếp điện, than hóa sơ bộ, sau đó cho vào lò nung và tiến hành tro hoá mẫu ở nhiệt độ 500-5500C trong trong thời gian từ 4 - 6 tiếng, cho đến khi thu được tro trắng Các chất hữu cơ

bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi Khối lượng tro chính là phần chất còn lại sau khi nung [1, tr 1301]

Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng không đổi, có khối lượng m4

% tro trung bình =

5

1

%5

tro



Trong đó: m4: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)

c Xác định hàm lượng một số kim loại trong vỏ cây hoa sữa bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

Tro thu được sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng, định mức bằng nước cất và xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS [1, tr 1297-1298]

Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành trong điều kiện như sau : Mẫu sau khi tro hoá được hoà tan bằng dung dịch HNO3 loãng và định mức đến 200 mL Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm lượng một số kim loại tại Trung tâm khí tượng thủy văn Quốc gia - Đài khí tượng thủy văn khu vực Trung Trung Bộ - 660 Trưng Nữ Vương, Đà Nẵng

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ, các kĩ thuật chiết tách đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng –lỏng và chiết rắn - lỏng Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp chiết rắn – lỏng với các kĩ thuật chiết soxhlet và ngâm dầm

 Kĩ thuật chiết soxhlet:

Cân một lượng bột vỏ cây hoa sữa (khoảng 5 g/1 mẫu) cho vào bình cầu, cho vào 200 mL lần lượt các dung môi chloroform, ethyl acetate, methanol rồi tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ sôi của dung môi với những thời gian khác nhau: 4h, 6h, 8h, 10h, 12h thu được các dịch chiết LH x 5, LC x 5, LE x 5, LM x 5 Rót 20 mẫu dịch chiết trên vào các cốc đã được cân khối lượng (mc, gam), sau đó tiến hành để bay hơi tự nhiên đến thể tích 40 mL và tiến hành cân các cốc chứa các dịch chiết ( m5, gam)

m6 = m5-mc

với m6 (gam)là khối lượng của dịch chiết

Dùng phương pháp trọng lượng khảo sát độ tăng khối lượng (∆m) của các dịch chiết sau mỗi 2h chiết để chọn được thời gian tối ưu chiết được nhiều chất nhất với mỗi dung môi chiết

Chiết ngấm kiệt

Chất chiết bị biến đổi trong dung môi ở nhiệt độ cao, nên sử dụng phương pháp ngấm kiệt để chiết kiệt Dịch chiết đầu của mẫu 1 làm dung môi sau cho mẫu 4, dịch chiết sau mẫu 1 làm dung môi đầu cho mẫu 2 Dịch chiết sau của mẫu 2 làm dung môi đầu cho mẫu 3, dịch chiết sau mẫu 3 làm dung môi cho mẫu 4, dịch chiết sau mẫu 4 lấy từ dịch chiết đầu mẫu 1 Thu toàn bộ dịch chiết

2.2.3 Khảo sát các điều kiện chiết

Tiến hành soxhlet ở nhiệt độ sôi của dung môi hòa tan tốt các cấu tử cần khảo sát Ở đây tiến hành khảo sát yếu tố dung môi chiết ảnh hưởng đến hiệu quả chiết tách

 Thời gian chiết

Thí nghiệm 1: Cân một lượng bột vỏ cây hoa sữa (khoảng 5g/1 mẫu) cho vào bình cầu, cho vào 200 ml dung môi methanol rồi tiến hành chiết soxhlet ở khoảng 64.7℃; với những thời gian khác nhau : 6h, 8h, 10h, 12h, 14h Lọc, thu dịch chiết (L1), tiến hành pha loãng và đo UV-VIS

Thí nghiệm 2: Cân một lượng bột vỏ cây hoa sữa (khoảng 5g/1 mẫu) cho vào bình cầu, cho vào 200 ml dung môi clorofom rồi tiến hành chiết soxhlet ở 650C với những thời gian khác nhau: 6h, 8h, 10h, 12h, 14h Lọc, thu dịch chiết ( L2), tiến hành pha loãng và đo UV-VIS

Thí nghiệm 3: Cân một lượng bột vỏ cây hoa sữa (khoảng 5g/1 mẫu) cho vào bình cầu, cho vào 200 ml dung môi ethyl acetate rồi tiến hành chiết soxhlet ở 77.1℃ với những thời gian khác nhau: 6h, 8h, 10h, 12h, 14h Lọc, thu dịch chiết ( L2), tiến hành pha loãng và đo UV-VIS

2.2.4 Phương pháp định tính một số lớp chất trong vỏ cây hoa sữa

thoảng lắc trộn Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan phần cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan Lọc, lấy dịch lọc để thử nghiệm với hai loại thuốc thử Mayer, Wagner

- Phần 2: Bột vỏ cây xay nhuyễn (5 g) và dung dịch nước H2SO4 1% được cho vào bình tam giác và đun nhẹ, trong 1 giờ Lọc, lấy dịch lọc để thử nghiệm với hai loại thuốc thử Mayer, Wagner

- Pha thuốc thử và hiện tượng:

+ Thuốc thử Mayer : hòa tan 1.36 gam HgCl2 trong 60 mL nước cất và hòa tan

5 gam KI trong 10 mL nước cất Thuốc thử Mayer gồm hỗn hợp hai dung dịch trên thêm nước cất cho đủ 100 mL,

Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào mẫu dịch lọc ở trên, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt

+ Thuốc thử Wagner: hòa tan 1.27 gam iod I2 và 2 gam KI trong 20 mL nước cất Thêm nước cho đủ 100 mL,

Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào mẫu dịch lọc ở trên, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu

b Flavonoid

Cân 5 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình tam giác 100 mL có nắp đậy, thêm

50 mL cồn 90˚, đậy kín Đun cách thủy trong 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc Cho 1mL dịch chiết vào ống nghiệm rồi đem đi thử với các phản ứng sau: dung dịch NaOH 10%; dung dịch H2SO4 đặc; FeCl3 5%

Tác dụng với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Thêm vài giọt dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm chứa dịch lọc Nếu là flavon, flavonol cho màu vàng đậm đến màu cam và có phát huỳnh quang đặc biệt; nếu là chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương - đỏ; nếu là flavonon cho màu từ cam đến đỏ

Tác dụng với dung dịch NaOH 1%: Thêm vài giọt dung dich NaOH 1% vào ống nghiệm chứa dịch lọc sẽ có màu từ vàng đến cam - đỏ Nếu là flavon, isoflavon, chalcon, isoflavanon, flavanon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng Flavonol cho màu

từ vàng đến cam Auron cho màu tím đến đỏ tím

Tác dụng với dd FeCl3 5% : hợp chất flavonoid có màu khác nhau từ xanh lục đến xanh đen

c Coumarin

Cân 5 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình nón 100ml có nắp đậy, thêm 50 mL cồn 90˚, đậy kín Đun cách thủy trong 5 phút, lọc nóng qua bông, giữ lấy phần dịch Dịch lọc thu được đem thử nghiệm với phản ứng mở đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm bằng nhau mỗi ống 1ml dịch chiết:

+ Ống 1: thêm 0.5 mL dung dịch NaOH 10%

Cho vào 2 ống nghiệm bằng nhau mỗi ống 1 mL dịch chiết:

+ Ống 1: 5 mL HCl 0.1N (pH=1) + 3giọt dịch chứa mẫu thử

+ Ống 2: 5 mL NaOH 0.1N (pH=13) + 3 giọt dịch chứa mẫu thử

Bịt miệng 2 ống nghiệm và lắc mạnh cả 2 ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bột bong bóng ở cả 2 ống nghiệm:

Nếu cột bột trong cả 2 ống nghiệm cao bằng nhau và bột có độ bền như nhau,

có thể có saponin triterpenoid Nếu ống 2 có cột bột cao hơn nhiều so với ống 1 thì

có saponin steroid

e Đường khử

Cao chiết vỏ cây hoa sữa được chấm trên một tấm sắc ký lớp mỏng, giải ly Dung dịch nước 0.1 N AgNO3 (1 mL ), dung dịch 5N NH4OH (5 mL ), phun xịt dung dịch lên bảng mỏng, sấy bản 5-10 phút ở 105oC

Nếu bản mỏng xuất hiện vết đen xậm thì chứng tỏ có đường khử

g Steroid

Để phát hiện sự hiện diện của steroid trong vỏ cây hoa sữa, chúng tôi đã dùng

phản ứng Salkowski như sau:

Hoà tan 2 mg cao chiết clorofom trong cloroform (2 mL ) và nhỏ H2SO4 đậm đặc (1 mL), phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu đỏ đậm, xanh, xanh-tím

h Axit hữu cơ

Cân khoảng 3 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào ống nghiệm to, thêm 10 mL nước cất rồi đem đun sôi trực tiếp 10 phút Để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp, giữ lấy phần dịch Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 mL dịch lọc, thêm một ít tinh thể

Na2CO3 Quan sát hiện tượng, nếu có bọt khí thoát ra có axit hữu cơ

i Chất béo

Cân 3 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình tam giác 100 mL có nút đậy, thêm

10 mL ether dầu hỏa, đậy nắp, ngâm trong 1 giờ Lọc qua giấy lọc gấp nếp, giữ lấy phần dịch lọc Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy lọc, sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi Quan sát hiện tượng nếu có vết mờ trên giấy có chất béo

+ Ống 2: 2 mL nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol

+ Ống 3: 2 mL dịch chiết

- Pha thuốc thử và hiện tượng: