Đánh giá khả năng sống sót trong dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang alginat tinh bột chitosan chứa lactobacillus acidophilus

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HOA Mã sinh viên: 1301156 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT TRONG DỊCH TIÊU HÓA MÔ PHỎNG CỦA VI NANG ALGINAT – TINH BỘT – CHITOSAN CHỨA Lactobacillu

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ HOA

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT TRONG DỊCH TIÊU HÓA MÔ PHỎNG CỦA VI NANG ALGINAT – TINH BỘT –

CHITOSAN CHỨA Lactobacillus

acidophilus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI-2018

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ HOA

Mã sinh viên: 1301156

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT TRONG DỊCH TIÊU HÓA MÔ PHỎNG CỦA VI NANG ALGINAT – TINH BỘT

– CHITOSAN CHỨA Lactobacillus

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được thực hiện tại tổ Vi sinh – Bộ môn Công nghiệp Dược

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp

đỡ từ thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước tiên, với tất cả sự kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc

đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân, người thầy đã tiếp lửa cho tôi trên con đường nghiên

cứu khoa học Người thầy luôn tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu tiên đến khi tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn DS Nguyễn Thị Ngọc, TS Bùi Thị Thúy Luyện đã

tận tình hướng dẫn, giải đáp thắc mắc và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Công nghiệp Dược, những người đã luôn quan tâm giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất

cho tôi trong suốt quá trình thực nghiệm và làm đề tài nghiên cứu tại bộ môn Đồng thời

tôi xin cảm ơn Viện Công nghiệp Thực phẩm đã giúp đỡ tôi trong các phép đo hoạt độ

nước

Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban và toàn thể các thầy cô, các cán

bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập và nghiên cứu tại đây

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và những người bạn đáng mến - những người đã luôn bên tôi, luôn động viên khích lệ tôi trong học tập và trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Lê Thị Hoa

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về probiotic 2

1.1.1 Lịch sử phát triển của probiotic 2

1.1.2 Khái niệm probiotic 2

1.1.3 Các chủng probiotic phổ biến 3

1.1.4 Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotic 3

1.2 Vi khuẩn lactic 4

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 4

1.2.2 Loài Lactobacillus acidophilus 5

1.3 Tổng quan về vi nang 7

1.3.1 Khái niệm 7

1.3.2 Cấu tạo, thành phần 7

1.3.3 Đặc điểm của vi nang 7

1.3.4 Phương pháp vi nang hóa 8

1.3.5 Vi nang hóa bằng phương pháp tách pha đông tụ 9

1.4 Một số thành phần sử dụng trong vi nang probiotic 11

1.4.1 Alginat 11

1.4.2 Chitosan 13

1.5 Một số nghiên cứu về vi nang alginat – tinh bột – chitosan 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị 15

2.1.1 Chủng vi sinh vật 15

2.1.2 Nguyên vật liệu, hóa chất 15

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 15

2.1.4 Một số môi trường sử dụng 16

2.1.5 Một số dung dịch sử dụng 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Khảo sát một số đặc tính của vi nang Alg – TB – Chi chứa Lactobacillus acidophilus 17

2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ VSV của vi nang Alg – TB – Chi trong dịch tiêu hóa mô phỏng 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 18

2.3.2 Phương pháp nhân giống 18

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 18

2.3.4 Phương pháp tạo vi nang chứa Lactobacillus acidophilus bằng kỹ thuật đông tụ hóa muối 19

2.3.5 Phương pháp đông khô 20

2.3.6 Phương pháp xác định hàm ẩm 20

2.3.7 Phương pháp xác định hoạt độ nước của vi nang 20

2.3.8 Phương pháp xác định hình ảnh vi nang bằng kính lúp soi nổi 20

2.3.9 Phương pháp định tính bằng đo phổ hồng ngoại (IR) 21

2.3.10 Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV 21

2.3.11 Phương pháp khảo sát khả năng bảo vệ VSV của vi nang Alg – TB – Chi trong môi trường dịch dạ dày mô phỏng 22

2.3.12 Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng VSV của vi nang trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng 23

2.3.13 Phương pháp xử lý kết quả 23

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Khảo sát một số đặc tính của vi nang Alg – TB – Chi chứa Lactobacllus acidophilus 25

3.1.1 Khảo sát cảm quan bên ngoài của vi nang Alg – TB – Chi trước và sau đông khô 25

3.1.2 Khảo sát một số thông số của vi nang Alg – TB – Chi chứa L acidophilus.

30

3.1.3 Khảo sát mật độ L acidophilus của vi nang Alg – TB – Chi sau đông khô và

trong quá trình bảo quản 323.2 Đánh giá khả năng bảo vệ VSV của vi nang Alg – TB – Chi trong dịch tiêu hóa

mô phỏng 343.2.1 Khảo sát vi nang Alg – TB – Chi trong môi trường dịch dạ dày mô phỏng 353.2.2 Đánh giá khả năng giải phóng VSV của vi nang Alg – TB – Chi trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ATCC American Type Culture Collection

(Trung tâm giữ giống quốc gia Hoa Kỳ)

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

(Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)

kl/tt Khối lượng/thể tích

L acidophilus Lactobacillus acidophilus

(Vi khuẩn lactic)

(Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Đường kính vi nang M1 và M2 trước và sau đông khô 28Bảng 3.2 Hoạt độ nước của vi nang Alg – TB – Chi sau đông khô 30Bảng 3.3 Hàm ẩm của vi nang Alg – TB – Chi theo thời gian (%) 30

Bảng 3.4 Mật độ L acidophilus của vi nang Alg – TB – Chi sau đông khô và trong quá

Bảng 3.5 Khả năng sống sót của L acidophilus khi ủ vi nang Alg – TB – Chi và

Bảng 3.6 Khả năng sống sót của L acidophilus khi ủ vi nang Alg – TB – Chi và

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 5

Hình 1.3 Mô hình “Vỉ trứng”, vị trí của ion Ca2+ trong gel và sự tạo gel calci alginat 12

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan 13

Hình 3.2 Hình ảnh vi nang M1, M2 trước và sau đông khô 27

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hàm ẩm (%) của vi nang Alg – TB – Chi theo thời gian 31

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn số lượng VSV được bao gói sau đông khô và trong quá trình

Hình 3.5 Hình ảnh vi nang M2 (Alg – TB – Chi) sau khi lắc 1 giờ và 2 giờ trong dịch

Hình 3.6 Hình ảnh so sánh phổ IR của chitosan, vi nang M1 và vi nang M2 sau khi lắc

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng giải phóng VSV của vi nang Alg – TB – Chi và

ĐẶT VẤN ĐỀ

Probiotic được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con người như ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị cho người bị suy thận, giảm cholesterol máu,…[32] Tuy nhiên nhóm VSV này dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như pH, nhiệt độ, độ ẩm… Khi sử dụng theo đường uống, pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật là các yếu tố làm giảm

số lượng VSV sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh đường ruột

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tạo ra các chế phẩm nhằm đảm bảo cung cấp đủ số lượng vi sinh vật đem lại tác dụng mong muốn Trong đó, phương pháp vi nang hóa tỏ ra ưu việt, giúp tăng độ ổn định và hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có

sự thay đổi về nhiệt độ, pH hay sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường làm tế bào kéo dài khả năng tồn tại [50] Trong các nghiên cứu gần đây, các tác giả sử dụng vi nang calci – alginat – chitosan để bao gói các vi sinh vật [34], [37], [40], [48] Việc sử dụng alginat và chitosan làm vật liệu bao gói vi nang probiotic có nhiều ưu điểm nổi bật như an toàn, không độc, vi nang tạo thành có độ đồng đều cao Chitosan giúp bảo vệ, làm tăng khả năng sống sót của vi sinh vật, hạn chế tác động của acid dịch vị và muối mật khi vi sinh vật đi qua đường tiêu hóa [40]

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá khả năng sống sót trong dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang alginat – tinh bột – chitosan

chứa Lactobacillus acidophilus” với các mục tiêu sau:

1 Khảo sát một số đặc tính của vi nang alginat – tinh bột – chitosan chứa

Lactobacillus acidophilus

2 Đánh giá khả năng bảo vệ VSV của vi nang alginat – tinh bột – chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về probiotic

1.1.1 Lịch sử phát triển của probiotic

Việc sử dụng các chế phẩm sinh học đã biết đến từ rất lâu, trước khi các vi khuẩn được phát hiện Các sản phẩm sữa lên men được ghi lại trong các chữ tượng hình Ai Cập, sữa yak lên men truyền thống được những người du mục Tây Tạng sử dụng trong những chuyến đi dài [23], [39] Hiệu quả của việc sử dụng các sản phẩm lên men đã được các nhà khoa học phát hiện từ những năm 1800, nhưng lời giải thích cho những lợi ích này vẫn chưa được khám phá Năm 1905, nhà khoa học người Nga đạt giải Noben-Elie Metchnikoff, phát hiện ra mối liên hệ giữa tuổi thọ của người Bulgaria với

Lactobacilli dùng để lên men sữa chua và sự hiện diện của Lactobacilli trong ruột kết Năm 1906, Henry Tissier cô lập Bifidobacterium từ một trẻ sơ sinh [20], [39] Năm

1922, một nghiên cứu sử dụng Lactobacillus acidophilus cho 30 bệnh nhân bị táo bón

mãn tính, tiêu chảy, eczema và nhận thấy những cải thiện cho 3 triệu chứng này Mười

năm sau, năm 1932, một nghiên cứu chứng minh tác dụng của L acidophilus ở bệnh

nhân bị táo bón và tâm thần Trong những năm 1950-1980, nghiên cứu probiotic tập trung vào việc sàng lọc các chủng probiotic tiềm năng từ các chủng phân lập trong tự nhiên hoặc từ vật chủ của con người và xác định cơ chế hoạt động của các chủng probiotic Từ những năm 2000, sự bùng nổ của những nghiên cứu về chế phẩm sinh học được phản ánh bằng sự gia tăng số lượng ấn phẩm về probiotic: từ 176 ấn phẩm năm

2000 tăng lên 1476 ấn phẩm năm 2014 Sự gia tăng theo cấp số nhân cũng được nhìn thấy trong các thử nghiệm lâm sàng chứng minh hiệu quả và độ an toàn của các sản phẩm này Việc gia tăng các số lượng ấn phẩm với hàng trăm loại chế phẩm sinh học khác nhau giúp các nhà cung cấp dịch vụ chăm sóc sức khỏe và công chúng biết được probiotic nào là thích hợp nhất cho các trường hợp cụ thể [39]

1.1.2 Khái niệm probiotic

Thuật ngữ probiotic có nguồn gốc từ Hy Lạp Theo nghĩa gốc, “biotic” hay

“biosis” xuất phát từ chữ “life” là đời sống và “pro” là thân thiện, nên probiotic có thể hiểu là “thân thiện với đời sống con người”[50] Thuật ngữ này được giới thiệu bởi nhà khoa học người Đức Werner Kollath vào năm 1953: probiotic “là những hoạt chất cần thiết để cơ thể phát triển khỏe mạnh” Năm 1965, thuật ngữ này được Lilly và Stillwell

sử dụng để đại diện cho “các chất tiết ra bởi một sinh vật kích thích sự phát triển của loài khác” Vào năm 1992, Fuller đã định nghĩa probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng

có lợi cho vật chủ”[23]

Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) đã đưa ra một định nghĩa ngắn gọn và đầy đủ về probiotic như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống, mà khi đưa vào cơ thể với số lượng đủ lớn sẽ đem lại lợi ích cho vật chủ” [20], [50] Probiotic có thể được sử dụng cho cả người và động vật

Trong quá trình bảo quản và sử dụng, probiotic bị ảnh hưởng bởi nhiều điều kiện bất lợi của môi trường bên ngoài cũng như môi trường trong đường tiêu hóa [20], [41]

Số lượng mà WHO đưa ra là vi sinh vật phải ổn định trong chế phẩm trong suốt quá trình bảo quản, duy trì số lượng sống sót ở mức tối thiểu là 106-107 CFU/g [14] Số lượng vi sinh vật vừa đủ cho kết quả hiệu lực thành công trên các thử nghiệm lâm sàng

là từ 107-1011 CFU/ngày [27]

1.1.3 Các chủng probiotic phổ biến

Theo WHO và FAO, tiêu chí quan trọng nhất của chủng giống là: Có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa, có khả năng phát triển trong ruột, có hiệu quả có lợi và đáng tin cậy (được chứng minh một cách khoa học, thử nghiệm trên động vật và trên người) [20]

Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu

thuộc hai chi Lactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra Enterococcus và Streptococcus

cũng được sử dụng nhưng ít hơn Những vi khuẩn này thường cư trú ở ruột [29], [44]

Một số chủng tiêu biểu bao gồm L acidophilus, L gasseri, L rhamnosus, B longum, B bifidum Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii

cũng được xem là probiotic

1.1.4 Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotic

Hiện nay, các chế phẩm probiotic ngày càng phổ biến trên thị trường Tuy nhiên, nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng số lượng vi khuẩn probiotic trong các chế phẩm trên thị

trường còn thấp dưới mức FAO/WHO quy định Để cải thiện số lượng vi sinh vật sống sót trong suốt quá trình bảo quản và trong môi trường pH thấp của hệ tiêu hóa, các nhà cung cấp đã nghiên cứu các công thức bảo vệ VSV trong các sản phẩm probiotic với bốn thế hệ bào chế sau:

- Thế hệ 1 (non – coated): VSV sống trong sữa chua, phomat,…bào tử VSV, đơn loài, bào chế dưới dạng bột đông khô, gói bột uống, không bao Nhược điểm của thế hệ này là VSV hầu như không thể sống sót khi đi qua dạ dày

- Thế hệ 2 (enteric – coated): Bào chế dưới dạng viên nén, viên nang, đơn và đa loài, có lớp bao tan trong ruột

- Thế hệ 3 (micro – encapsulated): Vi nang hóa

- Thế hệ 4 (dual – coated): Bao kép, giải phóng VSV ở ruột Lớp bao bên trong

là peptid/protein, giải phóng VSV tùy thuộc pH của môi trường ruột Lớp bao bên ngoài là polysaccharid và hydrocollorid, giúp bảo vệ VSV chống lại tác động của nhiệt độ, độ ẩm, áp suất, do đó làm tăng độ ổn định của VSV trong quá trình bảo quản chế phẩm [3]

1.2 Vi khuẩn lactic

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria - LAB) là một nhóm các loài vi khuẩn có trong tự nhiên với ba đặc điểm chung: vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử và chuyển hóa đường bằng quá trình lên men lactic LAB được biết đến là thành phần của ruột người, chúng cũng xuất hiện rộng rãi trong sữa, thịt, thực vật và các sản phẩm lên men [38] Quá trình lên men acid lactic là một quá trình lên men kỵ khí, khi đó, đường glucose

sẽ được chuyển thành acid lactic

Nhóm vi khuẩn lactic gồm 5 chi chính với vài trăm loài khác nhau Theo thứ tự

tầm quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, LAB gồm 5 chi: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus [5], [43] Trong các chi của LAB, chi Lactobacillus có tính kháng axit Hiện nay, vi khuẩn lactic được sử dụng rộng

rãi trong nhiều thực phẩm và quá trình lên men trên toàn thế giới Việc sử dụng vi khuẩn lactic giúp bảo quản và tạo nên hương vị độc đáo cho các sản phẩm [38]

1.2.2 Loài Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus là một chi không đồng nhất, bao gồm nhiều vi khuẩn với các đặc tính sinh lý và sinh hóa khác nhau [22] Chi Lactobacillus là chi lớn nhất của LAB, với

185 loài theo kết quả phân loại năm 2013, tăng đáng kể so với năm 2008 (145 loài) do

sự phân loại lại [16], [38] Việc xác định các chủng phân lập dựa trên các đặc điểm kiểu hình truyền thống như quá trình lên men carbohydrat, hình thái tế bào; kết hợp với việc

thiếu khung phân loại mạnh mẽ đã dẫn đến các chủng Lactobacillus được chỉ định không

chính xác ở cấp chi, loài

Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập vào năm 1900 từ đường tiêu hóa của con người (từ phân trẻ sơ sinh), nhưng được chỉ định là Bacillus acidophilus Trong suốt quá trình phát triển các phương pháp xác định và mô tả vi khuẩn,

L acidophilus đã trải qua rất nhiều phiên bản phân loại

1.2.2.1 Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy

Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, nhóm vi

khuẩn lactic (LAB) và tồn tại trong đường tiêu hóa, âm đạo của người và động vật Tên

của loài có nghĩa là “ưa acid”, L acidophilus có khả năng chịu được điều kiện pH

khoảng 5,0 đến 6,0 trong 24 - 36 giờ [2], [38]

Đặc điểm hình thái của L acidophilus: trực khuẩn hình que, Gram dương, kích

thước 0,6 - 0,9 μm x 1,5 - 6,0 μm, tồn tại riêng lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn, không sinh bào tử, không di động, kỵ khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm tính Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 37ºC, không phát triển trong khoảng 20 - 22ºC hoặc ở nhiệt

độ cao hơn 48ºC [2]

Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

Tuy nhiên, khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilus phụ thuộc vào nhiều

yếu tố như pH, sự acid hóa trong sản phẩm lên men, sản phẩm hydroperoxid, nồng độ oxy hòa tan (khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ bảo quản, độ ổn định của dạng khô hoặc đông khô [47], [53] Trong đó, nồng độ oxy hòa tan

có vai trò đáng kể trong việc hạn chế khả năng sống sót của L acidophilus Do đó, sau một thời gian bảo quản, số lượng L acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể

L acidophilus có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật, 8

ngày trong dịch tràng và có khả năng kháng được 40 loại kháng sinh [25]

1.2.2.2 Vai trò của L acidophilus

Probiotic được dùng để phòng và điều trị bệnh và các triệu chứng liên quan do

sự thiếu vi khuẩn gây ra [1] Lactobacillus acidophilus tạo ra môi trường acid thuận lợi

cho hệ vi sinh vật lên men đường ruột, đồng thời ức chế sự phát triển của các vi khuẩn

gây bệnh Gram (-) L acidophilus có khả năng sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn

như Lactocidin, Bacteriocin Chúng đóng vai trò sinh lý quan trọng trong tổng hợp

vitamin B12 [21] Hơn nữa L acidophilus giảm sinh tổng hợp cholesterol, làm giảm béo phì và gan nhiễm mỡ [12], [21] L acidophilus ức chế các vi khuẩn đường ruột chuyển

đổi tiền chất gây ung thư thành chất gây ung thư Chúng có vai trò quan trọng trọng điều

trị các bệnh đường tiêu hóa như táo bón, tiêu chảy Ngoài ra, L acidophilus cạnh tranh

vị trí, làm giảm số lượng vi sinh vật hoặc nấm gây hại ở ruột non, có khả năng sinh lactase - một enzym quan trọng liên quan quá trình chuyển hóa sữa [21] Một số nghiên

cứu còn chỉ ra L acidophilus có vài trò trong việc ngăn ngừa viêm ruột hoại tử và nhiễm

trùng bệnh viện ở trẻ đẻ non thiếu tháng [49]

1.2.2.3 Một số chế phẩm probiotic trên thị trường hiện nay

Antibio Pro do công ty dược phẩm Han Wha, Hàn Quốc sản xuất với dạng bào chế

gói bột pha hỗn dịch uống Mỗi gói chứa 75 mg Lactobacillus acidophilus tương đương

với 108 CFU/gói Antibio Pro giú p ức chế vi khuẩn có hại trong đường ruột Antibio Pro được dùng để hỗ trợ điều trị những trường hợp rối loạn hoă ̣c mất cân bằng hệ vi sinh

Lactomin Plus do công ty Rexgene Biotech, Hàn Quốc sản xuất Mỗi gói 3g, chứa

probiotics (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus), bào chế

dưới dạng vi nang, với 108 CFU/gói Với công dụng: bổ sung lợi khuẩn, giúp lập lại cân

bằng hệ vi sinh đường ruột, hỗ trợ phòng ngừa rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy, táo bón

do loạn khuẩn đường ruột,…

Bifina R do hãng Morishita Jintan, Nhật Bản sản xuất, dạng bào chế vi nang, sử

dụng màng bao kép Mỗi gói chứa 1,2 g, thành phần gồm 2 probiotic: Bifidobacterium

(2,5x109 CFU/gói), Lactobaccillus (1x109 CFU/gói) và Prebiotic (0,29 g chất xơ Oligosaccharide) Men vi sinh Bifina R hỗ trợ điều trị: viêm đại tràng, rối loạn tiêu hóa, viêm đại tràng co thắt, đầy bụng chướng hơi, táo bón, hấp thu kém ăn không tiêu, dùng kháng sinh kéo dài

1.3.3 Đặc điểm của vi nang

Vi nang có lớp vỏ như một lớp màng bán thấm bao quanh tế bào VSV, giúp tế bào cách ly với môi trường xung quanh, bảo vệ tế bào trong các điều kiện bất lợi như

pH thấp, muối mật, sốc nhiệt,… [32] Vi nang không được làm tổn hại đến tế bào sống

mà phải bảo vệ tế bào sống Lớp vỏ vi nang có độ bền tương đối giúp bảo vệ VSV sống bên trong, tuy nhiên không được quá vững chắc để đảm bảo khả năng giải phóng VSV khi cần thiết [8], [32] Vi sinh vật được giải phóng theo các cơ chế như: gãy vỡ màng, hòa tan màng hoặc khuếch tán qua màng,…[32]

Kích thước vi nang là một yếu tố quan trọng Giữa kích thước hạt vi nang, độ bền vững và khả năng giải phóng VSV có mối tương quan với nhau Kích thước hạt càng lớn thì độ bền cơ học của hạt càng cao, khả năng bảo vệ VSV càng cao, tuy nhiên khả năng giải phóng VSV chậm, khó khăn Ngược lại, kích thước hạt càng nhỏ thì độ bền của hạt thấp, khả năng “nhốt”, “bẫy” VSV giảm nhưng khả năng giải phóng VSV nhanh

và dễ dàng hơn [8], [32] Ngoài ra còn một số đặc điểm cần lưu ý như: sự mài mòn của các hạt vi nang do sự va chạm ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn của hạt…[8] Một số tính chất của nguyên liệu sử dụng là vỏ nang như khả năng bám dính, tính thấm,

độ ổn định, hút ẩm, khả năng hòa tan phải phù hợp với mục đích bào chế vi nang và VSV “nhốt”, “bẫy”

1.3.4 Phương pháp vi nang hóa

Vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay Phương pháp này sử dụng các chất tạo màng là các polyme có nguồn gốc

tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose,… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycon (PEG),… để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống [8], [43]

Ưu điểm

Vi nang có khả năng cố định một lượng lớn VSV sống tạo ra mật độ VSV lớn Trong các ngành sản xuất sản phẩm lên men như bia, rượu,… thì kỹ thuật vi nang hóa được lựa chọn để cố định tế bào VSV trong công đoạn lên men, nhằm sử dụng VSV tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn Trong các ngành sản xuất các sản phẩm liên quan đến probiotic, vi nang hóa là phương pháp có ý nghĩa rất quan trọng giúp cải thiện cảm quan cho sản phẩm, tăng độ ổn định, kiểm soát giải phóng cũng như thuận lợi hơn trong quá trình bảo quản [8], [32]

Vi nang giúp bảo vệ VSV khỏi các yếu tố bất lợi của môi trường như pH thấp, muối mật, sốc nhiệt,… Ngoài ra, vi nang giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt của chất ức chế trong môi trường lên men Do đó, vi nang hóa làm tăng độ ổn định và kéo dài khả năng tồn tại của VSV [50]

Vi nang hóa có thể tạo ra các gradien nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm, nồng

độ oxy hòa tan, pH môi trường lên men… từ đó có thể tạo ra các môi trường khác nhau cho tế bào trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng Vi nang cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của VSV, cho phép sử dụng tế bào ở một pha riêng biệt đối với môi trường lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh [8], [32], [50]

Nhược điểm

Đa số các vật liệu sử dụng trong quá trình tạo vi nang như gelatin, thạch,… đều

là các nguồn dinh dưỡng mà VSV có thể tiêu hóa được Do đó VSV được bao gói bên trong vi nang hoặc VSV tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa lớp vỏ nang và làm cho lớp màng bảo vệ bị rách, thủng,… dẫn đến hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm xuống đáng kể

Vì vậy, việc nghiên cứu, lựa chọn các vật liệu bao gói phù hợp với từng chủng VSV là rất quan trọng

Vi nang hóa probiotic yêu cầu kỹ thuật bào chế phức tạp, vật liệu vi nang hóa an toàn - hiệu quả, chủng VSV có hiệu lực cao, chỉ các chủng VSV tiềm năng mới có thể được sử dụng Bên cạnh đó, sự phát triển sản phẩm cần cả thời gian và nguồn lực tài chính Brownlie ước tính rằng việc vi nang hóa probiotic có thể tăng chi phí hai hoặc ba lần so với không bao gói Mặc dù chi phí tăng nhưng vi nang hóa đem lại lợi ích tiềm năng cao hơn [46]

1.3.5 Vi nang hóa bằng phương pháp tách pha đông tụ

Phương pháp tách pha đông tụ dựa trên nguyên tắc tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt

độ, pH, sự hóa muối hoặc khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ vi nang Từ dung dịch keo trong một dung môi thích hợp, tiến hành tác động nhằm thay đổi độ tan của nó, kết quả là một lượng đáng kể keo được tách ra thành pha mới Như vậy hệ trở thành hai pha, một pha có nồng độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ được gọi là giọt đông

tụ Sau đó, các giọt đông tụ dần kết dính lại với nhau hoặc hấp phụ trên bề mặt chất cần bao gói tạo thành lớp màng bao [7], [42]

Vi nang hóa bằng phương pháp tách pha đông tụ có thể chia làm 2 loại: đông tụ đơn giản và đông tụ phức hợp Nếu chỉ sử dụng một loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp đông tụ đơn giản, nếu sử dụng nhiều loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp đông tụ phức tạp [7], [42]

Đông tụ đơn giản:

Là quá trình loại nước của các chất keo thân nước dùng trong hệ, do đó làm giảm

độ tan của chất keo Trong phương pháp này thường chỉ sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose) Có thể làm giảm độ tan của chất keo bằng cách: Thêm một dung môi có thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, propanol, dioxan, isopropanol,…) hoặc thêm một muối vô cơ (ví dụ natri sulfat) hay thay đổi nhiệt

độ [30]

Đông tụ phức hợp:

Là quá trình tương tác giữa các phân tử tích điện âm và tích điện dương của hai hoặc nhiều hợp chất cao phân tử, có thể do sự thay đổi nồng độ các chất tan cao phân tử hoặc thay đổi pH Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện càng dễ tạo thành hạt đông tụ [7], [30], [42] Tách pha còn có thể được thực hiện do thêm vào một polyme khác không tương đồng, do thêm vào một dung môi thứ hai, do sự hóa muối (đông tụ thông thường), hoặc do sự tương tác giữa các polyme…[7]

Kỹ thuật đông tụ hóa muối (đông tụ thông thường)

Kỹ thuật đông tụ hóa muối còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định gel, ion hóa tạo gel để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel) Phương pháp này thường sử dụng các polyme có nguồn gốc tự nhiên, có tính tương thích sinh học cao như alginat, chitosan, gôm gellan… Các polyanion như alginat sẽ kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới không gian ba chiều bao gói lấy dược chất hoặc kết hợp tạo phức với các polyanion khác trên bề mặt của hạt gel alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao hơn, ngăn thấm tốt hơn

Phương pháp đông tụ hoa muối có thể được thực hiện bằng kỹ thuật nhỏ giọt hoặc kỹ thuật phun đông tụ Kỹ thuật nhỏ giọt thường cho các vi nang có kích thước lớn nằm trong khoảng 2 - 5 mm [52] Với kỹ thuật phun đông tụ, sử dụng hệ thống phun dung dịch alginat dưới áp suất không khí tạo các giọt nhỏ và trở thành đông tụ khi gặp môi trường có tác nhân liên kết chéo Kỹ thuật này cho vi nang có kích thước bé (5 – 15µm) nhưng yêu cầu bắt buộc là phải có thiết bị thích hợp, tốn kém, khả năng tắc nghẽn cao

1.4 Một số thành phần sử dụng trong vi nang probiotic

1.4.1 Alginat

Cấu tạo

Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic, tồn tại dưới dạng anion Acid aginic là một heteropolymer saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α – L – guluronic (G) và acid β – D – mannuronic (M) nối với nhau bằng liên kết 1 – 4 – glycosid [24] Alginat được chiết xuất từ rong biển nâu, được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm nhờ khả năng bao gói các chất đại phân tử và tế bào

Hình 1.2 Hình ảnh mô tả cấu trúc của alginat

Alginat có tỷ lệ khối G cao (tỷ số M/G thấp) tạo gel cứng hơn Ngược lại, alginat chủ yếu là khối M thì gel hình thành mềm hơn và đàn hồi hơn

Một số tính chất liên quan đến bào chế vi nang

Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, rẻ tiền và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Alginat có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung dịch và khả năng tạo gel [24]

Độ nhớt dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh của phân tử alginat Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của ion kim loại [15], [31]

Dung dịch alginat có khả năng tạo gel với các cation kim loại hóa trị II, III như

Ca2+, Ba2+, Sr2+, sự tạo gel được giải thích theo mô hình “vỉ trứng” Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại block M là các dải hẹp và block G là các dải gấp khúc Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị ở nồng độ thích hợp thì xảy ra sự gel hóa Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều Với cấu trúc gel này, khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng có kiểm soát [24]

Hình 1.3 Mô hình “Vỉ trứng”, vị trí của ion Ca 2+ trong gel và sự tạo gel calci alginat

Nhược điểm

Độ bền gel phụ thuộc một số ion hóa trị I và các chất tạo phức với ion Ca2+ Gel alginat rã khi các cation hóa trị II phối hợp được thay thế bằng các cation hóa trị I hoặc các chất tạo phức với Ca2+ Tương tác giữa alginat và các cation hóa trị I dẫn đến hiện tượng hòa tan của gel [17]

Việc ứng dụng alginat trong quy mô công nghiệp gặp khó khăn do chi phí cao, khả năng co giãn yếu cũng như dễ hình thành nứt và mất ổn định trong môi trường acid, dẫn đến sự khuếch tán nhanh chóng độ ẩm và chất lỏng qua các viên nang làm giảm khả năng bảo vệ chống lại các yếu tố môi trường không thuận lợi Điều này có thể khắc phục bằng cách trộn alginat với polyme khác như tinh bột trong vi nang [28]

1.4.2 Chitosan

Nguồn gốc

Chitosan là một polyaminosaccharid sinh học tự nhiên, thu được từ phản ứng deacetyl hóa của chitin - một polyme tự nhiên chuỗi dài của N-acetylglucosamine và dẫn xuất đường glucose Chitosan là thành phần cơ bản của lớp biểu bì côn trùng, màng của nấm và là thành phần trong lớp vỏ bảo vệ động vật giáp xác như: tôm, cua, [45]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan

Tính chất

Chitosan có phân tử lượng từ 3.800 đến 2.000.000 dalton, mức độ acetyl hóa từ 40% đến 98% [45] Nhóm amino của chitosan có pKa xấp xỉ 6,5 Chitosan là một base yếu, tích điện dương, không tan trong nước và dung môi hữu cơ Chitosan tan trong hầu hết các dung dịch acid loãng (pH < 6.5) như acid formic, acid acetic, acid tartaric và acid citric do trong môi trường acid, nhóm amin của chitosan nhận proton tạo thành dạng polysaccharid tích điện dương tan được Các muối glutamat, clorid của chitosan tan trong nước Chitosan không tan trong môi trường trung tính và kiềm Đặc tính này

được ứng dụng để chế tạo vi cầu, vi nang chitosan [45]

Chitosan có ưu điểm là độc tính thấp, tính tương thích sinh học cao với tế bào

VK và nhiều hoạt chất khác, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm đồng thời tự phân hủy được nên chitosan thường được dùng làm chất mang trong công nghệ dược phẩm

Trong bào chế vi nang probiotic, chitosan có vai trò cung cấp một lớp bao phủ hiệu quả, bảo vệ các tế bào vi khuẩn trong quá trình bảo quản và sử dụng, đảm bảo VSV

có thể đi qua đường tiêu hóa (acid dạ dày, muối mật, ) đến ruột già mà vẫn đủ số lượng VSV cần thiết để phát huy tác dụng [14]

1.5 Một số nghiên cứu về vi nang alginat – tinh bột – chitosan

Theo Mariana Araujo Etchepare và cộng sự (2016) [37]: Lactobacillus acidophilus được bao gói trong vi nang bằng kĩ thuật đùn Bổ sung prebiotics và chitosan

làm tăng kích thước của hạt ẩm (đường kính vi nang là 70,37 µm so với hạt chỉ chứa alginat là 55,13 µm) Đồng thời nghiên cứu đã chứng minh chitosan có khả năng bảo vệ VSV tốt hơn trong dịch tiêu hóa mô phỏng

Theo Mohammad Ali Khosravi Zanjani và cộng sự (2014) [40]: Lactobacillus casei và Bifidobacterium bifidum được bao gói trong vi nang bằng kỹ thuật nhũ tương

hóa Nghiên cứu thực hiện với 3 mẫu VSV: không được bao gói, bao gói với vi nang calci – alginat - tinh bột và bao gói với vi nang calci – alginat – tinh bột phủ chitosan Các mẫu này được ủ trong dịch dạ dày mô phỏng (cùng với pepsin, pH = 1.5) và dịch ruột mô phỏng (cùng với pancreatin, pH = 8) trong 2 giờ ở 37 0C Kết quả cho thấy tỷ

lệ sống sót của probiotic trong vi nang calci - alginat - tinh bột bao chitosan tăng đáng

kể trong môi trường dạ dày – ruột mô phỏng so với tế bào tự do

Theo Đàm Thanh Xuân và cộng sự (2016) [11]: tác giả tạo vi nang probiotic chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp đông tụ hóa muối Các mẫu vi nang tạo

thành được bảo quản trong túi polyme kín miệng ở nhiệt độ 2 – 80C Tác giả tiến hành đánh giá khả năng bảo vệ VSV ở môi trường pH 1,2 trong 1 giờ Kết quả cho thấy các

thành phần alginat, tinh bột, chitosan đều có ảnh hưởng đến đặc tính và khả năng bảo vệ Lactobacillus acidophilus

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1 Chủng vi sinh vật

Lactobacillus acidophilus (ATCC 4653) – Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại

học Dược Hà Nội

2.1.2 Nguyên vật liệu, hóa chất

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất sử dụng

Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc

Triamoni citrat Trung Quốc Natri citrat Trung Quốc

Natri acetat Trung Quốc Natri clorid Trung Quốc

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

❖ Thiết bị

Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Nguồn gốc Máy đo phổ IR Nhật (Jasco)

Cân phân tích Đức (Satorious) Máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc (KWF) Nồi hấp tiệt trùng Nhật (ALP) Máy ly tâm Đức (Satorious)

Tủ sấy Hàn quốc (Daihan) Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd)

Tủ ấm CO2 Nhật (Sanyo) Máy lắc (Votex) Trung Quốc (IKA) Thiết bị đông khô Đức (Christ Alpha) Tủ lạnh sâu Đức (Satorious)

Tủ lạnh bảo quản Hàn Quốc (LG) Kính lúp soi nổi Nhật (Nikon) Máy đo hoạt độ nước Thụy Sỹ (Hygrolab) Máy đo hàm ẩm Mỹ (Ohaus)

❖ Dụng cụ

Bình nón 100, 250, 1000 ml Pipet pasteur

Ống nghiệm có nắp Đĩa petri đường kính 9 cm

Điều chỉnh pH 6,3 – 6,5

❖ Môi trường MRS thạch

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát một số đặc tính của vi nang Alg – TB – Chi chứa Lactobacillus

acidophilus

➢ Khảo sát cảm quan bên ngoài của vi nang Alg – TB – Chi trước và sau đông khô

➢ Khảo sát một số thông số của vi nang Alg – TB – Chi chứa L acidophilus

➢ Khảo sát mật độ L acidophilus của vi nang Alg – TB – Chi sau đông khô và

trong quá trình bảo quản

2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ VSV của vi nang Alg – TB – Chi trong dịch tiêu hóa mô phỏng

➢ Khảo sát vi nang Alg – TB – Chi trong môi trường dịch dạ dày mô phỏng

➢ Đánh giá khả năng giải phóng VSV của vi nang Alg – TB – Chi trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn

2.3.1.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được gói kín bằng giấy bạc hoặc đựng trong bình nón đậy kín bằng nút bông, sau đó tiệt trùng bằng nồi hấp tiệt khuẩn ở nhiệt độ 1150C áp suất 0,6 atm trong 20 phút

2.3.1.2 Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall

Chế phẩm cần tiệt khuẩn được đựng trong bình nón và đậy kín bằng nút bông không thấm nước, đun cách thủy ở 700C – 800C trong 1h Sau đó ủ bình trong tủ ấm ở điều kiện 370C trong 24 giờ Lặp lại thao tác này trong 3 ngày liên tiếp thu được chế phẩm tiệt khuẩn

2.3.2 Phương pháp nhân giống

Cân, đong các thành phần trong môi trường MRS lỏng tính cho 40 ml (công thức nêu trong mục 2.1.4), hòa tan, phân tán hết các thành phần trong cốc có mỏ Đong 40,0

ml MRS lỏng vào bình nón có dung tích thích hợp, đậy kín bình nón bằng nút bông không thấm nước Hấp tiệt khuẩn môi trường ở nhiệt độ 1150C áp suất 0,6 atm trong 20 phút Để nguội đến nhiệt độ 37 – 400C, cấy 0,40 g bột giống vào bình nón trên (thao tác tiến hành trong tủ cấy vô trùng) Sau đó ủ bình nón đã cấy giống trong tủ ấm 5% CO2

trong 24 giờ ở điều kiện 37±10C

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào

Cân, đong các thành phần trong môi trường MRS lỏng tính cho 400 ml (công thức nêu trong mục 2.1.4), hòa tan, phân tán hết các thành phần trong cốc có mỏ Đong 400,0 ml MRS lỏng vào bình nón có dung tích thích hợp, đậy kín bình nón bằng nút bông không thấm nước Hấp tiệt khuẩn môi trường ở nhiệt độ 1150C áp suất 0,6 atm trong 20 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ 37– 400C Cấy giống đã ủ 24 giờ vào bình nón đã chuẩn bị trên trong tủ cấy vô trùng (tỷ lệ cấy giống: 10% thể tích môi trường) Ủ bình nón trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ ở nhiệt độ 370C thu được dịch nuôi cấy chứa sinh khối VSV

2.3.4 Phương pháp tạo vi nang chứa Lactobacillus acidophilus bằng kỹ thuật đông

tụ hóa muối

Bảng 2.3 Bảng thiết kế công thức vi nang

Thành phần Alginat Tinh bột Calci clorid Chitosan

❖ Chuẩn bị:

- Sinh khối L acidophilus: Nuôi cấy Lactobacillus acidophilus trong 400 ml MRS

lỏng trong tủ ấm CO2 5% (phương pháp nêu ở mục 2.3.3) Sau 24 giờ, ly tâm dịch nuôi

cấy ở điều kiện 4000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch trong, thu sinh khối VSV

- Pha 200 ml dung dịch natri alginat 3% (kl/tt); 500 ml dung dịch natri clorid 0,9% (kl/tt); 100 ml dung dịch calci clorid 2% (kl/tt); 200 ml dung dịch calci clorid 2%, chitosan 0,5% trong acid acetic 0,5%, pH 5,5– 6,0 (phương pháp nêu ở mục 2.1.5); hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 1150C áp suất 0,6 atm trong 20 phút, để nguội

- Tạo hỗn dịch natri alginat – tinh bột chứa L acidophilus: Phân tán 20,0 g tinh bột

đã tiệt khuẩn bằng phương pháp tiệt khuẩn Tyndall (phương pháp nêu ở mục 2.3.1.2) vào 200 ml dung dịch natri alginat 3% đã tiệt khuẩn Sinh khối tươi thu được sau khi ly tâm đem votex thu toàn bộ sinh khối và phân tán trong bình nón trên (theo tỷ lệ 100 ml dịch nuôi cấy cho 50 ml alginat 3%) Đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong 20 phút

thu được hỗn dịch S (natri alginat 3% – tinh bột 10% chứa sinh khối L acidophilus)

Hỗn dịch này được sử dụng để tạo vi nang

❖ Tiến hành: Tạo 2 mẫu vi nang trong tủ cấy vô trùng

• Mẫu M1: Vi nang Alg – TB chứa L acidophilus

Nhỏ hỗn dịch S bằng một pipet pasteur có kích thước đầu pipet cỡ 2 mm vào dung dịch CaCl2 2% (đã hấp tiệt khuẩn và để nguội) để tạo vi nang Để yên 30 phút cho vi nang ổn định, sau đó sử dụng lưới vớt hạt đã tiệt khuẩn vớt lấy vi nang, rửa vi nang ba lần bằng dung dịch natri clorid 0,9% (kl/tt) đã chuẩn bị ở trên

• Mẫu M2: Vi nang Alg – TB – Chi chứa L acidophilus

Nhỏ hỗn dịch S qua một pipet pasteur có kích thước đầu pipet cỡ 2 mm xuống dung

dịch calci clorid 2%, chitosan 0,5% trong acid acetic 0,5%, pH 5,5– 6,0 để tạo vi nang

Để yên 30 phút cho vi nang ổn định, sau đó sử dụng lưới vớt hạt đã tiệt khuẩn vớt lấy vi nang, rửa vi nang ba lần bằng dung dịch natri clorid 0,9% (kl/tt) đã chuẩn bị ở trên Toàn bộ quá trình tạo vi nang đều tiến hành trong tủ cấy vô trùng

2.3.5 Phương pháp đông khô

❖ Chuẩn bị mẫu:

Các mẫu vi nang tạo thành (theo phương pháp nêu ở mục 2.3.4) được dàn đều và đậy kín trong các đĩa petri đã rửa sạch, tiệt khuẩn và sấy khô sau đó đem đi tiền đông ở tủ lạnh sâu -700C trong 24 giờ cho đông rắn hoàn toàn

❖ Tiến hành:

Các mẫu sau khi tiền đông ở tủ lạnh sâu được làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô ở điều kiện nhiệt độ khoảng -500C và áp suất 0,1 mbar – 0,12 mbar trong

24 giờ

Kết thúc quá trình đông khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, chuyển các mẫu nguyên liệu

từ đĩa petri vào lọ thủy tinh, đậy kín bằng nút cao su để trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng

40C – 80C, độ ẩm tương đối 30%

2.3.6 Phương pháp xác định hàm ẩm [11]

Tiến hành đo hàm ẩm trên thiết bị đo hàm ẩm Ohaus theo phương pháp mất khối lượng do làm khô

Cho lên mặt đĩa của thiết bị 0,5 – 1 g mẫu, dàn đều mẫu, đậy nắp, vận hành thiết

bị với các thông số: gia nhiệt 1050C, thời gian đo 5 phút Đọc, ghi lại số liệu hàm ẩm của mẫu hiển thị trên màn hình

2.3.7 Phương pháp xác định hoạt độ nước của vi nang

Hoạt độ nước được đo bằng máy đo hoạt độ nước Hygrolab (Thụy Sỹ) tại Viện Công nghiệp Thực phẩm

Chuẩn bị khoảng 0,5 g vi nang, đóng kín trong lọ thủy tinh, đậy nút cao su và xiết nắp nhôm đã tiệt khuẩn Gửi mẫu đến Viện Công nghệ Thực phẩm, sau đó nhận kết quả gửi về

2.3.8 Phương pháp xác định hình ảnh vi nang bằng kính lúp soi nổi