Nghiên cứu định lượng riboflavin natri phosphat natrazolin nitrat clorpheniramin maleat pyridoxin hydroclorid và dexphanthenol trong thuốc nhỏ mắt naphacollyre b complex bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Để giúp cho cơ sở tiêu chuẩn hoá sản phẩm, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu định tính và định lượng riboflavin natri phosphat, naphazolin nitrat, clorpheniramin maỉeat, pyridoxin hydroclo

PHAN T H Ị THÙY C H I

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG RIBOFLAVIN NATRI PHOSPHAT, NAPHAZOLIN NITRAT, CLORPHENIRAMIN

MALEAT, PYRIDOXIN HYDROCLORID VÀ

DEXPANTHENOL TRONG THUỐC NHỎ MẮT

NAPHACOLLYRE B-COMPLEX Bằ NG SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM n g h i ệ m THUỐC - ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60 73 15

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Thái Phan Quỳnh N hư

CH

HÀ N Ộ I - 2 0 0 5

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Thái Phan

Quỳnh Như đ ã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận

lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện Kiểm nghiệm,

tập th ể cán bộ phòng H óa lý 1 - Viện Kiểm nghiệm đ ã quan tâm, tạo

điều kiện thuận lợi đ ể tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên

cứu trong thời gian qua.

]ũn trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, cảm ơn các

thầy cô trong Phòng Đ ào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng

các Bộ môn khác của Trường Đ ại học Dược H à nội đ ã tạo điều kiện

tốt cho tôi trong thời gian học tập tại trường.

Cuối cùng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đ ã luôn động viên,

khích lệ và giúp đ ỡ tôi tận tình.

P h a n T h ị T h ù y C h ỉ

1.1 Vài nét về riboflavin natri phosphat, naphazolin nừrat, 3

clorpheniramin maleat, pyridoxin hydrodorid và dexpanthenol.

1.2 M ột s ố phương pháp được áp dụng đ ể định lượng riboflavin 8

natrỉ phosphat, naphazolin nitrat, clorphenỉramin maleat,

pyridoxin hydroclorid và dexpanthenoỉ.

Phần 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 NGHIÊN CỨU

2.2.2 Xây dựng phương pháp HPLC để phân tích định tính và 23 định lượng B2, NP, CM, B5 và B6 trong thuốc nhỏ mắt

Naphacollyre B-complex

2.2.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 25

3.2 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng B2, NP,

CM, B5 và B6 trong thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex

bằng phương pháp HPLC.

3.2.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký

3.2.3 Xây dựng và đánh giá phưcfng pháp định tính, định lượng

B2, NP, CM, B5 và B6 trong thuốc nhỏ mắt Naphacollyre

B-complex

3 3 Bàn luận.

3.4 Áp dụng phương pháp đ ã xây dựng đ ể định lượng B2, NP, 2 ị

CM, B5 và B6 trong một s ố lô thuốc nhỏ mắt Naphacollyre

49

BP : Dược điển Anh.

B2 : Riboflavin natri phosphat

STT Ký hiệu Nội dung T rang

1 Bảng 3.1 Hệ số match so sánh giữa phổ chuẩn và thử 34

2 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính thích hựp của hệ thống 39

3 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của B2,

STT Ký hiệu Nội dung T ran g

2 Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của B2 30

3 Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của NP 30

4 Hình 3.3 Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của CM 31

5 Hình 3.4 Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của B6 31

6 Hình 3.5 Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của B5 31

7 Hình 3.6 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn B2, NP và CM 35

18 Hình 3.17 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của

Trong những năm gần đây do môi trường sống ngày càng bị ô nhiễm nên các bệnh về mắt ngày càng gia tăng Các loại thuốc nhỏ mắt đơn thành phần không còn đáp ứng được nhu cầu điều trị trong chuyên khoa mắt Các nhà bào chế dược phẩm đã cho ra đời rất nhiều các chế phẩm thuốc nhỏ mắt kết hợp nhiều dược chất khác nhau để đáp ứng nhu cầu phòng và chữa cácbệnh khác nhau về mắt Các biệt dược thuốc nhỏ mắt đa thành phần được sảnxuất, lưu hành và sử dụng rất nhiều ở nước ta như: Virondo của Xí nghiệp dược phẩm trung ưcfng II; Pinkle của Hanil Pharmaceutical Corporation; Tobirob của Ahn Gook Pharmaceutical Corporation; Kodomo và V.Rohto của Rohto Pharmaceutical Corporation v.v Tuỳ theo mục đích điều trị mà các nhà sản xuất đã phối hợp các thành phần hoạt chất khá đa dạng trong công thức bào chế.

Công ty cổ phần dược phẩm Nam Hà nghiên cứu sản xuất chế phẩm thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex với công thức bào chế như sau:

Nước cất và tá dược vừa đủ lOOml

Biệt dược này là sản phẩm dựa trên sự phối hợp tác dụng dược lý của các chất co mạch, giảm viêm, chống dị ứng, giảm ngứa, lành vết loét, bảo vệ niêm mạc mắt Thuốc được chỉ định khi nhức mỏi mắt, mờ mắt, xung huyết kết mạc,

Thuốc đa thành phần này là sản phẩm mới, không có trong các Dược điển hiện hành nên chưa có phương pháp để kiểm nghiệm đánh giá chất lượng

Để giúp cho cơ sở tiêu chuẩn hoá sản phẩm, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu định tính và định lượng riboflavin natri phosphat, naphazolin nitrat, clorpheniramin maỉeat, pyridoxin hydroclorid và dexpanthenol trong thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex bằng phương pháp HPLC ” nhằm đánh giá

chất lượng của thuốc trong sản xuất và lưu thông phân phối

- Mục tiêu của công trình là:

Xây dựng phương pháp định tính và định lượng B2, NP, CM, B6 và B5 trong thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex đủ tin cậy, nhanh chóng, thuận tiện nhằm góp phần nâng cao khả năng kiểm tra chất lượng thuốc trong quá trình sản xuất và lưu hành

- Công trình thực hiện các nội dung sau:

+ Xây dựng chương trình sắc ký thích hợp cho phép tách và định lượng năm thành phần này

+ Đánh giá phưofng pháp đã xây dựng

+Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng một số lô sản phẩm

1.1 Vài nét về riboflavin natri phosphat, naphazolin nitrat, clorpheniramin maleat, pyridoxin hydroclorid và dexpanthenol

1.1.1 Naphazolin nitrat

Tên khoa học : 2-(l-naphthylm etyl )-2-imidazolin nitrat

Công thức phân tử : C14H14N2.HNO3

Clorpheniramin maleat có dạng bột kết tinh trắng, không mùi, vị đắng

Dễ tan trong nước, tan trong cloroform, ethanol 96%, khó tan trong ether

Riboflavin natri phosphat là hỗn hợp chứa chủ yếu Riboflavin 5 ’- natri hydrogen phosphat và các riboflavin natri monophosphat khác.

Riboflavin natri phosphat có dạng bột kết tinh màu vàng hay vàng cam,

dễ hút ẩm Tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong ether

riboflavin Nếu thiếu riboflavin có thể có những triệu chứng về mắt như ngứa

và rát bỏng, sợ ánh sáng và rối loạn phân bố mạch ở giác mạc [2] Được chỉ định để chữa quáng gà, viêm kết mạc, viêm loét giác mạc, chảy máu võng mạc [3]

1.1.4 Pyridoxin hydroclorid

Tên khoa học;5-hydroxy-6-methylpyridin-3,4-dimethanol hydroclorid

Công thức phân tử : CgHjjNOg HCl

Đặc tính p h ổ hấp thụ tử ngoại:

Trong môi trường acid hydrocloric 0,1M có 1 cực đại hấp thụ ở khoảng 290nm (E l% ,lc m = 427) Trong môi trường đệm phosphat 0,025M có 2 cực đại hấp thụ: một cực đại ở khoảng 248 - 256nm (E l% ,lc m = 175 - 195) và một cực đại ở khoảng 320 - 327nm (E l% ,lc m = 345 - 365) [1], [17], [21]

đặc trưng ở các số sóng sau: 1277, 1212, 1015, 1540, 870, 1086 [18].

Tác dụng và công dụng :

Pyridoxin hydroclorid được dùng để phòng và điều trị thiếu vitamin B6

có thể dẫn đến các triệu chứng về mắt giống như thiếu vitamin B2 [2]

1.2 Một số phưong pháp định lượng riboflavin natri phosphat, naphazolin nitrat, clorpheniramỉn maleat, pyridoxin hydroclorid và dexpanthenol

Để định lượng naphazolin nitrat, clorpheniramin maleat, riboflavin natri phosphat, pyridoxin hydroclorid và dexpanthenol người ta thường áp dụng các phưcmg pháp sau;

1.2.1 Phương pháp chuẩn độ

Thường áp dụng để định lượng nguyên liệu

* Naphazolin nitrat: Chuẩn độ môi trường khan bằng dung dịch acid percloric

0,1N Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp đo thế [1], [17], bằng chỉ thị tím tinh thể [30], [31]

* Clorpheniramin maleat: Chuẩn độ môi trường khan bằng dung dịch acid

percloric 0,1N Xác định điểm kết thúc bằng chỉ thị tím tinh thể [1], [25], [30], [31], [32], bằng phương pháp đo thế [17], [21]

* Pyridoxin hydroclorid: Chuẩn độ môi trường khan bằng dung dịch acid

percloric 0,1N với sự có mặt của dung dịch thuỷ ngân acetat Xác định điểm kết thúc bằng chỉ thị tím tinh thể [1], [17], [21], [25], bằng phương pháp đo thế [30], [31]

* Dexpanthenoh Chuẩn độ môi trường khan thừa trừ bằng dung dịch kali

biphtalat 0,1M Xác định điểm kết thúc bằng chỉ thị tím tinh thể [32], bằng chỉ thị naphthobenzein [17]

1.2.2 Phương pháp đo quang p h ổ tử ngoại khả kiến

Phương pháp này dựa trên định luật Lambert - Beer là mật độ quang của dung dịch một chất ở một bước sóng nào đó tỉ lệ thuận với nồng độ và bề dày của lớp dung dịch đem đo:

D = k l.c

Trong tniofng hợp c tính theo nồng độ phần trăm (kl/tt), 1 tính bằng cm

thì hệ số hấp thụ k được gọi là hệ số hấp thụ riêng, ký hiệu là A (l% ,lcm ) và

lúc này ta có:

D = A (l% ,lcm ) C.1

Phương pháp đo độ hấp thụ quang được áp dụng tương đối phổ biến trong các dược điển như D Đ V N III, BP 2003, USP 26, JP 14 và một số tài liệu khác để định lượng 5 thành phần trên trong các chế phẩm đơn thành phần hoặc hỗn hợp bằng cách đo trực tiếp độ hấp thụ quang của dung dịch mẫu thử trong môi trường thích hợp song song vói chuẩn hoặc so với A (1%, Icm) tại các bước sóng xác định, hoặc đo độ hấp thụ quang của mẫu thử song song với mẫu chuẩn sau khi tạo màu với thuốc thử thích hợp

* Clorpheniramin maleat: Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 264 nm hoặc

265nm trong môi trường acid, áp dụng để định lượng cloipheniramin maleat trong các chế phẩm đơn thành phần [1], [17], [21], [25], [29], [30], [31], [32] Các tác giả Nguyễn Việt Hoà, Trần Tử An và Thái Phan Quỳnh Như đã sử dụng phương pháp tạo cặp ion chiết - đo quang để định lượng clorpheniramin maleat trong thuốc đa thành phần: Clorpheniramin maleat được tạo cặp ion với

da cam methyl trong môi trường đệm acetat pH 4,6, sau đó được chiết bằng cloroform và đo độ hấp thụ ở 422 ± 2 nm [7]

* Pyridoxin hydroclorid: Đo độ hấp thụ ở bước sóng 290nm trong môi trường

acid, áp dụng để định lượng vitamin B6 trong các chế phẩm đơn thành phần [1]» [17], [21], [25] Đo độ hấp thụ ở bước sóng 650nm sau khi tạo màu với 2,6-dicloroquinon clorimid [29], [32] hay với 2,6 dibromo-N-cloro-1,4-

benzoquinon monoimin [30], [31] Reddy, M.N và cộng sự lại tạo màu với dung dịch 3-methylbenzothiazolin-2-on hydrazon và ceii amoni sulfat, sau đó

đo độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm [26]

* Riboflavin natri phosphat: Đo độ hấp thụ ở bước sóng 444nm trong môi

trường natri aceat, áp dụng để định lượng vitamin B2 nguyên liệu và thuốc tiêm đơn thành phần [17], [21], [25] Đo độ hấp thụ ở bước sóng 446nm trong môi trường đệm phosphat pH = 4,0, áp dụng để định lượng vitamin B2 trong thuốc tiêm vitamin B và c [17] Đo độ hấp thụ ở bước sóng 445nm trong môi trường acid acetic loãng, áp dụng để định lượng vitamin B2 nguyên liệu và thuốc tiêm đofn thành phần [30], [31]

* Dexpanthenol: Dexpanthenol không có cực đại hấp thụ tử ngoại nên không

định lượng được bằng cách đo trực tiếp độ hấp thụ quang Mostafa A.M Shehata và cộng sự đã định lượng dexpanthenol trong mỹ phẩm và dược phẩm bằng cách thuỷ phân dexpanthenol trong môi trường kiềm tạo thành ị3-alanol p-alanol được xác định bằng cách cho phản ứng với vanillin (thuốc thử Duquenois) trong môi trường đệm Mcllvain pH 7,5, sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 406 nm; hoặc cho phản ứng với ninhydrin và đo huỳnh quang với bước sóng kích thích là 385 nm và bước sóng phát xạ là 465 nm [23]

* Naphazolin nitrat: Một số tác giả đã dùng phương pháp quang phổ tử ngoại

đạo hàm tỉ đối để định lượng naphazolin nitrat trong thuốc nhỏ mắt Ngô Tuấn Cộng và cộng sự đã định lượng naphazolin nitrat bằng cách lấy giá trị đạo hàm bậc 1 của phổ tỉ đối ở bước sóng 226,12 nm khi có mặt cloramphenicol [5] Trịnh Văn Quỳ - Đặng Trần Phương Hồng đã định lượng naphazolin nitrat bằng cách lấy giá trị đạo hàm bậc 1 của phổ tỉ đối ở bước sóng 239,4 nm khi

có mặt cloramphenicol và dexamethason natii phosphat [14] Khadiga M Kelani đã định lượng đồng thời naphazolin hydroclorid và clorpheniramin

maleat trong thuốc nhỏ mắt và nhỏ mũi bằng cách lấy giá trị đạo hàm bậc 1 ở bước sóng 295,5 nm khi xác định naphazolin hydroclorid và giá trị đạo hàm bậc 2 ở bước sóng 261,7 nm khi xác định clorpheniramin maleat [22].

Nói chung phương pháp đo phổ tử ngoại khả kiến trực tiếp hoặc so sánh với chuẩn chỉ được các dược điển sử dụng trong trường hợp định lượng các chế phẩm đcrn thành phần Trong trường hợp thuốc đa thành phần có thể tạo màu với thuốc thử đặc trưng hoặc áp dụng phương pháp quang phổ đạo hàm để loại ảnh hưởng của các thành phần khác có trong chế phẩm

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân tích hoá lý dùng để tách, định tính và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn với nhau: pha tĩnh (được bao bên ngoài chất mang và nhồi trong cột sắc ký) và pha động (dung môi rửa giải) Pha động cùng với mẫu thử được bcfm qua cột dưới áp suất cao, các chất cần phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau tuỳ theo ái lực của chúng với hai pha và dẫn đến sự tách các chất Sự tách này đạt được là do quá trình phân bố, hấp phụ hoặc trao đổi ion

Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là detector Tuỳ theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp Detector hay được sử dụng nhất là detector u v - VIS (phát hiện chất cần phân tích dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại hoặc ánh sáng nhìn thấy của chất cần phân tích ở một bước sóng xác định) Đường cong rửa giải sau một qúa trình sắc ký được gọi là sắc ký đồ, nó thường có dạng như hình 1.1 [8], [13]

Ir (Thời gian lưu thực) = tR -

to-ô( (Độ lệch chuẩn): Độ rộng nửa pic tại các điểm uốn tương ứng

© 0 5 (Độ rộng pic ở nửa chiều cao) = 2,354ôf

©(,: Độ rộng đáy pic

Thời gian lưu Ir là thông tin về mặt định tính của các sắc đồ, nó là một hằng số đối với một cấu tử đã cho khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi Để đặc trưng cho một chất thuận lợi hcfn người ta dùng hệ số dung lượng

k Thường tính k theo công thức:

k ’ = — = ~ ^0 - Ỉ J L - l

Trên thực tế k' nằm trong khoảng từ 1-5 là tốt nhất, các giá trị k' lớn hơn chỉ dẫn đến sự doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài, k ’ thấp tương ứng với chất bị rửa giải ở thời điểm gần với thời điểm bơm mẫu và do đó làm giảm khả năng tách.

Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị k khác nhau và được đánh giá thông qua thừa số chọn lọc hay hệ số chọn lọc a:

^0,5.1 *^0,5.2

Khi: R = 0,75 hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều

R = 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau khoảng 4%

R = 1,5 hai pic tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ khoảng 0,3%

Độ phân giải phụ thuộc hệ số kj (hệ số dung lượng của cấu tử ra sau), độ chọn lọc a và số đĩa lý thuyết N của cột thông qua phương trình:

„ _VĨV a - 1 k i

R = - — X—

Như vậy, để tăng độ phân giải R ta có thể tăng N (dùng cột dài hơn hoặc giảm tốc độ dòng pha động); tăng k’2 (bằng cách thay đổi thành phần pha

động); tăng a (bằng cách thay loại pha tĩnh hoặc thay đổi thành phần pha

Trong phép định lượng để tính diện tích pic thì T < 2,5 là chấp nhận được Muốn làm cho pic cân xứng hcfn, ta có thể làm giảm thể tích chết, tức là đoạn nối từ cột đến detector; thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên; giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột, bằng cách pha loãng mẫu phân tích hoặc giảm thể tích tiêm

Ngày nay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc nói chung

Theo các tài liệu mà chúng tôi đã tham khảo thì phương pháp này được nghiên cứu áp dụng rất phổ biến cho việc định lượng các dược chất trong thuốc đa thành phần

Dưới đây là một số chương trình HPLC dùng để định lượng 5 hoạt chất

mà chúng tôi quan tâm trong các hỗn hợp đa thành phần khác nhau:

* Định lượng Clorpheniramin maleat:

+ ƯSP 26 [32] giới thiệu các chương trình HPLC khác nhau để định lượng clorpheniramin maleat trong các chế phẩm như:

- Trong viên có tác dụng kéo dài;

Detector UV: 214 nm;

Tốc độ dòng: 2 ml/phút

+ Bùi Thị Hoà và cộng sự [6] sử dụng chương trình HPLC pha thuận định lượng đồng thời với phenylpropanolamin hydroclorid, dextromethorphan hydrobromid và guaiphenesin:

Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.

+ Nhà sản xuất Hanil [19] đã định lượng clorpheniramin maleat trong thuốc nhỏ mắt Pinkle với chương trình:

C ộtC lS ;

Pha động: Dung dịch natri laurylsulfat 0,0 IM đã chỉnh pH = 4,0 bằng

dung dịch acid phosphoric 0 ,1% - acetonitiil ( 1 :1 ) ;

Detector UV: 214 nm;

Tốc độ dòng: 1 ml/phút

* Định lượng naphazolin: Naphazolin trong thuốc nhỏ mắt đã được định lượng

với các chương trình sau:

+ Chương trình của USP 26 [32[:

Cột Rp 8 duy trì ở nhiệt độ 40°C;

Pha động: Dung dịch đệm (Hoà tan 3 g kali dihydrophosphat trong 1000

ml nước, thêm 3 ml triethylamin, chỉnh pH đến 3,0 bằng acid phosphoric) -

Pha động: Dung dịch kali dihydrophosphat 10 mM pH 4,5 - acetonitril (7 : 3);

Detector UV: 250 nm;

Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

Naphazolin hay được kết hợp với clorpheniramin maleat trong các sản phẩm thuốc nhỏ mắt khác nhau nên có nhiều chương trình HPLC đã được dùng để định lượng đồng thời hai hoạt chất này Sau đây là một số chương trình HPLC mà chúng tôi đã tham khảo được:

Cột Phenyl duy trì ở nhiệt độ 40°C;

Pha động: Dung dịch natri heptansulfonat (Hoà tan l,02g natri heptansulfonat trong 20ml dung dịch acid acetic 12,5%, thêm 755ml nước) - acetonitril (75 : 25);

Detector UV: 220nm

Tốc độ dòng: 1 ml/phút

Pha động: Trộn 0,4ml triethylamin, 15,0ml acid acetic băng với 350 ml methanol và thêm dung dịch natri hexansulfonat 0,008M vừa đủ 2000ml;

Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

Ngoài các phương pháp định lượng đã nêu, vitamin B2 còn có thể định lượng bằng phưcỉng pháp quang phổ huỳnh quang [32] hoặc phương pháp HPLC với detector huỳnh quang [20], vitamin B5 có thể định lượng bằng phương pháp vi sinh [32]

Qua các tài liệu đã tham khảo được, chúng tôi nhận thấy: chưa có một chế phẩm nào chứa 5 thành phần như thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex, do

đó chưa có phưcỉng pháp để định tính và định lượng 5 hoạt chất trong chế phẩm Xuất phát từ nhu cầu cần có phương pháp để kiểm nghiệm sản phẩm khi

sản xuất và lưu hành chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu định tính và định lượng riboflavin natri phosphat, naphazolin nitrat, clorpheniramin maleat, pyridoxin hydroclorid và dexpanthenol trong thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex bằng phương pháp HPLC ” nhằm mục đích xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật cho

sản phẩm để đánh giá được chất lượng của sản phẩm, bảo đảm thuốc khi lưu thông và sử dụng đạt tiêu chuẩn

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DƯNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiến cứu sử dụng là thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex của công ty cổ phần dược phẩm Nam hà, SKS : 01- NC, có công thức như sau :

Riboflavin (dạng natii phosphat) 10 mg

Tá dược ( Thimerosal, natri dihydrophosphat,

dinatri hydrophosphat, nước cất) vừa đủ 100 ml

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Lựa chọn dung môi đ ể pha mẫu

Mẫu nghiên cứu là thuốc nhỏ mắt nên các hoạt chất đã được hoà tan trong nước do đó chúng tôi không phải tìm dung môi thích hợp để chiết xuất mẫu nữa Chỉ còn vấn đề chọn dung môi pha loãng mẫu thích hợp để tiêm sắc ký

Các dung môi pha loãng mẫu đã chọn là: nước để định lượng B2, NP và CM; pha động để định lượng B5 và B6

2.2.2 Xây dựng phương pháp HPLC đ ể phân tích định tính và định lượng B2, NP, CM, B 5 và B6 trong thuốc nhỏ mắt naphacollyre B-complex

2.2.2.I Khảo sát điều kiện sắc ký

Trên cơ sở có sẵn cột RP 18 (250 X 4mm; 5|am), chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chưcmg trình sắc ký thích hợp

a./ Khảo sát chon thành phán pha đỏng thích hcfp cho phép tách B2 NP CM B5 và B6 ra khỏi hỗn hơp phân tích

b./ Khảo sát chon bước sổng xác đinh B2 NP CM B5 và B6

c./ Khảo sát sư ảnh hưởng của tốc đổ dòng pha đống tới quá trình tách sắc ký.d./ Điều kiên sắc ký đã chon:

+ Hệ sắc ký 1: Định lượng B2, NP và CM:

Cột Apollo Lichrosphere RP18 (250 X 4mm, 5|am)

Pha động: Dung dịch đệm pH 2,7 (Hòa tan 2,72g kali dihydrophosphat trong 800 ml nước, thêm 3 ml triethylamin, điều chỉnh đến pH =2,7 bằng acid phosphoric, thêm nước vừa đủ 1000 ml) - acetonitril (75 : 25)

2.2.2.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng B2, NP, CM, B5 và

B6 trong thuốc nhỏ m ắt Naphacolly B-complex

a./ Xây dưng phương pháp đinh tính B2 NP CM B5 và B6:

Sử dụng máy HPLC với detector diod aưay để xây dựng việc định tính đồng thời B2, NP, CM, B5 và B6 dựa vào các thông số:

- Thời gian lưu và hình dạng pic trên sắc ký đồ trong cùng điều kiện sắc

- Xác định giới hạn định lượng (LOQ) của B2, NP, CM, B5 và B6

- Khảo sát độ lặp lại của phương pháp

- Khảo sát độ đúng của phưcmg pháp

Trên cơ sở đó, chọn nồng độ định lượng của mẫu chuẩn và mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn trên mẫu thử, song song với mẫu chuẩn

Trong khoảng tuyến tính nồng độ chất tỷ lệ thuận với diện tích pic (đáp ứng) trên sắc ký đồ So sánh diện tích pic mẫu chuẩn và mẫu thử để định lượng chất thử trong dung dịch phân tích từ đó tính ra hàm lượng chất thử trong mẫu cần định lượng

Công thức tính như sau:

D : Hệ số pha loãng của mẫu thử

V : Thể tích thuốc nhỏ mắt lấy đem định lượng (ml)

2.2.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

2.2.3.1 Đánh giá dung môi pha mẫu

Để đánh giá sự thích hợp của dung môi sử dụng, dùng phương pháp HPLC đã xây dựng để đánh giá sự phù hợp của dung môi sử dụng

Trong đó; X , y là các độ hấp thụ đo được trong các phổ mẫu thử và mẫu chuẩn tương ứng ở cùng bước sóng.

PHẦN 3 THỰC NGHIỆM, KÊT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu

Dung môi pha mẫu:

Tiến hành sắc ký trong khoảng thời gian 3 giờ: RSD của diện tích pic < 2,0%

và của thời gian lưu < 1,0%: Đảm bảo yêu cầu về độ thích hợp hệ thốngHPLC

3.2 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng B2, NP, CM, B5 và B6 trong thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex bằng phương pháp HPLC

3.2.1 Dụng cụ - Hoá chất - Mẫu thử

3.2.1.1 Dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao; WATERS 1525, Detector UV-VIS hoặc

Detector diode array và được nối với máy tính IBM, máy in Laser

- Máy đo quang phổ UV-VIS

- Máy đo pH 691 pH Meter - Metrohm

- Cân phân tích METTLER TOLEDO AB 204

- Các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết

3.2.1.2 Hoá chất

- Chất chuẩn làm việc: naphazolin nitrat, clorpheniramin maleat, riboflavin

natri phosphat, pyridoxin hydroclorid và dexpanthenol của Viện Kiểm nghiệm

- Acetonitril: loại dùng cho sắc ký lỏng.

- Kali dihydrophosphat; loại tinh khiết phân tích

- Natri dihydrophosphat: loại tinh khiết phân tích

- Acid phosphoric: loại tinh khiết phân tích

- Triethylamin: loại tinh khiết phân tích

3.2.I.3 Chuẩn bị mẫu thử và chuẩn

* Định lượng B2, N P và CM:

Dung dịch thử: Hút chính xác 5ml chế phẩm cho vào bình định mức

25ml, thêm nước cất đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45|j,m, dịch lọc đem tiêm sắc ký (nồng độ B2 khoảng 20|Lig/ml; NP khoảng 50|j,g/ml và CM

khoảng 40 |Lig/ml).

Dung dịch chuẩn: Cân và pha chính xác các chất chuẩn B2, NP và CM

trong nước để thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp có thành phần và nồng độ các chất tương đương với dung dịch thử, lọc qua màng lọc 0,45 ỊLim Dịch lọc đem tiêm sắc ký

^Định lượng B5 và B6:

Dung dịch thử: Hút chính xác 5ml chế phẩm cho vào bình định mức 25ml,

thêm pha động đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45|am, dịch lọc đem tiêm sắc ký (nồng độ B5 khoảng 200jj,g/ml; B6 khoảng 100|Lig/ml)

Dung dịch chuẩn: Cân và pha chính xác các chất chuẩn B5 và B6 trong nước

để thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp có thành phần và nồng độ các chất tương đưcmg với mẫu thuốc nhỏ mắt Hút chính xác 5ml dung dịch thu được cho vào bình định mức 25ml, thêm pha động đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc

0,45|Lim, dịch lọc đem tiêm sắc ký

3.2.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký

Trên cơ sở cột sẵn có Apollo Lichrosphere RP18 (250 X 4mm, 5|j.m) và qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như pha động, tốc độ dòng và bước sóng phát hiện cho phép tách được B2, NP,

CM, B5 và B6 trong dung dịch chuẩn hỗn hợp cũng như trong mẫu thử thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex

a./ Khảo sát chọn thành phần pha động và tốc độ dòng thích hợp cho phép thu được các pic của các chất có thời gian lưu khác nhau để có thể định tính và định lượng chính xác

Qua các tài liệu tham khảo, chúng tôi đã khảo sát trên một số hệ HPLC để định lượng B2, NP, CM, B5 và B6 và lựa chọn 2 hệ dung môi sắc ký sau:

+ Hệ dung môi định lượng B2, NP và CM: Dung dịch đệm pH 2,7 - acetonitril

(75 : 25) với tốc độ dòng 1 ml/phút

* Dung dịch đệm pH 2,7: Hoà tan 2,72g kali dihydrophosphat trong 800ml nước, thêm 3ml triethylamin, điều chỉnh pH đến 2,7 bằng acid phosphoric đặc

và thêm nước vừa đủ lOOOml

+ Hệ dung môi định lượng B5 và B6: Dung dịch natri dihydrophosphat 0,25M

- acetonitril (980 : 35), điều chỉnh pH đến 2,5 bằng acid phosphoric đặc với tốc độ dòng 1,5 ml/phút

0,01 mg/ml trong pha động, cốc đo dày Icm, mẫu trắng là pha động Kết quả ghi ở hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 và 3.5 :

Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của B2

7995 nm 0.6762 AU

Bước sóng (nm) Hình 3.2: Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của NP

Hình 3.3: Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của CM

Hình 3.4: Phổ hấp thụ UV-VIS trong pha động của B6

Các phổ đồ cho thấy B2 cho các cực đại hấp thụ ở 223; 267,8; 367,4 và

445,6nm NP cho cực đại hấp thụ ở khoảng 280nm CM cho cực đại hấp thụ ở

khoảng 264nm Để định lượng đồng thời B2, NP và CM chúng tôi chọn bước sóng 264nm Bước sóng 264nm là bước sóng hấp thụ cực đại của CM, ưu tiên

chọn bước sóng này vì CM có A (1%, Icm) khoảng 212 ở 264nm, thấp nhất so

với A (1%, Icm) của B2 ở bước sóng hấp thụ cực đại 267nm là khoảng 600 và của NP ở bước sóng hấp thụ cực đại 280nm là khoảng 250 Tại bước sóng này chúng ta có thể phát hiện và định lượng đồng thời cả ba chất trên với các pic không chênh lệch nhau nhiều

Phổ đồ của B6 cho cực đại hấp thụ ở 290 nm Phổ đồ của B5 không cho cực

đại hấp thụ và chỉ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng dưới 230nm Để định lượng B6

chúng tôi chọn bước sóng hấp thụ cực đại của nó là 290nm để đặc hiệu Để định lượng B5 chúng tôi chọn bước sóng 210nm, tuy là bước sóng ngắn hay bị nhiễu nhưng ở đó B5 mới hấp thụ tử ngoại đủ lớn để có thể định lượng được

Tóm lại

Qua tham khảo tài liệu và tiến hành thực nghiệm, chúng tôi đã xây dựng hai chương trình sắc ký có khả năng tách và phát hiện tốt năm hoạt chất riboflavin natri phosphat, naphazolin nitrat, clorpheniramin maleat, pyridoxin hydroclorid và dexpanthenol trong thuốc nhỏ mắt Naphacollyre B-complex như sau:

+ Hệ sắc ký 1: Định lượng B2, NP và CM;

Cột Apollo Lichrosphere RP18 (250 X 4mm, 5ịj.m)

Pha động: Dung dịch đệm pH 2,7 (Hòa tan 2,12% kali dihydrophosphat

trong 800 ml nước, thêm 3 ml triethylamin, điều chỉnh đến pH =2,7 bằng acid phosphoric, thêm nước vừa đủ 1000 ml) - acetonitril (75 : 25).Detector UV: 264 nm

Tốc độ dòng: 1 ml/phút

Thể tích tiêm: 20|^1

Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng